微生物学报

Strains and plasmids	Characteristics	Sources
Strains
E. coli
Trelief 5α	fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169phoAglnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17	Tsingke Biotechnology Co., Ltd.
P. kudriavzevii
E1-01	E1, ΔURA3	[19]
E1-03	E1-01, ΔPDC, ldh	This study
E1-05	E1-03, Δdld, BtLDHA	This study
E1-07	E1-05, Δdld upstream, P_TDH3	This study
E1-X01	E1-03, Δdld, P_TDH3-xylT-T_TEF1	This study
E1-X04	E1-05, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT5-IGG6	This study
E1-X05	E1-01, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-SsXYL1-IGG6-SsXYL2-T_TEF1	This study
E1-X06	E1-07, ΔPkXYL1 upstream, P_GDP-PkXUT1-IGG6	This study
E1-X07	E1-01, ΔADH1, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1	This study
E1-X08	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Mgt05196^N360F -T_TEF1	This study
E1-X09	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-RGT2-T_TEF1	This study
E1-X10	E1-01, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT6-IGG6	This study
E1-Xpg1140	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg1140-T_TEF1	This study
E1-Xpg1151	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg1151-T_TEF1	This study
E1-Xpg2942	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg2942-T_TEF1	This study
E1-Xpg3423	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg3423-T_TEF1	This study
E1-Xpg4178	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4178-T_TEF1	This study
E1-Xpg4562	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4562-T_TEF1	This study
E1-Xpg4764	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4764-T_TEF1	This study
E1-Xpg1758	E1-01, ΔEG17, P_TDH3-Xpg1758-T_TEF1	This study
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E1-X13	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXYL1-T_TEF1	This study
E1-X14	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXYL2-T_TEF1	This study
E1-X15	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1	This study
Plasmids
pCas-dldN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting dld	This study
pCas-PkXYL1upN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting PkXYL1	This study
pCas-URA3upN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting URA3upstream	This study
pCas-ADH1N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting ADH1	This study
pCas-EG17N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG17	This study
pCas-EG4N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG4	This study

Strains and plasmids	Characteristics	Sources
Strains
E. coli
Trelief 5α	fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169phoAglnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17	Tsingke Biotechnology Co., Ltd.
P. kudriavzevii
E1-01	E1, ΔURA3	[19]
E1-03	E1-01, ΔPDC, ldh	This study
E1-05	E1-03, Δdld, BtLDHA	This study
E1-07	E1-05, Δdld upstream, P_TDH3	This study
E1-X01	E1-03, Δdld, P_TDH3-xylT-T_TEF1	This study
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E1-X13	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXYL1-T_TEF1	This study
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E1-X15	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1	This study
Plasmids
pCas-dldN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting dld	This study
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Primer names	Primer sequences (5′→3′)
XUT1-F	ATGCACGGAGGTTCAGACGGTAATGACG
XUT1-R	GGCCGCTGATGCTGATGCTGACAGTGCTTAA
XUT5-F	ATGACGGAAAGAAGCATTGGACC
XUT5-R	TTACTTCTTTGTATTAACAACAAAACCTTG
XUT6-F	ATGTCCAGTGTTGAAAAAAGTGC
XUT6-R	TTAGCTGATGTTTTCGACATGCTC
P_TDH3-Mgt05196^N360F -F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCGTCGAATGAGCAGGTTACTCC
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P_TDH3-SsXYL1-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCCTCCATTAAGTTGAAC
Ter-SsXYL1-R	AGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAACGAAGATTGGAATCTTATCCC
P_TDH3-SsXYL2-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTGCTAACCCATCTTTGGTCTTG
Ter-SsXYL2-R	AGAAGAAACTATCAGCTCACTCATTCTGGACCATCAATCAAACAC
P_TDH3-SsXKS1-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTACTACTCCATTTGATG
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Enzyme	Cofactor	Relative activity/U^-1	Standard deviation
PkXR	NADPH	7.83×10^-4	4.88×10^-5
NADH	0	0
PkXDH	NADP⁺	7.92×10^-4	9.06×10^-5
NAD⁺	6.43×10^-3	9.58×10^-4
PkXK	NADPH	7.28×10^-4	2.14×10^-5
NADH	1.56×10^-3	6.07×10^-4

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Sample name	YNBX10-1	YNBX10-2	YNBX10-3	YNBD10-1	YNBD10-2	YNBD10-3
Total reads	43 875 248	47 610 284	47 610 284	43 393 264	46 227 090	43 471 870
Total mapped	42 885 172 (97.74%)	46 528 186 (97.73%)	44 312 658 (97.93%)	42 745 235 (98.51%)	45 265 452 (97.92%)	42 836 789 (98.54%)
Uniquely mapped	42 117 293 (95.99%)	45 714 092 (96.02%)	43 671 882 (96.51%)	41 578 857 (95.82%)	44 217 482 (95.65%)	41 604 691 (95.7%)

Sample name	YNBX10-1	YNBX10-2	YNBX10-3	YNBD10-1	YNBD10-2	YNBD10-3
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库德里阿兹威氏毕赤酵母木糖代谢沉默机制解析

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袁子童 ¹ , 王一 ² , 张日鹏 ² , 曹利民 ¹ , 于波 ² , 王丽敏 ²

微生物学报 | 研究报告 2026,66(8): 4226-4241

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微生物学报 |研究报告 2026 , 66 (8) : 4226 -4241

库德里阿兹威氏毕赤酵母木糖代谢沉默机制解析

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袁子童¹, 王一², 张日鹏², 曹利民¹, 于波², 王丽敏²

作者信息

^1.首都师范大学生命科学学院，北京

^2.中国科学院微生物研究所，微生物多样性与资源创新利用全国重点实验室，北京

通讯作者:

曹利民, 王丽敏

作者简介:

作者贡献声明

袁子童：开展实验、数据收集与处理、论文撰写；王一：开展实验、数据收集与处理；张日鹏：数据收集与处理、论文撰写；曹利民：论文修改；于波：论文修改；王丽敏：研究构思、设计、论文修改。

Mechanism underlying the silencing of xylose metabolism in Pichia kudriavzevii

Zitong YUAN¹, Yi WANG², Ripeng ZHANG², Limin CAO¹, Bo YU², Limin WANG²

Affiliations

^1.College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing, China

^2.State Key Laboratory of Microbial Diversity and Innovative Utilization, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Corresponding Author:

E-mail: CAO Limin, caolimin@cnu.edu.cn;

WANG Limin, wanglimin@im.ac.cn

出版时间: 2026-08-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20260162

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摘要

收起

木质纤维素的高效转化是生物精炼实现经济可行性的核心，其中木糖的充分利用是提升转化效率的关键。库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)凭借其出色的耐酸、耐高温及强抗逆性，在工业生物制造领域展现出巨大潜力，但其天然木糖利用能力的缺陷严重限制了其在生物质转化中的应用。 【目的】 解析P. kudriavzevii E1木糖代谢沉默的分子生物学机制，为木质纤维素原料的生物利用提供理论支持。 【方法】 评估P. kudriavzevii E1菌株的木糖利用能力，分析其基因组中木糖代谢相关基因，确定木糖代谢限制因素；采用比较转录组学方法分析木糖转运蛋白导入前后木糖代谢基因的表达差异；通过异源表达高效木糖代谢相关基因验证木糖代谢的抑制性限速环节。 【结果】 生物信息学分析结合异源表达转运蛋白恢复P. kudriavzevii E1木糖摄取能力的试验证实，缺乏对木糖具有亲和力的跨膜转运蛋白是该菌株无法摄取木糖的关键限制因素。P. kudriavzevii E1基因组中天然存在编码木糖氧化还原代谢途径核心酶的3个基因PkXYL1、PkXYL2和PkXKS1。体外相对酶活性测定表明，P. kudriavzevii E1的内源木糖还原酶PkXR较低的相对活性是底物积累和木糖代谢缓慢的关键原因。针对恢复木糖利用能力的菌株P. kudriavzevii E1-Xpg4562的比较转录组学分析表明，木糖环境中酵母细胞的代谢应答发生深刻重编程，细胞优先激活核糖体生物发生和氧化磷酸化，但因TAL1显著下调且磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)相关基因转录响应不足，导致木糖环境中细胞PPP通量低下，碳流无法有效回流至糖酵解，阻碍了木糖下游代谢途径的畅通。对转录组分析涉及的关键木糖代谢基因进行表达水平检测，进一步表明关键下游基因的转录调控不协同阻碍了木糖的代谢效率。 【结论】 P. kudriavzevii E1的木糖代谢受阻是底物转运缺失、内源酶催化活性低下和转录调控不协同共同作用的结果。本研究为非模式酵母木糖代谢途径的精准改造提供了重要理论依据。

关键词

库德里阿兹威氏毕赤酵母 / 木糖代谢 / 木糖转运蛋白 / 转录组学

Abstract

收起

The efficient conversion of lignocellulosic biomass is at the core of ensuring the economic feasibility of biorefineries, where the comprehensive utilization of xylose serves as a determinant of overall conversion efficiency. Pichia kudriavzevii has demonstrated significant potential in industrial bioprocessing owing to its tolerance to low pH, high temperatures, and environmental stressors. However, its innate deficiency in xylose assimilation severely restricts its application in biomass valorization. [Objective] To elucidate the molecular mechanisms underlying the silencing of xylose metabolism in P. kudriavzevii E1, thereby providing a theoretical basis for the bioconversion of lignocellulosic feedstocks. [Methods] The xylose assimilation capacity of P. kudriavzevii E1 was evaluated, and its genome was analyzed to identify the genes and metabolic bottlenecks associated with xylose assimilation. Comparative transcriptomics was employed to characterize the differential expression of metabolic genes before and after the introduction of a xylose transporter. Furthermore, the heterologous expression of genes involved in efficient xylose metabolism was performed to verify specific rate-limiting steps within the pathway. [Results] Bioinformatics analysis, coupled with the functional restoration of xylose uptake via heterologous transporter expression, confirmed that the lack of high-affinity xylose transporters was the primary limiting factor for xylose assimilation in P. kudriavzevii E1. Although three genes—PkXYL1, PkXYL2, and PkXKS1—encoding core enzymes of the xylose redox pathway were natively present in the P. kudriavzevii E1 genome, in vitro enzymatic assays revealed that the low relative activity of PkXR was a critical cause of substrate accumulation and slow xylose metabolism. Comparative transcriptomics of the engineered strain P. kudriavzevii E1-Xpg4562 indicated that yeast cells underwent profound metabolic reprogramming in xylose-containing media, preferentially activating ribosome biogenesis and oxidative phosphorylation. However, the significant downregulation of TAL1 and the insufficient transcriptional response of genes in the pentose phosphate pathway (PPP) resulted in inefficient PPP flux. This prevented the effective redirection of carbon flux into glycolysis, thereby obstructing downstream xylose metabolism. Finally, quantification of the expression of key xylose metabolism genes identified by transcriptomics further demonstrated that the uncoordinated transcriptional regulation of essential downstream genes hindered overall metabolic efficiency. [Conclusion] The silencing of xylose metabolism in P. kudriavzevii E1 results from the combined effects of deficient substrate transport, low endogenous catalytic activity, and uncoordinated transcriptional regulation. This study provides a crucial theoretical foundation for the precision engineering of xylose metabolic pathways in non-conventional industrial yeasts.

Key words

Pichia kudriavzevii / xylose metabolism / xylose transporter / transcriptomics

引用本文

袁子童, 王一, 张日鹏, 曹利民, 于波, 王丽敏. 库德里阿兹威氏毕赤酵母木糖代谢沉默机制解析. 微生物学报, 2026 , 66 (8) : 4226 -4241 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20260162

Zitong YUAN, Yi WANG, Ripeng ZHANG, Limin CAO, Bo YU, Limin WANG. Mechanism underlying the silencing of xylose metabolism in Pichia kudriavzevii[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (8) : 4226 -4241 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20260162

正文

收起

随着全球能源需求的持续增长与环境问题日益凸显，利用工程微生物将可再生生物质转化为生物燃料和高附加值化学品的需求愈发迫切。木质纤维素作为来源丰富、环境友好的生物质资源受到研究者广泛关注^[1]，而木糖作为自然界中第二丰富的糖类，占木质纤维素水解糖总量的18%-30%^[2-3]。木糖的生物可利用性是影响木质纤维素生物加工经济可行性的关键因素。然而，许多工程微生物缺乏天然的木糖转运蛋白或代谢途径，且木糖代谢常与中心碳代谢相互干扰，导致利用木糖进行生物合成的产物种类有限、转化效率低下^[4-5]。

木糖代谢的首要障碍是木糖转运入细胞的效率较低。在天然酵母中，木糖的转运主要依赖非特异性己糖转运蛋白，这些转运蛋白对木糖的亲和力远低于葡萄糖等己糖，生化动力学分析表明，己糖转运蛋白对木糖的米氏常数(K_m)通常比葡萄糖高出10-100倍，这意味着在混合糖发酵环境中葡萄糖会通过竞争性结合优先占据转运位点，从而阻断木糖的转运。此外，尽管部分酵母中确实存在专一性木糖转运蛋白，但其天然表达水平与动力学特性不足以支持快速的木糖同化^[6-7]。在不能天然利用木糖的酵母中恢复木糖摄取能力的常规策略集中于转运蛋白的引入与改造^[8]。例如，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中异源表达来自树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的XUT和来自休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的GXS1^[9]；对于具有木糖亲和性的转运蛋白，可通过理性设计(如基于结构与功能关系的定点突变)或非理性改造(如易错PCR或定向进化)获得转运效率更高的突变体，以减弱葡萄糖抑制效应并改善木糖转运动力学特性^[6]。

天然具备木糖利用能力的酵母，如S. stipitis、C. shehatae和Spathaspora passalidarum通过由木糖还原酶(xylose reductase, XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)构成的氧化还原途径(xylose reductase-xylitol dehydrogenase pathway, XR-XDH途径)将木糖转化为木酮糖，随后木酮糖经木酮糖激酶(xylulokinase, XK)磷酸化生成木酮糖-5-磷酸，并进入磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)完成进一步代谢^[10-11]。此外，木糖异构酶(xylose isomerase, Ⅺ)可在无需氧化还原辅因子的条件下催化木糖直接转化为木酮糖。然而，Ⅺ仅存在于细菌、植物及少数丝状真菌中，如硫色软霉变种(Malbranchea pulchella var. sulfurea)和梨囊鞭菌(Piromyces sp.)，该途径在天然酵母中尚未被发现^[12-14]。为克服木糖代谢受限、提升工程酵母的木糖利用效率，已有研究将外源Ⅺ和XR-XDH途径引入工程菌株^[4,15]。

库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)是一种非常规酵母，常被用于生产多种传统发酵饮料、食品及生化制品^[16-17]。同时，作为一种具有重要工业应用潜力的候选益生菌^[18]，P. kudriavzevii在生物技术领域的地位日益提升。工程酵母菌株P. kudriavzevii E1分离自酒糟，前期研究表明该菌株具备优异的耐酸(pH 2.0-4.0)、耐高温(45 ℃)及耐受糠醛等发酵抑制物的能力，能够在不添加中和剂的条件下生产光学纯度100%的L-乳酸，产量达74.45 g/L^[19]。然而，由于无法利用木糖，P. kudriavzevii E1在木质纤维素水解液生物炼制中的应用受到限制。此外，尽管在S. cerevisiae中木糖代谢调控网络已较为明确，且已有研究提出克服碳代谢阻遏、优化利用效率的工程策略^[20]，但在P. kudriavzevii等非常规酵母中对木糖利用沉默的复杂机制解析仍显不足。

在木糖诱导条件下，P. kudriavzevii E1的全局转录响应尚未得到表征，其胞内潜在代谢节点也缺乏系统研究。研究表明，即便部分非常规酵母基因组中存在木糖代谢的关键酶，但由于缺乏受诱导的转录激活机制，这些酶长期处于低活性水平^[21]。因此，单纯异源表达基因通常难以实现木糖碳流的高效传递，亟需通过多维度的系统生物学手段对P. kudriavzevii E1的木糖代谢进行深度解析，从而识别制约其木糖同化的核心因素。本研究通过整合比较基因组学、异源基因表达及生理特性分析系统探讨了P. kudriavzevii E1木糖代谢缺陷的分子基础，旨在为开发具有木糖利用能力的非模式酵母菌株提供理论参考。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

本研究涉及的菌株及质粒如表1所示。菌株P. kudriavzevii E1由本课题组前期从酒糟中分离并保存^[19]。感受态大肠杆菌(Escherichia coli) Trelief 5α用于质粒的克隆与扩增。

1.1.2 主要试剂和仪器

E.Z.N.A.酵母DNA提取试剂盒，Bio-Rad公司；Phusion Plus高保真DNA聚合酶、NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒，New England Biolabs公司；E.Z.N.A.质粒提取及凝胶回收试剂盒，Omega Bio-tek公司；PrimeScript RT反转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量试剂盒，TaKaRa公司；D-葡萄糖、D-木糖、无氨基酸酵母氮源、琼脂粉及其他常用生化试剂，麦克林生化科技股份有限公司及酷来博科技有限公司。

梯度PCR仪、凝胶成像的全自动凝胶成像系统、HPLC的HPX-87H柱(7.8 mm×300 mm)，Bio-Rad公司；DNA浓度测定的超微量分光光度计，ThermoFisher Scientific公司；菌株培养的恒温振荡培养箱，智城分析仪器有限公司；高效液相色谱仪，Agilent公司；超纯水系统，Merck Millipore公司。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0；配制固体培养基时需加入15 g/L琼脂粉，抗生素根据质粒抗性标记添加。YPD培养基(g/L)：酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0；其中蛋白胨和酵母提取物经115 ℃蒸汽灭菌15 min，葡萄糖配制成200.0 g/L母液并经0.22 μm滤膜过滤除菌，两者于培养基冷却至约55 ℃后混合，培养基最终pH 6.5；配制固体培养基时需加入20.0 g/L琼脂粉。YNBX₁₀培养基(g/L)：YNB 6.7，D-木糖10.0，尿嘧啶0.060。YNBD_0.5培养基(g/L)：YNB 6.7，D-木糖0.5，尿嘧啶0.060。YNBD₁₀培养基(g/L)：YNB 6.7，葡萄糖0.5，尿嘧啶0.060。

1.2 基因组DNA模板的提取方法

将培养过夜的菌液收集于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心2 min，弃上清；加入500 μL buffer SE和5 μL lyticase，37 ℃孵育30 min以裂解细胞壁；10 000 r/min离心2 min收集原生质体，加入200 μL buffer YL和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴2 h；加入220 μL buffer YB，70 ℃水浴10 min；加入220 μL无水乙醇，混匀后转移至吸附柱；按照试剂盒说明书进行洗涤和洗脱，最终用50 μL预热至65 ℃的elution buffer洗脱DNA。提取的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定浓度和纯度，确认OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8-2.0，置于-20 ℃保存备用。

1.3 PCR反应体系和方法

PCR反应体系(50.0 μL)：2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，上、下游引物(10.0 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板(100.0 ng) 1.0 μL，ddH₂O补足至50.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5.0 min；95 ℃变性15.0 s，于低于引物T_m值2 ℃的温度下退火15.0 s，72 ℃延伸(20.0 s/kb)，共30个循环；72 ℃终延伸10.0 min；4 ℃保温。

1.4 目的基因的克隆

以E1基因组DNA为模板，XUT1/5/6-F和XUT1/5/6-R为引物PCR扩增获得内源转运体基因XUT1/5/6片段；以合成基因为模板，使用引物P_TDH3-Mgt05196^N360F -F和Ter-Mgt05196^N360F -R扩增高特异性木糖转运体编码基因Mgt05196^N360F 片段；以成对引物Xpgxxxx-F和Xpgxxxx-R (“xxxx”为预测转运蛋白基因编号) PCR扩增预测的木糖转运体编码基因；以S. stipitis基因组DNA为模板，使用引物P_TDH3-SsXYL1/SsXYL2/SsXKS1-F和Ter-SsXYL1/SsXYL2/SsXKS1-R分别扩增获得SsXYL1、SsXYL2和SsXKS1。PCR所用引物信息如表2所示。

1.5 功能质粒与打靶片段构建

采用Gibson Assembly策略构建重组质粒及打靶片段。对核心片段和质粒骨架分别进行PCR扩增，回收纯化后的片段按比例混合，于50 ℃条件下进行同源重组连接。连接产物采用热激法转化至E. coli Trelief 5α中，通过含相应氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。利用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行酶切及测序验证。

1.6 木糖转运蛋白的预测

使用Funannotate (v1.8.17)对木糖代谢阳性的毕赤酵母菌株与木糖代谢阴性的Pichia kudriavzevii E1菌株的基因组进行基因预测，并使用InterProScan软件进行功能注释，提取含有糖类转运蛋白结构域的蛋白序列作为各菌株的候选木糖转运蛋白。

对毕赤酵母菌株木糖转运蛋白的进一步预测通过2种方式进行。(1) 基于蛋白结构特征进行预测。使用AlphaFold3预测候选蛋白结构，并使用Foldseek软件将其与UniProt数据库中真菌糖类转运蛋白的结构进行比对，计算TM-Score值与RMSD值，根据最佳比对结果识别不同糖类的转运蛋白；(2) 利用木糖培养条件下的特征性转录组数据。比较菌株在不同葡萄糖或木糖条件下生长的转录组数据，选取木糖培养条件下转录水平较葡萄糖条件上调≥1.5倍的糖转运蛋白编码基因作为木糖转运蛋白的候选基因。

1.7 P.kudriavzevii E1基因组木糖转运蛋白插入

菌株P. kudriavzevii E1的遗传改造采用课题组前期构建的CRISPR-Cas9编辑系统^[19]。将设计好的针对目标位点的gRNA表达质粒与含有Xpg4562表达框及同源臂的打靶片段共同转化进P. kudriavzevii E1。酵母转化采用电转化法：取对数生长期的P. kudriavzevii E1种子液，按1%比例转接至20 mL YPD液体培养基中，待OD₆₀₀达到0.6-0.8，6 000×g离心10 min收集菌体。用酵母电转化预处理悬浮液重悬收集的菌体，置于摇床中30 ℃、200 r/min振荡30 min以制备酵母感受态细胞。用预冷的1 mol/L山梨醇洗涤酵母菌体3次，加入500 μL 1 mol/L山梨醇重悬菌体。将1 μg质粒与200-500 ng打靶片段混合后加入预冷的0.2 cm电转杯中，利用电穿孔仪设置放电参数为5.0 kV、3 ms。电击完成后，立即向杯中加入700 μL预冷的YPDS复苏培养基，轻轻晃动电转杯以悬浮菌体。将悬浮液转移至1.5 mL EP管中，于30 ℃恒温条件下静置复苏1 h，随后移至30 ℃、200 r/min继续恢复生长1 h。复苏后的菌液经离心浓缩，涂布于含博来霉素的SD培养基平板上。待平板于30 ℃培养48-72 h生长出单菌落后，随机挑取转化子进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳观察条带大小进行初步验证。对于条带长度符合插入片段预期长度的转化子，委托北京天一辉远生物科技有限公司进行单分子实时测序验证，经传代3次后获得一系列遗传稳定的重组酵母菌株。

1.8 木糖代谢能力测试与培养策略

细胞内木糖含量检测：挑取酵母单克隆在200 mL YPD培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，收集菌体。将酵母菌体转至等量YNBX₁₀中30 ℃、200 r/min培养，初始OD₆₀₀为0.73。48 h后6 000×g离心10 min收集细胞，烘干称取干重，用生理盐水洗涤3次，超声破碎(380 W，30 min，4 ℃)，12 000 r/min离心10 min，取上清液，经氮吹干燥后重溶，使其浓缩10倍。

培养环境中木糖消耗检测：挑取酵母单克隆在YPD培养基中进行种子培养，在30 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀为0.6。按1%接种量转接至250 mL三角瓶的YNBX₁₀培养基中。诱导分析：为进行转录组采样，菌株在30 ℃下诱导培养6 h后收集细胞，立即用液氮冷冻。发酵性能测试：连续培养72 h并定时取样，记录OD₆₀₀数值，并收集离心上清液样品用于HPLC代谢产物分析。

1.9 样品处理与HPLC检测

培养液样品以9 000×g离心2 min，取发酵液上清，经0.22 μm滤膜过滤。木糖浓度通过高效液相色谱进行测定。色谱柱温度为35 ℃，流速为0.5 mL/min，以6 mmol/L硫酸溶液为流动相。每个测定实验设置3个平行样品。所有定量数据均采用t检验或单因素方差分析进行统计分析，实验数据以平均值±标准差表示。

1.10 XR、XDH及XK酶活性检测方法

将待测菌株接种于YPD培养基，于30 ℃、200 r/min振荡10 h，6 000×g离心10 min收集菌体并用无菌水洗涤2次，随后转接至以木糖为唯一碳源的YNBX诱导培养基中诱导培养12 h。诱导结束后，离心收集菌体，采用离心管加玻璃珠机械破碎法或超声破碎法处理细胞，于4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清液作为粗酶液用于后续检测。PkXR活性测定体系(1 mL)包含100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、0.2 mmol/L NAD(P)H及200 mmol/L D-木糖；PkXDH活性测定体系包含100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)、2 mmol/L NAD(P)⁺和50 mmol/L木糖醇；PkXK活性采用偶联酶法测定，体系包含100 mmol/L Gly-Gly缓冲液(pH 7.4)、5 mmol/L ATP、0.2 mmol/L NADH、10 mmol/L MgCl₂、2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸以及过量的丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶。通过酶标仪监测340 nm处NADH或NADPH氧化还原引起的吸光度变化。酶活单位(U)定义为：在实验条件下，每分钟转化1 pmol NAD(P)H或NAD(P)⁺所需的OD₆₀₀为1的菌液体积对应的酶量。

1.11 转录组测序与生物信息学分析方法

本研究各样本的转录组测序及基础数据分析由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。首先采用TRIzol法提取各样本总RNA，经NanoDrop 2000和Agilent 2100系统评估RNA的浓度、纯度及完整性，确保检测合格后进入文库构建。利用Oligo (dT)磁珠富集带有聚腺苷酸尾巴的mRNA，经随机片段化、cDNA合成、末端修复及接头连接等步骤完成测序文库的构建。文库检验合格后，利用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序。原始数据经fastp软件过滤接头及低质量序列获得干净数据(clean data)，使用HISAT2软件将干净数据比对至Pichia kudriavzevii CBS573参考基因组。基因表达量通过FeatureCounts进行定量，并利用DESeq2软件进行组间差异表达分析。差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)的筛选标准设定为∣log₂ fold change∣≥1且校正后的P值(P_adj)≤0.05。最后，利用clusterProfiler软件对DEG进行基因本体(gene ontology, GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路富集分析。

1.12 RT-qPCR实验方法

采用TRIzol法提取不同培养条件下各样本的总RNA，经DNase I处理去除基因组DNA污染后，利用反转录试剂盒将其合成cDNA模板。根据NCBI数据库中目标基因序列，利用Primer Premier 5软件设计特异性定量引物。以18S rRNA作为内参基因，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量试剂盒，在实时荧光定量PCR仪上设置3个平行重复进行扩增。反应体系及程序参照试剂盒说明书进行，通过熔解曲线评估扩增产物的特异性。基因相对表达水平采用2^-ΔΔ^C^t法进行计算。

2 结果与分析

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2.1 表达系列木糖转运蛋白的工程化 P.kudriavzevii E1菌株的构建与验证

为解析木糖利用障碍的遗传基础，本研究对P. kudriavzevii E1的基因组序列进行了生物信息学分析。首先，以来自S. stipitis的典型XR、XDH和XK，以及木糖转运蛋白序列作为比对基础，通过BLASTp进行同源基因筛选。结合Pfam结构域分析，最终鉴定了一套完整的内源XR-XDH途径基因，即编码木糖还原酶PkXR的PkXYL1、编码木糖醇脱氢酶PkXDH的PkXYL2和编码木酮糖激酶PkXK的PkXKS1。为进一步证明上述3种酶在胞内表达并具有活性，使用细胞粗提物测定了其体外相对酶活性(表3)。结果表明，即使木糖代谢通量较低，测试的3种木糖代谢核心酶在胞内仍具备一定的活性，其中PkXR表现出最低的相对活性。这说明E1中天然的木糖代谢途径存在动力学失衡，PkXR固有的低催化效率是P. kudriavzevii E1木糖同化的重要限速步骤，但并非该菌株木糖代谢沉默的机制根源。因此，本研究重点转向P. kudriavzevii E1木糖摄取能力的缺失。生物信息学分析显示，P. kudriavzevii E1缺乏高亲和力的木糖转运蛋白编码基因。为从生理水平验证上述预测，本研究检测了木糖培养条件下细胞内的游离木糖含量。结果显示，浓缩后的胞质提取液中未检测到木糖(低于检测限0.1 g/L)。该结果与生物信息学分析一致，证实野生型P. kudriavzevii E1菌株缺乏有效的木糖跨膜转运蛋白，木糖无法被摄入胞内，这构成了木糖代谢途径的首要瓶颈。

为突破转运限制，本研究首先导入异源转运蛋白编码基因XUT5、XUT6和XylT，但并未发现重组菌株在以木糖为唯一碳源的培养基中恢复生长，同时浓缩后的胞质提取液中仍未检测到木糖，推测这3种转运蛋白可能无法在P. kudriavzevii E1膜上正确定位或形成正确构象。为解决这一问题，基于对近缘毕赤酵母基因组的分析，通过功能结构域比对，预测了10个可能与糖转运相关的编码基因；同时，克隆了来自高效木糖利用菌株S. stipitis的高亲和力木糖转运蛋白基因RGT2；将这些基因分别构建于强启动子P_TDH3控制下的表达载体中，并分别导入P. kudriavzevii E1-01。在以木糖为唯一碳源的培养条件下，评估了各工程菌株的木糖消耗(图1)。结果表明，10种预测转运蛋白导入后，菌株表现出不同程度的木糖消耗，尽管72 h木糖消耗量均低于0.5 g/L，但异源表达转运蛋白仍可恢复P. kudriavzevii E1菌株的木糖摄取功能。其中P. kudriavzevii E1-Xpg4562、E1-Xpg4764和E1-X09的木糖消耗能力较强，72 h木糖消耗量分别为0.38、0.29、0.11 g/L。然而，所有工程菌株的木糖消耗速率仍远低于理论水平，且生物量积累未见显著改善，表明在克服转运障碍后，细胞内木糖代谢途径自身仍存在其他关键限制环节，有待进一步解析。此部分研究为后续深入剖析菌株的木糖代谢沉默机制提供了重要的工程菌株基础与表型依据。

2.2 木糖与葡萄糖条件下重组菌株的比较转录组分析

2.2.1 转录组文库构建和质量控制

为全面了解恢复木糖利用能力的重组菌株在木糖环境中的转录响应，对以葡萄糖或木糖为单一碳源培养的P. kudriavzevii E1-Xpg4562进行了RNA-seq分析，并比较了其基因表达谱。在Illumina NovaSeq 6000平台上对在2种不同碳源条件下培养的E1-Xpg4562总RNA所构建的6个cDNA文库进行了双端测序。在过滤掉重复、低复杂性和低质量读段后，将高质量读段比对至P. kudriavzevii CBS573参考基因组。6个文库(YNBX10-1、YNBX10-2、YNBX10-3、YNBD10-1、YNBD10-2、YNBD10-3)的测序结果如表4所示。主成分分析显示生物学重复样本聚类清晰，且唯一比对率(uniquely mapped)均在95.6%以上，确保了后续表达量定量及差异分析的可靠性。

2.2.2 木糖环境中 P.kudriavzevii E1-Xpg4562表达差异基因分析

通过对全基因组表达水平的初步对比，发现P. kudriavzevii E1-Xpg4562从葡萄糖切换至木糖环境后转录谱发生了剧烈重塑。共鉴定出2 126个DEG，其中1 190个基因显著上调，936个基因显著下调。这一显著的转录响应表明，尽管表型上木糖消耗量较低，但细胞在转录水平上已出现复杂应答。P. kudriavzevii E1-Xpg4562响应不同碳源诱导的DEG总体分布如图2A所示。

本研究通过比较转录组学分析与RT-qPCR验证(图2B)，系统解析了P. kudriavzevii E1-Xpg4562在木糖诱导下的转录响应。结果显示，2种检测手段所得的基因表达趋势高度吻合。PkXYL1和PkXKS1表达水平分别为葡萄糖条件下的1.40倍和1.70倍，同时PkXYL2稳定表达(1.18倍)，表明木糖同化途径已被激活；HXT6表现出18.18倍的显著上调，而HXT14和HXT2则受到显著抑制，反映了细胞对跨膜转运蛋白的差异性调度。在PPP方面，转录组数据显示编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的ZWF1上调3.22倍以补偿木糖还原过程对NADPH的消耗，但下游SOL3下调及GND转录水平较低导致氧化分支内部出现严重的转录不协同，这一现象在RT-qPCR验证中表现为RPIA、SOL3和6GPD表达水平均下调至0.14-0.56倍。此外，转录组分析显示RKI1微弱上调(1.09倍)且衔接糖酵解的关键基因TAL1显著下调至0.54倍，直接阻断了木糖碳骨架回流至中心代谢的路径，引发了胁迫响应基因SLT2 (64.00倍)和ecdD (34.60倍)的显著上调，单羧酸转运蛋白基因ESBP6表达量锐减(0.04倍)。综上所述，P. kudriavzevii E1在感知木糖信号后，由于中心代谢路径尤其是非氧化PPP的转录响应不足或不协同，导致碳流回流受阻并诱发强烈的生理应激，这是制约该菌株木糖代谢效率的重要因素。

2.2.3 GO功能显著性富集分析

为进一步解析差异基因的功能特征，对DEG进行了GO富集分析。根据显著性水平(-lg P_adj)最高的10类富集DEG (图3A)，核糖体生物发生(ribosome biogenesis)和前核糖体(preribosome)在生物过程(biological process, BP)和细胞组分(cellular component, CC)分类中占据首位，-lg P_adj分别为5.42和1.70。这表明P. kudriavzevii E1-Xpg4562经木糖处理后发生广泛的物质重组并提升翻译能力，以支持碳源的同化与利用，这也与转运蛋白相关基因的显著富集相一致。85个跨膜转运蛋白(-lg P_adj≈2.45)和34个无机阳离子跨膜转运蛋白(-lg P_adj≈2.40)相关基因的富集显示出较高的显著性。GO富集分析结果表明，在诱导初期，细胞大规模上调蛋白合成相关基因并重塑膜转运系统，以适应木糖作为碳源的生长环境。这种高能量投入与极低的实际木糖利用率形成鲜明对比，表明细胞感应到新碳源的存在，但细胞内部代谢流并未能顺畅切换。

2.2.4 KEGG代谢通路富集分析

为阐明潜在的系统性代谢调整，对P. kudriavzevii E1-Xpg4562在木糖或葡萄糖环境中生长的差异表达基因进行了KEGG通路富集分析(图3B)。分析表明，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)是显著性最强且涉及基因数量最多的通路，共涉及47个基因，说明菌株的代谢重点在于蛋白质合成和能量产生，这与初始的GO富集分析一致。同时，碳代谢(carbon metabolism)上调显著，其涵盖了主要的六碳糖利用途径，如糖酵解、糖异生，说明在摄入碳源量较低、生物合成加快的情况下细胞对碳代谢的需求增加。值得注意的是，PPP相关基因也呈现富集，凸显了PPP在处理木糖来源的少量碳流、将生成的五碳中间体导入中心代谢中的作用。此外，嘌呤代谢、辅因子生物合成以及叶酸介导的一碳池的激活说明细胞需要加快合成必需的前体物和辅因子以维持快速的核酸合成和整体合成代谢。氧化磷酸化的高度显著富集说明细胞在快速产生ATP以支持跨膜转运和核糖体合成。PPP基因的富集程度不足是限制木糖通量的重要因素，意味着即便木糖通过转运蛋白Xpg4562进入细胞，其向下游酵解途径转化的效率依然受限。KEGG富集分析揭示了一种碳流受限而能量消耗升高的细胞应激状态，表明细胞可能通过上调其他供能物质的代谢途径满足翻译和物质合成的需求，而木糖的下游代谢则被持续抑制。

2.3 XR-XDH限制环节分析和优化

将来自S. stipitis的高效XR-XDH途径关键基因SsXYL1、SsXYL2和SsXKS1与相同表达元件构成组成型表达框，并分别靶向整合到P. kudriavzevii E1-Xpg4562的同一中性位点以完成异源表达。RT-qPCR证实了3个基因在改造菌株中实现了稳定表达，且表达水平相近。对重组菌株P. kudriavzevii E1-X13、E1-X14和E1-X15在YNBX_0.5培养基上的木糖代谢和生物量积累进行了表征(图4B、4C)。与P. kudriavzevii E1-Xpg4562相比，重组菌株72 h累积生物量均有所提升，同时木糖消耗速率也有相应提高。该结果说明，在引入预测转运蛋白Xpg4562缓解摄取限制之后，由内源性木糖还原酶催化的木糖向木糖醇转化的初始步骤是天然氧化途径中的核心限制因素。这一限制体现为中间工程菌株E1-Xpg4562较低的比生长速率和木糖醇的适度积累。这一结果提供了直接的功能证据，表明克服PkXR固有的低活性对于实现较高的木糖代谢通量至关重要。这种功能互补证明了PkXR的动力学特性不足以维持由Xpg4562所实现的木糖输入通量，从而限制了进入中心PPP的总体碳流。综上所述，这一逐步工程策略有效解析了P. kudriavzevii E1中的代谢瓶颈：木糖转运体的缺失虽是初始障碍，但内源性木糖还原酶的低催化效率是其木糖同化速率的关键限制因素。

3 讨论与结论

收起

本研究通过生物信息学分析、酶动力学表征及比较转录组学手段，系统解析了工业酵母P. kudriavzevii E1木糖利用障碍的分子机制。实验结果证实，该菌株的木糖代谢沉默是由底物转运缺失、酶促动力学失衡及转录调控不协同共同作用的结果。

首先，跨膜转运限制被证实是P. kudriavzevii E1利用木糖的首要阻碍。生物信息学预测结果与胞内游离木糖含量检测结果一致，均表明P. kudriavzevii E1缺乏高效的木糖特异性转运蛋白。尽管通过异源表达转运蛋白Xpg4562部分恢复了P. kudriavzevii E1的木糖摄取功能，但重组菌株的木糖消耗速率及生物量积累仍远低于理想水平。此结果表明，相较于已被广泛研究的模式酵母S. cerevisiae，P. kudriavzevii E1在木糖利用上存在天然的多级限制，胞内代谢路径的受限程度高于S. cerevisiae^[5]，因此仅解除转运限制不足以驱动较高的木糖代谢通量，胞内存在更为复杂的限制环节。其次，内源代谢途径的动力学失衡是限制木糖同化的核心胞内因素。酶活性检测显示，尽管P. kudriavzevii E1基因组存在完整的XR-XDH途径基因，且在胞内具备基础活性，但PkXR的相对活性显著低于下游酶。这种酶促反应速率的不匹配导致初始同化步骤的动力学受阻。GO与KEGG富集分析共同表明，细胞在感知木糖信号后优先将胞内物质和能量投入核糖体生物发生和氧化磷酸化等过程。由于缺乏与之匹配的中心代谢通量支持，这种以最大化生物量合成为导向的代谢策略导致了严重的代谢失调。转录水平的非协同性进一步表明PPP是关键限制节点。转录组与RT-qPCR数据均证实，虽然ZWF1的上调反映了细胞对NADPH消耗的应激补偿，但下游SOL3和GND的下调限制了氧化分支的通量；在非氧化分支中，衔接糖酵解的关键基因TAL1出现显著转录抑制，直接阻断了木糖来源碳流向中心代谢回流的路径。这种木糖诱导下的转录响应弱化现象在S. cerevisiae的相关转录组研究中较少见，通常S. cerevisiae经木糖适应性进化后能较快建立协同的PPP通量^[20]。P. kudriavzevii E1木糖代谢通量受阻不仅限制了生物量积累，更诱发了胁迫响应基因SLT2和ecdD的高水平表达，反映了细胞在木糖环境下处于强烈的代谢应激状态。

综上所述，P. kudriavzevii E1的木糖代谢受阻是一个多级限制过程：转运缺失构成初始障碍，而进入胞内的碳流因PkXR催化效率低下及PPP转录响应不足无法有效导入糖酵解途径。这一发现表明，针对非模式酵母的木糖代谢改造，必须在建立高效转运体系的基础上同步提高内源限速酶的催化效率并重塑PPP途径的转录协同性。

参考文献

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文献

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2026年第66卷第8期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20260162

接收时间：2026-02-28
首发时间：2026-08-21
出版时间：2026-08-04

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收稿日期：2026-02-28
录用日期：2026-03-30

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^1.首都师范大学生命科学学院，北京

^2.中国科学院微生物研究所，微生物多样性与资源创新利用全国重点实验室，北京

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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RefWorks
TxT

Strains and plasmids	Characteristics	Sources
Strains
E. coli
Trelief 5α	fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169phoAglnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17	Tsingke Biotechnology Co., Ltd.
P. kudriavzevii
E1-01	E1, ΔURA3	[19]
E1-03	E1-01, ΔPDC, ldh	This study
E1-05	E1-03, Δdld, BtLDHA	This study
E1-07	E1-05, Δdld upstream, P_TDH3	This study
E1-X01	E1-03, Δdld, P_TDH3-xylT-T_TEF1	This study
E1-X04	E1-05, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT5-IGG6	This study
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E1-X06	E1-07, ΔPkXYL1 upstream, P_GDP-PkXUT1-IGG6	This study
E1-X07	E1-01, ΔADH1, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1	This study
E1-X08	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Mgt05196^N360F -T_TEF1	This study
E1-X09	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-RGT2-T_TEF1	This study
E1-X10	E1-01, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT6-IGG6	This study
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E1-Xpg2942	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg2942-T_TEF1	This study
E1-Xpg3423	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg3423-T_TEF1	This study
E1-Xpg4178	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4178-T_TEF1	This study
E1-Xpg4562	E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4562-T_TEF1	This study
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E1-Xpg1758	E1-01, ΔEG17, P_TDH3-Xpg1758-T_TEF1	This study
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E1-Xpg3179	E1-01, ΔEG17, P_TDH3-Xpg3179-T_TEF1	This study
E1-X13	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXYL1-T_TEF1	This study
E1-X14	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXYL2-T_TEF1	This study
E1-X15	E1-Xpg4562, ΔEG4, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1	This study
Plasmids
pCas-dldN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting dld	This study
pCas-PkXYL1upN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting PkXYL1	This study
pCas-URA3upN20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting URA3upstream	This study
pCas-ADH1N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting ADH1	This study
pCas-EG17N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG17	This study
pCas-EG4N20	Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG4	This study

Strains and plasmids

Characteristics

Sources

Strains

E. coli

Trelief 5α

fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169phoAglnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17

Tsingke Biotechnology Co., Ltd.

P. kudriavzevii

E1-01

E1, ΔURA3

[19]

E1-03

E1-01, ΔPDC, ldh

This study

E1-05

E1-03, Δdld, BtLDHA

This study

E1-07

E1-05, Δdld upstream, P_TDH3

This study

E1-X01

E1-03, Δdld, P_TDH3-xylT-T_TEF1

This study

E1-X04

E1-05, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT5-IGG6

This study

E1-X05

E1-01, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-SsXYL1-IGG6-SsXYL2-T_TEF1

This study

E1-X06

E1-07, ΔPkXYL1 upstream, P_GDP-PkXUT1-IGG6

This study

E1-X07

E1-01, ΔADH1, P_TDH3-SsXKS1-T_TEF1

This study

E1-X08

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Mgt05196^N360F -T_TEF1

This study

E1-X09

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-RGT2-T_TEF1

This study

E1-X10

E1-01, ΔPkXYL1 upstream, P_TDH3-XUT6-IGG6

This study

E1-Xpg1140

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg1140-T_TEF1

This study

E1-Xpg1151

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg1151-T_TEF1

This study

E1-Xpg2942

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg2942-T_TEF1

This study

E1-Xpg3423

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg3423-T_TEF1

This study

E1-Xpg4178

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4178-T_TEF1

This study

E1-Xpg4562

E1-01, ΔURA3 upstream, P_TDH3-Xpg4562-T_TEF1

This study

E1-Xpg4764

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This study

E1-Xpg1758

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This study

E1-Xpg1807

E1-01, ΔEG17, P_TDH3-Xpg1807-T_TEF1

This study

E1-Xpg3179

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This study

E1-X13

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This study

E1-X14

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E1-X15

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This study

Plasmids

pCas-dldN20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting dld

This study

pCas-PkXYL1upN20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting PkXYL1

This study

pCas-URA3upN20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting URA3upstream

This study

pCas-ADH1N20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting ADH1

This study

pCas-EG17N20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG17

This study

pCas-EG4N20

Amp^r; Cas9; specific sgRNA targeting neutral site EG4

This study

Primer names	Primer sequences (5′→3′)
XUT1-F	ATGCACGGAGGTTCAGACGGTAATGACG
XUT1-R	GGCCGCTGATGCTGATGCTGACAGTGCTTAA
XUT5-F	ATGACGGAAAGAAGCATTGGACC
XUT5-R	TTACTTCTTTGTATTAACAACAAAACCTTG
XUT6-F	ATGTCCAGTGTTGAAAAAAGTGC
XUT6-R	TTAGCTGATGTTTTCGACATGCTC
P_TDH3-Mgt05196^N360F -F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCGTCGAATGAGCAGGTTACTCC
Ter-Mgt05196^N360F -R	AAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAAACCCTTTCGGCTTCGTCCACCTCAG
P_TDH3-SsXYL1-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCCTCCATTAAGTTGAAC
Ter-SsXYL1-R	AGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAACGAAGATTGGAATCTTATCCC
P_TDH3-SsXYL2-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTGCTAACCCATCTTTGGTCTTG
Ter-SsXYL2-R	AGAAGAAACTATCAGCTCACTCATTCTGGACCATCAATCAAACAC
P_TDH3-SsXKS1-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTACTACTCCATTTGATG
Ter-SsXKS1-R	GGTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACGTGCTTCAATTCAGATTCCATCTTAG
Xpg1140-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCTTCAGATAAGCATTGGCACTACG
Xpg1140-R	AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAGCATTTTCATAGCCTTGAAC
Xpg1151-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCACAAAATACACCCACTGC
Xpg1151-R	AGAAGAAACTATCAGCTCACTTATTCAAGCTTTTCTTGAGG
Xpg2942-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCTCAAGTTTACAAGAAGACTAGTGG
Xpg2942-R	AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAGTATTTGTCAATTGAAC
Xpg3423-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCTATCACAGTTTTCGGATC
Xpg3423-R	AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAAGTAACCAACCACGCTTTTCAAC
Xpg4178-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTTAAACAAACACTTAGG
Xpg4562-R	AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTATTTTTTCATATTTTGCATG
Xpg4764-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGGGTGTTCCAGCACTTTTCCG
Xpg4764-R	GAAGAAACTATCAGCTCACTTAATATCTGTTACCGTTGTTGTAG
Xpg1758-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAGCGTTCAAATTGATCAAAAG
Xpg1758-R	GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAATTAATGTGAGCAACTTCTGG
Xpg1807-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTAGACTTATTAAATAAAAAGG
Xpg1807-R	GGTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAAAATTCAGAAGAATTGTTAATTTC
Xpg3179-F	CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCTTCAAGTTCTATTTCAG
Xpg3179-R	GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAACGTTTTGATCGTTGACTAG
RGT2-F	CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGGGTTTAGAAGACAGTGCTCTC
RGT2-R	GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACCTATACAGAAGCTTCTTCAACTTCAG

Primer names

Primer sequences (5′→3′)

XUT1-F

ATGCACGGAGGTTCAGACGGTAATGACG

XUT1-R

GGCCGCTGATGCTGATGCTGACAGTGCTTAA

XUT5-F

ATGACGGAAAGAAGCATTGGACC

XUT5-R

TTACTTCTTTGTATTAACAACAAAACCTTG

XUT6-F

ATGTCCAGTGTTGAAAAAAGTGC

XUT6-R

TTAGCTGATGTTTTCGACATGCTC

P_TDH3-Mgt05196^N360F -F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCGTCGAATGAGCAGGTTACTCC

Ter-Mgt05196^N360F -R

AAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAAACCCTTTCGGCTTCGTCCACCTCAG

P_TDH3-SsXYL1-F

CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCCTCCATTAAGTTGAAC

Ter-SsXYL1-R

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P_TDH3-SsXYL2-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTGCTAACCCATCTTTGGTCTTG

Ter-SsXYL2-R

AGAAGAAACTATCAGCTCACTCATTCTGGACCATCAATCAAACAC

P_TDH3-SsXKS1-F

CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGACTACTACTCCATTTGATG

Ter-SsXKS1-R

GGTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACGTGCTTCAATTCAGATTCCATCTTAG

Xpg1140-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCTTCAGATAAGCATTGGCACTACG

Xpg1140-R

AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAGCATTTTCATAGCCTTGAAC

Xpg1151-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCACAAAATACACCCACTGC

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Xpg2942-R

AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAGTATTTGTCAATTGAAC

Xpg3423-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCCTATCACAGTTTTCGGATC

Xpg3423-R

AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAAGTAACCAACCACGCTTTTCAAC

Xpg4178-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTTAAACAAACACTTAGG

Xpg4562-R

AAGAAGAAACTATCAGCTCACTTATTTTTTCATATTTTGCATG

Xpg4764-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGGGTGTTCCAGCACTTTTCCG

Xpg4764-R

GAAGAAACTATCAGCTCACTTAATATCTGTTACCGTTGTTGTAG

Xpg1758-F

CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAGCGTTCAAATTGATCAAAAG

Xpg1758-R

GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAATTAATGTGAGCAACTTCTGG

Xpg1807-F

CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTAGACTTATTAAATAAAAAGG

Xpg1807-R

GGTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTCAAAATTCAGAAGAATTGTTAATTTC

Xpg3179-F

CACACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCTTCAAGTTCTATTTCAG

Xpg3179-R

GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACTTAAACGTTTTGATCGTTGACTAG

RGT2-F

CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGGGTTTAGAAGACAGTGCTCTC

RGT2-R

GTAAAAGAAGAAACTATCAGCTCACCTATACAGAAGCTTCTTCAACTTCAG

Enzyme	Cofactor	Relative activity/U^-1	Standard deviation
PkXR	NADPH	7.83×10^-4	4.88×10^-5
NADH	0	0
PkXDH	NADP⁺	7.92×10^-4	9.06×10^-5
NAD⁺	6.43×10^-3	9.58×10^-4
PkXK	NADPH	7.28×10^-4	2.14×10^-5
NADH	1.56×10^-3	6.07×10^-4

Enzyme

Cofactor

Relative activity/U^-1

Standard deviation

PkXR

NADPH

7.83×10^-4

4.88×10^-5

NADH

PkXDH

NADP⁺

7.92×10^-4

9.06×10^-5

NAD⁺

6.43×10^-3

9.58×10^-4

PkXK

NADPH

7.28×10^-4

2.14×10^-5

NADH

1.56×10^-3

6.07×10^-4

Sample name	YNBX10-1	YNBX10-2	YNBX10-3	YNBD10-1	YNBD10-2	YNBD10-3
Total reads	43 875 248	47 610 284	47 610 284	43 393 264	46 227 090	43 471 870
Total mapped	42 885 172 (97.74%)	46 528 186 (97.73%)	44 312 658 (97.93%)	42 745 235 (98.51%)	45 265 452 (97.92%)	42 836 789 (98.54%)
Uniquely mapped	42 117 293 (95.99%)	45 714 092 (96.02%)	43 671 882 (96.51%)	41 578 857 (95.82%)	44 217 482 (95.65%)	41 604 691 (95.7%)

Sample name

YNBX10-1

YNBX10-2

YNBX10-3

YNBD10-1

YNBD10-2

YNBD10-3

Total reads

43 875 248

47 610 284

43 393 264

46 227 090

43 471 870

Total mapped

42 885 172

(97.74%)

46 528 186

(97.73%)

44 312 658

(97.93%)

42 745 235

(98.51%)

45 265 452

(97.92%)

42 836 789

(98.54%)

Uniquely mapped

42 117 293

(95.99%)

45 714 092

(96.02%)

43 671 882

(96.51%)

41 578 857

(95.82%)

44 217 482

(95.65%)

41 604 691

(95.7%)