微生物学报

Primer names	Primer sequences (5′→3′)
TRPV4-Q-FP^[25]	GAGACAAGTGGCGTAAGTT
TRPV4-Q-RP	TCCTGTGAAGAGCGTGAT
β-actin-Q-FP^[25]	GGCTGTATTCCCCTCCATCG
β-actin-Q-RP	CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
16S-F^[26]	CCTACGGGNGGCWGCAG
16S-R	GACTACHVGGGTATCTAATCC
Bact934F^[27]	GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT
Bact1060R	AGCTGACGACAACCATGCAG
Bac32F^[28]	AACGCTAGCTACAGGCTT
Bac708R	CAATCGGAGTTCTTCGTG
Enterobacter cloacae-F	CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT
Enterobacter cloacae-R	CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA
TNF-α-F	ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC
TNF-α-R	GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA
IL-1β-F^[29]	CGTGCTGTCGGACCCATA
IL-1β-R	GGTGTGCCGTCTTTCATTAC
IL-6-F^[29]	TTCTTGGGACTGATGCTGGT
IL-6-R	CTCTGGCTTTGTCTTTCTTGTT

Primer names	Primer sequences (5′→3′)
TRPV4-Q-FP^[25]	GAGACAAGTGGCGTAAGTT
TRPV4-Q-RP	TCCTGTGAAGAGCGTGAT
β-actin-Q-FP^[25]	GGCTGTATTCCCCTCCATCG
β-actin-Q-RP	CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
16S-F^[26]	CCTACGGGNGGCWGCAG
16S-R	GACTACHVGGGTATCTAATCC
Bact934F^[27]	GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT
Bact1060R	AGCTGACGACAACCATGCAG
Bac32F^[28]	AACGCTAGCTACAGGCTT
Bac708R	CAATCGGAGTTCTTCGTG
Enterobacter cloacae-F	CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT
Enterobacter cloacae-R	CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA
TNF-α-F	ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC
TNF-α-R	GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA
IL-1β-F^[29]	CGTGCTGTCGGACCCATA
IL-1β-R	GGTGTGCCGTCTTTCATTAC
IL-6-F^[29]	TTCTTGGGACTGATGCTGGT
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Description	Parameters
Scan type/(m/z)	50-1 200
Ion source gas 1/(psi)	50
Ion source gas 2/(psi)	50
Curtain gas/(psi)	35
Source temperature/℃	500
IonSpray voltage floating (+)/V	5 500
IonSpray voltage floating (-)/V	-4 500
Interface heater	on
Declustering potential/V	80
Collision energy/eV	40±20

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Trpv4 基因编辑对小鼠肠道屏障及菌群-代谢微环境的影响

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阮浩龙 ¹^,²^,³ , 刘桂福 ¹^,²^,³ , 阿苏约布木 ¹^,²^,³ , 李广燕 ¹^,²^,³ , 于鸿浩 ¹^,²^,³^,⁴ , 岳鹏鹏 ¹^,²^,³^,⁴

微生物学报 | 研究报告 2026,66(5): 2498-2520

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(5): 2498-2520

Trpv4 基因编辑对小鼠肠道屏障及菌群-代谢微环境的影响

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阮浩龙¹^,²^,³, 刘桂福¹^,²^,³, 阿苏约布木¹^,²^,³, 李广燕¹^,²^,³, 于鸿浩¹^,²^,³^,⁴, 岳鹏鹏¹^,²^,³^,⁴

作者信息

^1.桂林医科大学，罕见病防治广西高校工程研究中心，广西桂林

^2.桂林医科大学，广西高校医药生物技术与转化医学重点实验室，广西桂林

^3.桂林医科大学人工智能医学院，广西桂林

^4.桂林医科大学检验与生物技术学院，广西桂林

Effects of Trpv4 editing on intestinal barrier and flora-metabolic microenvironment in mice

Haolong RUAN¹^,²^,³, Guifu LIU¹^,²^,³, Yuebumu ASU¹^,²^,³, Guangyan LI¹^,²^,³, Honghao YU¹^,²^,³^,⁴, Pengpeng YUE¹^,²^,³^,⁴

Affiliations

^1.Engineering Research Center of Rare Disease Prevention and Control, University of Guangxi, Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, China

^2.Key Laboratory of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, China

^3.School of Artificial Intelligent Medicine, Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, China

^4.School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, China

出版时间: 2026-05-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250631

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摘要

收起

目的瞬时受体电位香草酸4型(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是由Trpv4编码的非选择性阳离子通道，深度参与多器官系统的生理病理调控，但其突变对动物肠道及肠道菌群的综合影响机制尚未明确。本研究旨在探究Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A突变对小鼠肠道屏障完整性及菌群-代谢微环境的调控作用，为解析宿主基因与肠道菌群的互作机制提供实验依据。方法以实验室前期构建的Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A基因编辑小鼠为研究对象，采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting, WB)技术检测肠组织中Trpv4 mRNA及TRPV4蛋白的表达水平；通过病理切片观察肠道组织结构变化；结合16S rRNA基因高通量测序分析肠道菌群结构差异；利用LC-MS非靶代谢组学技术检测粪便代谢物变化，并分析菌群与代谢物的相关性。结果 Trpv4基因编辑导致小鼠肠组织Trpv4 mRNA转录及TRPV4蛋白表达异常，引发肠道组织结构异常及肠屏障功能损伤。肠道菌群分析显示，基因编辑小鼠肠道菌群稳态失衡，拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度显著升高，芽孢杆菌门(Bacillota)与拟杆菌门比例(F/B)显著下降，葡萄球菌属(Staphylococcus)等常见共生菌丰度降低。代谢组学分析表明，Trpv4基因编辑小鼠存在脂质代谢紊乱及免疫相关代谢物异常，其中拟杆菌门相关类群与脂质相关代谢物呈正相关，而脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterobacter)等则与部分脂质代谢物及免疫相关代谢物呈负相关。结论 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A基因编辑小鼠肠道屏障受损，肠道菌群结构与代谢微环境发生改变。本研究为解析特定基因突变与肠道菌群的互作提供了基础数据，也为Trpv4相关疾病的诊断与治疗策略开发提供了理论支撑。

关键词

Trpv4基因编辑 / 肠道菌群 / 16S rRNA基因高通量测序 / 非靶代谢组学

Abstract

收起

Objective Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4), a non-selective cation channel, is deeply involved in the physiological and pathological regulation of multiple organ systems, while the comprehensive influencing mechanism of its mutation on animal intestines and intestinal flora is not clear. This study explored the regulatory effects of Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A mutation on intestinal barrier integrity and flora-metabolic microenvironment in mice, aiming to provide an experimental basis for analyzing the interaction mechanisms between host genes and intestinal flora. Methods Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A gene-edited mice previously constructed in our laboratory were taken as the research objects, and the expression levels of Trpv4 and TRPV4 in the intestinal tissue were determined by qPCR and Western blotting, respectively. Pathological sections were prepared for observation of the structural changes of the intestinal tissue. The 16S rRNA gene high-throughput sequencing was conducted to reveal the structural differences of intestinal flora. Non-targeted metabolomics based on LC-MS was employed to examine the changes of fecal metabolites, and the correlations between flora and metabolites were analyzed. Results Trpv4 editing led to the abnormal expression of Trpv4 and TRPV4 in the intestinal tissue of mice, which resulted in the structural abnormality of the intestinal tissue and the impairment of intestinal barrier function. In addition, the gene-edited mice exhibited an imbalance in intestinal flora, with significantly increased relative abundance of Bacteroidota, a significantly decreased Bacillota/Bacteroidota (F/B) ratio, and reduced abundance of common commensal bacteria such as Staphylococcus. Metabolomic analysis indicated that the gene-edited mice presented disordered lipid metabolism and abnormalities in immune-related metabolites. The abundance of Bacteroidota was positively correlated with lipid metabolites, while that of Desulfovibrio and Enterobacter was negatively correlated with lipid and immune metabolites. Conclusion Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A gene-edited mice exhibited impaired intestinal barrier function, along with alterations in intestinal flora structure and the metabolic microenvironment. This study provides basic data for elucidating the interactions between specific gene mutations and the gut microbiota and offers theoretical support for the development of diagnostic and therapeutic strategies for Trpv4-related diseases.

Key words

Trpv4 editing / intestinal flora / 16S rRNA gene high-throughput sequencing / non-targeted metabolomics

引用本文

阮浩龙, 刘桂福, 阿苏约布木, 李广燕, 于鸿浩, 岳鹏鹏. Trpv4 基因编辑对小鼠肠道屏障及菌群-代谢微环境的影响. 微生物学报, 2026 , 66 (5) : 2498 -2520 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250631

Haolong RUAN, Guifu LIU, Yuebumu ASU, Guangyan LI, Honghao YU, Pengpeng YUE. Effects of Trpv4 editing on intestinal barrier and flora-metabolic microenvironment in mice[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (5) : 2498 -2520 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250631

正文

收起

瞬时受体电位香草酸4型(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是由Trpv4基因编码的非选择性阳离子通道蛋白^[1-2]，广泛分布于多种组织和器官^[3-5]，在渗透调节、机械应力等多种生理过程中发挥关键作用^[6-7]。此外，TRPV4通道与多种疾病相关，如关节炎、视网膜血管生成、肺水肿等^[8-10]。

近年来，TRPV4在肠道生理与病理机制方面的研究不断深入。研究表明TRPV4的激活会破坏肠上皮细胞的紧密连接，导致肠道通透性增加，进而削弱肠道对外界病原体和有害物质的防御能力^[11]。这种通透性的增加不仅影响肠道屏障的物理完整性，还可能改变肠道菌群的组成和功能。此外，在肠道炎症性疾病进程中TRPV4的异常激活可加剧肠道屏障功能障碍^[12-13]，驱动促炎细胞因子的级联释放，形成恶性循环，从而影响肠道菌群的微环境^[14-15]。Mihara等^[16]和Ye等^[17]的研究表明，TRPV4作为肠上皮机械感受与紧密连接调控通道，可通过影响肠黏膜屏障的完整性及通透性，间接调节宿主-菌群互作与肠道微生态稳态。

肠道菌群，也称为肠道微生物群，通过影响免疫功能、代谢和消化等各种生理过程，其代谢产生的氨基酸、脂肪酸、胆酸、胆碱等在维持人体健康方面起着至关重要的作用^[17]。研究发现，肠道菌群的组成和多样性与全身炎症、肥胖、胰岛素抵抗及血脂异常等病理状态密切相关^[18-20]。此外，肠道菌群及其代谢产物通过构建肠道免疫屏障，在抵御病原体入侵、调控肠道黏膜细胞增殖与修复等方面发挥着不可或缺的作用^[21-23]。随着分子生物学等领域的不断发展，越来越多的研究者开始聚焦于肠道，TRPV4在肠道领域的研究也在不断增多。尽管目前尚未有大规模研究将TRPV4突变与炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)或代谢综合征等肠道-菌群-代谢疾病明确关联，但有研究表明TRPV4在IBD患者结肠组织中的表达显著改变^[24]。

本实验室前期基于一个常染色体显性遗传病家系鉴定了致病性TRPV4 exon 8 c.1491+1G>A新突变，并利用CRISPR/Cas9技术将该突变精准引入小鼠同源位点，构建了携带Trpv4exon 8 c.1491+1G>A突变的基因编辑小鼠模型，该模型表现出骨骼异常及肺、肾、肠等多器官病理损伤^[25]。在此基础上，本研究聚焦于该基因编辑小鼠的肠道微环境，探究Trpv4exon 8 c.1491+1G>A突变对肠道屏障功能及菌群-代谢互作网络的影响，识别肠道微生态变化的细菌生物标志物，并探索潜在的新型治疗策略，以期为相关疾病的干预提供理论依据。

1 材料与方法

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1.1 研究对象

选取实验室早期通过CRISPR/Cas9技术制备的Trpv4exon 8 c.1491+1G>A基因编辑小鼠，包括同窝的纯合子(Hom)、杂合子(Het)和野生型(WT) C57BL/6J雄性小鼠各5只，15-18周龄。所有小鼠分笼饲养于桂林医科大学智能医学与生物技术学院动物实验室，室温为23-24 ℃，湿度为40%-60%，小鼠可自由摄食、饮水，昼夜周期各12 h。本研究所有动物实验获得桂林医科大学实验动物伦理委员会批准，编号为GLMC202103279。

1.2 样本采集

将15只小鼠按基因型分为Hom组、Het组和WT组，每组5只。在经过紫外灭菌的生物安全柜中采用拎尾法收集小鼠粪便样本至无菌EP管中。采集完成后，将样本-80 ℃保存。采集粪便样本后，将实验小鼠空腹放置1 d，随后麻醉并脱颈处死，进行组织取样，将收集到的组织置于-80 ℃保存。

1.3 DNA提取和测序

使用E.Z.N.A.^® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek公司)提取粪便基因组DNA。然后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。使用扩增细菌16S rRNA基因的通用引物(338F: 5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)靶向16S rRNA基因的V3-V4区扩增目标产物。PCR反应体系(20 μL)：5×TransStart FastPfu缓冲液4 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(5 µmol/L)各0.8 µL，DNA模板10 ng，ddH₂O补足至20 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27个循环；72 ℃终延伸10 min。QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，混合样品后，用2%琼脂糖凝胶回收产物完成文库构建，最后使用MiSeq测序仪进行双末端测序。

1.4 qPCR检测宿主基因及肠道菌属的表达水平

从小鼠肠组织和粪便样本中提取核酸用于qPCR分析。肠组织总RNA采用TRIzol法提取，并经氯仿、异丙醇及75%乙醇纯化；粪便DNA使用粪便基因组DNA提取试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)提取。使用NanoDrop 2000测定核酸浓度后，按照BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)体系进行扩增。PCR反应体系(20 μL)：BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.4 µL，DNA模板2 μL，ddH₂O补足至20 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃终延伸10 min。相关引物序列见表1。所有样本均设置3次重复，并通过溶解曲线验证扩增特异性。采用2^-ΔΔ^C^t方法计算目标基因及拟杆菌门(Bacteroidota)等的相对表达量。

1.5 蛋白质印迹(Western blotting, WB)检测蛋白的表达

将小鼠肠组织样本用含PMSF的Western/IP裂解液裂解，冰上孵育30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，统一浓度后加入SDS-PAGE loading buffer，95 ℃变性10 min。取等量蛋白(30 μg)经10% SDS-PAGE分离后电转至PVDF膜(Millipore公司)，用快速封闭液封闭20 min。PVDF膜分别孵育一抗：Anti-TRPV4抗体(Abcam公司，1:2 000)、Occludin Polyclonal antibody抗体(Proteintech公司，1:5 000)和β-actin抗体(Proteintech公司，1:5 000)、4 ℃过夜。TBST洗膜后加入二抗(Abmart公司，1:5 000)，室温孵育2 h。最后使用ECL发光试剂显影，并用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，进行定量比较。

1.6 免疫荧光染色检测Occludin表达

取小鼠结肠组织石蜡切片，依次脱蜡至水后，将切片置于枸橼酸缓冲液中加热进行抗原修复。随后用牛血清白蛋白进行封闭。加入Occludin一抗(1:200)，于4 ℃湿盒中避光孵育过夜；洗涤后加入山羊抗兔IgG二抗，避光孵育50 min。接着使用DAPI染液对细胞核进行复染，并淬灭组织自发荧光。封片后采集免疫荧光图像。

1.7 苏木精-伊红(HE)染色

将小鼠肠组织在4%多聚甲醛中固定48 h，然后脱水用常规石蜡包埋。组织切片厚4 µm，65 ℃烘烤3-4 h。用二甲苯脱蜡后，采用梯度乙醇溶液逐步洗涤切片，用苏木素伊红染色液染色，脱水，并用中性树胶密封。

1.8 阿利新蓝(alcian)染色

取小鼠肠组织用4%多聚甲醛固定48 h，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，切成4 µm厚的切片。切片常规脱蜡至水，随后将切片置于阿利新蓝染液中，在室温下染色30 min。染色结束后，用蒸馏水充分冲洗切片以去除多余染液，再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

1.9 肠道通透性检测

对小鼠进行12 h禁食处理(期间自由饮水)，随后对小鼠进行FITC-葡聚糖的灌胃处理，并在灌胃后继续禁食禁水4 h。通过眼球取血法收集0.8-1.0 mL血液样本，静置30 min后，取上清液按1:50 (血清:PBS)的比例用PBS缓冲液稀释。将稀释后的样本加入96孔板，采用酶标仪检测血液中荧光强度。

1.10 肠道菌群16S rRNA基因测序分析

采用Uparse算法进行序列分析^[30]。默认以97%的同一性聚集成操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)。利用RDP classifier^[31] (http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.11)结合Silva 16S rRNA基因数据库(v138)进行OTU物种分类学注释，置信阈值设置为70%，并在不同物种分类水平下统计每个样本的菌群结构组成。采用mothur软件(http://www.mothur.org/wiki/Calculators)计算Chao1、Shannon指数等α多样性指数^[32]，同时通过Wilcoxon秩和检验分析α多样性的组间差异；使用基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)检验样本间微生物群落结构的相似性，结合PERMANOVA非参数检验判断样本组间微生物群落结构差异的显著性；采用线性判别分析效应量(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析(http://huttenhower.sph.harvard.edu/LEfSe)^[33]，在LDA>3且P<0.05的条件下，于门至属的水平确定不同组间差异显著的肠道菌群，并使用PICRUSt2 (v2.2.0)软件进行16S rRNA基因功能预测分析^[34]。

1.11 小鼠粪便LC-MS非靶代谢组学分析

使用LC-MS检测小鼠粪便中的代谢物。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm，1.8 µm；Waters公司)；流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)；流速为0.40 mL/min，进样量为10 µL，柱温为45 ℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。数据矩阵用80%规则去除缺失值，即保留至少一组样品中非零值80%以上的变量，再进行填补空缺值(用原始矩阵中最小值填补空缺值)，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵。同时删除QC样本相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)>30%的变量，并进行对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵。具体参数如表2。利用R语言ropls包(v1.6.2)对预处理后的数据矩阵进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)及正交最小偏二乘判别分析分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis, OPLS-DA)。显著差异代谢物的筛选结合OPLS-DA模型计算的变量投影重要度(variable important in projection, VIP)与Student’s t检验P值来确定，筛选标准为VIP>1且P<0.05。利用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)对筛选出的差异代谢物进行代谢通路注释，明确其参与的生物学通路，同时结合Python软件包scipy.stats开展通路富集分析，通过Fisher精确检验筛选与实验处理关联最密切的生物学途径。

1.12 统计分析

本研究使用GraphPad Prism 9软件进行数据处理、绘图和组间分析，多组之间比较采用单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)，并结合Tukey事后检验，以P<0.05为差异有统计学意义。在所有的分析中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1，ns (not significant)表示P>0.05。

2 结果与分析

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2.1 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对小鼠肠道的影响

2.1.1 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对小鼠肠组织 Trpv4 表达的影响

从小鼠肠组织中提取到了较为完整的RNA (图1A)。qPCR分析发现，与WT小鼠相比，Trpv4基因编辑组(Het组和Hom组)的Trpv4 mRNA表达水平显著降低(图1B)。同时，结合WB实验结果可见，TRPV4蛋白的表达量也呈现出与mRNA水平同步下调(图1C、1D)。上述结果表明，Trpv4基因编辑小鼠肠组织不能转录出正常的Trpv4 mRNA，进而导致正常TRPV4蛋白的表达下降。生信分析表明，基因编辑小鼠Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A突变破坏了正常的剪接位点，导致外显子错配和开放阅读框提前终止，产生一个包含721个氨基酸的截短突变蛋白。

2.1.2 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对小鼠肠组织形态结构和肠屏障的影响

相较于WT小鼠，Trpv4基因编辑小鼠的结肠组织呈现出明显的形态学改变，结肠隐窝形态异常，黏膜下层增宽且出现水肿现象；结肠组织中杯状细胞排列紊乱、长度缩短，数量显著减少(图2A、2B、2E)。小肠组织的杯状细胞同样受到影响，表现为数量减少及黏液分泌功能受损(图2C、2D、2F)，提示肠道黏液屏障功能可能受到干扰。在通透性方面，Trpv4基因编辑小鼠纯合子的肠组织通透性显著增加(图2G)。

2.2 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变导致小鼠肠道菌群紊乱

2.2.1 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对肠道菌群多样性的影响

测序分析显示，Trpv4基因编辑小鼠肠道菌群在物种丰富度和多样性方面呈现一定的变化趋势，但差异不显著(图3A-3D)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)显示，第一主成分(PC1)可解释22.55%的菌群结构变异，Trpv4基因编辑组与WT组样本在PC1轴上呈现明显分离，经ANOSIM检验证实该分离具有统计学显著性(R=0.36, P=0.002) (图3E)；同时，非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)进一步验证了这一结果，其压力值为0.155 (<0.200，表明拟合效果可靠) (图3F)，3组样本在二维空间中形成清晰的分组聚集，Trpv4基因编辑组样本集中分布于右侧象限，WT组则分布于左侧象限，说明基因编辑小鼠肠道菌群结构相对野生型小鼠发生了改变。

2.2.2 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对小鼠肠道菌群组成的影响

在门水平上，芽孢杆菌门(Bacillota)、拟杆菌门(Bacteroidota)是小鼠肠道菌群的优势菌门。其中，Trpv4基因编辑组拟杆菌门的相对丰度高于WT组，而芽孢杆菌门、假单胞菌门(Pseudomonadota)和放线菌门(Actinomycetota)的相对丰度低于WT组(图4A)。在属水平上，Trpv4基因编辑组中未分类的鼠杆状菌科(unclassified_f__Muribaculaceae)、气球菌属(Aerococcus)的相对丰度升高，而葡萄球菌属(Staphylococcus)的相对丰度则显著下降(图4B)。进一步采用LEfSe分析方法确定组间的标志性菌属，拟杆菌门相关类群[拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、鼠杆状菌科等]是Trpv4基因编辑小鼠Hom组肠道特征菌；肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)在Het组的肠道菌群结构中发挥关键作用；而葡萄球菌属与g__unclassified_f__Anaerovoracaceae则是WT组的标志性菌属(图4C、4D)。通过多组差异检验进一步证实，Trpv4基因编辑组拟杆菌门的相对丰度显著高于WT组，而放线菌门和葡萄球菌属的相对丰度则显著低于WT组(图4E、4F)。

2.3 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变导致小鼠粪便代谢谱发生改变

本研究分析了QC样本的特征峰检出情况及代谢物鉴定比率。在正离子模式(pos)下，QC样本共检测到5 079个有效峰，其中1 829个被成功鉴定，鉴定比例为36.01%；在负离子模式(neg)下，共获得6 871个有效峰，成功鉴定的代谢物为1 295个，鉴定比例为18.85%。此外，在混合模式(mix)下共检测到11 950个有效峰，其中3 124个被鉴定，鉴定比例为26.14%。进一步对origin数据进行比对后，各模式下的有效峰数量与可鉴定代谢物比例(pos: 35.85%, neg: 19.17%, mix: 26.37%)与raw数据保持一致，仪器运行周期内峰型、峰强及离子响应较为稳定，代谢组数据质量可用于后续统计分析。

多元统计分析显示，Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A突变改变了小鼠的粪便代谢谱。在PLS-DA与OPLS-DA模型中，WT组与Het组、Hom组样本在代谢特征上呈明显分离(图5A-5C)。相较WT组，Trpv4基因编辑小鼠粪便中共有203种代谢物发生变化(图5D-5F)，其中151种上调、52种下调(VIP>1，P<0.05)。上调代谢物主要包括葫芦酸(cucurbic acid)、水杨酸(salicylic acid)、大豆苷(daidzin)、羟基去甲基博生坦(hydroxy desmethyl bosentan)和烯酮丙酮酸(enol-phenylpyruvate)等，涉及脂质代谢、芳香族化合物降解及药物代谢通路，提示与炎症反应及氧化应激相关的代谢网络被激活。下调代谢物如3-羟基-7,12-二酮胆烷酸(3-hydroxy-7,12-diketocholanoic acid)、N-花生四烯酰-3-羟基-γ-氨基丁酸(N-arachidonoyl-3-hydroxy-γ-aminobutyric acid)和七羟基去氧蟾蜍配基(telocinobufagin)等，主要参与胆汁酸代谢、鞘脂代谢等。这些变化表明，Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A基因编辑后脂质氧化与免疫代谢异常，肠道能量代谢与屏障功能可能受损。整体而言，Trpv4基因编辑重塑了肠道菌群的代谢微环境。

2.4 Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A 突变对肠道菌群功能及代谢途径的影响

为揭示Trpv4基因编辑对肠道菌群功能的影响，本研究基于PICRUSt2功能预测与KEGG代谢通路注释结果进行了综合分析。相对于WT小鼠，Trpv4基因编辑小鼠的肠道菌群在碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、能量代谢(energy metabolism)等关键功能通路的相对丰度均降低(图6A)。与营养吸收及物质转运相关的通路，如膜转运(membrane transport)和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)同样出现下降，表明Trpv4突变可能削弱了菌群的基础代谢功能。

依赖于肠道菌群的代谢微环境重塑在关键的菌群相关代谢物上得到了具体体现。肠道菌群的代谢物分析发现Trpv4基因编辑组中脂质氧化及免疫相关的代谢物相对量明显改变(图6B)，其中，升麻素(cimifugin)与岩芹酸(petroselinic acid)在Trpv4基因编辑小鼠中上调，前者为具有抗炎和抗氧化活性的植物源苯丙素类化合物，后者为单不饱和脂肪酸，参与脂质稳态调节和膜结构重塑。对甲基苯甲醛(p-tolualdehyde)、磺胺酸(sulfanilic acid)、月桂酸(dodecanoic acid)、扁豆苷素(lentialexin)等代谢物显著下调，这些分子主要涉及芳香族化合物代谢、含硫代谢及中链脂肪酸氧化过程。它们的减少说明Trpv4基因编辑小鼠存在菌群失衡与屏障功能障碍。

与此同时，KEGG通路富集分析揭示Trpv4基因编辑组的代谢扰动显著集中于能量代谢及相关疾病通路(图6C)。其中，与能量代谢相关的脂质代谢途径，如脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、脂肪的消化和吸收(fat digestion and absorption)、胆固醇代谢(cholesterol metabolism)以及脂肪细胞脂解的调控(regulation of lipolysis in adipocytes)等通路均发生明显改变。这从通路层面证实了该基因编辑会引发脂代谢紊乱。除此之外，疾病相关的代谢途径，如癌症的胆碱代谢(choline metabolism in cancer)、fc-γR-介导的吞噬作用(fc gamma R-mediated phagocytosis)、胰岛素抵抗(insulin resistance)等通路也呈现出变化。

基于代谢组学的GSEA通路富集分析(图6D)显示，正相关代谢物在排列图的前端聚集分布，表明基因编辑小鼠发生了系统性的代谢改变。Spearman秩相关分析显示(图6E)，16-羟-10-氧-十六烷酸(16-hydroxy-10-oxohexadecanoic acid)、神经酰胺[cer(d17:1/16:0)]、溶血磷脂酸[lysoPA(O-18:0/0:0)]等与拟杆菌属显著正相关。十七烷酸(heptadecanoic acid)、胆红素同分异构体[(4E,15Z)-bilirubin]、对甲基苯甲醛(p-tolualdehyde)与肠杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)显著正相关，灵芝酸K (ganoderic acid K)、岩芹酸与肠杆菌属、肠球菌属显著负相关。鸟嘌呤(guanine)与葡萄菌属、链球菌属呈显著正相关。亚油酸反式异构体(linoelaidic acid)、灵芝酸A (ganolucidic acid A)、(2″,6″-di-O-acetylononin)与嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、嗜黏阿克曼菌(Akkermansia)显著正相关。溶血磷脂酸、黄豆苷素II (glyceollin II)等与脱硫弧菌属负相关。同时，属水平肠道菌群共现性网络分析(图6F)显示Trpv4基因编辑导致肠道菌群种属间的生态互作网络改变，从复杂、稳定的共生状态(WT组)演变为正联接较少的紊乱状态(Hom组)。总体而言，这些代谢物与菌群的相关性主要集中在脂质代谢及氧化应激与炎症反应通路上。Trpv4基因编辑重塑了肠道菌群与代谢微环境。

2.5 实验验证菌群丰度、肠道炎症状态与紧密连接蛋白表达

为进一步确认关键菌群和肠道分子变化，本研究进行了qPCR、WB和免疫荧光染色验证。qPCR结果显示(图7A-7C) Trpv4基因编辑组小鼠肠道拟杆菌门、拟杆菌目显著上调，与16S rRNA基因测序结果一致。同时，阴沟肠杆菌等条件致病菌也在Trpv4基因编辑组显著富集。Trpv4基因编辑组炎症因子IL-1β、TNF-α与IL-6的表达显著升高(图7D-7F)，这与粪便代谢组分析中代谢和免疫紊乱结果相呼应。WB及免疫荧光结果均显示肠道紧密连接蛋白Occludin显著下调(图7G-7I)，其中免疫荧光观察到Hom组结肠上皮中Occludin信号减弱且连续性受损，而WT组呈现连续完整的表达分布。上述结果进一步表明，Trpv4基因编辑导致肠道紧密连接受损，肠道屏障功能下降，条件致病菌增多，肠道存在炎症反应和菌群紊乱。

3 讨论

收起

近年来，肠道菌群作为人体中生物多样性最为丰富的共生系统，通过复杂的代谢网络深度参与能量代谢、营养吸收及免疫调控等关键生理过程，不仅为宿主提供必需的能量与营养物质，还在维持免疫稳态、抵御病原体入侵等方面发挥核心作用，已成为生命科学领域的前沿研究热点^[35-36]。既往对于Trpv4基因的研究多聚焦于离子通道功能调控、疼痛感知及机械敏感性等方面的作用机制，而关于其与肠道菌群之间的交互作用及潜在调控机制的相关研究较少^[9,37]。本研究利用Trpv4基因编辑小鼠模型研究了Trpv4基因编辑对小鼠肠道屏障及菌群-代谢微环境的影响。

在本研究中，Trpv4基因编辑导致小鼠肠组织无法转录正常的Trpv4 mRNA，进而无法表达正常的TRPV4蛋白。HE染色发现，Trpv4基因编辑小鼠的肠组织中杯状细胞数量显著减少，且杯状细胞染色深度变浅，同时伴有黏膜下层水肿。Chen等^[38]、Mandile等^[39]和Peng等^[40]的研究表明，杯状细胞的减少会对肠黏膜屏障造成破坏，并且这一变化与IBD息息相关。结合本研究中肠通透性增加和连接蛋白Occludin下调的结果，认为Trpv4基因编辑会导致小鼠的肠屏障受损。

在肠道菌群结构方面，Trpv4基因编辑小鼠的芽孢杆菌门、脱硫菌门和放线菌门相对丰度下降，而拟杆菌门的丰度上升。传统上，芽孢杆菌门与拟杆菌门的比例(F/B)常被用于评估肠道菌群是否失调^[41]。本研究中Trpv4基因编辑小鼠肠道菌群的F/B比值减小，并且该F/B比值的变化趋势与IBD患者所表现出的变化相一致^[42]，表明Trpv4基因编辑可导致小鼠肠道菌群稳态紊乱，可能增加IBD的发病风险。值得注意的是，已有研究证实TRPV4离子通道的异常激活能够破坏肠道屏障完整性，加速IBD的病理进程^[43]，这与本研究结果一致，表明Trpv4基因编辑引发的肠道菌群紊乱与TRPV4通道功能异常可能存在协同作用，共同推动IBD的发生发展。此外，Trpv4基因编辑小鼠肠拟杆菌门相关类群、阴沟肠杆菌的丰度显著上升，在肠道菌群失衡时这些细菌可能转变为条件致病菌，通过破坏肠道屏障完整性、增加肠道通透性等机制，引发尿路感染、炎症等疾病^[44-46]。本研究推测Trpv4基因编辑后条件致病菌过度生长、菌群代谢紊乱的微生态状态可能进一步加剧肠道炎症和损伤，从而形成炎症与屏障损伤的正反馈循环。

粪便的非靶代谢组学分析结果显示，Trpv4基因编辑小鼠的脂质代谢通路受到抑制，其中月桂酸及扁豆苷素等关键代谢物的相对表达量显著降低。这一结果提示，脂肪酸代谢从“合成、氧化、修饰”的全过程均受到抑制，可能导致能量代谢效率下降^[47-48]。然而，免疫相关代谢物如岩芹酸、西风参素等的相对表达水平升高，这些代谢物具有抑制炎症反应、改善肠道屏障功能障碍的潜在作用^[49-51]，可能是机体对基因编辑诱导的肠道微生态失衡的代偿性调节机制。结合KEGG通路富集分析进一步发现，Trpv4基因编辑小鼠脂质代谢和免疫代谢相关通路呈现富集状态，表明其体内这两大代谢过程发生了系统性重塑^[52]。脂质作为生物膜的重要组成成分，同时参与能量储存与信号传导过程^[53]，其代谢异常可能引发一系列生理功能紊乱。Cӑtoi等^[54]的研究已证实，肠道菌群可通过分泌胆汁酸代谢酶、短链脂肪酸等代谢产物直接调控宿主脂质代谢过程。本研究通过整合差异肠道菌群与代谢物数据，鉴定出拟杆菌门相关属、脱硫弧菌属、肠杆菌属、肠球菌属等受Trpv4基因编辑影响显著的关键菌群，拟杆菌门相关类群的丰度与16-羟-10-氧-十六烷酸等多种脂质及类脂分子代谢物波动显著正相关，脱硫弧菌属与脂质代谢物及黄豆苷素II等免疫相关代谢物显著负相关，肠杆菌属和肠球菌属与十七烷酸等部分脂肪酸及免疫相关分子变化呈正相关，而与灵芝酸K等部分代谢物变化负相关。上述结果表明Trpv4 exon 8 c.1491+1G>A基因突变诱导了肠道菌群紊乱，重塑菌群代谢网络。

尽管本研究揭示了Trpv4基因编辑所引发的肠道屏障破坏、菌群结构变化和代谢异常，但仍有若干问题值得进一步深入研究。首先，当前证据主要基于多组学关联与共现分析，尚需通过时间序列与功能验证实验来明确因果关系。未来可在不同发育阶段追踪突变小鼠的屏障功能与菌群演替过程，或借助粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)模型解析菌群在代谢重塑中的直接作用机制。其次，菌群代谢物(如短链脂肪酸)是否通过TRPV4介导的上皮钙信号参与屏障稳态调控，有待在体外上皮细胞模型中进一步验证。此外，后续研究可通过 TRPV4药理调控试验确认表型的特异性与可逆性，并结合血清及组织代谢组学实现多层次代谢通路整合，从而更全面地揭示宿主-菌群-代谢网络的动态互作和深入分子机制。考虑到饲养环境与饮食因素可能对菌群组成产生潜在影响，未来研究将引入标准化饲养程序与交叉笼设计实验，进一步提高实验组间的可比性与结果的可靠性。

4 结论

收起

Trpv4exon 8 c.1491+1G>A基因编辑导致小鼠肠组织无法转录正常的Trpv4 mRNA，进而使TRPV4蛋白表达异常，引发肠道组织结构异常与肠屏障功能损伤。与此同时，该基因编辑致使小鼠肠道菌群稳态失衡，拟杆菌门丰度显著升高，芽孢杆菌门与拟杆菌门比例(F/B)下降，葡萄球菌属等常见共生菌相对丰度降低。Trpv4基因编辑小鼠还存在肠道菌群脂质代谢异常与免疫代谢物紊乱，其中拟杆菌门相关类群与脂质及类脂分子代谢物正相关，而脱硫弧菌属、肠杆菌属和肠球菌属则与部分脂质代谢物及免疫相关代谢物呈负相关。

基金

收起

国家自然科学基金(32160147)
国家自然科学基金(32460152)
广西高等教育本科教学改革工程项目(2023JGA271)

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文献

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2026年第66卷第5期

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文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250631

接收时间：2025-08-15
首发时间：2026-05-09
出版时间：2026-05-04

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作者

出版历史

收稿日期：2025-08-15
录用日期：2025-12-26

基金

The National Natural Science Foundation of China(32160147)

国家自然科学基金(32160147)

The National Natural Science Foundation of China(32460152)

国家自然科学基金(32460152)

The Guangxi Higher Education Undergraduate Teaching Reform Project(2023JGA271)

广西高等教育本科教学改革工程项目(2023JGA271)

作者信息

^1.桂林医科大学，罕见病防治广西高校工程研究中心，广西桂林

^2.桂林医科大学，广西高校医药生物技术与转化医学重点实验室，广西桂林

^3.桂林医科大学人工智能医学院，广西桂林

^4.桂林医科大学检验与生物技术学院，广西桂林

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250631

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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