畜牧兽医学报

名称 Name	序列（5′→3′） Sequence
pmirGLO-circPRKAA2-WT	TTTGATTATCTAACATGATGTCAGATGGTGAATTTCTGCGAACTAGCTGCGG-ATCCCCAAATTATGCAGCACCTGAAGTCATCTCAGGCAGCTGTATGCAGGTC-CTGAAGTGGATATCTGGAGCTGCGGTGTTATTTTGTATGCTCTTCTTTGTGG- CACCCTCCCATTTGATGATGAGCATGTGCCTACGCTGTTTAAGAAGATCC
pmirGLO-circPRKAA2-MUT	TTTGATTATCTAACATGATGTCAGATGGTGAATTTCTGCGAACTAGCTGCGG-ATCCCCAAATTATGCAGCACCTGAAGTCATCTCAGGCAGCTGTATGCTCCAG-GAGAAGTGGATATCTGGAGCTGCGGTGTTATTTTGTATGCTCTTCTTTGTG-GCACCCTCCCATTTGATGATGAGCATGTGCCTACGCTGTTTAAGAAGATCC
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基因 Gene	登录号 Accession number	引物序列（5′→3′） Primer sequence	产物长度/bp Products length
GAPDH	NM_001034034.2	F： TCGGAGTGAACGGATTCGG	192
R： TGATGACGAGCTTCCCGTTC
E2F2	XM_024982675.2	F： AGTGAGTCTGAGGATGGGGTTCTG	121
R： CCTTCTTGCGGATGAGCTGGATG
NR3C1	NM_001206634.1	F： AGTTCTCCTCCATCCAGTTCCTCAG	149
R： TGCTGTCCTTCCACTGCTCTTTTG
ELOVL6	NM_001102155.1	F： GCAAAGCACCCGAACTAGGAGATC	104
R： CCAGGAGTACAGAAGCACAGTGAG
SLC27A1	NM_001033625.2	F： CAGATGTGGCTGTGTATGGAGTGG	113
R： CAGTTCCTCGTACAGTGCGTTGG
KAT5	NM_001192066.2	F： CGGAACCAGGACAACGAAGATGAG	124
R： TCACCCATTCATCCAGGCGTTTG
PIK3R6	XM_024980100.2	F： CAGCCAACATCCAGATCCAGAGC	103
R： GCAACCTCGAACCTGACCACATC
MFGE8	NM_176610.1	F： GCGAGTCACGGGCATCATCAC	104
R： CAGTCCAGGTCACACCATCATCAC
SYNE1	XM_024997066.2	F： CTTCTGCTGACGAACTGGACACC	140
R： GGACCTGCTATGTGGACTGTTGAC
TMEM43	NM_001102480.1	F： GGGCAGGTGAAGACGGAGAGG	133
		R： GGCTGTTGCGGTGAACGACTC
ADCY5	NM_001192069.1	F： TGTCTGGTCTAACGATGTC	164
		R： CGATACTGTGCTCCTTGA
U6		F： CTCGCTTCGGCAGCACA
		R： AACGCTTCACGAATTTGCGT
circPRKAA2		F： GTTCTGTTGCTACTCTCCT
		R： TCACCTGGTATCTTATGTC
miR-22-3p		F： ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG
		RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACCAGTTC
Universal reverse primer		ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG

基因 Gene	登录号 Accession number	引物序列（5′→3′） Primer sequence	产物长度/bp Products length
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Universal reverse primer		ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG

circPRKAA2通过调控miR-22-3p/SLC27A1轴对奶牛乳脂合成的影响

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王川川 ¹^,² , 陈亚飞 ¹^,² , 田佳 ³ , 冯小芳 ⁴ , 佟丽佳 ¹^,² , 王华 ¹^,² , 雪林 ¹^,² , 顾亚玲 ¹^,² , 张娟 ¹^,²

畜牧兽医学报 | 遗传育种 2026,57(2): 740-752

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畜牧兽医学报 |遗传育种 2026 , 57 (2) : 740 -752

circPRKAA2通过调控miR-22-3p/SLC27A1轴对奶牛乳脂合成的影响

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王川川¹^,², 陈亚飞¹^,², 田佳³, 冯小芳⁴, 佟丽佳¹^,², 王华¹^,², 雪林¹^,², 顾亚玲¹^,², 张娟¹^,²

作者信息

^1.宁夏大学动物科技学院，银川 750021

^2.宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 750021

^3.宁夏回族自治区畜牧工作站，银川 750021

^4.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030

通讯作者:

张娟，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail： zhangjuannxy@nxu.edu.cn

作者简介:

王川川，博士生，主要从事动物遗传育种研究，E-mail： abc2667234769@163.com

Effect of circPRKAA2 on Milk Fat Synthesis in Dairy Cows via the miR-22-3p/SLC27A1 Axis

Chuanchuan WANG¹^,², Yafei CHEN¹^,², Jia TIAN³, Xiaofang FENG⁴, Lijia TONG¹^,², Hua WANG¹^,², Lin XUE¹^,², Yaling GU¹^,², Juan ZHANG¹^,²

Affiliations

^1.College of Animal Science and Technology，Ningxia University，Yinchuan 750021，China

^2.Ningxia Hui Autonomous Region Key Laboratory of Molecular Cell Breeding，Yinchuan 750021，China

^3.Ningxia Hui Autonomous Region Animal Husbandry Workstation，Yinchuan 750021，China

^4.College of Life Sciences and Engineering，Northwest Minzu University，Lanzhou 730030，China

Corresponding Author:

ZHANG Juan， E-mail： zhangjuannxy@nxu.edu.cn

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.015

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摘要

收起

旨在通过对影响乳脂合成相关的DE-circ RNAs进行深入分析，探究其构建的分子网络对奶牛乳脂合成的影响。本研究利用前期构建的高、低乳脂率荷斯坦奶牛circRNA的文库和转录组测序数据，筛选并鉴定出的与乳脂合成相关的DE-circ RNAs（circPRKAA2），进一步使用Targetscan和miRanda软件预测其ceRNA调控网络，并利用实时荧光定量、RNA pull down和双荧光素酶报告试验等分子实验技术进行靶向关系验证，结合油红O和BODIPY染色探索靶miRNA对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）脂滴分泌的影响。结果表明，成功预测并验证了ceRNA（circPRKAA2/miR-22-3p/SLC27A1）网络的调控关系，预测得到9个miRNA及10个候选mRNA，验证了miR-22-3p为其关键枢纽，并探明了circPRKAA2和miR-22-3p主要分布于BMECs的细胞质中。circPRKAA2在BMECs内参与乳脂合成的过程中对miR-22-3p进行负调控。miR-22-3p抑制BMECs中脂滴的分泌、甘油三酯和胆固醇的生成，并对SLC27A1进行负调控。综上所述，本研究分析验证了circPRKAA2/miR-22-3p/SLC27A1的靶向关系及对乳脂合成的调控作用，以期为改善牛奶品质提供新的见解。

关键词

荷斯坦奶牛 / SLC27A1 / miR-22-3p / circPRKAA2 / 乳脂

Abstract

收起

The aim of this study was to explore the impact of molecular networks constructed by DE-circRNAs related to milk fat synthesis on milk fat synthesis in dairy cows through in-depth analysis. In this study， we used the circRNA library and transcriptome sequencing data of Holstein dairy cows with high and low milk fat percentage constructed previously to screen and identify DE-circ RNAs（circPRKAA2） related to milk fat synthesis， and further predicted their ceRNA regulatory network using Targetscan and miRanda software. Real-time fluorescence quantitative PCR， RNA pull down assay and dual luciferase reporter assay were used to verify the targeting relationship. Oil red O and BODIPY staining were used to investigate the effect of target miRNA on lipid droplet secretion in BMECs. The results indicated that the regulatory relationship of the ceRNA （circPRKAA2/miR-22-3p/SLC27A1） network was successfully predicted and verified， and 9 miRNAs and 10 candidate mRNAs were predicted， and it was clarified that circPRKAA2 and miR-22-3p were mainly distributed in the cytoplasm of BMECs. circPRKAA2 negatively regulated miR-22-3p during the process of milk fat synthesis in BMECs. miR-22-3p inhibited the secretion of lipid droplets， the production of triglycerides and cholesterol in BMECs， and negatively regulated SLC27A1. In conclusion， this study analyzed and verified the targeting relationship of circPRKAA2/miR-22-3p/SLC27A1 and its regulatory effect on milk fat synthesis， with the hope of providing new insights for improving milk quality.

Key words

Holstein cow / SLC27A1 / miR-22-3p / circPRKAA2 / milk fat

引用本文

王川川, 陈亚飞, 田佳, 冯小芳, 佟丽佳, 王华, 雪林, 顾亚玲, 张娟. circPRKAA2通过调控miR-22-3p/SLC27A1轴对奶牛乳脂合成的影响. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 740 -752 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.015

Chuanchuan WANG, Yafei CHEN, Jia TIAN, Xiaofang FENG, Lijia TONG, Hua WANG, Lin XUE, Yaling GU, Juan ZHANG. Effect of circPRKAA2 on Milk Fat Synthesis in Dairy Cows via the miR-22-3p/SLC27A1 Axis[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 740 -752 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.015

正文

收起

乳脂是一种高质量的天然脂肪，不仅是影响牛奶品质的关键因素，也是反刍动物育种的主要目标性状^［1］。牛奶中的乳脂富含各类有益脂肪酸，并主要以乳脂球（milk fat globule，MFG）形式存在，而包裹在乳脂球外的乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）是牛奶中最重要的生物活性成分之一^［2-3］，在机体免疫^［3-4］和新陈代谢^［5］等方面发挥重要作用，而低乳脂率意味着牛奶中的MFG和MFGM含量较少，这也会影响消费者对乳制品的消费。

乳脂的调控涉及多个基因、网络调控和信号转导^［6］。有研究表明，circRNA通过与竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络中的miRNA间接作用于乳脂合成相关基因，从而对转录产生积极影响^［6］。circRNA也可以调节乳腺上皮细胞的增殖、分化和凋亡等重要过程，也被认为是调控脂肪酸合成的重要转录调节因子^［7］。在山羊乳腺组织中，circRNA8220海绵吸附miR-8516增加糖蛋白激素水平，激活Ras/MEK/ERK通路，从而促进乳腺上皮细胞的增殖并抑制细胞凋亡，也可以通过βCTC2上调STC2激活PI3K/AKT/mTOR通路并增强β-酪蛋白和甘油三酯的合成^［8］。Ding等^［9］通过全转录组测序，发现并确定了与猪肌内脂肪生成有关的基因，构建了在猪肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）沉积调控中发挥关键作用的ceRNA调控网络。Wu等^［10］研究发现，circPPARγ通过海绵miR-92a-3p调节成脂分化。Liu等^［11］研究发现，circ-016910海绵吸附miR-574-5p通过MAPK和PI3K/ KT-mTOR 信号通路调控并促进山羊乳腺上皮细胞β-酪蛋白和甘油三酯的分泌，同时对山羊乳腺上皮细胞具有增殖和抗凋亡的作用。

miRNA是一类内源性非编码RNA^［12］，通过碱基互补配对来控制靶标的表达，并被认为在转录后进行调节靶标^［13］。近年来，大多研究发现miRNA都调节关键的细胞过程，包括增殖、分化和凋亡等^［14-15］。牛奶的产量在很大程度上取决于上皮细胞的数量及其分泌活性。因此，miRNA对乳腺上皮细胞的影响非常重要。研究表明，LATS2的另一个上游调节因子是miR-497，它能抑制牛乳腺上皮细胞中甘油三酯和不饱和脂肪酸的产生^［16］。根据Chen等^［17］的研究，将miR-16a模拟物引入牛乳腺上皮细胞，能够通过靶向LATS1破坏脂肪代谢。然而，目前需要全面鉴定参与乳脂合成的关键circRNA和miRNA，为揭示荷斯坦奶牛乳脂作用的调控机制奠定基础。

基于此，本研究利用前期构建的高、低乳脂率荷斯坦奶牛circRNA的文库和转录组测序数据，筛选并鉴定出的与乳脂合成相关的DE-circ RNAs（circPRKAA2），预测ceRNA调控网络，并利用分子试验技术进行靶向关系验证，探索靶miRNA对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）脂滴分泌的影响，借此揭示circPRKAA2对荷斯坦奶牛乳脂的作用调控机制，从而为提高荷斯坦奶牛乳脂率的研究提供理论基础。

1　材料与方法

收起

1.1　预测circPRKAA2靶向的miRNA及其靶基因预测

本研究前期构建了高、低乳脂率荷斯坦奶牛circRNAs的文库，经过转录组测序筛选并鉴定出了与乳脂合成相关的DE-circRNAs（circPRKAA2），并已进行了circPRKAA2真实性验证^{［18⁃19］}。进一步通过Targetscan和miRanda预测circRNA的靶向miRNAs，以Targetscan软件中的Context+和miranda软件中Free Energy值为标准，以Context+≤-0.20和Free Energy≤-20为标准筛选高分靶miRNAs。接着通过Targetscan和miRanda预测miR-22-3p的靶基因，分别以Context+≤-0.30和Free Energy≤-30为标准筛选高分靶基因，筛选评分前10个与乳脂合成相关的靶基因。

1.2　细胞的培养

BMECs来自课题组前期分离、培养并冻存。本研究在20%的完全培养基中进行培养，主要包括DMEM/F12（BI，Jerusalem，以色列）、20%胎牛血清（Gibco，美国）和1%青霉素/链霉素（索莱宝，北京）。诱导培养基在20%完全培养基的基础上添加5 µg·mL^-1胰岛素（MCE，美国），5 µg·mL^-1氢化可的松（MCE，美国）和20 ng·mL^-1催乳素（ProSpec，以色列）。HEK-293T细胞来自课题组前期购买，其在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的高糖DMEM（Gibco，美国）中培养。细胞在37 ℃、5% CO₂及湿度适宜的培养箱中进行培养。每48 h更换一次培养基。根据试剂说明，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）对质粒进行转染，48 h后收集细胞用于进一步分析，每次处理采用3个生物学重复。

1.3　载体构建与细胞转染

构建双荧光素酶报告所需circPRKAA2的野生型和突变型载体，miR-22-3p的模拟物，circPRKAA2的野生型和突变型载体以及其他miRNA模拟物均交由西安擎科生物科技有限公司合成（表1）。将HEK-293 T复苏并稳定传至3~4代后接种至培养板，当细胞汇合度达到70%~80%时，将circPRKAA2的野生型和突变型载体分别与miRNA模拟物（miR-22-3p mimic：AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG；miR-22-3p inhibitor：CAGUUCUUCAACUGGCAGCUU）共转染，转染48 h后，进行双荧光素酶报告试验（Promega，美国）。

1.4　RNA的提取及实时荧光定量检测

当培养的BMECs融合度达到90%以上时，使用Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit试剂盒（NORGREN，加拿大）提取BMECs的细胞质和细胞核RNA。以U6为细胞核的内参，GAPDH为细胞质的内参，接着进行RT-qPCR检测。使用Trizol提取细胞中的总RNA，利用逆转录试剂盒（TaKaRa，中国）合成cDNA。miRNA采用茎环法设计逆转录和特异性引物，mRNA使用Primer Premier 6设计。以U6和GAPDH分别作为miRNA和mRNA的内参，使用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒（ABclonal，中国）进行定量检测。利用2^-ΔΔCt法对基因的相对表达水平进行分析，qPCR引物的详细信息见表2。qRT-PCR反应体系：ddH₂O 8 µL，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各0.5 µL。qRT-PCR反应程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，退火30 s，60 ℃延伸5 s，40个循环。

1.5　RNA pull down和双荧光素酶报告试验

设计一种生物素化探针特异性识别circPRKAA2，Lacz探针用作对照，收集4×10⁷个乳腺上皮细胞，用冰冷的PBS洗涤，在裂解缓冲液中裂解处理。将细胞提取物与生物素化探针混合，并将洗涤好的磁珠添加至结合反应中杂交，将生物素偶联的RNA复合物拉下来，并用裂解缓冲液洗涤磁珠，并纯化提取RNA混合物，进一步通过RT-qPCR进行分析。合成RNA pull down试验所需circPRKAA2的生物素探针（circPRKAA2 probe sequence：AATCTGTTGGAGTGCTGATCACC- TGGTATCTTATGTCTTTGATAGTTGCTCG-TTTCAG）和lacz probe探针（lacz probe sequence：TGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTC-GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGAT- GT），通过RT-qRCR检测下拉的miR-22-3p表达水平。将293T细胞接种于12孔板，当细胞密度达到70%~80%时，转染48 h后用PBS清洗细胞，加入200 µL细胞裂解液，室温条件下置于摇床200 r·min^-1下轻缓摇动培养板15 min。使用离心机3 000 r·min^-1离心30 s后，在96孔板中加入20 µL细胞裂解液，再将50 μL LAR II加入混匀，使用酶标仪检测萤火虫荧光素酶的活性，记录为X值。最后每孔加入50 µL Stop&Glo，检测海肾荧光素酶的活性，记录为Y值，计算X/Y的比值即Luc值。

1.6　BODIPY染色

细胞转染48 h后，用PBS清洗细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，弃去固定液并清洗后，每孔细胞添加800 µL的BODIPY（5 µmoL）工作液（Thermo Fisher Scientific，美国），室温避光染色30 min后弃去染色液，并用PBS清洗3次，用DAPI染核15 min，清洗后于荧光显微镜下进行成像观察，并拍照记录。

1.7　油红O染色

油红O试剂购自索莱宝（索莱宝，中国），将转染后的细胞用PBS清洗两次，加入固定液固定30 min，弃去后用60%异丙醇浸润5 min，使用ORO Stain染色15 min后弃去加入清洗。加入苏木素染色液，复染细胞核3 min，弃去染液并水洗3次。加入ORO Buffer 1 min弃去，在显微镜下拍照。

1.8　甘油三酯和胆固醇含量测定

选择生长状况良好的BMECs接种在6孔细胞培养板中进行培养，待单层细胞融合度达70%时进行转染，每个样本3个生物学重复。48 h后用PBS进行清洗，在1.5 mL离心管中使用裂解液对细胞沉淀进行裂解，离心收集上清液。取10 µL的上清液与工作液混合，用酶标仪在550 nm测定各孔的OD值。另取10 µL的上清液进行BCA蛋白浓度测定。最后，以每mg标准品蛋白浓度矫正甘油三酯或和胆固醇的含量（普利莱，中国）。

1.9　数据分析

利用SPSS开展单因素方差分析（ANOVA），并对各组间进行差异分析，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。采用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software， Inc.， La Jolla， CA，USA）进行作图。

2　结果

收起

2.1　ceRNA网络构建

对前期研究得到的与乳脂合成相关的差异circPRKAA2进行ceRNA调控网络预测^［20］。利用Targetscan和miRanda软件预测与circPRKAA2具有相互作用的miRNA（图1A）。再以Context+≤-0.20和FreeEnergy≤-20为标准筛选高分靶基因。最终构建了circPRKAA2-miRNA-mRNA互作调控网络（图1B）。结果表明，该网络中共有9个miRNA被预测。其中miR-22-3p被预测的靶基因主要有：KAT5、TRPM7、SYNE1、PIK3R6、TMEM43、ELOVL6、E2F2、NR3C1、SLC27A1和MFGE8。其中有与调控脂代谢相关基因ELOVL6、E2F2和SLC27A1。推测circPRKAA2-miR-22-3p-mRNA在乳脂合成中发挥重要的调控作用，并用于进一步的研究。

2.2　circPRKAA2的亚细胞定位

对circPRKAA2和miR-22-3p进行亚细胞定位，如图2所示，U6在细胞核中的表达量多于在细胞质中的表达量，占核质表达量的70%以上。而GAPDH、bta-miR-22-3p和circPRKAA2在细胞质中的表达量均高于在细胞核中的表达量，并分别超过占核质表达量的60%、95%和60%。鉴于circRNA主要在细胞质中富集，推测其可以作为高效的miRNA海绵，从而抑制miRNA的表达。

2.3　circPRKAA2海绵吸附miR-22-3p

本研究设计了特定生物素标记的circRNA探针和Lacz对照探针，首先验证了在BMECs中circPRKAA2探针的下拉效率。接着利用RT-qPCR检测circPRKAA2探针下拉海绵复合物中miR-22-3p的富集。结果发现，circPRKAA2探针能够极显著下拉miR-22-3p（P<0.01）（图3A和B）。进一步利用双荧光素酶报告试验确定circPRKAA2与miR-22-3p是否存在靶向结合关系，结果显示，miR-22-3p mimic和circPRKAA2-WT共转染组的双荧光素酶活性极显著低于NC和circPRKAA2-WT的共转染组（P<0.001），而miR-22-3p mimic和circPRKAA2-MUT、NC和circPRKAA2-MUT这两对共转染组的双荧光素酶活性基本一致（图3C和D）。表明circPRKAA2和miR-22-3p具有靶向结合关系。

2.4　miR-22-3p抑制甘油三酯和胆固醇的合成

合成miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor及NC转染BMECs 48 h后。通过qRT-PCR对其相对表达量进行检测。结果显示，miR-22-3p mimic的表达水平极显著高于NC mimic组（P<0.001），而miR-22-3p inhibitor表达极显著被抑制（P<0.001）（图4A和B）。表明通过转染miR-22-3p mimic、inhibitor可极显著影响miR-22-3p在BMECs中的表达水平（P<0.001）。甘油三酯在乳脂中的含量高达98%，通过测定转染后细胞内甘油三酯含量的变化来研究miR-22-3p对BMECs中甘油三酯的合成的影响。结果显示，转染miR-22-3p mimic的BMECs中甘油三酯的水平极显著降低（P<0.001），而转染miR-22-3p inhibitor后BMECs中甘油三酯的水平极显著升高（P<0.001）（图4C）。而miR-22-3p对胆固醇的影响和甘油三酯的变化趋势一致（图4D）。上述结果表明，miR-22-3p能够抑制甘油三酯和胆固醇的生成。

2.5　miR-22-3p抑制BMECs中脂滴的合成

为研究miR-22-3p在BMECs在脂质代谢中的作用，本研究将miR-22-3p的NC mimic、mimic、NC inhibitor 和inhibitor分别转染至BMECs中进行BODIPY和油红O检测。BODIPY结果表明，miR-22-3p mimic较于NC mimic 组抑制脂滴积累；与 NC inhibitor组相比，miR-22-3p inhibitor促进脂滴的合成与沉积（图5A）。油红O染色发现，miR-22-3p mimic抑制BMECs脂滴的生成，而miR-22-3p inhibitor促进BMECs脂滴的生成（图5B）。综上，miR-22-3p对BMECs中脂滴的积累具有抑制作用。

2.6　miR-22-3p靶基因的筛选

通过Targetscan和miRanda预测并选择了评分前10的与乳脂合成相关的miR-22-3p的高分候选靶基因做进一步的研究。将miR-22-3p mimic和其阴性对照（NC）分别转染到BMECs中，48 h后通过RT-qPCR检测这些靶基因的表达情况。结果显示（图6），转染miR-22-3p mimic后，KAT5、TRPM7、SYNE1、PIK3R6、TMEM43、ELOVL6、E2F2、NR3C1、SLC27A1和MFGE8这10个靶基因表达水平均极显著低于NC组（P<0.01）。转染miR-22-3p inhibitor后，TRPM7、ELOVL6和SLC27A1这3个基因表达水平均极显著高于NC组（P<0.01），而MFGE8表达水平与NC组差异不显著。

2.7　miR-22-3p与SLC27A1的靶向关系鉴定

选择SLC27A1并对其进行双荧光素酶报告试验，进一步验证miR-22-3p与SLC27A1之间的靶向关系。本研究构建了SLC27A1的野生型（pmirGLO-SLC27A1-3'UTR-WT）和突变型载体（pmirGLO-SLC27A1-3'UTR-MUT）。将其分别与miR-22-3p mimic/NC共转染到HEK-293T细胞中，36 h后检测荧光素酶的相对活性。结果表明，miR-22-3p mimic和SLC27A1-WT共转染组的双荧光素酶活性极显著低于NC和SLC27A1-WT的共转染组（P<0.01），而miR-22-3p mimic和SLC27A1-MUT、NC和SLC27A1-MUT这两对共转染组的双荧光素酶活性差异不显著（图7）。表明miR-22-3p与SLC27A1存在靶向关系。

3　讨论

收起

Targetscan和miRanda是预测mRNA或circRNA与miRNA靶向关系的两个常用工具。Targetscan是根据mRNA与miRNA的表达谱数据进行拟合，找到一些具有生物学意义的位点序列特征和相对保守性的打分模型^{［21， 22］}。miRanda是基于 RNA二级结构和自由能的动态规划算法^［23］。因此，本研究利用前期测序得到的与乳脂合成相关的circPRKAA2为基础，利用两者成功预测得到circPRKAA2的靶向miRNA（miR-22-3p），以及miR-22-3p的预测靶mRNA（KAT5、TRPM7、SYNE1、PIK3R6、TMEM43、ELOVL6、E2F2、NR3C1、SLC27A1和MFGE8）。这与Li等^［24］预测的miR-22-3p靶向ELOVL6在内的一些脂质代谢相关靶基因结果一致。以上信息提示，circPRKAA2可能通过ceRNA网络在泌乳方面发挥潜在的调控功能。

有研究表明circRNAs的亚细胞定位存在差异，且在不同亚细胞区室中的circRNA可以与不同的靶基因相互作用，以执行其不同的调节功能^［25］。大多研究表明，circRNA在细胞核中产生，主要在细胞质中富集，通过与细胞质中的 miRNA相互作用而发挥重要的调节作用^{［26⁃28］}，主要作用机制为circRNA作为miRNA的“海绵”通过与相应的miRNA竞争性结合从而进一步降低其对其靶标的抑制作用^{［29⁃32］}。研究发现，circEIF3J和circPAIP2在细胞核中与U1 snRNP结合，然后将RNA聚合酶II募集到亲本基因的启动子位点，从而增强circRNA及其同源mRNA的表达^［33］。circANRIL在细胞核中竞争性抑制pre-rRNA和PES1蛋白之间的相互作用，从而抑制rRNA的加工和成熟^［34］。本研究对circPRKAA2和miR-22-3p做了亚细胞定位的结果显示，U6在细胞核中高表达，GAPDH在细胞质中高表达。本研究将BMECs的细胞核与细胞质成功的分离开，且miR-22-3p和circPRKAA2在细胞质中的表达量均是多于在细胞核中的表达量，这表明二者主要存在于细胞质内参与调控奶牛的乳脂合成。

验证circRNA与miRNA互作关系最常规的方法是双荧光素酶基因报告试验，除此之外，RNA Pull down和AGO2 RIP也是筛选和验证circRNA-miRNA最经典的方法之一。Chen等^［35］利用RIP和RNA Pull down研究了circNTRK2与miR-140-3p结合的ceRNA调控机制。Zhang等^［36］使用同样的方法鉴定circNRIP1的下游miR-149-5p。Lu等^［37］也通过以上两种方法证明miR-1193是circSEC24A的直接靶标。本研究使用带有标记核酸探针作为诱饵来富集circPRKAA2的靶向结合物，直接捕获circPRKAA2与miR-22-3p靶向关系。也通过荧光素酶活性的高低来判断circPRKAA2与miR-22-3p的调控关系。最终通过RNA pull down和双荧光素酶报告双重验证了circPRKAA2与miR-22-3p的靶向关系，证明circPRKAA2对miR-22-3p进行负调控。

牛奶中的乳脂主要是BMECs分泌的脂滴，而脂滴在细胞中主要由甘油三酯和甾醇酯组成^{［38⁃39］}。因此，本研究检测了miR-22-3p对甘油三酯和胆固醇的生成的影响。结果发现，miR-22-3p会抑制甘油三酯和胆固醇的生成，同时也发现，miR-22-3p会抑制脂滴的生成。Deng等^［40］的研究发现miR-22-3p在鸡的多级卵泡中高表达，通过抑制PTEN激活PI3K/AKT/mTOR通路，促进鸡颗粒细胞增殖、类固醇生成和脂质代谢。miR-22-3p还通过影响ELOVL6基因的表达参与控制产蛋鸡肝脏脂质代谢^［41］。之后，对miR-22-3p过表达和干扰后，针对Targetscan和miRanda预测miR-22-3p的高分候选靶基因进行检测。结果发现，过表达miR-22-3p后，10个靶向基因表达水平均被下调。当对miR-22-3p干扰后，检测感兴趣的4个基因后，发现仅有TRPM7、ELOVL6和SLC27A1的表达水平被上调，进而挑选了最感兴趣的SLC27A1。最后，通过双荧光素酶报告验证miR-22-3p与SLC27A1的靶向调控关系，结果表明，miR-22-3p与SLC27A1具有靶向关系且对其进行负调控。研究表明，SLC27A1是一种进化上保守的蛋白质，能够参与细胞中长链脂肪酸的摄取，已被证明在脂肪酸代谢快的组织（心脏、骨骼肌和脂肪组织等）中表达^［41］。SLC27A1通过负调控CPT1A影响鸡脂质积累^［42］。在骨骼肌细胞中过表达SLC27A1会促进脂肪酸的氧化^［43］。推测SLC27A1对脂质生成起着重要的调控作用，在后续的研究中需要进一步去验证。

综上，本研究成功构建了circPRKAA2、miR-22-3p和SLC27A1的ceRNA网络，探明了其靶向调控关系，也验证了miR-22-3p对乳脂生成的负调控作用。为探究荷斯坦奶牛乳脂合成的分子调控机制提供了理论基础。

4　结论

收起

本研究成功构建了circPRKAA2/miR-22-3p/SLC27A1这一ceRNA调控轴。研究发现，circPRKAA2与miR-22-3p均主要定位于BMECs的细胞质中，且circPRKAA2可作为miRNA海绵负调控miR-22-3p的表达。功能试验表明，miR-22-3p通过靶向抑制SLC27A1的表达，进而显著抑制BMECs中脂滴的分泌以及甘油三酯和胆固醇的合成。这些发现揭示了circPRKAA2通过调控miR-22-3p/SLC27A1对奶牛乳脂合成的影响，为深入理解奶牛乳脂代谢的调控网络提供了新的理论依据（图8）。

基金

收起

宁夏地区奶牛分子育种液相芯片研发及基因组大数据分析平台构建(2023BCF01004)
宁夏自治区青年拔尖人才培养工程项目

参考文献

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文献

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.015

接收时间：2025-07-04
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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收稿日期：2025-07-04

基金

宁夏地区奶牛分子育种液相芯片研发及基因组大数据分析平台构建(2023BCF01004)

宁夏自治区青年拔尖人才培养工程项目

作者信息

^1.宁夏大学动物科技学院，银川 750021

^2.宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 750021

^3.宁夏回族自治区畜牧工作站，银川 750021

^4.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030

通讯作者:

张娟，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail： zhangjuannxy@nxu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

名称 Name	序列（5′→3′） Sequence
pmirGLO-circPRKAA2-WT	TTTGATTATCTAACATGATGTCAGATGGTGAATTTCTGCGAACTAGCTGCGG-ATCCCCAAATTATGCAGCACCTGAAGTCATCTCAGGCAGCTGTATGCAGGTC-CTGAAGTGGATATCTGGAGCTGCGGTGTTATTTTGTATGCTCTTCTTTGTGG- CACCCTCCCATTTGATGATGAGCATGTGCCTACGCTGTTTAAGAAGATCC
pmirGLO-circPRKAA2-MUT	TTTGATTATCTAACATGATGTCAGATGGTGAATTTCTGCGAACTAGCTGCGG-ATCCCCAAATTATGCAGCACCTGAAGTCATCTCAGGCAGCTGTATGCTCCAG-GAGAAGTGGATATCTGGAGCTGCGGTGTTATTTTGTATGCTCTTCTTTGTG-GCACCCTCCCATTTGATGATGAGCATGTGCCTACGCTGTTTAAGAAGATCC
SLC27A1-3′UTR-WT	ATCCCGAGACCACCCCGCCAGGACAGCCCGGACCTTCCCATCAGCTTCGTCGG-TGGCTCATCCCAGACACCCATCGGTGGGGCTGGCCACCGAGACTGCCCCCCGT-CCCTCCCTCTGGCAGCACCGCCCGGCAGCTAGAACAGCAAGGCCAGTAGCAA-ATGACCCCGTGCTGTTTCGCATGGGCCTTTTCAAGCACTGAGGTTTTGTTTC-CTCGTTGAGTTTAAGAAATAAACCTGCAGAGCGTCTGGTGCCTG
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名称

Name

序列（5′→3′）

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基因 Gene	登录号 Accession number	引物序列（5′→3′） Primer sequence	产物长度/bp Products length
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E2F2	XM_024982675.2	F： AGTGAGTCTGAGGATGGGGTTCTG	121
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R： TGCTGTCCTTCCACTGCTCTTTTG
ELOVL6	NM_001102155.1	F： GCAAAGCACCCGAACTAGGAGATC	104
R： CCAGGAGTACAGAAGCACAGTGAG
SLC27A1	NM_001033625.2	F： CAGATGTGGCTGTGTATGGAGTGG	113
R： CAGTTCCTCGTACAGTGCGTTGG
KAT5	NM_001192066.2	F： CGGAACCAGGACAACGAAGATGAG	124
R： TCACCCATTCATCCAGGCGTTTG
PIK3R6	XM_024980100.2	F： CAGCCAACATCCAGATCCAGAGC	103
R： GCAACCTCGAACCTGACCACATC
MFGE8	NM_176610.1	F： GCGAGTCACGGGCATCATCAC	104
R： CAGTCCAGGTCACACCATCATCAC
SYNE1	XM_024997066.2	F： CTTCTGCTGACGAACTGGACACC	140
R： GGACCTGCTATGTGGACTGTTGAC
TMEM43	NM_001102480.1	F： GGGCAGGTGAAGACGGAGAGG	133
		R： GGCTGTTGCGGTGAACGACTC
ADCY5	NM_001192069.1	F： TGTCTGGTCTAACGATGTC	164
		R： CGATACTGTGCTCCTTGA
U6		F： CTCGCTTCGGCAGCACA
		R： AACGCTTCACGAATTTGCGT
circPRKAA2		F： GTTCTGTTGCTACTCTCCT
		R： TCACCTGGTATCTTATGTC
miR-22-3p		F： ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG
		RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACCAGTTC
Universal reverse primer		ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG

基因

Gene

登录号

Accession number

引物序列（5′→3′）

Primer sequence

产物长度/bp

Products length

GAPDH

NM_001034034.2

F： TCGGAGTGAACGGATTCGG

192

R： TGATGACGAGCTTCCCGTTC

E2F2

XM_024982675.2

F： AGTGAGTCTGAGGATGGGGTTCTG

121

R： CCTTCTTGCGGATGAGCTGGATG

NR3C1

NM_001206634.1

F： AGTTCTCCTCCATCCAGTTCCTCAG

149

R： TGCTGTCCTTCCACTGCTCTTTTG

ELOVL6

NM_001102155.1

F： GCAAAGCACCCGAACTAGGAGATC

104

R： CCAGGAGTACAGAAGCACAGTGAG

SLC27A1

NM_001033625.2

F： CAGATGTGGCTGTGTATGGAGTGG

113

R： CAGTTCCTCGTACAGTGCGTTGG

KAT5

NM_001192066.2

F： CGGAACCAGGACAACGAAGATGAG

124

R： TCACCCATTCATCCAGGCGTTTG

PIK3R6

XM_024980100.2

F： CAGCCAACATCCAGATCCAGAGC

103

R： GCAACCTCGAACCTGACCACATC

MFGE8

NM_176610.1

F： GCGAGTCACGGGCATCATCAC

104

R： CAGTCCAGGTCACACCATCATCAC

SYNE1

XM_024997066.2

F： CTTCTGCTGACGAACTGGACACC

140

R： GGACCTGCTATGTGGACTGTTGAC

TMEM43

NM_001102480.1

F： GGGCAGGTGAAGACGGAGAGG

133

R： GGCTGTTGCGGTGAACGACTC

ADCY5

NM_001192069.1

F： TGTCTGGTCTAACGATGTC

164

R： CGATACTGTGCTCCTTGA

F： CTCGCTTCGGCAGCACA

R： AACGCTTCACGAATTTGCGT

circPRKAA2

F： GTTCTGTTGCTACTCTCCT

R： TCACCTGGTATCTTATGTC

miR-22-3p

F： ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG

RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACCAGTTC

Universal reverse primer

ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG