微生物学报

Strains	Biosynthetic gene clusters	Coverage (%)
B. halotolerans T101	NRPS 5; T3PKS 1; transAT-PKS, NRPS 1; NRPS, transAT-PKS 1; NRPS, T1PKS, terpene 1; transAT-PKS, T3PKS, PKS-like 1; RRE-containing 2; transAT-PKS 1; Phosphonate 1; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS, NRPS-like 1; NI-siderophore 1; Azole-containing-RiPP 1; RiPP-like 1; NRPS, NRP-metallophore 1; NRPS-like, terpene-precursor 1	24.38
P. kribbensis T431	RRE-containing 2; Terpene-precursor 2; Terpene 2; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS 3; NI-siderophore 1; NRPS-like 1; NRP-metallophore, NRPS 1; Lassopeptide 1; Proteusin 1; Phosphonate 1	9.54
P. contaminans T270	Terpene-precursor, RRE-containing 1; Terpene-precursor 4; Terpene 2; Azole-containing-RiPP 2; Proteusin 1; RRE-containing 1; Ectoine 1	2.71
P. farraposensis T327	Terpene-precursor 2; Terpene, RiPP-like 1; NRPS-like 1; Phosphonate 1; Ranthipeptide 1; Proteusin 1; Lassopeptide 1; NRPS 5; Cyclic-lactone-autoinducer 4; RRE-containing 1; Terpene 1; NI-siderophore 1	11.65
P. kribbensis T234a	Terpene-precursor 2; Terpene 2; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS 5; NI-siderophore 1; NRPS-like 1; NRP-metallophore, NRPS 1; Lassopeptide 1; Proteusin 1; Phosphonate 1; RRE-containing 1; transAT-PKS, NRPS 1	11.23

Strains	Biosynthetic gene clusters	Coverage (%)
B. halotolerans T101	NRPS 5; T3PKS 1; transAT-PKS, NRPS 1; NRPS, transAT-PKS 1; NRPS, T1PKS, terpene 1; transAT-PKS, T3PKS, PKS-like 1; RRE-containing 2; transAT-PKS 1; Phosphonate 1; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS, NRPS-like 1; NI-siderophore 1; Azole-containing-RiPP 1; RiPP-like 1; NRPS, NRP-metallophore 1; NRPS-like, terpene-precursor 1	24.38
P. kribbensis T431	RRE-containing 2; Terpene-precursor 2; Terpene 2; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS 3; NI-siderophore 1; NRPS-like 1; NRP-metallophore, NRPS 1; Lassopeptide 1; Proteusin 1; Phosphonate 1	9.54
P. contaminans T270	Terpene-precursor, RRE-containing 1; Terpene-precursor 4; Terpene 2; Azole-containing-RiPP 2; Proteusin 1; RRE-containing 1; Ectoine 1	2.71
P. farraposensis T327	Terpene-precursor 2; Terpene, RiPP-like 1; NRPS-like 1; Phosphonate 1; Ranthipeptide 1; Proteusin 1; Lassopeptide 1; NRPS 5; Cyclic-lactone-autoinducer 4; RRE-containing 1; Terpene 1; NI-siderophore 1	11.65
P. kribbensis T234a	Terpene-precursor 2; Terpene 2; Cyclic-lactone-autoinducer 2; NRPS 5; NI-siderophore 1; NRPS-like 1; NRP-metallophore, NRPS 1; Lassopeptide 1; Proteusin 1; Phosphonate 1; RRE-containing 1; transAT-PKS, NRPS 1	11.23

荔枝霜疫霉拮抗菌资源筛选与功能评价

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梁秀贤 ¹^,² , 董红红 ² , 邓名荣 ² , 王鹏 ¹ , 朱红惠 ²

微生物学报 | 研究报告 2026,66(4): 1747-1763

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(4): 1747-1763

荔枝霜疫霉拮抗菌资源筛选与功能评价

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梁秀贤¹^,², 董红红², 邓名荣², 王鹏¹, 朱红惠²

作者信息

^1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄

^2.广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室农业农村部农业微生物组学重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州

Screening and functional evaluation of antagonistic bacterial resources against litchi downy blight

Xiuxian LIANG¹^,², Honghong DONG², Mingrong DENG², Peng WANG¹, Honghui ZHU²

Affiliations

^1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei, China

^2.State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Key Laboratory of Agricultural Microbiomics and Precision Application (MARA), Key Laboratory of Agricultural Microbiome (MARA), Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong, China

出版时间: 2026-04-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250691

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摘要

收起

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国重要的热带、亚热带水果。由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝的生产和采后贮藏过程，是我国荔枝产业健康发展的重大威胁。目的筛选高效拮抗荔枝霜疫霉的细菌菌株并评价其植物促生潜力，以丰富荔枝霜疫霉拮抗菌资源库。方法采集荔枝根围土壤样品，采用高通量培养法分离细菌，基于16S rRNA基因序列进行菌株鉴定。采用平板对峙法筛选拮抗荔枝霜疫霉的活性菌株，并通过功能平板测定评价拮抗菌株的促生功能(溶磷、解钾、固氮、产铁载体、产吲哚乙酸)。结果共分离获得细菌327株，其中92株对荔枝霜疫霉表现出拮抗活性(菌丝生长抑制率大于40%，分离到拮抗菌的阳性率达28.13%)。这些拮抗菌株系统发育多样，涵盖4门[主要为芽孢杆菌门(Bacillota)和假单胞菌门(Pseudomonadota)] 6纲12目20科42属，其中芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)为优势属。对92株拮抗菌的促生功能评价显示：55株菌(占59.8%)具备至少一种促生能力；30株菌(占32.6%)同时具备3种以上促生能力。综合拮抗活性和促生功能，发现兼具抗病和促生功能的短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的菌株T101、4株类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的菌株(T431、T270、T327和T234a)，及副伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia)的菌株R116b是最具生防应用潜力的菌株。结论本研究成功筛选出多株兼具拮抗荔枝霜疫霉活性与多种促生功能(溶磷、解钾、固氮、产铁载体、产吲哚乙酸)的细菌菌株，为荔枝霜疫病的绿色防控及荔枝生态友好型种植体系的构建提供了宝贵的微生物资源。

关键词

荔枝 / 荔枝霜疫霉 / 荔枝霜疫病 / 拮抗菌

Abstract

收起

Litchi (Litchi chinensis Sonn.) is one of the important tropical and subtropical fruits in China. However, litchi downy blight caused by the infection of Peronophythora litchii (Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.) a severe disease damaging litchi during production, storage, and transportation, seriously threatening the healthy development of China’s litchi industry. Objective We screened effective antagonistic bacteria against P. litchii and evaluated their plant growth-promoting potential, aiming to enrich the resources of antagonistic bacteria against P. litchii. Methods Soil samples from the litchi rhizosphere were collected, and the bacteria in the samples were isolated through a high-throughput isolation and culture method. The strains were identified by means of 16S rRNA gene sequence analysis. The antagonistic strains against P. litchii were screened via the plate confrontation method, and the plant growth-promoting functions [phosphorus solubilization, potassium solubilization, nitrogen fixation, siderophore secretion, and indole-3-acetic acid (IAA) production] of the antagonistic strains were further evaluated through functional plates. Results A total of 327 bacterial strains were isolated in this study, among which 92 (28.13%) strains were identified as antagonists (with mycelial growth inhibition rates>40%) against P. litchii. These antagonistic strains belonged to 4 phyla, 6 classes, 12 orders, 20 families, and 42 genera, with Bacillota and Pseudomonadota being the dominant phyla, and Bacillus and Paenibacillus as the dominant genera. Functional evaluation of the 92 antagonistic strains revealed that 55 (59.8%) strains exhibited more than one plant growth-promoting function, while 30 (32.6%) strains possessed three or more such functions. Through comprehensive evaluation of antagonistic activity and plant growth-promoting functions, one Brevibacillus strain T101, four Paenibacillus strains (T431, T270, T327, and T234a), and one Paraburkholderia strain R116b were identified as the most promising strains for biocontrol applications. Conclusion Multiple antagonistic strains against P. litchi,with functions of phosphorus solubilization, potassium solubilization, nitrogen fixation, siderophore secretion, and IAA production, are screened out, which provides efficient strain resources for the green control of litchi downy blight.

Key words

Litchi chinensis Sonn. / Peronophythora litchii / litchi downy blight / antagonistic strains

引用本文

梁秀贤, 董红红, 邓名荣, 王鹏, 朱红惠. 荔枝霜疫霉拮抗菌资源筛选与功能评价. 微生物学报, 2026 , 66 (4) : 1747 -1763 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250691

Xiuxian LIANG, Honghong DONG, Mingrong DENG, Peng WANG, Honghui ZHU. Screening and functional evaluation of antagonistic bacterial resources against litchi downy blight[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (4) : 1747 -1763 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250691

正文

收起

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)作为广东省最具特色与优势的亚热带水果产业，在促进农民增收和推动乡村振兴中发挥着关键作用^[1-2]。随着市场需求的持续增长，荔枝种植规模不断扩大，种植年限也相应延长。然而，这一发展趋势也导致荔枝病害日益加剧，严重制约了产业的健康发展，其中以荔枝霜疫病、炭疽病、灰霉病等最为常见^[3-4]。

荔枝霜疫病(litchi downy blight)是由病原卵菌荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的，是荔枝在采前、采后贮藏及运输过程中最严重的病害，其影响范围不仅局限于近熟果实，还会扩展至叶片、嫩梢、花穗等多个部位^[5]。该病在流行年份可导致减产高达80%，造成巨大经济损失^[6]，已成为危害荔枝产业最具毁灭性的病害之一。荔枝霜疫霉适应性极强，可在果园土壤中存活16个月。一旦环境条件适宜，病原菌能迅速完成侵染循环，从孢子萌发到病症显现不足24 h，使得传统化学防治的窗口期极为短暂^[7]。目前，荔枝产业普遍依赖化学杀菌剂，但长期使用不仅会导致病原菌抗药性增强，还会引发农药残留超标及生态平衡破坏等日益突出的问题。

利用拮抗微生物进行植物病害生物防治，因其具有环境友好、无污染的优势，已成为替代或辅助传统化学防治的有效策略，符合现代农业可持续发展的核心理念。因此发展安全、高效且环境友好的绿色防控技术是保障荔枝产业可持续发展的迫切需求。微生物是荔枝霜疫病生防资源的一大宝库，但受限于分离培养技术，迄今发现的荔枝霜疫霉拮抗菌仍较为有限^[8]。已报道的拮抗菌主要以芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为主，其中枯草芽孢杆菌(B. subtilis) BS-2和TL2、解淀粉链芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PP19和LI24、短小芽孢杆菌(B. pumilus) PI26及地衣芽杆菌(B. licheniformis) HS10等可作为荔枝霜疫霉的生防细菌^[9-10]，其中TB2和BS-2菌液抑制率可达60%以上^[10]。此外，乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum) SI17、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7及发光杆菌(Photobacerium sp.) 1029等生防细菌对荔枝霜疫霉也有显著抑制作用^[2]。目前，尚未有研究对一份荔枝根围土壤样品中的所有拮抗微生物进行系统分离鉴定，因此对土壤中拮抗微生物的组成与多样性认识较为有限。

在微生物资源发掘研究中，分离培养是解析微生物群落组成及结构的重要方法，主要包括传统的分离培养和基于培养组学(culturomics)技术的分离手段^[11-12]。传统方法通过稀释涂板或使用选择性培养基分离微生物，经纯化获得单菌落后，依据形态学特征进行筛选和初步鉴定^[13]。该方法虽然具有快速、简便、易操作等优点且应用广泛，但也存在显著局限：其筛选过程主要依赖主观形态判断，易导致形态相似菌株的遗漏或对快速生长菌株的重复挑取，从而大幅增加研究工作量。研究表明，传统方法可能仅能分离出植物根际0.1%-10%的微生物，难以高效获取目标功能菌株^[13]。近年来，高通量培养组学技术的兴起为微生物分离提供了新思路。该方法通过设计多种培养条件与方法，结合96孔板高通量培养模式，对微生物进行大规模分离，并利用16S rRNA基因测序技术进行精准鉴定，显著提升了对细菌资源的获取能力与鉴定水平^[12]。

本研究采用高通量培养组学技术对一份荔枝根围土壤样品中的微生物进行分离，通过平板对峙培养法筛选对荔枝霜疫霉具有显著拮抗活性的生防菌株，利用功能平板系统评价拮抗菌株的植物促生性能，发掘兼具抗病与促生功能的优良微生物资源，以期为荔枝产业的绿色、可持续发展提供核心菌株支撑。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 样品采集

细菌高通量分离试验所用的土壤样品于2024年8月3日采集自广东省广州市华南农业大学荔枝资源圃(23°09′35.1756″N，114°21′14.1156″E)。样地的土壤有机质、全氮、全磷、全钾含量分别为12.47、0.36、0.48、17.43 g/kg，pH 5.89。采集前，选择3棵长势一致的健康桂味荔枝(Litchi chinensis Sonn.)树作为生物学重复，清除地表可见的石块和凋落物，每棵树采用五点取样法用不锈钢土钻采集根围距离地表8-15 cm处的土壤，5钻混合为一份样品。样品过2 mm筛后充分混匀，装入采样袋中于4 ℃冰盒运输带回实验室用于细菌的分离。

1.1.2 主要试剂和仪器

PCR扩增所用Taq酶，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细菌高通量分离培养和鉴定所用的第一轮和第二轮PCR引物及细菌16S rRNA基因鉴定通用引物27F (5′‐AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG‐3′)和1492R (5′‐GGTTACCTT GTTACGACTT‐3′)均由安升达(南京)生命科学技术有限公司合成。

PCR仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.1.3 培养基

胡萝卜(carrot agar, CA)培养基参照赵冉^[1]的方法配制。R2A培养基、无机磷细菌培养基、有机磷细菌培养基、无氮培养基、固氮菌用阿须贝氏培养基、M1997培养基和CAS检测培养基均购自Hopebio公司。胰蛋白胨大豆肉汤培养基、营养肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。CAS检测液购自北京酷来搏科技有限公司；Salkowski比色液：50 mL 35%的HClO₄，1 mL 0.5 mol/L FeCl₃，pH 7.4；碱性裂解液：25 mmol/L NaOH，0.2 mmol/L Na₂-EDTA，pH 12.0；中和缓冲液：40 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5。

1.2 荔枝根围土壤细菌高通量分离培养和鉴定

荔枝根围土壤细通量分离培养和鉴定参考Zhang等^[14]的植物根系细菌高通量分离培养和鉴定方法，主要流程如下：首先通过梯度稀释法确定荔枝根围土壤样品的最适稀释浓度，然后进行细菌的高通量培养(48个96孔板)，进一步通过碱裂解法提取所有孔对应细菌的DNA，利用未标记的引物799F (5′‐AACMGGATTAGATA CCCKG‐3′)和1193R (5′‐ACGTCATCCCCACCT TCC‐3′)进行第一轮PCR扩增。PCR反应体系(20 µL)：Green Taq Mix (p131) 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.9 µL，DNA模板3 µL，ddH₂O 5.2 µL。PCR反应条件：95 °C预变性3 min；95 °C变性15 s，55 °C退火15 s，72 °C延伸15 s，共35个循环；72 °C终延伸5 min。完成第一轮PCR扩增后，对PCR产物进行120倍稀释作为第二轮PCR的模板，采用双侧标签PCR扩增法进行第二轮PCR扩增，以添加孔和板的标签，所用的48对带标签(barcode)和测序接头的引物参照Zhang等^[14]的报道。PCR反应体系(20 µL)：Green Taq Mix (p131) 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1.5 µL，DNA模板1.5 µL，ddH₂O 5.5 µL。PCR反应条件：95 °C预变性3 min；95 °C变性15 s，55 °C退火15 s，72 °C延伸15 s，共35个循环；72 °C终延伸5 min。最后将第二轮PCR每块板(共48块)的96个PCR产物混合为1个样品，共计获得48个样品进行琼脂糖电泳分析，切胶回收大小为500 bp的条带进行纯化，并通过NanoDrop测定样品浓度。每个样品按照100 ng进行合并建库，合并后的样品送上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina测序。

测序结果的生物信息学分析采用刘永鑫等^[15]开发的培养组学生物信息分析流程Culturome (http://bailab.genetics.ac.cn/culturome)和编写的R脚本进行。依次进行样本信息的编写、双端序列的合并、引物切除、基于unoise3算法去噪构建扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASV)表、基于RDP训练集建物种注释表等分析。

对测序结果分析后得到带有注释信息的选菌表，每一个ASV选取1-3个孔接种在1/2 TSB平板上进行反复纯化。利用碱性裂解液提取细菌DNA，利用通用引物27F (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACC TTGTTACGACTT-3′)进行16S rRNA基因扩增。PCR反应体系(25 µL)：Green Taq Mix (p131) 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板2 µL，ddH₂O 8.5 µL。PCR反应条件：95 °C预变性3 min；95 °C变性15 s，56 °C退火15 s，72 °C延伸90 s，共35个循环；72 °C终延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序。测序得到27F和1492R的两端序列，用DNAMAN软件进行序列拼接，获得16S rRNA基因全长序列，最后通过EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)数据库^[16]对分离细菌的进行比对鉴定，初步确定菌株的分类信息。

1.3 分离菌株对荔枝霜疫霉的拮抗活性筛选

1.3.1 荔枝霜疫霉菌株活化

取保存于试管的供试菌株，用灭菌后的竹签将其移植到胡萝卜培养基平板上，25 ℃培养3 d。待生长出新的菌落后，在菌落边缘切取菌丝块转移到新的胡萝卜培养基平板上培养，获得生命力较强的新鲜菌落。

1.3.2 拮抗活性测定

采用平板对峙培养法^[17]测定荔枝根围土壤分离细菌对荔枝霜疫霉的拮抗活性。具体做法为：用打孔器在新鲜培养的荔枝霜疫霉平板的菌落边缘打取直径为8 mm的菌饼，放置于新鲜的胡萝卜培养基平板中心，用接种针蘸取活化于TSA培养基中的候选拮抗菌菌液，在距离菌饼2.5 cm处划线，以只接荔枝霜疫霉的平板作为对照，所有平板在25 ℃下培养7 d后，拍摄菌落生长照片并测量病原菌生长直径。菌丝生长抑制率的计算如公式(1)所示。

菌丝生长抑制率=(对照组菌丝生长量-拮抗菌处理组菌丝生长量)/对照组菌丝生长量×100%^[4](1)

1.4 高效荔枝霜疫霉拮抗菌株的抑菌机制研究

采用乙酸乙酯提取法对高效拮抗菌株的活性产物进行粗分离：挑取新鲜活化的菌落接入TSB培养基中，28 ℃、200 r/min培养24 h得种子液；按5%接种量分别吸取种子液到TSB培养基中，于28 ℃、200 r/min摇床发酵7 d。发酵液8 000 r/min离心10 min收集上清液，上清液在室温下加入等体积乙酸乙酯混合摇匀，静置5-10 min待上清液澄清后，收集上层乙酸乙酯层溶液，重复以上操作3次，将有机相溶液旋干，称重，-20 ℃保存。

用DMSO将粗提物溶解为浓度100 mg/mL的溶液，用0.22 µm滤膜过滤，将荔枝霜疫霉病原菌菌饼放在平板中间，周边四孔分别加入100 µL样品，以加入无菌水作为对照，25 ℃培养5 d，观察抑菌效果。

1.5 高效拮抗菌株的基因组测序及代谢潜能分析

高效拮抗菌株的基因组DNA采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Magen公司)进行提取，经16S rRNA基因扩增验证正确后，由上海美吉生物医药科技有限公司完成基因组测序、双端文库构建和Illumina HiSeq 2500测序。下机数据利用SPAdes (v3.13.0)软件^[18]进行基因组序列拼接组装。通过antisMASH 6.0^[19]利用默认参数对高效拮抗菌株的基因组序列进行分析，预测可能的次级代谢产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BCGs)，评估菌株的次级代谢产物合成能力。

1.6 荔枝霜疫霉拮抗菌株的促生功能测定

荔枝霜疫霉拮抗菌株的促生功能测定根据Wang等^[20]的研究方法进行：将活化好的菌株挑单菌落分别点在无机磷细菌培养基、有机磷细菌培养基、无氮培养基、固氮菌用阿须贝氏培养基、M1997培养基和CAS检测培养基的四周，倒置于30 ℃培养箱培养8 d，若细菌周围出现透明圈表明菌株具有解磷、固氮或解钾能力，透明圈越大表示菌株解磷、固氮或解钾能力越强。菌株的产铁载体能力则通过培养基是否出现橘黄色晕圈来判断，晕圈越大代表产铁能力越强。

菌株产吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的定量测定采用Salkowski比色法^[21]，具体做法为：将菌株的种子液12 000 r/min离心5 min，取50 μL上清液于96孔板中，同时加入50 μL Salkowski比色液，孔板于室温避光放置30 min后，用酶标仪测OD₅₃₀的吸光值，以加入50 μL 50 mg/L的IAA标准品作为阳性对照。

菌株产铁能力的定量测定采用CAS检测法进行^[22]，具体做法为：取100 μL菌株上清液于96孔板中，加入100 μL CAS检测液混合均匀，静置1 h后，酶标仪测定OD₆₃₀的吸光值记为A_s，分别取100 μL的无菌水与CAS等体积混合，测定OD₆₃₀的吸光值记为A_r，菌株产生的铁载体量根据公式(2)计算，计算结果小于10%，则认为铁载体分泌为阴性。

铁载体量=(A_r-A_s)/A_r×100%(2)

2 结果与分析

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2.1 荔枝根围土壤中可培养细菌的高通量分离

在对荔枝根围土壤样品进行高通量培养时，预实验发现稀释倍数为222倍的96孔板中约有30%的孔变浑浊，因此确定222倍为最佳稀释浓度。培养2周后，对48个96孔板中的细菌进行鉴定，通过对所测得的细菌种类分析发现，随着测序量的增加，培养细菌的ASV序列逐渐增加，并趋于平缓，表明设置的稀释倍数合理，在此范围内有足够多的细菌被分离得到(图1A)。本研究经过双侧标签PCR扩增建库、三代测序以及基于Culturome v1.0的生物信息学分析，共鉴定到827个ASVs。通过整合每个孔中ASV对应的测序量、纯度、ASV编号和物种注释，最终获得了可分离的460个ASVs信息。在门水平上，培养细菌的ASVs主要属于芽孢杆菌门(Bacillota)、假单胞菌门(Pseudomonadota)、放线菌门(Actinomycetota)和拟杆菌门(Bacteroidota) (图1B)。

对应培养组学鉴定的结果和每个孔的纯度对菌株进行活化与纯化鉴定，共得到327株菌，这些菌株分布于5门8纲22目38科92属(图2)，其中，芽孢杆菌门(Bacillota)占据主导地位，共有135株，其次为假单胞菌门(Pseudomonadota)，有127株，再次为放线菌门(Actinomycetota)，有57株，拟杆菌门(Bacteroidota)和出芽单胞菌门(Gemmatimonadota)最少，分别为7株和1株(图2A)。在科水平上，微杆菌科(Paenibacillaceae)分离菌株最多，共65株，占比19.9%，其次为芽孢杆菌科(Bacillaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)，占比分别为18.3%、9.2%和7.6% (图2B)。在属分类水平上，优势属为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，共分离出48株，占比14.7%，其次为假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)，占比分别为6.7%和5.5%。

进一步分析发现，分离的327株细菌中包含潜在新物种90株，占比27.5%，这些潜在新物种分布在5门8纲14目20科39属中。其中，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株的占比最高，有25株，其次为科恩氏菌属(Cohnella)，有10株，再次为节杆菌属(Arthrobacter)和副伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia)，分别有6株和4株(图3)。

2.2 荔枝霜疫霉拮抗菌资源筛选及分类情况

采用平板对峙法对分离的327株细菌进行拮抗荔枝霜疫霉的试验，以菌丝生长抑制率≥40%为筛选标准，共筛选到92株拮抗菌株，这些拮抗菌分布在4门6纲12目20科42属中(图4)。在门水平上，芽孢杆菌门(Bacillota)和假单胞菌门(Pseudomonadota)为优势门，分别有34株和33株，其次是放线菌门(Actinomycetota)，有23株，拟杆菌门(Bacteroidota)最少，仅有2株(图4A)。在属水平上，芽孢杆菌(Bacillus)和类芽孢杆菌(Paenibacillus)为优势属，分别有11株和8株，其次是伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)，有7株(图4B)。

对筛选到的92株荔枝霜疫霉拮抗菌株进行拮抗活性比较，发现菌丝生长抑制率最高的为耐盐短芽孢杆菌(Brevibacillus halotolerans) T101，达74.83%，其次为4株类芽孢杆菌属的细菌，分别为克里布所类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis) T431、污染类芽孢杆菌(Paenibacillus contaminans) T270、法拉珀类芽孢杆菌(Paenibacillus farraposensis) T327和克里布所类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis) T234a (图5)，菌丝生长抑制率在72.56%-73.92%之间；进一步分析了5株拮抗菌的无细胞发酵上清液(cell-free fermentation supernatant, CF)、加热处理后的无细胞发酵上清液(heat-treated cell-free supernatant, HCF)及乙酸乙酯萃取的粗提取物(ethyl acetate crude extract, EACr)对荔枝霜疫霉的拮抗活性，发现5株菌的CF、HCF及EACr均对荔枝霜疫霉表现出显著的抑菌活性，其中法拉珀类芽孢杆菌(P. farraposensis) T327和克里本类芽孢杆菌(P. kribbensis) T234a的HCF的抑菌活性弱于CF (图5)，这表明其拮抗活性物质中还存在一些非蛋白类的次级代谢产物。EACr活性测定结果显示耐盐短芽孢杆菌(B. halotolerans) T101和法拉珀类芽孢杆菌(P. farraposensis) T327的粗提物对荔枝霜疫霉表现出最强的抑菌活性(图5)，暗示其基因组中可能含有高效的抑菌活性物质，可作为新型活性物质分离的备选菌株。

2.3 高效拮抗菌株活性次级代谢产物分析

对5株高效菌株进行了全基因组测序分析，并预测了各菌株基因组中的次级代谢产物生物合成基因簇(BGCs)。如表1所示，发现耐盐短芽孢杆菌(B. halotolerans) T101基因组中的BGCs总数最多，共鉴定出16种不同类型的BGCs，其基因组覆盖率达24.38% (表1)，远高于其他菌株，突出其强大的次级代谢物合成潜力。该菌株的BGCs类型丰富，主要包括非核糖体多肽(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)、Ⅲ型聚酮合酶(type Ⅲpolyketide synthetase, T3PKS)、反式酰基转移酶-聚酮合酶(trans-acyltransferase polyketide synthase, transAT-PKS)、Ⅰ型聚酮合酶(typeⅠpolyketide synthase, T1PKS)、萜烯(terpene)、类聚酮合酶(polyketide synthase-like enzyme, PKS-like)、RiPP前体识别元件(RiPP recognition element-containing protein, RRE-containing)、膦酸酯(phosphonate)、环内酯自诱导物(cyclic-lactone-autoinducer)、类非核糖体肽合成酶(NRPS-like)、NRPS非依赖性铁载体(NRPS-independent siderophore, NI-siderophore)、含唑类的核糖体合成和翻译后修饰肽(azole-containing ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide, azole-containing-RiPP)、萜类前体(terpene-precursor)等。克里布所类芽孢杆菌(P. kribbensis) T431含有11种BGCs，覆盖率为9.54%；(P. contaminans) T270的BGCs种类最少(7个)，覆盖率仅为2.71%；法拉珀类芽孢杆菌(P. farraposensis) T327和克里布所类芽孢杆菌(P. kribbensis) T234a均有12种BGCs，覆盖率分别为11.65%和11.23%。值得注意的是，在5株高效拮抗菌株的次级代谢产物分析预测结果中均预测到了非核糖体多肽(NRPS)、萜烯(terpene)、环内酯自诱导物(cyclic-lactone-autoinducer)，反映了这些拮抗菌株中普遍存在编码合成这些次级代谢产物的关键基因。

2.4 荔枝霜疫霉拮抗菌株的促生功能评价

通过功能平板对上述筛选到的92株荔枝霜疫霉拮抗菌进行了产IAA、产铁载体、溶解有机磷、溶解无机磷、解钾和固氮等功能的评价，结果发现55株拮抗菌具备至少一种促生能力，占比59.8%，而具有3种以上促生能力的拮抗菌株有30株(图6)，其中一株斯泰恩氏副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia steynii) R116b同时具有6种促生功能，一株褪色沙雷氏菌(Serratia marcescens) T307b同时具有5种促生功能。此外，本研究还筛选到了一些能够高效溶解有机磷、固氮和产铁载体的菌株，这些拮抗菌主要是伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的一些菌株，如新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia) R047a、污染伯克霍尔德氏菌(Burkholderia contaminans) T076a和稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis) T092 (图7)。

3 讨论与结论

收起

本研究应用高通量分离培养技术成功从一份健康荔枝根围土壤中分离获得327株细菌，涵盖了丰富的物种多样性。尤为突出的是，其中鉴定出90株潜在新物种，广泛分布于39个属，且显著富集于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和科恩氏菌属(Cohnella)。该分离效率远超传统稀释涂布平板法，有力印证了高通量分离培养技术在发掘未(难)培养微生物资源方面的显著优势，为深入解析荔枝根围土壤特异微生物组成提供了强有力的支撑。然而，本研究中有55%的细菌ASV成功获得了纯培养物，仍有45%未被捕获，提示部分微生物类群的可培养性仍是当前的技术瓶颈。此外，分离过程仅使用了TSA和R2A培养基。已有研究表明，组合应用多种培养基可有效提高细菌种类的可培养率^[12]。因此，在具备充足资源的前提下，后续研究应采用更广泛的培养基组合进行高通量分离，以期更全面地覆盖荔枝根围的细菌多样性。

通过对327株分离菌株的抗菌活性进行系统性筛选，共获得了92株对荔枝霜疫霉具有拮抗活性的菌株，阳性率高达28.1%。这一结果表明，基于培养组学的高通量分菌技术除了能提高可培养菌株的分离效率外，对于拮抗菌株的分离也具有显著的促进作用，也提示荔枝果树根围土壤中蕴藏着极其丰富的生防微生物资源。对92株拮抗菌株的分类分布进行分析，发现这些菌株分属于4门42属，展现了高度的系统发育多样性，暗示其在环境适应、生存竞争及抗菌物质产生方面可能具有普遍优势，为开发新型生防制剂奠定了重要的资源基础。本研究也系统评估了92株拮抗菌株的植物促生潜力。结果显示，59.8% (55株)的拮抗菌株至少具备一种促生功能，其中30株同时具备3种以上的促生功能。这一现象支撑了植物根围微生物中普遍存在兼具拮抗病原菌与促进植物生长双重功能的益生菌这一观点^[23-24]。尤为突出的是，斯泰恩氏副伯克霍尔德菌(Paraburkholderia steynii) R116b和黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens) T307b，同时具备5种或以上促生功能。此类功能菌株不仅能通过直接拮抗作用保护植物免受病原菌侵害，更能通过固氮、解磷、产IAA及产铁载体等多种机制协同促进植物生长并增强其整体抗逆性^[25-26]。

综合拮抗活性和促生功能，本研究发现短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的菌株T101、4株类芽孢杆菌(Paenibacillus)的菌株(T431、T270、T327和T234a)及副伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia)的菌株R116b是最具生防应用潜力的菌株。例如，耐盐短芽孢杆菌(B. halotolerans) T101的拮抗活性显著高于其他菌株，并且能够产生IAA和分泌铁载体。短芽孢杆菌属(Brevibacillus)作为抗菌活性物质的重要来源已获得广泛认可^[27]。短短芽孢杆菌(B. brevis)能合成短杆菌肽、伊短菌素等多种抑菌物质，主要通过破坏病原菌细胞膜或干扰DNA复制、蛋白质翻译等机制发挥作用^[28-29]。值得注意的是，目前针对耐盐短芽孢杆菌所产生的活性物质的结构、功能及其作用机制研究仍相当有限。虽有少量研究利用antiSMASH对其基因组进行了代谢产物预测分析^[30-31]，但该菌拮抗荔枝霜疫霉的具体机制尚未见系统报道，未来值得深入探索。同时需要指出，本研究的所有活性评价均在体外条件下完成，高效拮抗菌株(如T101)的实际田间防效仍需通过温室盆栽和田间试验进一步验证。

研究表明，很多非核糖体多肽(NRPS)类产物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性，比如短杆菌肽是由NRPS合成的环肽类抗生素，能通过改变细胞膜的通透性来抑制细菌生长^[28]。萜类化合物作为关键的次生代谢产物，参与植物在逆境胁迫下的抗氧化、信号传递及气孔运动等生理过程，在植物逆境响应中扮演着重要角色。它们不仅可以直接参与植物的防御机制，还能够作为信号分子调节植物间的相互作用，影响植物群体的适应性和稳定性^[32]。本研究的5株高效拮抗菌株基因组中均预测到了不同数量的NRPS和萜类化合物，这些化合物可能在其对荔枝霜疫霉的拮抗中发挥着重要作用；此外，还预测到一些与已知化合物相似度较低的BCGs，未来有必要对这些BCGs进行分离纯化，这将为发掘新的化合物提供依据。

综上所述，本研究通过对荔枝根围土壤细菌的高通量分离培养及多维度功能评价，成功发掘了一系列对荔枝霜疫霉具有拮抗活性且同时具备多种植物促生功能的优良菌株。这不仅深化了对荔枝根围微生物群落结构和功能的认识，也为后续深入探究微生物-植物互作机制、开发基于多功能益生菌的荔枝病害绿色防控策略提供了宝贵资源。

基金

收起

广东特支计划(NYQN2025010)
广州市科技计划(2023E04J0947)
广东省种业振兴行动专项资金项目(2022-440000-43010104-9463)
广东省自然科学基金(2024A1515011067)

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2026年第66卷第4期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250691

接收时间：2025-09-09
首发时间：2026-04-14
出版时间：2026-04-04

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收稿日期：2025-09-09
录用日期：2025-12-02

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Guangdong Special Support Program(NYQN2025010)

广东特支计划(NYQN2025010)

Guangzhou Science and Technology Plan(2023E04J0947)

广州市科技计划(2023E04J0947)

Guangdong Seed Industry Revitalization Project(2022-440000-43010104-9463)

广东省种业振兴行动专项资金项目(2022-440000-43010104-9463)

Natural Science Foundation of Guangdong Province(2024A1515011067)

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^1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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