微生物学报

Genome features	Value
Genome size/bp	4 470 512
G+C content/%	63.34
Gene number	4 155
Chromosome size/bp	4 049 701
Chromosome G+C content/%	63.57
Protein-coding genes/(CDS)	4 155
Total CDS length/bp	3 966 174
5S rRNA genes	6
16S rRNA genes	6
tRNA genes	53
23S RNA genes	23
sRNA genes	4

Genome features	Value
Genome size/bp	4 470 512
G+C content/%	63.34
Gene number	4 155
Chromosome size/bp	4 049 701
Chromosome G+C content/%	63.57
Protein-coding genes/(CDS)	4 155
Total CDS length/bp	3 966 174
5S rRNA genes	6
16S rRNA genes	6
tRNA genes	53
23S RNA genes	23
sRNA genes	4

Strain names	Genome size/Mb	G+C content/%	ANI value/%	Plasmids	GenBank number
Pu17	4.47	63.34	-	Chromosome, plasmid 1, plasmid 2, plasmid 3	-
P. ureafaciens DnL1-1	4.7	63.50	96.51	Chromosome, pADNL1, pADNL2	GCA_017357445.1
P. ureafaciens SD-1	5.1	63.50	96.39	Chromosome, unnamed 1, unnamed 2, unnamed 3, unnamed 4, unnamed 5, unnamed 6, unnamed 7	GCA_025919765.1
P. ureafaciens SD-2	4.9	63.50	96.45	Chromosome, unnamed 1, unnamed 2, unnamed 3, unnamed 4	GCA_025919745.1
P. ureafaciens YL1	4.7	63.50	96.49	Chromosome	GCA_014076395.1
P. ureafaciens AAC22	5.1	63.50	96.95	Chromosome, pAAC22-1, pAAC22-2, pAAC22-3, pAAC22-4	GCA_011393315.3
P. ureafaciens xwA7	4.7	63.00	96.47	Chromosome, plasmid	GCA_051027645.1
P. ureafaciens L-1	4.4	63.50	96.80	Chromosome	GCA_032598885.1
P. ureafaciens AT	4.6	63.50	96.78	Chromosome, pA, pB, pC, pD	GCA_022810785.1
P. ureafaciens CZY1	4.4	63.50	96.87	Chromosome, pCZY	GCA_016694995.1

Strain names	Genome size/Mb	G+C content/%	ANI value/%	Plasmids	GenBank number
Pu17	4.47	63.34	-	Chromosome, plasmid 1, plasmid 2, plasmid 3	-
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EC ID	Gene names	Gene mapping	Gene function	KEGG similarity/%
1.5.99.4	ndhC	Plasmid 1: 72 049: 74 763: -	Nicotine dehydrogenase subunit C	100.0
ndhA	Plasmid 1: 74 986: 75 618: -	Nicotine dehydrogenase subunit A	100.0
1.5.3.5	nctB, 6-hlno	Plasmid 1: 70 704: 71 966: -	(S)-6-hydroxynicotine oxidase	99.8
1.5.99.14	kdhA	Plasmid 1: 66 784: 67 674: +	6-hydroxypseudooxynicotine dehydrogenase subunit alpha	100.0
3.7.1.19	dhponh	Plasmid 1: 62 701: 63 786: +	2,6-dihydroxypseudooxynicotine hydrolase	99.7
1.14.13.10	dhpH	Plasmid 1: 57 606: 58 799: -	2,6-dihydroxypyridine 3-monooxygenase	100.0
3.5.1.107	nicF	Plasmid 3: 72 277: 72 828: +	Maleamate amidohydrolase	98.9
5.2.1.1	nicE, maiA	Chromosome 1: 3 883 908: 3 884 636: +	Maleate isomerase	98.8
1.1.1.328	nboR	Chromosome 1: 3 328 960: 3 329 571: +	Nicotine blue oxidoreductase	100.0
1.5.3.21	mao	Plasmid 1: 29 566: 30 831: -	4-methylaminobutanoate oxidase (methylamine-forming)	99.8
1.5.3.19	mabO	Plasmid 1: 36 195: 38 669: -	4-methylaminobutanoate oxidase (formaldehyde-forming)	100.0
1.2.1.16 1.2.1.79 1.2.1.20	gabD	Chromosome 1: (1 165 530: 1 167 011: +)	Succinate-semialdehyde dehydrogenase/ glutarate-semialdehyde dehydrogenase	85.4
(1 773 781: 1 775 220: -)	99.4
(1 871 582: 1 872 937: +)	99.3
Plasmid 1: (32 025: 33 263: +)	91.7
(194 584: 196 068: -)	91.4
(217 819: 219 195: +)	71.8
Plasmid 2: 12 595: 13 974: +	90.4

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1.5.99.4	ndhC	Plasmid 1: 72 049: 74 763: -	Nicotine dehydrogenase subunit C	100.0
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Plasmid 2: 12 595: 13 974: +	90.4

产脲节杆菌Pu17通过吡啶途径降解烟碱解析

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黄应群 ¹ , 李昂 ² , 李佳颖 ¹ , 骆君华 ¹ , 金锦杭 ¹ , 袁春辉 ¹ , 许小霞 ² , 金丰良 ²

微生物学报 | 研究报告 2026,66(5): 2462-2480

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(5): 2462-2480

产脲节杆菌Pu17通过吡啶途径降解烟碱解析

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黄应群¹, 李昂², 李佳颖¹, 骆君华¹, 金锦杭¹, 袁春辉¹, 许小霞², 金丰良²

作者信息

^1.湖南省烟草公司永州市公司，湖南永州

^2.华南农业大学植物保护学院，绿色农药全国重点实验室，广东广州

Elucidation of nicotine via the pyridine pathway by Paenarthrobacter ureafaciens Pu17

Yingqun HUANG¹, Ang LI², Jiaying LI¹, Junhua LUO¹, Jinhang JIN¹, Chunhui YUAN¹, Xiaoxia XU², Fengliang JIN²

Affiliations

^1.Hunan Tobacco Company Yongzhou Company, Yongzhou, Hunan, China

^2.State Key Laboratory of Green Pesticide, College of Plant Protection, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong, China

出版时间: 2026-05-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250905

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摘要

收起

目的针对上部烟叶烟碱含量过高所引发的生产和环境问题，以前期筛选获得的高效烟碱降解菌Pu17为研究对象，利用基因组学方法系统解析其降解烟碱的分子机制。方法采用平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)分析确定其分类地位；通过全基因组测序与注释阐明烟碱代谢通路；利用MS/MS技术检测降解过程中的关键中间产物；通过活体试验探究降解烟碱的最佳施用方法。结果系统发育分析表明，Pu17与产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)的ANI值为96.51%，鉴定Pu17为产脲节杆菌。其基因组大小为4.47 Mb，G+C含量为63.34%，编码4 155个蛋白。功能注释与比较基因组学分析发现，Pu17在重金属抗性、细胞表面合成及代谢潜能方面具有独特的基因簇，构成了其环境适应性策略。代谢产物分析检测到6-羟基假氧尼古丁等关键中间体，结合基因组分析证实Pu17通过吡啶途径降解烟碱，其关键基因(如nboR、mao、6-hlno等)主要位于质粒上。降解效能评估显示，Pu17发酵液在烟草植株(叶面喷施与根灌)应用中均能有效降低烟碱含量，活体烟叶中最大降解率达14.00%。结论本研究从基因组学、代谢组学及应用层面系统阐明了P. ureafaciens Pu17降解烟碱的分子机制与应用潜力，为基于微生物的烟草废弃物修复及降害技术开发提供了理论依据和菌种资源。

关键词

烟碱 / MS/MS / Pu17菌株 / 全基因组分析

Abstract

收起

Objective In view of the production and environmental issues caused by excessively high nicotine content in upper tobacco leaves, this study aims to decipher the molecular mechanism of nicotine degradation by an efficient nicotine-degrading strain Pu17 screened out in the previous study via genomic approaches. Methods The taxonomic status of the strain was determined by average nucleotide identity (ANI) analysis. Whole genome sequencing and annotation were employed to clarify the nicotine metabolic pathway. Key intermediates during degradation were detected by MS/MS. Live plant trials were conducted to explore the optimal application method for nicotine reduction. Results Phylogenetic analysis revealed an ANI value of 96.51% between Pu17 and Peanarthrobacter ureafaciens, identifying Pu17 as a strain of P. ureafaciens. The genome of Pu17 was 4.47 Mb in length, with the G+C content of 63.34%, encoding 4 155 proteins. Functional annotation and comparative genomics identified unique gene clusters related to heavy metal resistance, cell surface synthesis, and metabolic potential in Pu17, which constituted its environmental adaptation strategy. Metabolite analysis detected key intermediates such as 6-hydroxypseudooxynicotine. This result, combined with that of genomic analysis, confirmed that Pu17 degraded nicotine via the pyridine pathway, with key genes (e.g., nboR, mao, and 6-hlno) primarily located on plasmids. Efficacy evaluation demonstrated that the Pu17 fermentation broth effectively reduced nicotine content in tobacco plants through both foliar spraying and root irrigation, achieving a maximum degradation rate of 14.00% in live leaves. Conclusion This study systematically elucidates the molecular mechanism and application potential of P. ureafaciens Pu17 for nicotine degradation from genomic, metabolomic, and application perspectives. It provides a theoretical basis and microbial resources for the development of bioremediation technologies for tobacco waste and harm reduction.

Key words

nicotine / MS/MS / strain Pu17 / whole genome analysis

引用本文

黄应群, 李昂, 李佳颖, 骆君华, 金锦杭, 袁春辉, 许小霞, 金丰良. 产脲节杆菌Pu17通过吡啶途径降解烟碱解析. 微生物学报, 2026 , 66 (5) : 2462 -2480 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250905

Yingqun HUANG, Ang LI, Jiaying LI, Junhua LUO, Jinhang JIN, Chunhui YUAN, Xiaoxia XU, Fengliang JIN. Elucidation of nicotine via the pyridine pathway by Paenarthrobacter ureafaciens Pu17[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (5) : 2462 -2480 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250905

正文

收起

烟草是我国重要的经济作物，其所含的尼古丁(烟碱)通常占烟草总生物碱含量的95%左右^[1]。尼古丁由一个氢化吡咯烷环和一个吡啶环构成，近年来由于烟草种植中氮肥施用过量，导致烟叶中尼古丁积累过多，在某些情况下可达烟叶干重的6%，严重影响其吸食品质^[2]。研究表明，烟叶中淀粉与尼古丁含量过高、还原糖含量偏低，易导致烟气粗糙、刺激性强、香气不足及口感不协调等问题。其中，尼古丁含量过高已成为制约我国烟叶品质提升的关键因素之一^[3]。此外，卷烟加工过程中产生的烟草废弃物中也含有大量尼古丁。种植与加工环节残留的尼古丁可能通过雨水淋溶进入地下水，造成环境污染。更值得关注的是，尼古丁可穿透生物膜及血脑屏障，对人体组织与细胞产生毒性效应^[4]。因此，欧盟早在1999年已将烟草废弃物列为有毒有害废弃物^[5]。目前常用的尼古丁削减技术主要包括农业调控、物理化学处理及微生物降解3类。然而，农业手段存在育种周期长、操作复杂等局限；物理化学方法则成本较高，且可能带来二次污染。相比之下，微生物降解尼古丁具有效率高、环境友好等优势，被认为是降低烟叶和环境介质中尼古丁含量的潜在有效途径^[6-7]。

微生物作为自然界的重要分解者，代谢方式多样、繁殖迅速，在土壤生态修复、质量改良及尼古丁降解等方面展现出高效、低污染和可持续的应用潜力^[8-9]。目前已报道的尼古丁降解微生物主要通过吡咯途径、吡啶途径及吡咯-吡啶途径进行代谢，常见菌属包括假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、农杆菌属(Agrobacterium sp.)、申氏菌属(Shinella sp.)及苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)等^[2,10-12]。

然而，国内关于节杆菌属降解尼古丁的研究相对有限，现有报道多集中于菌株对离体尼古丁或烟叶中尼古丁的降解效果，对其分子机制与代谢途径的系统阐述仍较为缺乏。目前研究多集中于微生物直接处理烟叶，尚未系统探讨施用方式及烟草生长时期对降解效果的影响。已有研究显示，在适宜条件下节杆菌对尼古丁具有可观的降解潜力：李旭^[13]报道的节杆菌粗酶在100 mg/L尼古丁条件下，于最适温度30-40 ℃、最适pH 7.0-8.0范围内降解率可达97.6%-96.9%；邓娜娜等^[14]分离的Arthrobacter sp. AH14在120 h内可完全降解6 g/L尼古丁，对14 g/L尼古丁的降解率为30.22%；帖金鑫等^[15]通过响应面优化Arthrobacter sp. Z3降解白肋烟尼古丁的工艺，在最佳条件下降解率达31.06%。另据报道，利用烟草节杆菌GYC103发酵处理烟叶12 h后，烟叶中烟碱、淀粉和蛋白质含量分别降低4.32%、32.50%和8.20%，总糖与还原糖含量则分别增加13.51%和10.02%，感官品质显著改善^[16]。

本实验室从湖南烟草种植区分离得到一株产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens) Pu17^[17]。该菌株具有蛋白酶活性，最适生长条件为烟碱浓度2.0 g/L、温度30 ℃、pH 6.0；生长曲线分析显示，其在LB培养基中延滞期显著短于纯烟碱培养基；Pu17能以烟碱为唯一碳氮源，在48 h内降解率达92.75%，在LB培养基中60 h降解率为90.57%^[17]。目前，基于多组学系统阐述节杆菌降解尼古丁分子机制的研究尚属空白。为此，本研究综合利用基因组学等方法深入探究Pu17降解尼古丁的分子机制，以期为尼古丁降解的吡啶途径提供新见解，并为相关微生物资源的开发应用提供理论依据。

l　材料与方法

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1.1 菌株Pu17的全基因组测序与组装

将Pu17的单菌落接种于LB液体培养基，于30 ℃、150 r/min培养至对数生长期，即OD₆₀₀=0.6-0.8之间。随后，在4 ℃、10 000×g离心5 min收集菌体。取1 g湿菌体样品送至华大基因进行全基因组测序。测序采用从头测序策略：首先将提取的基因组DNA随机片段化，经电泳筛选并回收目标片段，连接接头以构建测序文库；使用建库试剂盒(Oxford Nanopore公司)完成文库制备。采用DNBSEQ Platform和Nanopore Platform测序平台，BGISEQ Dat为288×，测序深度为PE100，reads N50为17 134。利用Canu软件(v1.5)对所得序列进行基因组从头组装。最后，使用gene ontology (GO) (http://geneontology.org/)、KEGG (https://www.kegg.jp/)和clusters of orthologous genes (COG) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/COG/)数据库对组装获得的基因组序列进行通用功能注释。

1.2 平均核苷酸一致性(ANI)分析

基于16S rRNA基因序列比对结果，从NCBI Assembly数据库中下载与菌株Pu17所在属级分支对应的各参考菌株全基因组序列。采用OAT软件(v0.90)计算各参考菌株与Pu17之间的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)值，以评估系统发育相关性。在比较基因组学中，ANI与数字DNA-DNA杂交值常共同作为物种划分的关键指标，通常认为数字化DNA-DNA杂交(digital DNA-DNA hybridization, dDDH)值≥70%或ANI值≥95%的菌株可归为同一物种。本研究的ANI分析与dDDH分析分别通过EzBioCloud在线平台(https://www.ezbiocloud.net/)及GGDC 3.0网站(https://ggdc.dsmz.de)完成。为进一步明确Pu17的系统发育地位，从比对结果中筛选ANI值大于95%的菌株，自NCBI获取其全基因组序列，并将Pu17与这些近缘种进行单核苷酸水平上的全基因组比对，以更精确地解析其进化关系与遗传相似性。

1.3 染色体比对分析

从NCBI数据库下载P. ureafaciens及相关种属的菌株全基因组序列。首先，随机选取包括Arthrobacter agilis、A. bambusae、A. citreus等在内的12株代表性菌株。采用BGRI软件(v0.95)将Pu17菌株的染色体1与上述菌株的染色体1进行全基因组比对。其次，专门针对P. ureafaciens种内菌株，自NCBI随机选取包括P. ureafaciens DnL1-1、SD-1、YL1等在内的12株菌株。同样使用BGRI软件(v0.95)，对Pu17染色体1与这些菌株的染色体1进行系统比对分析。

1.4 菌株Pu17烟碱代谢通路基因簇预测

基于KEGG自动注释系统(KEGG automatic annotation server, KAAS)与BlastKOALA工具，对Pu17全基因组编码的4 155个基因进行功能注释。通过关键词nicotine degradation、nicotinate metabolism及酶编号(EC number)进行初步筛选。利用KEGG MODULE数据库中的M00811模块(尼古丁降解吡咯烷途径)与map00760通路(烟酸与烟酰胺代谢)进行精细匹配与通路重构。

1.5 Pu17代谢烟碱产物的MS/MS分析

为解析菌株Pu17对烟碱的代谢过程，设计了体外降解实验。将对数生长期的Pu17种子液按体积分数为1%的接种量接入以烟碱为唯一碳氮源(初始浓度2 g/L)的无机盐培养基，并设置灭菌培养基作为阴性对照。于30 ℃、150 r/min条件下培养，分别在接种后24 h和48 h取样。样品经10 000 r/min离心10 min后，取上清液过0.22 μm滤膜，滤液于-20 ℃保存备用。代谢产物采用超高效液相色谱-串联质谱(Agilent公司)进行分析。色谱分离在BEH-C18反相色谱柱上进行，柱温35 ℃。流动相为甲醇:水(10:90，体积比)，等度洗脱，流速1 mL/min，检测波长259 nm。质谱采用正离子模式，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔电压3 kV。通过比对实验组与对照组的代谢谱差异，系统鉴定烟碱降解过程中的中间代谢物。

1.6 Pu17降解活体烟草烟碱的最适施用方式测定

1.6.1 菌液制备

挑取Pu17单菌落接种于LB液体培养基，于30 ℃、150 r/min培养至OD₆₀₀=0.6-0.8。将发酵液以体积比1:15的比例与水混匀，作为Pu17施用液；将等量LB培养基同比例稀释，作为对照液。

1.6.2 施用频次实验

设计5种叶面喷施处理，以当天17:00施用为基准，分别记为单次喷施(A1，即17:00施用)，以及在此基准时间点之前额外喷施1次(A2，即14:00和17:00施用)、2次(A3，即11:00、14:00和17:00施用)、3次(A4，即8:00、11:00、14:00和17:00施用)、4次(A5，即5:00、8:00、11:00、14:00和17:00施用)。每个处理于施用24 h后，采集植株自上而下第5片叶，每组20片叶，试验重复3次。

1.6.3 根部灌施效果检测

以每株400 mL的剂量，将Pu17施用液浇灌于烟草根部作为处理组，以等量对照液灌根作为对照组。于灌施后不同时间点采集第5片叶，采样方案同1.6.2节。

1.6.4 施用时期与方式组合实验

设计6种处理组合：采摘期叶施(P-L)、打顶期叶施(T-L)、两期双次叶施(D-L)、采摘期根灌(P-R)、打顶期根灌(T-R)、两期双次根灌(D-R)。以喷施对照液为对照。于采摘期处理后72 h采集烟叶，采样方案同1.6.2节。

烟草烟叶中烟碱含量检测参照李佳颖等^[17]的方法。

1.7 数据统计与分析

采用GraphPad Prism (v8.0)进行图表绘制，并运用IBM SPSS Statistics (v25.0)对进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。

2　结果与分析

收起

2.1 菌株Pu17的基因组序列组装及基本信息

为解析产脲节杆菌(P. ureafaciens)菌株Pu17的遗传背景，本研究对其进行了全基因组测序并完成图水平的组装。组装结果表明，Pu17的完整基因组由1个环状染色体和3个质粒构成(图1)，总大小为4.47 Mb，整体G+C含量为63.34%。共预测到4 155个蛋白编码基因(coding sequence, CDS)，总长度为3.97 Mb，占基因组总长度的88.73%。

染色体大小为4 049 701 bp，G+C含量为63.57%。3个附属质粒的大小与碱基组成各异：其中最大者为质粒1 (219 760 bp，G+C含量60.11%)，其次为质粒2 (113 710 bp，G+C含量61.65%)和质粒3 (87 341 bp，G+C含量62.81%)。此外，基因组中注释到6个5S rRNA基因、6个16S rRNA基因、23个23S rRNA基因、53个tRNA基因以及4个sRNA基因(表1)。Pu17基因组已上传ScienceDB，DOI：10.57760/sciencedb. j00231.00039。

2.2 基于ANI比对的属间物种分类鉴定

Pu17的16S rRNA基因经PCR扩增和测序，确认其全长为1 365 bp。通过将16S rRNA基因上传至NCBI进行BLAST比对，Pu17与Arthrobacter sp. HS-B2 (GenBank登录号为F901933.1)的16S rRNA基因高度相似，相似度为100.00%^[17]。基于ANI分析，菌株Pu17与产脲节杆菌(P. ureafaciens)中的参考菌株(GenBank登录号为GCA_017357445.1)的ANI值为96.51%，高于细菌物种划界的公认阈值(95%)，因此确定Pu17属于该物种。与之相比，Pu17与其余分析的45个菌株间的ANI值均低于90.00%，进一步支持其与P. ureafaciens在系统发育上的紧密关系(图2A)。基于上述结果，该菌株被鉴定为产脲节杆菌(P. ureafaciens) Pu17。为进一步探究其基因组特征，将Pu17与从NCBI数据库中获取的12株节杆菌属(Arthrobacter)菌株的核心染色体(染色体1)进行了比较。结果显示，这些染色体在整体上保持较高的序列相似性与共线性，体现了该属核心基因组的保守性。然而，在约1 700-2 000 kb区域(标记为b1)观察到显著的结构差异。该区域在Pu17中包含287个编码序列(CDS编号为Epu17GL001547-Epu17GL001833)。功能注释表明，这些基因广泛参与多种生物学过程，主要包括代谢(96个基因)、环境信息应答(34个基因)和遗传信息处理(13个基因)，此外也涉及细胞过程、人类疾病及器官系统等相关功能(分别为9、7和9个基因)。该差异区域的基因组成特征可能反映了Pu17在特定代谢途径或环境适应性方面与其他节杆菌属菌株的功能分化(图2B)。

2.3 基于ANI比对的种间物种分类鉴定

为明确菌株Pu17的分类地位，本研究基于ANI将其与多个产脲节杆菌(P. ureafaciens)菌株进行了比较基因组分析。所有比对结果显示，Pu17与这些菌株的ANI值介于96.39%-96.95%，均稳定高于细菌物种界定的公认阈值(95%)，其中与P. ureafaciens AAC22的相似性最高(96.95%)。该结果强有力地支持将Pu17归类为产脲节杆菌，并表明其与该物种的核心菌群具有密切的系统发育关系。进一步将Pu17的染色体1与从NCBI数据库获取的9株P. ureafaciens的染色体1进行共线性比较(图3B)。结果显示，Pu17染色体1与这些菌株在大部分区域呈现高度相似性，表明核心染色体结构保守。但在两处特定区域(约990-1 010 kb与3 100-3 150 kb)存在明显差异。这些差异区域分别对应以下基因簇及其预测功能。位于990-1 010 kb的区域：该区域包含terC、arsR、dptH基因，分别编码碲酸盐抗性蛋白TerC、参与砷/锑胁迫应答的ArsR家族转录调控因子，以及依赖DNA硫修饰的限制性内切酶DptH。位于3 100-3 150 kb的区域：该区域基因簇功能更为多样，主要涉及细胞壁/荚膜多糖合成、糖核苷酸代谢及部分次级代谢途径。细胞壁/荚膜合成相关：如壁酸转运蛋白(TagH, tagG)、糖基转移酶(WcaI, MshA)、壁酸转移酶(TagT_U_V)及CDP-核糖醇磷酸转移酶(TarL)等。糖核苷酸代谢相关：如葡萄糖-1-磷酸胸苷酰转移酶(RfbA)、dTDP-鼠李糖合成酶(RmlA, RffH, RfbCD, RmlCD)和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GalU)等。其他功能：如纤维素合酶(BcsA)、几丁质酶、信号肽酶I (SipW)、二酰甘油激酶(DagK)、苯乙酰辅酶A代谢酶(PaaG, PaaE)以及辅酶F420氢化酶亚基(FrhB)等。这些基因簇的存否或序列差异可能反映了Pu17在环境适应(如重金属抗性)、细胞表面结构合成或特定代谢潜能方面与其他产脲节杆菌菌株的分化。

2.4 Pu17菌株基因功能注释

通过对COG、GO及KEGG数据库进行功能注释分析，Pu17菌株的基因组显示出显著的代谢功能特征。在COG分类中，注释到的3 587个基因主要富集于代谢(metabolism)类别，共1 772个基因，表明该菌株具有活跃的代谢潜能(图4A)。GO注释结果进一步支持这一发现：在7 606个注释基因中生物过程(biological process)涵盖基因数量最多(共计3 888个)，其中又以细胞过程(cellular process) (共计1 856个基因)和代谢过程(metabolic process) (共计1 666个基因)为主(图4B)。同样地，KEGG通路分析显示，在总计3 180个注释基因中隶属于代谢(metabolism)大类的基因多达2 441个，数量远超环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)等其他类别(图4C)。这些结果共同表明，Pu17基因组编码了丰富且多样化的代谢功能体系。

2.5 产脲节杆菌Pu17菌株的基因组分析

产脲节杆菌菌株Pu17的完整基因组由一条环状染色体和3个质粒组成。染色体大小为4 049 701 bp，G+C含量为63.57%；3个质粒的大小分别为219 760、113 710和87 341 bp，共同构成总大小为4.47 Mb、平均G+C含量为63.34%的完整基因组(表2)。比较基因组分析显示，该物种的基因组结构呈现一定多样性，其质粒数量在不同菌株间差异显著，例如菌株P. ureafaciens L-1不含任何质粒，而菌株P. ureafaciens SD-1则携带多达7个质粒。在此背景下，Pu17的基因组总大小(4.47 Mb)和G+C含量均处于该物种已知的范围内(基因组大小4.40-5.10 Mb，G+C含量约63.50%)，符合产脲节杆菌的典型基因组特征。

2.6 菌株Pu17烟碱代谢基因簇分析

KEGG注释结果表明，菌株Pu17的基因组携带与吡啶途径烟碱代谢相关基因高度同源的序列。分析发现，参与烟碱降解的关键基因簇主要分布于质粒1上，另有1个基因位于质粒3，2个基因位于染色体(图5A)。这些基因包括ndhC、ndhA、6-hlno、kdhA、dhponh、dhpH、nicF、nicE、maiA、nboR、mao、mabO、gabD等，共同构成协同降解烟碱的遗传基础(图6)。

进一步比对显示，Pu17中多个烟碱代谢基因与已知同源基因相似度较高(表3)。其中，尼古丁脱氢酶亚基C (ndhC)、6-羟基假氧化尼古丁脱氢酶α亚基(kdhA)、2,6-二羟基吡啶-3-单加氧酶(dhpH)、尼古丁蓝氧化还原酶(nboR)及4-甲氨基丁酸氧化酶(产甲醛) (mabO)的相似度均为100.0%；(S)-6-羟基尼古丁氧化酶(6-hlno)为99.8%；2,6-二羟基假氧化尼古丁水解酶(dhponh)为99.7%；马来酰胺酸酰胺水解酶(nicF)为98.9%；马来酸异构酶(nicE)为98.8%；4-甲氨基丁酸氧化酶(产甲胺) (mao)为99.8%。此外，马来酸顺反异构酶(iso)、2,5-二羟基吡啶双加氧酶(hpo)和尼古丁脱氢酶亚基A (ndhA)的相似性分别为97.2%、94.7%和91.6%，为相似度差异最为显著的3个基因(图5A、表3)。

2.7 Pu17代谢烟碱产物MS/MS检测

基于MS/MS分析技术，对菌株Pu17代谢烟碱的产物进行了鉴定。如图5所示，在代谢过程中检测到3种关键中间产物，分别为6-羟基假氧尼古丁(6-hydroxypseudooxynicotine)、6-羟基-N-甲基肌胺(6-hydroxy-N-methylmyosmine)以及马来酸盐(maleamate)，三者均属于烟碱吡啶降解途径的特征代谢物。具体而言，6-羟基-N-甲基肌胺的母离子质荷比(m/z)为195.112 7，主要碎片离子为66.034 2、94.028 7、122.023 8、148.075 5和164.070 8 m/z，与图5B的质谱特征一致。6-羟基假氧尼古丁对应的母离子质荷比(m/z)为177.102 2，其碎片离子包括103.054 3、120.080 8、130.065 0及148.075 7 m/z，与图5C所示的质谱信号高度匹配。马来酸盐的母离子质荷比(m/z)为118.086 4 m/z，碎片离子包括58.065 5、71.013 3和99.008 0 m/z，与图5D的谱图吻合良好。上述代谢产物的鉴定结果进一步证实，Pu17主要通过吡啶途径降解烟碱(图6)，为其烟碱代谢机制提供了直接的质谱证据。

2.8 Pu17通过不同方式处理对活体烟草烟叶中烟碱的降解效果

本研究测定了Pu17通过不同方式处理对活体烟草烟叶中烟碱的降解效果。结果表明，叶面喷施Pu17可有效降低烟叶烟碱含量。其中，喷施3次的处理组效果最为显著，烟碱含量较对照组下降19.98%；喷施1、2、4、5次的处理组之间虽无显著差异，但烟碱含量均显著低于对照组(图7A)。根灌处理同样显著降低了烟叶烟碱含量，在处理后42 h烟碱降低幅度最大，降解率为13.46%；24 h和72 h的降解率分别为8.87%和9.18% (图7B)。不同根灌次数处理均能显著降低烟碱含量，其中根灌3次和4次的降解效果较为突出，降解率分别为13.45%和15.60%，且显著优于根灌1次和2次处理(图7C)。此外，不同施用时期的结果显示，仅在打顶期进行喷施(P=0.936)或根灌(P=0.525)对烟碱含量无显著影响；而在采摘期(P=0.035)与双期喷施(P=0.012)均可显著降低烟碱含量，双期根灌也呈现显著的降低趋势(P=0.012)。其中，双期喷施处理的效果最佳，烟碱降解率达到14.00% (图7D)。

3　讨论与结论

收起

全基因组测序技术的快速发展显著推动了比较基因组学研究的深入^[18]。基于微生物基因组ANI的分析方法已成为物种分类与鉴定不可或缺的重要工具^[19-20]。该技术不仅深化了对微生物代谢网络及其调控机制的理解，也为新型抗生素、工业酶及污染物降解相关基因资源的挖掘提供了强大手段，拓展了其在生物技术领域的应用前景。研究表明，通过将目标基因组与多株已知菌株进行系统发育比较能够构建可靠的发育树，进而揭示物种适应性进化及功能多样性的遗传基础^[21]。本研究综合运用生物信息学方法筛选具有烟碱降解潜力的微生物资源，系统解析其降解相关基因及代谢通路，以阐明尼古丁生物降解的分子机制，从而为环境污染修复与微生物资源开发提供理论依据。

节杆菌(Arthrobacter)隶属于放线菌门(Actinomycetota)节杆菌科(Arthrobacteraceae)，为革兰氏阳性菌，在土壤环境中分布广泛。已报道的菱形节杆菌(Arthrobacter rhombi)完整基因组大小为3.48 Mb，G+C含量为69.15%，共预测编码3 170个蛋白质，并含有50个tRNA基因及7个rRNA基因^[22]。产脲节杆菌(P. ureafaciens) L-1基因组大小约为4.3 Mb，G+C含量为63.5%，在COG、GO和KEGG数据库中获得功能注释的基因分别有3 760、3 830和3 845个^[23]。本研究所用菌株Pu17含有1条环状染色体及3个质粒，基因组总大小为4.47 Mb，G+C含量为63.34%，共编码4 155个预测蛋白编码序列。功能注释显示，分别在GO、COG和KEGG数据库中注释到7 606、3 587和3 180个蛋白，其中代谢相关基因在3个数据库中均占较高比例，此特征与P. ureafaciens L-1相似。系统发育分析表明，Pu17与P. ureafaciens (GCA_017357445.1)的ANI值为96.51%，证实两者亲缘关系密切，因此将该菌株鉴定为P. ureafaciens Pu17。比较基因组学分析进一步揭示，Pu17的染色体在990-1 010 kb与3 100-3 150 kb处与其他产脲节杆菌存在差异，Pu17基因组中独特的基因簇共同构成了其区别于其他产脲节杆菌菌株的多层次适应性策略。在环境胁迫抵抗层面，terC和arsR等基因使其具备了对碲、砷等重金属的特异性解毒能力，而dptH则可能提供了基于DNA硫修饰的防御系统，共同增强了其在复杂或污染环境中的生存优势。在细胞表型层面，大量细胞壁/荚膜合成及糖核苷酸代谢相关基因(如tagH/G、wcaI、rmlA、galU等)的存在，暗示其细胞表面多糖组成与结构可能发生显著重塑，这直接影响其黏附、生物膜形成、抗逆性及与宿主或环境的相互作用。在代谢潜能拓展层面，bcsA、几丁质酶、paaG/E及frhB等基因的携带，使其获得了合成纤维素、降解几丁质、利用芳香化合物(如苯乙酸)以及可能参与特殊氧化还原反应(辅酶F420途径)的潜在能力，极大地扩展了其碳源利用范围和生态位宽度。

微生物在烟草废弃物治理中展现出重要应用潜力，其烟碱降解功能对于减轻环境污染具有关键作用^[24-25]。目前，细菌降解尼古丁的途径已明确的主要有3种：以节杆菌属为代表的吡啶途径，其核心是通过羟基化打开烟碱的吡啶环^[26]；以假单胞菌属为代表的吡咯途径，主要攻击吡咯烷环^[27]；以及以根癌农杆菌为代表的吡啶-吡咯混合途径^[28-29]。本研究通过MS/MS技术分析了菌株Pu17降解烟碱的中间代谢产物，检测到6-羟基-N-甲基肌胺、6-羟基假氧尼古丁和马来酸盐等关键中间体(图5B-5D)。这些产物的组成特征表明，Pu17主要通过吡啶途径实现烟碱的降解。

基因组分析进一步支持了这一结论。Pu17的烟碱降解相关基因(如nbor、mao、sad、coxD、nit、coxG、dhph、pkc、pnh、kdhL、kdhM、6-hlno、ndhL、modC等)主要分布于质粒1上，另有少数位于质粒3和染色体上，这些基因协同参与了烟碱的降解过程。本研究结果与其他相关报道相互印证。例如，Wang等^[7]对嗜烟碱节杆菌中负责二次羟基化的kdh基因进行了深入研究；对新型嗜烟节杆菌aRF-1的代谢物分析提示其可能存在多条代谢途径^[30]；而在P. nicotinovorans中也鉴定出包括nboR、mao、6-hlno等在内的多个关键基因^[31]。这些研究共同勾勒出吡啶途径复杂的酶学基础。此外，李旭^[13]的研究表明，异源表达来自其他菌株的关键酶(如6Hlno、Dhponh、Dhph)能有效提升烟叶中烟碱的降解率，这为利用关键酶进行应用开发提供了思路。综合MS/MS代谢产物分析与全基因组测序结果，本研究证实产脲节杆菌Pu17采用吡啶途径降解烟碱(图6)。

在降解效能方面，Pu17表现出较强的烟碱降解能力。当以1%的接种量接入初始烟碱浓度为2 g/L的培养基时，48 h内即可降解大部分烟碱^[17]。在烟草植株的应用试验中，Pu17同样表现出显著的降解效果。叶面喷施试验显示，喷施3次的处理组烟碱降低幅度最大，达19.98%，推测过度施用Pu17导致的过高菌群密度，可能通过群体感应诱导转换，从利于定殖转向游动生存^[32]，反而减少Pu17在烟叶上的定殖数量，导致喷施3次处理组烟碱含量最低。喷施1、2、4、5次的处理组间虽无显著差异，但烟碱含量均显著低于对照组(图7A)。根灌处理也能有效降低烟碱含量，在处理后42 h的降幅最大，为13.46% (图7B)。不同根灌次数处理均能显著降低烟碱，但各次数组间差异不显著(图7C)。此外，处理时期对效果有重要影响：打顶期单独进行喷施或根灌对烟碱含量无显著影响，根据之前的研究Pu17施用于烟叶后，烟叶中的烟碱虽显著降低，但是随着时间的推移呈现回补现象，推测打顶期和采摘时长时间间隔可能导致烟叶内烟碱回补至不显著状态^[17]；而在采摘期与双期进行处理，均可显著降低烟碱，其中以双期喷施处理效果最佳，降解率达14.00% (图7D)。本研究结果与利用其他节杆菌及其酶制剂进行烟碱降解的报道相呼应，共同印证了该类微生物的应用潜力。例如，在烟秆与污泥堆肥体系中接种嗜组氨醇节杆菌EA-17，可使烟碱降解率提升至49.33%，显著高于未接种的对照组(28.27%)^[33]。利用烟草节杆菌GYC103发酵烟叶，可同时降低烟碱、淀粉和蛋白质含量，并提升糖分^[16]。另有研究通过应用节杆菌Z3来源的烟碱脱氢酶粗酶液处理白肋烟叶，使烟碱降解率达到49.32%，成功将其烟碱含量调整至与烤烟相当的水平^[34]。Pu17菌液喷施于大田烟叶，可能受制于田内的高温和太阳直晒等不可避免的环境因素破坏Pu17的稳态，导致细胞裂解死亡，从而烟碱降解率低于上述处理，但活体烟叶中烟碱含量14.00%的降解率仍满足工业预期。这些研究从不同角度(全细胞、发酵、酶制剂)支撑了微生物法降解烟碱的可行性。

综上所述，本研究通过整合比较基因组学、代谢产物分析与降解效能评估，系统阐明了菌株Pu17通过吡啶途径降解烟碱的机制。实验表明，Pu17在烟草植株应用中均表现出高效的烟碱降解能力，在已报道的其他节杆菌属菌株或酶制剂基础上对烟草烟叶进行了活体实验，进一步凸显了该菌株在烟草废弃物生物修复与烟草制品定向降害方面的应用潜力。未来可通过多技术联用策略系统性提升Pu17降解烟碱效能。在菌株改造层面，可通过过表达其烟碱降解途径中的关键酶基因(如羟基化酶、脱氢酶)或引入异源高效基因簇来直接强化代谢通路。在应用策略层面，可将其与能互补利用降解中间产物、增强定殖能力或抵抗环境胁迫的辅助菌株配伍，构建稳定高效的复合菌剂。同时，通过优化施用条件(如接种密度、温度、pH、营养添加剂及表面活性剂使用)来最大程度激活菌株活力并促进其与烟草基质的接触。为后续基于Pu17或其关键酶系开发相应的生物修复技术与产品提供了重要的菌种资源与理论依据。

基金

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湖南省烟草公司永州市公司科技项目(YZ2021KJ11)

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2026年第66卷第5期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250905

接收时间：2025-12-05
首发时间：2026-05-09
出版时间：2026-05-04

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作者

出版历史

收稿日期：2025-12-05
录用日期：2026-01-15

基金

The Science and Technology Project of Yongzhou Branch of Hunan Tobacco Company(YZ2021KJ11)

湖南省烟草公司永州市公司科技项目(YZ2021KJ11)

作者信息

^1.湖南省烟草公司永州市公司，湖南永州

^2.华南农业大学植物保护学院，绿色农药全国重点实验室，广东广州

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250905

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Genome features	Value
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G+C content/%	63.34
Gene number	4 155
Chromosome size/bp	4 049 701
Chromosome G+C content/%	63.57
Protein-coding genes/(CDS)	4 155
Total CDS length/bp	3 966 174
5S rRNA genes	6
16S rRNA genes	6
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Genome features

Value

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4 470 512

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63.34

Gene number

4 155

Chromosome size/bp

4 049 701

Chromosome G+C content/%

63.57

Protein-coding genes/(CDS)

4 155

Total CDS length/bp

3 966 174

5S rRNA genes

16S rRNA genes

tRNA genes

23S RNA genes

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Strain names

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Chromosome

GCA_014076395.1

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4.4

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96.87

Chromosome, pCZY

GCA_016694995.1

EC ID	Gene names	Gene mapping	Gene function	KEGG similarity/%
1.5.99.4	ndhC	Plasmid 1: 72 049: 74 763: -	Nicotine dehydrogenase subunit C	100.0
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1.5.3.5	nctB, 6-hlno	Plasmid 1: 70 704: 71 966: -	(S)-6-hydroxynicotine oxidase	99.8
1.5.99.14	kdhA	Plasmid 1: 66 784: 67 674: +	6-hydroxypseudooxynicotine dehydrogenase subunit alpha	100.0
3.7.1.19	dhponh	Plasmid 1: 62 701: 63 786: +	2,6-dihydroxypseudooxynicotine hydrolase	99.7
1.14.13.10	dhpH	Plasmid 1: 57 606: 58 799: -	2,6-dihydroxypyridine 3-monooxygenase	100.0
3.5.1.107	nicF	Plasmid 3: 72 277: 72 828: +	Maleamate amidohydrolase	98.9
5.2.1.1	nicE, maiA	Chromosome 1: 3 883 908: 3 884 636: +	Maleate isomerase	98.8
1.1.1.328	nboR	Chromosome 1: 3 328 960: 3 329 571: +	Nicotine blue oxidoreductase	100.0
1.5.3.21	mao	Plasmid 1: 29 566: 30 831: -	4-methylaminobutanoate oxidase (methylamine-forming)	99.8
1.5.3.19	mabO	Plasmid 1: 36 195: 38 669: -	4-methylaminobutanoate oxidase (formaldehyde-forming)	100.0
1.2.1.16 1.2.1.79 1.2.1.20	gabD	Chromosome 1: (1 165 530: 1 167 011: +)	Succinate-semialdehyde dehydrogenase/ glutarate-semialdehyde dehydrogenase	85.4
(1 773 781: 1 775 220: -)	99.4
(1 871 582: 1 872 937: +)	99.3
Plasmid 1: (32 025: 33 263: +)	91.7
(194 584: 196 068: -)	91.4
(217 819: 219 195: +)	71.8
Plasmid 2: 12 595: 13 974: +	90.4

EC ID

Gene

names

Gene mapping

Gene function

KEGG

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1.5.99.4

ndhC

Plasmid 1: 72 049: 74 763: -

Nicotine dehydrogenase subunit C

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(S)-6-hydroxynicotine oxidase

99.8

1.5.99.14

kdhA

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6-hydroxypseudooxynicotine

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100.0

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dhponh

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2,6-dihydroxypseudooxynicotine hydrolase

99.7

1.14.13.10

dhpH

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2,6-dihydroxypyridine 3-monooxygenase

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nicF

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Maleamate amidohydrolase

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Maleate isomerase

98.8

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Nicotine blue oxidoreductase

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(methylamine-forming)

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(1 165 530: 1 167 011: +)

Succinate-semialdehyde dehydrogenase/

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