畜牧兽医学报

基因 Gene	SNP	cDNA	父本基因型 Paternal genotype	母本基因型 Maternal genotype	等位基因表达状态 Allelic expression status	胎盘 Placenta
DLK1	rs441687483（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2
rs109727539（T/A）	A	T/A	T/A	单等位基因表达	胎盘3
rs110780260（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
MEG3	rs211035616（G/A）	A	G/G	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs443104416（C/A）	C	C/C	C/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs135147011（G/A）	A	G/G	G/A	母源等位基因表达	胎盘2
rs209955636（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs41585323（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs41986828（T/C）	C	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs110532849（T/G）	T	T/G	T/G	单等位基因表达	胎盘3
RTL1	rs110501981（T/C）	T	T/C	C/C	单等位基因表达	胎盘2
MEG8	rs135792171（T/C）	C	T/C	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs110809274（C/A）	C	A/A	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs109919364（T/G）	G	T/T	G/G	母源等位基因表达	胎盘1
rs110409555（T/C）	T	C/C	T/T	母源等位基因表达	胎盘1
rs110250660（A/G）	G	A/A	G/G	母源等位基因表达	胎盘1
rs109610722（T/C）	C	T/T	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs110138805（G/A）	A	G/G	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs109253505（T/C）	T	C/C	T/T	母源等位基因表达	胎盘1
MEG9	rs454917639（A/G）	A	G/A	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
DIO3	rs109784396（T/G）	T	T/G	T/G	单等位基因表达	胎盘1
rs109735089（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2

基因 Gene	SNP	cDNA	父本基因型 Paternal genotype	母本基因型 Maternal genotype	等位基因表达状态 Allelic expression status	胎盘 Placenta
DLK1	rs441687483（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2
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rs109735089（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2

DMRs名称 Name of DMRs	染色体上位置 The position on chromosome	基因上位置 The position on genes	高甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypermethylated chains	低甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypomethylated chains	甲基化差异率/% Methylation difference rate
IG-DMR	chr21：65 708 298-65 714 157	DLK1基因与MEG3基因间	100	0	100
MEG3-DMR	chr21：65 721 981-65 726 571	MEG3基因启动子区	100	0	100
DLK1-DMR	chr21：65 633 118-65 634 647	DLK1基因3′末端	100	0	100
DLK1-DMR0	chr21：65 609 912-65 610 655	DLK1基因启动子区	100	0	100
DLK1-DMR1	chr21：65 621 774-65 622 939	DLK1基因启动子区	100	0	100
MEG8-DMR	chr21：65 799 513-65 800 104	MEG8基因内源6	93.3	0	93.3
MEG9-DMR	chr21：65 955 048-65 955 286	MEG9基因启动子区	100	8.3	91.7
DIO3-DMR1	chr21：66 464 165-66 464 578	MEG9基因与DIO3基因间	100	0	100
DIO3-DMR2	chr21：66 485 972-66 486 308	MEG9基因与DIO3基因间	81.8	0	81.8

DMRs名称 Name of DMRs	染色体上位置 The position on chromosome	基因上位置 The position on genes	高甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypermethylated chains	低甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypomethylated chains	甲基化差异率/% Methylation difference rate
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MEG8-DMR	chr21：65 799 513-65 800 104	MEG8基因内源6	93.3	0	93.3
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DIO3-DMR1	chr21：66 464 165-66 464 578	MEG9基因与DIO3基因间	100	0	100
DIO3-DMR2	chr21：66 485 972-66 486 308	MEG9基因与DIO3基因间	81.8	0	81.8

染色体上位置 The position on chromosome	CpG岛 CpG islands	基因上位置 The position on genes	甲基化状态 Methylation status
chr21： 65 608 823-65 609 056	CpG： 19	DLK1基因上游	高
chr21： 65 625 869-65 627 121	CpG： 110	DLK1基因5′端	低
chr21： 65 669 308-65 669 954	CpG： 46	DLK1和MEG3基因间	高
chr21： 65 670 829-65 671 044	CpG： 19	DLK1和MEG3基因间	高
chr21： 65 701 370-65 701 641	CpG： 23	DLK1和MEG3 基因间	高
chr21： 65 778 434-65 781 946	CpG： 220	RTL1和MEG8基因上	高
chr21： 65 807 941-65 808 170	CpG： 22	MEG8基因间上	高
chr21： 65 961 272-65 961 510	CpG： 22	MEG9基因下游	低
chr21： 66 490 150-66 490 492	CpG： 27	DIO3基因上游	低
chr21： 6 692 442-66 498 353	CpG： 525	DIO3基因上	低

染色体上位置 The position on chromosome	CpG岛 CpG islands	基因上位置 The position on genes	甲基化状态 Methylation status
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chr21： 66 490 150-66 490 492	CpG： 27	DIO3基因上游	低
chr21： 6 692 442-66 498 353	CpG： 525	DIO3基因上	低

牛胎盘DLK1-DIO3区域的印记及甲基化状态研究

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郑云畅 ¹ , 侯睿霖 ¹ , 梁晓贺 ¹ , 魏子露 ¹ , 杨利丹 ¹ , 霍浩楠 ¹ , 苏硕青 ² , 张萃 ¹ , 李树静 ² , 李世杰 ¹

畜牧兽医学报 | 生物技术与繁殖 2026,57(2): 789-800

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畜牧兽医学报 |生物技术与繁殖 2026 , 57 (2) : 789 -800

牛胎盘DLK1-DIO3区域的印记及甲基化状态研究

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郑云畅¹, 侯睿霖¹, 梁晓贺¹, 魏子露¹, 杨利丹¹, 霍浩楠¹, 苏硕青², 张萃¹, 李树静², 李世杰¹

作者信息

^1.河北农业大学生命科学学院，保定 071001

^2.河北天和肉牛种业有限公司，石家庄 050200

通讯作者:

李树静，主要从事胚胎生物技术研发和推广，E-mail： embryochina@163.com

李世杰，主要从事动物分子遗传与表观遗传学研究，E-mail： lishijie20005@163.com

作者简介:

郑云畅和侯睿霖为同等贡献作者

郑云畅，硕士，主要从事动物分子遗传与表观遗传学研究，E-mail： zyc15831601852@163.com

侯睿霖，硕士，主要从事动物分子遗传与表观遗传学研究，E-mail：13780586712@163.com

Analysis of Imprinting and DNA Methylation Status of DLK1-DIO3 Domain in Bovine Placenta

Yunchang ZHENG¹, Ruilin HOU¹, Xiaohe LIANG¹, Zilu WEI¹, Lidan YANG¹, Haonan HUO¹, Shuoqing SU², Cui ZHANG¹, Shujing LI², Shijie LI¹

Affiliations

^1.College of Life Science，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China

^2.Hebei Tianhe Beef Cattle Seed Industry Co. ，Ltd. ，Shijiazhuang 050200，China

Corresponding Author:

LI Shijie， E-mail： lishijie20005@163.com

LI Shujing， E-mail： embryochina@163.com

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.019

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摘要

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旨在研究牛DLK1-DIO3区域的印记状态和DNA差异甲基化区（differentially methylated regions，DMRs）。对3个牛的胎盘、及其亲本进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），挖掘单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）信息；联合转录组测序（RNA-sequencing，RNA-seq）数据，确定基因的印记状态；联合全基因组亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）数据，确定DNA的差异甲基化区。WGS与RNA-seq测序结果联合分析表明，牛MEG3、MEG8和MEG9基因为母源等位基因表达的印记基因，DLK1、RTL1和DIO3基因为父源等位基因表达的印记基因。WGBS数据分析发现，除与人和小鼠保守的Dlk1-DMR、IG-DMR、Gtl2-DMR和Meg8-DMR外，还发现5个新的DMRs，分别为位于DLK1基因上游的DLK1-DMR0和DLK1-DMR1、MEG9启动子区域的MEG9-DMR及DIO3上游的DIO3-DMR1和DIO3-DMR2。上述结果表明，DLK1-DIO3印记区域的印记状态和差异甲基化区在牛、人和小鼠中高度保守，此外，新发现了5个DMRs，其对DLK1-DIO3区域的调控机制有待于进一步研究。

关键词

DLK1-DIO3印记区域 / 转录组 / 甲基化组 / 牛 / 胎盘

Abstract

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The objective of this study was to investigate the imprinting status and to search for potential DNA differentially methylated regions （DMRs） of the DLK1-DIO3 domain in bovine placentas. In this study， whole genome sequencing （WGS） was performed on 3 bovine placentas and their parents to mining the informative single nucleotide polymorphisms （SNPs）. The imprinting status of genes in the DLK1-DIO3 domain were determined by the combined analysis of WGS and transcriptome sequencing （RNA-seq） results. The DMRs were identified by combination of WGS and whole genome bisulfite sequencing （WGBS） data. WGS and RNA-seq results showed that MEG3， MEG8 and MEG9 genes were maternally expressed imprinted genes and DLK1， RTL1 and DIO3 genes were paternally expressed imprinted genes. The WGBS data analysis showed that 4 DMRs， Dlk1-DMR， IG-DMR， Gtl2-DMR and Meg8-DMR were conserved in human and mouse， and 5 new DMRs were identified， DLK1-DMR0 and DLK1-DMR1 located upstream of the DLK1 gene， MEG9-DMR in MEG9 promoter region， and DIO3-DMR1 and DIO3-DMR2 located upstream of DIO3 genes， respectively. The results indicate that the imprinted status and differentially methylated regions of bovine DLK1-DIO3 imprinted region are highly conserved to human and mouse. In addition， 5 potential DMRs were identified in bovine DLK1-DIO3 region， and their regulating mechanism on the DLK1-DIO3 imprinted region needs to be further investigated.

Key words

DLK1-DIO3 imprinted domain / transcriptome / methylome / bovine / placenta

引用本文

郑云畅, 侯睿霖, 梁晓贺, 魏子露, 杨利丹, 霍浩楠, 苏硕青, 张萃, 李树静, 李世杰. 牛胎盘DLK1-DIO3区域的印记及甲基化状态研究. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 789 -800 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.019

Yunchang ZHENG, Ruilin HOU, Xiaohe LIANG, Zilu WEI, Lidan YANG, Haonan HUO, Shuoqing SU, Cui ZHANG, Shujing LI, Shijie LI. Analysis of Imprinting and DNA Methylation Status of DLK1-DIO3 Domain in Bovine Placenta[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 789 -800 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.019

正文

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基因组印记（genomic imprinting）是发生在哺乳动物中的一种表观遗传学机制，是指在子代中仅表达来源于亲本一方的等位基因，而另一方不表达或很少表达的现象^［1］。这种亲本特异性单等位表达的基因被称为印记基因，是哺乳动物表观遗传学研究的核心内容之一。大多数印记基因成簇存在，受印记控制中心（imprinting control center，ICR）调控，ICR通常含有DNA修饰在亲本等位基因之间存在显著差异的区域，称为DNA差异甲基化区（DNA differentially methylated regions，DMRs）^［2］。哺乳动物在配子生成和早期胚胎发育阶段经历2次基因组范围的去甲基化和从头甲基化过程^［3］，其中在配子形成期获得的差异甲基化区被称为种系DMR（germline DMR，gDMR），gDMR在维持基因组印记中起重要作用，而在受精后形成的体细胞DMR（somatic DMR，sDMR）通常受gDMR的调控^［4⁃5］。此外，组蛋白修饰和长非编码RNA等也参与调控基因组印记^［6⁃7］。基因组印记在物种间高度保守，目前发现约70个印记基因在人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）间保守^［8⁃10］。

Dlk1-Dio3区域是哺乳动物基因组中最大的印记簇之一，长约1.2 Mb，物种间高度保守^［11］。在小鼠中，Dlk1-Dio3区域在胚胎和胎盘发育、出生后生存及细胞分化过程中发挥重要作用^［12］。该域存在3个编码蛋白的父源等位基因（Dlk1、Rtl1/Peg11和Dio3），3个父源等位基因甲基化DMRs（Dlk1-DMR、IG-DMR和Gtl2-DMR），其中，位于Dlk1和Gtl2基因间的IG-DMR（intergenic DMR）是Dlk1-Dio3印记区域的ICR^［11］；此外，还含有多个母源单等位表达的长非编码RNA（包括Meg3/Gtl2、Meg8/Rian、Meg9/Mirg、anti-Rtl1/Peg11as）及多个microRNA和snoRNA^［11］，在Meg8基因的内元2上存在一个母源等位基因甲基化的Meg8-DMR^［13］。

目前，新一代测序技术飞速发展，全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、转录组测序（RNA-sequencing，RNA-seq）及全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）广泛应用于印记基因研究。WGS与RNA-seq联合分析可高效精准筛选印记基因，确定基因表达状态^［14］。WGS与WGBS联合分析可确定亲本甲基化状态及潜在的差异甲基化区^［15］。牛（Bos taurus）胚胎发育过程与人类高度相似^［16］，是研究人类胚胎发育的理想模式生物。胎盘是胚胎发育的第一个器官，负责母体与胎儿间的营养物质交换^［17］，也是印记基因发生数量最多的器官之一^［18］。胎盘发育异常会导致胎儿发育异常、妊娠疾病，甚至妊娠失败^［19］。牛胎盘DLK1-DIO3区域印记状态及DNA甲基化调控机制的研究具有重要意义。前期研究了牛DLK1-DIO3区域的GTL2、DIO3、MEG3、MEG8、MEG9、PEG11和多个长非编码RNA基因^{［20⁃22］}的等位基因表达状态，但牛胎盘DLK1-DIO3区域的印记和甲基化状态未被揭示，本研究通过WGS、RNA-seq与WGBS联合分析牛胎盘中DLK1-DIO3区域的印记状态和DMRs，丰富牛基因组印记的研究，并为牛作为模式生物研究人类胚胎和胎盘发育提供理论基础。

1　材料与方法

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1.1　试验材料

3个足月且自然娩出的胎盘（胎盘1、2、3）、对应母牛外周血液（血液1、2、3）及用于人工授精的公牛精液（精子1、2、3）采集于保定市某养殖场。样品采集后运回试验室-80 ℃冰箱保存备用。本研究中涉及的动物试验符合河北农业大学农业研究动物保护委员会的相关法规（编号14021）。

1.2　试验方法

1.2.1　DNA的提取及全基因组测序

使用DNA提取试剂盒（翌圣生物，上海）提取牛胎盘、精子和血液的DNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测样品完整性，超微量分光光度计检测样品浓度和质量。

Covaris破碎仪（Covaris，美国）将DNA切割为长度约350 bp的片段，将DNA片段末端修复为平末端，最后通过T4 DNA连接酶将Illumina测序接头连接至DNA文库的两端。Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒（Beckman Coulter，美国）筛选原始DNA文库，通过PCR富集DNA文库，qPCR和Agilent 5400系统（Agilent，美国）检测DNA文库质量。在Illumina平台（美国）PE 150（Pair end 150 bp）测序PCR产物，BWA软件（参数：mem-t 4-k 32-M）^［23］对比牛参考基因组，SAMTOOLS软件去除重复数据，检测单个SNP^［24］。统计的SNP读数数量在3~1 000个，且质量值（Mapping Quality，MQ）不低于20。

1.2.2　RNA的提取及转录组测序

使用RNA提取试剂盒（翌圣生物，上海）提取牛胎盘总RNA，琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测样品的质量和浓度。Oligo dT磁珠富集mRNA，随机六聚体引物合成cDNA链，建立cDNA文库。cDNA文库稀释至1.5 ng·μL^-1，Agilent 2 100 bioanalyzer和qRT-PCR筛选长度合格的片段进行测序。fastp软件（fastp 0.23.1）筛选raw reads，HISAT2（版本v2.0.5）软件对比牛参考基因组。每个胎盘进行3次平行的RNA-seq。

1.2.3　牛胎盘中DLK1-DIO3区域印记状态分析

用WGS和RNA-seq结果联合分析DLK1-DIO3区域内基因的印记状态。通过胎盘、精子和卵母细胞WGS结果中SNP区分等位基因，通过RNA-seq结果中SNP位点处reads确定基因印记状态，RNA-seq结果中SNP位点处reads应大于20个。将基因的父本reads和母本reads分别合并统计，通过二项式检验和BH校正（P<0.05）分析等位基因表达差异。父源表达的基因为平均母源表达的resds数量低于总reads数量的35%，与之相反为母源表达的基因。最后通过IGV软件查看所有测序结果，并进行分析。

1.2.4　牛胎盘全基因组亚硫酸盐测序及DMR的确定

Covaris超声破碎仪将基因组DNA打断为长度约300 bp的片段，DNA重亚硫酸盐转化试剂盒（天根，北京）处理DNA。Agilent 5 400系统评估文库质量，qPCR进行文库定量，对浓度大于1.5 nmol·L^-1的文库在Illumina测序平台上双端测序。FastQC（fastqc_v 0.11.8）和fastp软件评估、检测和过滤raw reads，Bismark软件（0.24.0版）^［25］将reads对比到参考基因组（-X 700-dovetail），经FDR校正（P<0.05）。DSS软件（2.12.0版）^［26］分析DMR，DMR标准是：300 bp片段中CpGs大于10个，且组间甲基化差异大于0.5。对牛胎盘进行3次平行WGBS试验。

本试验中的组学测序均由诺禾致源（北京）完成。

2　结果

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2.1　 DLK1-DIO3区域基因的印记状态

通过WGS和RNA-seq联合分析了DLK1-DIO3区域内6个基因（DLK1、RTL1、DIO3、MEG3、MEG8和MEG9）在牛胎盘中的印记状态（图1A）。在牛胎盘WGS测序结果中，DLK1、RTL1和DIO3基因编码序列上分别有3、1和2个SNPs位点，在RNA-seq数据中，3个基因均呈现单等位基因表达，亲本基因型确定DLK1、RTL1和DIO3基因为父源等位基因表达（图1B、C、D）。

MEG3基因中有7个SNPs位点，其中3个SNPs位点（rs211035616、rs443104416和rs135147011）根据亲本的基因型确定MEG3为母源等位基因表达（图1E）。MEG8基因存在55个SNPs位点，胎盘1、2和3中分别具有33、16、和6个，根据SNP的亲本基因型，确定MEG8基因为母源等位基因表达，图1F中仅列出3个SNPs的测序结果。MEG9基因仅在胎盘1中有1个SNP位点（rs454917639，A/G），其父母亲本基因型分别为G/A和A/A，确定MEG9基因为母源等位基因表达（图1G）。6个基因上SNPs位点的序列号、亲本基因型及等位基因表达状态见表1，MEG8基因的55个SNPs位点仅列出8个。

2.2　牛胎盘中IG-DMR和MEG3-DMR的确定

在UCSC（https：//genome.ucsc.edu）数据库中，牛DLK1与MEG3基因间存在8个CpG岛（图2A），分析其WGBS数据，发现1个长度为5 860 bp的DMR位于DLK1和MEG3基因之间，覆盖CpG： 23（chr21： 65 709 569-65 709 831）和CpG： 16（chr21： 65 713 651-65 713 868），包含215个CG位点（图2B）。在人、小鼠、猪和羊中，IG-DMR均具有典型重复序列。分析该DMR序列，发现包括20个核心序列为GCCAGTTGCCCGCGGTCC的重复序列（图2C），其与羊和猪的核心序列相似性最高（63.64%），与人和鼠的相似性分别为54.55%和50.00%（图2D），提示该差异甲基化区为牛的IG-DMR。

在人和小鼠中，MEG3-DMR位于MEG3基因上游的启动子区，在WGBS数据中，MEG3基因上游1 234 bp处，有一个长度为4 591 bp（chr21： 65 721 981-65 726 571），包含253个CG位点的DMR（图2E），其包含了CpG： 52（chr21： 65 723 879-65 724 532）、CpG： 45（chr21： 65 725 257-65 725 843）和CpG： 28（chr21： 65 726 242-65 726 578）（图2A），提示该差异甲基化区为牛的MEG3-DMR。IG-DMR与MEG3-DMR存在甲基化率为100%的高甲基化链以及甲基化率为0%的低甲基化链，两条链的甲基化水平差异率为100%（表2）。另外的3个CpG岛（CpG： 46、CpG： 19和CpG： 23）在牛胎盘中均为高甲基化状态（表3）。

2.3　 DLK1基因位置相关的DMRs

在UCSC数据库中，DLK1基因内部及上下游存在5个CpG岛，其中CpG： 19（chr21： 65 608 823-65 609 056）和CpG： 47（chr21： 65 609 728-65 610 458）位于DLK1基因上游的17 306 bp和15 904 bp处；CpG： 110（chr21： 65 625 869-65 627 121）和CpG： 51（chr21： 65 633 383-65 633 937）位于DLK1基因5′端和3′末端；CpG： 16（chr21： 65 634 588-65 634 803）位于DLK1基因下游117 bp处。此外，MethPrimer软件预测到1个长度为108 bp，包括6个CpGs的CpG岛（CpG： 6），位于DLK1基因启动子区chr21： 65 621 980-65 622 087处（图3A）。

WGBS数据发现，位于DLK1基因3′末端的CpG： 51和基因下游的CpG： 16亲本间存在差异甲基化链，且差异甲基化率高于50%（图3B），其位置与人和小鼠的DLK1-DMR一致，提示该DMR为牛的DLK1-DMR，长度为1 530 bp，包括92个CpG位点。

CpG： 47和CpG： 6存在甲基化水平有显著差异的两条链，命名为DLK1-DMR1和DLK1-DMR0，其中DLK1-DMR1长度为744 bp，包含44个CG，DLK1-DMR0长度为1 166 bp，包含39个CG，分别位于DLK1基因上游15 707 bp（图3C）和3 423 bp处（图3D）。DLK1-DMR、DLK1-DMR1和DLK1-DMR0等位基因间的差异甲基化率列于表2。CpG： 19和CpG： 110分别呈现高和低甲基化状态（表3）。

2.4　 MEG8基因内部的MEG8-DMR

MEG8基因内部和上游存在3个CpG岛，分别是位于MEG8基因启动子区的CpG： 220（chr21： 65 778 434-65 781 946）、内含子6中的CpG： 64（chr21： 65 799 107-65 799 898）和内含子7中的CpG： 22（chr21： 65 807 941-65 808 170）（图4A）。WGBS数据显示，CpG： 220和CpG： 22均为高甲基化状态（表3），CpG： 64内部及其下游chr21： 65 799 513-65 800 104位置存在差异甲基化链，其中高甲基化链的甲基化率为93.3%，低甲基化链的甲基化率为0%（表2），推断该区域为MEG8-DMR，全长592 bp，包含53个CG。在鼠中，Meg8-DMR全长664 bp，包含26个CG，存在1个CTCF结合位点（CTCF-BSs）CTCFBS3（GTGCCACAAGGGGGCTGCCT）及（GGCG）n重复序列（图4B），牛的MEG8-DMR亦存在1个CTCFBS2（AGCCCAGGGGAGGGCGCGGG）和（GCG）n的重复序列（图4A），与小鼠的MEG8-DMR具有保守的特征。

2.5　 MEG9基因上游的MEG9-DMR

CpG： 21（chr21：65 955 048-65 955 286）和CpG： 22（chr21：65 961 272-65 961 510）位于MEG9基因上游及下游（图5A）。CpG： 21等位基因间存在差异甲基化链，甲基化率差异为91.7%（表2），命名为MEG9-DMR，其长度为239 bp，包含21个CG（图5B）。CpG： 22为低甲基化状态（表3）。

2.6　 DIO3基因上游的DMRs

DIO3基因内部及上游有4个CpG岛，位于基因上游的CpG： 29（chr21： 66 464 257-66 464 578）和CpG： 17（chr21： 66 486 106-66 486 308）存在DMRs，命名为DIO3-DMR1和DIO3-DMR2（图6A）。DIO3-DMR1位于DIO3基因上游29 819 bp处，长度为414 bp，包含32个CG（图6B）。DIO3-DMR2位于DIO3基因上游8 089 bp处，长度为337 bp，包含20个CG（图6C）。此外，DIO3上游的CpG： 27和DIO3基因内部的CpG： 525为低甲基化状态（表3）。

3　讨论

收起

印记基因在胎盘发育、胚胎生长以及多种疾病发生中发挥关键作用，母源印记基因表达异常会导致胎儿发育异常，妊娠女性发生高血压、蛋白尿、子痫等妊娠疾病^［27］；父源印记基因表达异常会导致癌症和肿瘤等疾病的发生^［28］。比较不同物种间的基因组印记有助于理解基因组印记的进化理论和生物学意义。Dlk1-Dio3区域是哺乳动物中最大的印记区域之一，位于人14号染色体、鼠12号染色体，Dlk1-Dio3印记区域不仅在胚胎和胎盘发育中起重要作用，还与诱导多能干细胞及克隆胚胎的发育密切相关^［12］。在人和小鼠中该区域内Dlk1、Rtl1和Dio3为母源印记基因，Meg3、Meg8和Meg9等为父源印记基因^［11］。本研究通过WGS和RNA-seq联合分析，确定了DLK1、RTL1和DIO3基因在牛中为父源等位基因表达，而MEG3、MEG8和MEG9基因为母源等位基因表达，与人和鼠中的印记状态一致，说明DLK1-DIO3印记区域在进化过程中高度保守。

SNP是基因组中最常见的遗传变异类型，基于SNP的RT-PCR直接测序法鉴定印记基因技术简单便捷，但效率较低，无法满足从基因组范围寻找更多的印记基因。全基因组测序可获得大量的SNP信息^［29］。本研究通过对胎盘进行全基因组测序，在DLK1-DIO3区域的DLK1、RTL1、DIO3、MEG3、MEG8和MEG9基因中发现了有效的SNP位点，为鉴定基因的印记状态奠定了基础。

在人和小鼠中，存在3个父源等位基因甲基化的DMRs，Dlk1-DMR、IG-DMR和Gtl2-DMR^［11］。本研究通过牛胎盘WGBS数据分析，确定了牛中DLK1-DMR、IG-DMR和GTL2-DMR的位置和长度，DLK1-DMR、IG-DMR和GTL2-DMR分别位于DLK1基因3′末端及其下游、DLK1与MEG3基因间和MEG3基因启动子区，与人和小鼠中一致。IG-DMR是DLK1-DIO3印记区域的印记调控区^{［30⁃31］}，人、小鼠、羊和猪的IG-DMR内分别存在9、7、16个和13个重复序列^［21］。本研究中鉴定的牛IG-DMR区域内存在20个重复序列，重复序列与人、小鼠、羊和猪的重复序列相似性大于50%，说明DLK1-DIO3区域的印记调控区在物种间高度保守。

在小鼠的Dlk1-Dio3印记区域，Meg8-DMR为第1个鉴定的母源等位基因发生甲基化的DMR，位于MEG8基因内含子2中^{［13，32］}，包含CTCF结合位点及重复序列。Meg8-DMR与CTCF结合位点的缺失会增加细胞迁移和侵袭，并抑制细胞的增殖^［33］。Meg8-DMR作为一个远程调控元件，缺失导致microRNAs表达上调^［13］。在人大脑中，Meg8-DMR甲基化水平随年龄增长而升高，且与Temple综合征患者智力的发展有关^［13］。本研究确定了牛MEG8-DMR位于MEG8基因的内含子6，存在CTCF结合位点及（GCG）n重复序列，其特征与人和小鼠高度保守。

此外，在牛DLK1-DIO3印记区域还发现了5个新的DMRs，DLK1-DMR0、DLK1-DMR1、MEG9-DMR、DIO3-DMR1和DIO3-DMR2。在小鼠中，Dlk1基因启动子区也存在1个差异甲基化区（Dlk1-DMR0），位于Dlk1基因上游7.4 kb处^［34］，牛DLK1-DMR0与小鼠Dlk1-DMR0物理位置相似，其余DMRs在其他物种中尚未见报道。这5个DMRs如何调控DLK1-DIO3区域印记基因的表达还需进一步研究。

4　结论

收起

牛MEG3、MEG8和MEG9为父源印记基因，DLK1、RTL1和DIO3为母源印记基因；4个DMRs（DLK1-DMR、IG-DMR、MEG3-DMR和MEG8-DMR）与人和小鼠中高度保守，此外还包括5个新发现的DMRs。

基金

收起

河北省自然科学基金(C2023204145)
河北省现代农业产业技术体系建设专项(HBCT2024240206)
河北省现代农业产业技术体系建设专项(HBCT2024240101)
中央引导地方科技发展资金项目(246Z2914G)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.019

接收时间：2025-06-16
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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收稿日期：2025-06-16

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河北省自然科学基金(C2023204145)

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河北省现代农业产业技术体系建设专项(HBCT2024240101)

中央引导地方科技发展资金项目(246Z2914G)

作者信息

^1.河北农业大学生命科学学院，保定 071001

^2.河北天和肉牛种业有限公司，石家庄 050200

通讯作者:

李树静，主要从事胚胎生物技术研发和推广，E-mail： embryochina@163.com

李世杰，主要从事动物分子遗传与表观遗传学研究，E-mail： lishijie20005@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

基因 Gene	SNP	cDNA	父本基因型 Paternal genotype	母本基因型 Maternal genotype	等位基因表达状态 Allelic expression status	胎盘 Placenta
DLK1	rs441687483（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2
rs109727539（T/A）	A	T/A	T/A	单等位基因表达	胎盘3
rs110780260（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
MEG3	rs211035616（G/A）	A	G/G	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs443104416（C/A）	C	C/C	C/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs135147011（G/A）	A	G/G	G/A	母源等位基因表达	胎盘2
rs209955636（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs41585323（T/C）	T	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs41986828（T/C）	C	T/C	T/C	单等位基因表达	胎盘3
rs110532849（T/G）	T	T/G	T/G	单等位基因表达	胎盘3
RTL1	rs110501981（T/C）	T	T/C	C/C	单等位基因表达	胎盘2
MEG8	rs135792171（T/C）	C	T/C	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs110809274（C/A）	C	A/A	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs109919364（T/G）	G	T/T	G/G	母源等位基因表达	胎盘1
rs110409555（T/C）	T	C/C	T/T	母源等位基因表达	胎盘1
rs110250660（A/G）	G	A/A	G/G	母源等位基因表达	胎盘1
rs109610722（T/C）	C	T/T	C/C	母源等位基因表达	胎盘1
rs110138805（G/A）	A	G/G	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
rs109253505（T/C）	T	C/C	T/T	母源等位基因表达	胎盘1
MEG9	rs454917639（A/G）	A	G/A	A/A	母源等位基因表达	胎盘1
DIO3	rs109784396（T/G）	T	T/G	T/G	单等位基因表达	胎盘1
rs109735089（G/A）	G	G/G	G/A	父源等位基因表达	胎盘2

基因

Gene

SNP

cDNA

父本基因型

Paternal genotype

母本基因型

Maternal genotype

等位基因表达状态

Allelic expression status

胎盘

Placenta

DLK1

rs441687483（G/A）

G/G

G/A

父源等位基因表达

胎盘2

rs109727539（T/A）

T/A

单等位基因表达

胎盘3

rs110780260（T/C）

T/C

单等位基因表达

胎盘3

MEG3

rs211035616（G/A）

G/G

A/A

母源等位基因表达

胎盘1

rs443104416（C/A）

C/C

C/A

母源等位基因表达

胎盘1

rs135147011（G/A）

G/G

G/A

母源等位基因表达

胎盘2

rs209955636（T/C）

T/C

单等位基因表达

胎盘3

rs41585323（T/C）

T/C

单等位基因表达

胎盘3

rs41986828（T/C）

T/C

单等位基因表达

胎盘3

rs110532849（T/G）

T/G

单等位基因表达

胎盘3

RTL1

rs110501981（T/C）

T/C

C/C

单等位基因表达

胎盘2

MEG8

rs135792171（T/C）

T/C

C/C

母源等位基因表达

胎盘1

rs110809274（C/A）

A/A

C/C

母源等位基因表达

胎盘1

rs109919364（T/G）

T/T

G/G

母源等位基因表达

胎盘1

rs110409555（T/C）

C/C

T/T

母源等位基因表达

胎盘1

rs110250660（A/G）

A/A

G/G

母源等位基因表达

胎盘1

rs109610722（T/C）

T/T

C/C

母源等位基因表达

胎盘1

rs110138805（G/A）

G/G

A/A

母源等位基因表达

胎盘1

rs109253505（T/C）

C/C

T/T

母源等位基因表达

胎盘1

MEG9

rs454917639（A/G）

G/A

A/A

母源等位基因表达

胎盘1

DIO3

rs109784396（T/G）

T/G

单等位基因表达

胎盘1

rs109735089（G/A）

G/G

G/A

父源等位基因表达

胎盘2

DMRs名称 Name of DMRs	染色体上位置 The position on chromosome	基因上位置 The position on genes	高甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypermethylated chains	低甲基化链甲基化率/% Methylationrate of hypomethylated chains	甲基化差异率/% Methylation difference rate
IG-DMR	chr21：65 708 298-65 714 157	DLK1基因与MEG3基因间	100	0	100
MEG3-DMR	chr21：65 721 981-65 726 571	MEG3基因启动子区	100	0	100
DLK1-DMR	chr21：65 633 118-65 634 647	DLK1基因3′末端	100	0	100
DLK1-DMR0	chr21：65 609 912-65 610 655	DLK1基因启动子区	100	0	100
DLK1-DMR1	chr21：65 621 774-65 622 939	DLK1基因启动子区	100	0	100
MEG8-DMR	chr21：65 799 513-65 800 104	MEG8基因内源6	93.3	0	93.3
MEG9-DMR	chr21：65 955 048-65 955 286	MEG9基因启动子区	100	8.3	91.7
DIO3-DMR1	chr21：66 464 165-66 464 578	MEG9基因与DIO3基因间	100	0	100
DIO3-DMR2	chr21：66 485 972-66 486 308	MEG9基因与DIO3基因间	81.8	0	81.8

DMRs名称

Name of DMRs

染色体上位置

The position on chromosome

基因上位置

The position on genes

高甲基化链甲基化率/%

Methylationrate of hypermethylated chains

低甲基化链甲基化率/%

Methylationrate of hypomethylated chains

甲基化差异率/%

Methylation difference rate

IG-DMR

chr21：65 708 298-65 714 157

DLK1基因与MEG3基因间

100

MEG3-DMR

chr21：65 721 981-65 726 571

MEG3基因启动子区

100

DLK1-DMR

chr21：65 633 118-65 634 647

DLK1基因3′末端

100

DLK1-DMR0

chr21：65 609 912-65 610 655

DLK1基因启动子区

100

DLK1-DMR1

chr21：65 621 774-65 622 939

DLK1基因启动子区

100

MEG8-DMR

chr21：65 799 513-65 800 104

MEG8基因内源6

93.3

MEG9-DMR

chr21：65 955 048-65 955 286

MEG9基因启动子区

100

8.3

91.7

DIO3-DMR1

chr21：66 464 165-66 464 578

MEG9基因与DIO3基因间

100

DIO3-DMR2

chr21：66 485 972-66 486 308

MEG9基因与DIO3基因间

81.8

染色体上位置 The position on chromosome	CpG岛 CpG islands	基因上位置 The position on genes	甲基化状态 Methylation status
chr21： 65 608 823-65 609 056	CpG： 19	DLK1基因上游	高
chr21： 65 625 869-65 627 121	CpG： 110	DLK1基因5′端	低
chr21： 65 669 308-65 669 954	CpG： 46	DLK1和MEG3基因间	高
chr21： 65 670 829-65 671 044	CpG： 19	DLK1和MEG3基因间	高
chr21： 65 701 370-65 701 641	CpG： 23	DLK1和MEG3 基因间	高
chr21： 65 778 434-65 781 946	CpG： 220	RTL1和MEG8基因上	高
chr21： 65 807 941-65 808 170	CpG： 22	MEG8基因间上	高
chr21： 65 961 272-65 961 510	CpG： 22	MEG9基因下游	低
chr21： 66 490 150-66 490 492	CpG： 27	DIO3基因上游	低
chr21： 6 692 442-66 498 353	CpG： 525	DIO3基因上	低

染色体上位置

The position on chromosome

CpG岛

CpG islands

基因上位置

The position on genes

甲基化状态

Methylation status

chr21： 65 608 823-65 609 056

CpG： 19

DLK1基因上游

高

chr21： 65 625 869-65 627 121

CpG： 110

DLK1基因5′端

低

chr21： 65 669 308-65 669 954

CpG： 46

DLK1和MEG3基因间

高

chr21： 65 670 829-65 671 044

CpG： 19

DLK1和MEG3基因间

高

chr21： 65 701 370-65 701 641

CpG： 23

DLK1和MEG3 基因间

高

chr21： 65 778 434-65 781 946

CpG： 220

RTL1和MEG8基因上

高

chr21： 65 807 941-65 808 170

CpG： 22

MEG8基因间上

高

chr21： 65 961 272-65 961 510

CpG： 22

MEG9基因下游

低

chr21： 66 490 150-66 490 492

CpG： 27

DIO3基因上游

低

chr21： 6 692 442-66 498 353

CpG： 525

DIO3基因上

低