畜牧兽医学报

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NF-κB	F R	AACCAGCCAGAAATCGCTGA TGCAGACATGTGTGGCCATT	61
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白藜芦醇缓解热应激诱导猪睾丸支持细胞氧化应激的作用

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张莉 , 冉茂良

畜牧兽医学报 | 生物技术与繁殖 2026,57(2): 780-788

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畜牧兽医学报 |生物技术与繁殖 2026 , 57 (2) : 780 -788

白藜芦醇缓解热应激诱导猪睾丸支持细胞氧化应激的作用

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张莉，硕士，主要从事动物繁殖生理的研究，E-mail： derlily95@163.com

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张莉, 冉茂良

作者信息

湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128

通讯作者:

冉茂良，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail： ranmaoliang0903@126.com

作者简介:

张莉，硕士，主要从事动物繁殖生理的研究，E-mail： derlily95@163.com

The Effect of Resveratrol on Alleviating Heat Stress Induced Oxidative Stress in Porcine Sertoli Cells

Li ZHANG, Maoliang RAN

Affiliations

College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China

Corresponding Author:

RAN Maoliang， E-mail： ranmaoliang0903@126.com

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.018

文章导航

摘要

收起

旨在探讨热应激对猪睾丸支持细胞抗氧化功能的影响，并进一步明确白藜芦醇（RES）缓解氧化应激的作用及其潜在机理。本研究采用猪睾丸支持细胞原代培养体系，设置对照组（NC，34 ℃）、热应激组（HS，43 ℃ 30 min）和热应激+白藜芦醇组（HS+200 nmol·L^-1 RES），检测ROS水平、MDA和AGEs含量以及SOD和CAT活性，实时荧光定量PCR技术检测RAGE、NOX4和NF-κB基因的表达水平。结果表明，热应激组的猪睾丸支持细胞内ROS水平（P<0.05）、MDA含量（P<0.05）和AGEs含量（P<0.01）显著增加，同时SOD和CAT活性显著降低（P<0.01），表明热应激诱导了猪睾丸支持细胞发生氧化应激。采用200 nmol·L^-1 RES预处理后，猪睾丸支持细胞内ROS水平、MDA含量和AGEs含量显著降低（P<0.05），SOD和CAT活性得到恢复（P<0.05）。此外，RES显著下调了由热应激诱导的RAGE、NOX4和NF-κB基因表达水平（P<0.05）。热应激导致猪睾丸支持细胞氧化还原平衡失衡而诱导氧化应激，白藜芦醇通过抑制AGEs-RAGE/NOX4/NF-κB通路活性以缓解热应激诱导的氧化应激。本研究结果为利用白藜芦醇改善夏季公猪精液品质提供了理论支撑。

关键词

热应激 / 猪睾丸支持细胞 / 白藜芦醇 / 氧化应激

Abstract

收起

This study aimed to investigate the impact of heat stress on the antioxidant capacity of porcine sertoli cells and to further elucidate the protective role and underlying mechanism of resveratrol （RES） in alleviating oxidative stress. Porcine sertoli cells were isolated and cultured primarily. The cells were divided into 3 groups： control group （NC， 34 ℃）， heat stress group （HS， 43 ℃ for 30 min）， and heat stress+resveratrol group （HS+200 nmol·L^-1RES）. The levels of reactive oxygen species （ROS）， the content of malondialdehyde （MDA） and advanced glycation end products （AGEs）， as well as the activities of superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） were measured. The expression levels of RAGE， NOX4， and NF-κB genes were determined using real-time fluorescence quantitative PCR. Compared with the control group， heat stress significantly increased ROS level （P<0.05）， MDA content （P<0.05）， and AGEs content （P<0.01）， whereas the activities of SOD and CAT were significantly decreased （P<0.01）， indicating that heat stress successfully induced oxidative stress in porcine sertoli cells. Pretreatment with 200 nmol·L^-1 RES significantly attenuated the heat stress-induced elevations in ROS， MDA， and AGEs levels （P<0.05）， and restored the activities of SOD and CAT （P<0.05）. Moreover， RES significantly downregulated the expression levels of RAGE， NOX4， and NF-κB genes induced by heat stress （P<0.05）. Heat stress disrupts redox homeostasis in porcine sertoli cells， leading to oxidative stress. Resveratrol alleviates this heat stress-induced oxidative stress by suppressing the AGEs-RAGE/NOX4/NF-κB signaling pathway. The findings provide a theoretical basis for utilizing resveratrol to improve boar semen quality during summer.

Key words

heat stress / porcine sertoli cells / resveratrol / oxidative stress

引用本文

张莉, 冉茂良. 白藜芦醇缓解热应激诱导猪睾丸支持细胞氧化应激的作用. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 780 -788 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.018

Li ZHANG, Maoliang RAN. The Effect of Resveratrol on Alleviating Heat Stress Induced Oxidative Stress in Porcine Sertoli Cells[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 780 -788 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.018

正文

收起

环境高温是影响畜牧生产的重要不利因素之一，对畜禽机体健康和生殖机能均有重要影响^［1⁃2］。睾丸支持细胞作为生精小管内唯一的体细胞，是精子生成过程中的“保姆细胞”，其完整的结构、正常的功能和足够的数量是保障成年雄性动物精子生成正常有序进行的重要前提^［3］。正常情况下ROS在细胞内处于动态平衡状态，细胞在外源或内源条件的刺激下平衡被破坏，则抗氧化系统无法完全清除过量的ROS而使其积累，进而破坏脂质、蛋白质等物质，导致细胞损伤，甚至对动物机体造成严重损伤^［4］。已有研究证实，热应激会引起公畜精子生成过程氧化应激，例如对猪睾丸支持细胞热处理发现，热应激引起细胞氧化损伤，ROS阳性细胞比例增多，MDA含量明显升高且抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活性显著降低^［5］。

白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种天然多酚二苯乙烯类化合物，被认为是一种天然抗氧化剂，能减少活性氧积累，清除超氧自由基，抑制脂质过氧化，调节抗氧化辅助因子和酶的表达^［6⁃7］。研究表明，在精液冷冻保护液中添加RES可以有效提升公羊^［8］、水牛^［9］和公鸡^［10］精液的抗氧化能力。同时，本课题组前期研究表明在公猪饲粮中添加200 mg·kg^-1 RES，可以有效改善夏季（7~8月份）精液和血清抗氧化能力（T-AOC、CAT和GSH-Px活性），提高精子密度和活力，且对血清生化指标无显著影响，但是其潜在的细胞分子机理尚不清楚^［11］。因此，本研究通过建立43 ℃体外热处理猪睾丸支持细胞模型，探究RES对热应激诱导的猪睾丸支持细胞氧化应激的干预作用及其潜在分子机理。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

1.1.1　试验动物

6头21日龄的健康沙子岭公猪由湘潭市沙子岭猪资源场提供，取睾丸组织用于分离猪睾丸支持细胞。

1.1.2　试剂

DMEM-F12培养基（Gibco），DPBS（Gibco），胎牛血清（Gibco），双抗（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），二甲基亚砜（DMSO，MeilunBio），反转录试剂盒（ABM），RNA提取试剂盒（AG），BCA蛋白定量试剂盒（雅酶），活性氧含量检测试剂盒（碧云天），过氧化氢酶检测试剂盒（南京建成），超氧化歧化酶检测试剂盒（南京建成），丙二醛检测试剂盒（索莱宝），晚期糖基化终末产物（AGEs）ELISA试剂盒（江莱），引物（生工生物），细胞计数板（Logos Biosystems），白藜芦醇（纯度98%，宝鸡科斯麦公司）。

1.1.3　主要仪器

PCR仪（APPlied Biosystems），CFX Connect 实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD），多功能酶标仪（Thermo Scientific），Nano Drop NC 2000 （Thermo Scientific），CO₂ 恒温细胞培养箱（Thermo），倒置显微镜（ZEISS），荧光倒置显微镜（ZEISS）。

1.1.4　白藜芦醇配置

称取0.011 412 g RES溶于1 mL DMSO，浓度为50 μmol·L^-1；然后加入细胞培养液，终浓度为200 nmol·L^-1。

1.2　方法

1.2.1　细胞分离

参考课题组前期研究的方法分离细胞^［12］，并进行免疫荧光和RT-PCR鉴定。

1.2.2　细胞培养

用10%胎牛血清、2%双抗和88% DMEM/F12培养基配制成完全培养基，培养在34 ℃、5%CO₂的培养箱中，根据细胞生长情况及时换液和传代。

1.2.3　细胞分组与处理

基于前人试验确定热应激温度及时间，设置对照组（34 ℃）和热应激组（43 ℃ 30 min）培养猪睾丸支持细胞^{［13⁃15］}，设置对照组（NC，34 ℃）、热应激组（HS，43 ℃ 30 min），热应激组+白藜芦醇（HS+RES，待细胞密度在50%左右，先加入RES预处理24 h，置于43 ℃ 30 min）。本研究参照课题组前期在猪睾丸间质细胞中研究结果^［11］，RES的终浓度为200 nmol·L^-1。

1.2.4　活性氧（ROS）含量检测

采用原位装载探针法，无血清培养液清洗细胞3次，加入终浓度为10 µmol·L^-1的DCFH-DA工作液，确保充分覆盖细胞，34 ℃避光孵育40 min，并轻晃培养板以促进探针与细胞的充分接触；随后，使用无血清培养液洗涤3次以去除多余DCFH-DA，加入1 mL无血清培养液后采用倒置荧光显微镜观察并采集图片。采用Image J计算最终结果。

1.2.5　丙二醛（MDA）含量检测

胰酶消化细胞，1.8 mL全培终止消化，重悬细胞，取10 µL悬液加入细胞计数板后再次离心弃上清，进行细胞计数，根据试剂盒说明书处理，酶标仪测定532 nm和600 nm的吸光度。

1.2.6　超氧化物歧化酶（SOD）活性检测

胰酶消化，取1.5 mL全培终止消化，细胞计数；1 000 r·min^-1离心10 min弃上清；加入1 mL DPBS轻轻吹打，1 000 r·min^-1离心10 min，弃上清。每100万细胞加入0.3~0.5 mL DPBS，超声破碎细胞，按照试剂盒说明书加样并轻微震荡混匀，37 ℃孵育20 min，酶标仪测定450 nm的吸光度。

1.2.7　过氧化氢酶（CAT）活性检测

样本前处理与SOD活性检测一样。按照试剂盒说明书，加样于不同管中，每管取200 µL的反应液加至96孔板，酶标仪测定405 nm的吸光度。

1.2.8　AGEs含量检测

细胞培养基1 000×g下离心20 min，取上清液；细胞胰酶消化，1 000 r·min^-1离心5 min后收集细胞，预冷的DPBS清洗3次，每100万个细胞中加入150 µL DPBS重悬，同时加入蛋白酶抑制剂，采用超声波破碎仪破碎细胞，之后于4 ℃，1 500 r·min^-1离心10 min，取上清检测。参照ELISA试剂盒说明书的要求处理后，在450 nm波长处测定OD值，计算AGEs浓度。

1.2.9　总RNA提取

培养皿中加入AG RNAex pro reagent，根据试剂盒说明书提取总RNA，溶解后的总RNA测量浓度并检测A_{260 nm}/A_{280 nm}和A_{260 nm}/A_{230 nm}值是否符合要求，-80 °C保存。

1.2.10　实时荧光定量PCR

采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，设计并合成RAGE、NOX4、NF-κB和β-actin基因的引物（表1）。构建12.5 µL实时荧光定量PCR反应体系，包括6.25 µL SYBR Premix Ex Taq、0.5 µL上游引物、0.5 µL下游引物、1 µL cDNA模板和4.25 µL ddH₂O。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；55~95 ℃ 30 s，每0.5 ℃进行1次荧光监测，绘制熔解曲线。β-actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCt公式计算相对表达水平。

1.3　数据统计与分析

每个试验至少进行3次生物学重复。采用spss 29软件进行数据统计分析，采用独立样本t检验分析两组间差异，单因素方差分析和邓肯检验进行多重比较。数据以“平均值±标准差”表示，*P<0.05表示差异显著，**P<0.01表示差异极显著，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2　结果

收起

2.1　热应激对猪睾丸支持细胞内氧化指标的影响

为明确热应激对猪睾丸支持细胞氧化还原平衡的影响，设置对照组（34 ℃）和热应激组（43 ℃ 30 min），检测细胞氧化指标。细胞内ROS荧光信号见图1A，ROS的相对荧光强度结果如图1B所示，热应激导致ROS显著积累（P <0.05）。采用MDA检测试剂盒检测发现热应激可显著提高细胞MDA含量（P<0.05）（图1C）。采用试剂盒检测猪睾丸支持细胞内CAT和SOD活性，热应激显著降低CAT和SOD活性（P<0.01）（图1D和1E）。细胞AGEs含量检测结果表明，热应激后细胞AGEs含量极显著增加（P<0.01）（图1F）。上述结果表明，热应激导致猪睾丸支持细胞氧化还原平衡失衡而诱导氧化应激。

2.2　RES对热应激诱导的猪睾丸支持细胞氧化应激的作用

RES对热应激诱导猪睾丸支持氧化应激的作用如图2所示。ROS检测结果显示，热应激后ROS水平显著上升（P<0.05），而添加RES后ROS水平恢复至对照组水平（P<0.05）（图2A和2B）。MDA检测结果显示，热应激后MDA水平显著上升（P<0.05），添加RES后MDA水平显著下降（P<0.05）（图2C）。CAT和SOD检测结果显示，热应激后CAT和SOD活性显著下降（P<0.05），添加RES后CAT和SOD水平显著上升（P<0.05）（图2D和2E）。

2.3　RES对热应激诱导猪睾丸支持细胞AGEs含量的影响

RES对热应激诱导的猪睾丸支持细胞AGEs含量的影响如图3所示。细胞AGEs含量检测结果表明，热应激后猪睾丸支持细胞AGEs含量极显著增加（P<0.05），而添加RES后AGEs含量恢复至对照组水平（P<0.05）。

2.4　RES对热应激后猪睾丸支持细胞RAGE、NOX4和NF-κB基因表达水平的影响

RES对热应激后猪睾丸支持细胞RAGE、NOX4和NF-κB基因表达水平的影响如图4所示。结果表明，热应激后RAGE基因表达水平显著上升（P<0.05），而添加RES后RAGE基因表达水平显著下降（图4A）。热应激后NOX4基因表达水平显著上升（P<0.05），而添加RES后NOX4基因表达水平显著下降（P<0.05）（图4B）。热应激后NF-κB基因表达水平显著上升（P<0.05），而添加RES后NF-κB基因表达水平恢复至对照组水平（P<0.05）（图4C）。

3　讨论

收起

夏季高温会导致公猪单次采精量下降，精子密度和活力降低，畸形率上升，进而导致有效精子数降低^{［16⁃17］}，还会影响CAT和MDA等氧化指标^［18］。热应激可诱导猪睾丸支持细胞活性氧过量产生，抑制抗氧化酶CAT和SOD的活性，线粒体膜电位降低，阻断细胞周期转变，诱导细胞凋亡^{［19⁃20］}。高温会使间质细胞凋亡、ROS增加和睾酮减少^［21］。本试验结果表明，热应激处理猪睾丸支持细胞后，细胞ROS和MDA水平升高，SOD和CAT活性降低，破坏了细胞的氧化应激平衡而导致氧化应激。

RES具有电子供体、自由基清除剂和抗氧化剂的作用，对睾丸和附睾的氧化应激具有良好的保护作用^{［22⁃23］}。RES可抑制长时间热暴露的有害影响，恢复正常生理功能，通过降低氧化和亚硝化应激标志物，提升SOD和CAT活性，增强睾丸组织抗氧化防御系统^［24］。精子在低温保存过程中产生了活性氧，而RES可以激活AMPK的磷酸化，减少活性氧的产生，增强精子抗氧化防御系统（如SOD和CAT）的活性^［25］。RES通过Nrf-2转录调控使CAT等抗氧化酶恢复^［26］。RES可有效下调NF-κB的激活，从而降低糖尿病的氧化应激。此外，NF-κB活性降低下调RAGE基因表达以及AGE-RAGE参与导致NF-κB-RAGE信号传导的良性循环中断^{［27⁃29］}。本试验结果表明，RES缓解了热应激诱导的氧化应激反应，HS+RES组显著降低了ROS和MDA的水平，显著提升了SOD和CAT的活性。

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products，AGEs）是一种多相、复杂的化合物，由不同的机制和不同的前体形成外源性或内源性AGEs^［30］。AGEs与许多导致炎症状态和疾病的信号通路有关，报道内源性和外源性AGEs试验数据的出版物数量正在迅速增加，表明它们参与许多生理和病理过程的证据越来越多^{［31⁃32］}。AGEs已被证明通过与其细胞表面受体RAGE（receptor of AGEs，RAGE）的相互作用引起氧化应激和炎症反应^{［33⁃35］}。AGEs与RAGE的结合通常会激活下游的NF-κB和其他转录因子^［36］。有研究表明，RAGE介导的NF-κB激活在发炎组织区域高于非发炎肠道组织区域，RAGE表达的增加可能会增强AGEs与RAGE的结合，从而加速ROS的局部产生^［37］。研究发现，ROS水平升高会导致蛋白质、脂质和核酸的氧化增加，而晚期糖基化终产物水平的增加又反馈支持活性氧和活性氮的形成，进一步诱导AGEs形成^［38］。本研究发现，43 ℃处理30 min使猪睾丸支持细胞内AGEs含量显著增加，而加入RES会显著降低AGEs含量。有研究表明AGEs通过氧化应激的产生上调RAGE表达，从而在AGEs和RAGE诱导的氧化应激之间形成一个正反馈回路^{［39⁃40］}。NF-κB广泛分布于细胞质中，在调节氧化应激和炎症中起重要作用。NOX4可激活NF-κB通路，进而上调炎症因子和氧化应激^{［41⁃42］}。有研究表明，木耳多糖在体外抑制AGE的形成，可以通过调节RAGE/TGF-β/NOX4通路减轻糖基化并改善细胞纤维化^［43］。本试验检测RAGE、NOX4和NF-κB基因的表达水平发现，热应激使AGEs通过与RAGE结合，激活下游的NOX4和NF-κB基因转录，加剧细胞损伤。这种AGEs-RAGE轴的异常激活是热应激诱导猪睾丸支持细胞氧化应激的新机理，然而RES可以通过抑制其活性以缓解热应激诱导的氧化应激。

此外，有研究报道，热应激可诱导动物生殖器官等组织氧化应激，支持细胞是睾丸组织中的重要体细胞，支持细胞的数量、结构及其功能是影响精子发生的重要因素^［44］。RES对雄性生殖有益处已有研究证明，RES对大鼠热应激诱导的睾丸损伤有保护作用，其抗氧化、抗炎、抗凋亡和雄激素特性可以有效抵消睾丸高热的退化影响^［24］。本研究未进行动物试验，但本试验与上述结果一致，热应激处理猪睾丸支持细胞产生氧化应激，RES预处理后能够缓解热应激导致的氧化应激及其对精子生成的不利影响。

4　结论

收起

热应激通过诱导ROS、MDA和AGEs积累而导致猪睾丸支持细胞氧化还原平衡失衡，进而导致氧化应激。RES通过抑制AGEs-RAGE/NOX4/NF-κB通路活性而缓解热应激诱导的氧化应激。

基金

收起

国家自然科学基金(32302717)
湖南省生猪产业技术体系(HARS-05)
湖南省自然科学基金面上项目(2023JJ30296)

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.018

接收时间：2025-06-18
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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收稿日期：2025-06-18

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国家自然科学基金(32302717)

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作者信息

湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128

通讯作者:

冉茂良，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail： ranmaoliang0903@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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