微生物学报

Strains and plasmids	Relevant characteristics	Sources
Escherichia coli
Top10	mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araD139Δ(ara-leu) 7697galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG, used for cloning	Invitrogen
ET12567(pUZ8002)	dam-13T: : Tn9 dcm-6 hsdM cml^R, kan^R, used for biparental mating	[31]
Pseudomonas protegens
Pf-5	Rhizosphere isolate, Amp^r	[32]
Pf5274	ΔcbrB derivative of Pf-5, Amp^r	This study
Pf-5 pBBR1Am	Pf-5 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pBBR1Am	Pf5274 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf-5 pAm-cbrB	Pf-5 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pAm-cbrB	Pf5274 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pythium ultimum
ACCC 37386	Soil isolate	Agricultural culture collection of China
Plasmids
pJQ200SK	Suicide vector with sacB counter-selectable marker used for homologous recombination, Gm^r	[33]
PJQΔcbrB	pJQ200SK carrying a 2 067 bp Xba Ⅰ/Spe Ⅰ insert with a deletion in the coding region of cbrB; Gm^r	This study
pBBR1MCS-5	Broad-host-range vector; Gm^r	[34]
pBBR001	pBBR1MCS-5 with a translational 'lacZ fusion, Gm^r	[35]
pBBR-pltL'-'lacZ	pBBR001 with a translational pltL'-'lacZ fusion; Gm^r	This study
pBBR1Am	Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ-digested apramycin resistance cassette subcloned in pBBR1MCS-5 digested with the same endonucleases, Am^r	This study
pAm-cbrB	pBBR1Am carrying a 1 504 bp Xba Ⅰ/Hind Ⅲ insert with the coding region of cbrB, Am^r	This study

Strains and plasmids	Relevant characteristics	Sources
Escherichia coli
Top10	mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araD139Δ(ara-leu) 7697galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG, used for cloning	Invitrogen
ET12567(pUZ8002)	dam-13T: : Tn9 dcm-6 hsdM cml^R, kan^R, used for biparental mating	[31]
Pseudomonas protegens
Pf-5	Rhizosphere isolate, Amp^r	[32]
Pf5274	ΔcbrB derivative of Pf-5, Amp^r	This study
Pf-5 pBBR1Am	Pf-5 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pBBR1Am	Pf5274 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf-5 pAm-cbrB	Pf-5 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pAm-cbrB	Pf5274 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pythium ultimum
ACCC 37386	Soil isolate	Agricultural culture collection of China
Plasmids
pJQ200SK	Suicide vector with sacB counter-selectable marker used for homologous recombination, Gm^r	[33]
PJQΔcbrB	pJQ200SK carrying a 2 067 bp Xba Ⅰ/Spe Ⅰ insert with a deletion in the coding region of cbrB; Gm^r	This study
pBBR1MCS-5	Broad-host-range vector; Gm^r	[34]
pBBR001	pBBR1MCS-5 with a translational 'lacZ fusion, Gm^r	[35]
pBBR-pltL'-'lacZ	pBBR001 with a translational pltL'-'lacZ fusion; Gm^r	This study
pBBR1Am	Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ-digested apramycin resistance cassette subcloned in pBBR1MCS-5 digested with the same endonucleases, Am^r	This study
pAm-cbrB	pBBR1Am carrying a 1 504 bp Xba Ⅰ/Hind Ⅲ insert with the coding region of cbrB, Am^r	This study

Name	Sequences (5′→3′)	Usage
小写字母为保护碱基和限制性内切酶酶切位点 Lowercase letters represent protecting bases and restriction enzyme cleavage sites.
cbrBU-U-Xba Ⅰ	cctctagATCTCGCGTATCGTCCAGT	Upstream homologous arm of cbrB
cbrBU-L-Xho Ⅰ	gtactcgaGATTTCGCCATTGTTGTTG
cbrBD-U-Xho Ⅰ	gtactcGAGCTGGCACGCAAACT	Downstream homologous arm of cbrB
cbrBD-L-Spe Ⅰ	gactagTGGGGGTGATATTGAGCAG
cbrBF	TACATCGCCAAGCCGTTC	Verification of cbrB deletion
cbrBR	TGACCTTTCGATCCAACCAG
cbrBF-Hind Ⅲ	ctcaagcttATGCCGCATATTCTGAT	Coding region of cbrB
cbrBR-Xba Ⅰ	ctctctagaCCTGTTACGTGCGATG
pltL-PF-Xba Ⅰ	ccttctagaGCCAAGTAGTCTTCCTGTTTC	Promoter and partial coding region of pltL
pltLʹ-PR-Xho Ⅰ	catctcgaGCCCGATCAAATCTTCCATG

Name	Sequences (5′→3′)	Usage
小写字母为保护碱基和限制性内切酶酶切位点 Lowercase letters represent protecting bases and restriction enzyme cleavage sites.
cbrBU-U-Xba Ⅰ	cctctagATCTCGCGTATCGTCCAGT	Upstream homologous arm of cbrB
cbrBU-L-Xho Ⅰ	gtactcgaGATTTCGCCATTGTTGTTG
cbrBD-U-Xho Ⅰ	gtactcGAGCTGGCACGCAAACT	Downstream homologous arm of cbrB
cbrBD-L-Spe Ⅰ	gactagTGGGGGTGATATTGAGCAG
cbrBF	TACATCGCCAAGCCGTTC	Verification of cbrB deletion
cbrBR	TGACCTTTCGATCCAACCAG
cbrBF-Hind Ⅲ	ctcaagcttATGCCGCATATTCTGAT	Coding region of cbrB
cbrBR-Xba Ⅰ	ctctctagaCCTGTTACGTGCGATG
pltL-PF-Xba Ⅰ	ccttctagaGCCAAGTAGTCTTCCTGTTTC	Promoter and partial coding region of pltL
pltLʹ-PR-Xho Ⅰ	catctcgaGCCCGATCAAATCTTCCATG

CbrB在防御假单胞菌Pf-5生物防治中的作用

PDF下载

饶光耀 ¹ , 万成 ² , 石红璆 ² , 董小林 ¹^,^* , 查代明 ²^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(9): 3506-3520

收起

微生物学报 | 研究报告 2024, 64(9): 3506-3520

CbrB在防御假单胞菌Pf-5生物防治中的作用

全屏

饶光耀¹, 万成², 石红璆², 董小林¹^,^*, 查代明²^,^*

作者信息

1 长江大学农学院, 农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建), 湖北荆州 434025

2 九江学院药学与生命科学学院, 江西九江 332005

Role of CbrB in the biocontrol strain Pseudomonas protegens Pf-5

Guangyao RAO¹, Cheng WAN², Hongqiu SHI², Xiaolin DONG¹^,^*, Daiming ZHA²^,^*

Affiliations

1 MARA Key Laboratory of Sustainable Crop Production in the Middle Reaches of the Yangtze River (Co-construction by Ministry and Province), College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China

2 School of Pharmacy and Life Sciences, Jiujiang University, Jiujiang 332005, Jiangxi, China

出版时间: 2024-06-05 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240168

文章导航

摘要

收起

【目的】从基因水平探究碳分解代谢阻遏调控系统中CbrB对防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) Pf-5生物防治能力的影响。【方法】通过基于pJQ200SK的二次同源重组法构建cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274，采用基于pBBR1Am的质粒回补法构建cbrB互补菌株及其对照菌株，通过测定菌株OD₆₀₀、结晶紫染色法、琼脂平板法、平板对峙法和pltL'-'lacZ融合报告菌株，分析CbrB对防御假单胞菌Pf-5生长、生物膜形成、运动性、抗真菌活性和藤黄绿脓菌素合成的影响。【结果】CbrB在天然培养基LB中显著抑制Pf-5的生长，而在基础培养基M9-葡萄糖中则显著促进Pf-5的生长；CbrB显著促进Pf-5的运动性，但是却抑制其生物膜形成、抗真菌活性及藤黄绿脓菌素合成。【结论】CbrB在调控防御假单胞菌Pf-5生物防治方面具有一定的作用，具体表现在菌株生长、生物膜形成、运动性、抗真菌活性及藤黄绿脓菌素合成等方面。本研究为利用基因工程技术提高生防菌株生物防治能力提供理论依据，并为深度发掘藤黄绿脓菌素生物合成奠定基础。

关键词

防御假单胞菌 / CbrB / 生物防治 / 藤黄绿脓菌素 / 运动性 / 生物膜形成

Abstract

收起

[Objective] To explore the effects of CbrB from the carbon catabolite repression system on the biocontrol performance of Pseudomonas protegens Pf-5. [Methods] The mutant Pf5274 with the markerless deletion of the coding region of cbrB was constructed by a double-crossover recombination event based on pJQ200SK. Moreover, the complementary strain of cbrB and the control strains were constructed by the plasmid complementation method based on pBBR1Am. Lastly, the effects of CbrB on the growth, biofilm formation, motility, antifungal activity, and pyoluteorin synthesis of Pf-5 were analyzed by the measurement of OD₆₀₀, crystal violet staining, agar plate culture, plate confrontation method, and pltL'-'lacZ fusion report strains, respectively. [Results] CbrB greatly slowed the growth of Pf-5 in the natural medium LB, but greatly sped up the growth of Pf-5 in the basic medium M9-glucose. In addition, CbrB significantly promoted the motility but inhibited the biofilm formation, antifungal activity, and pyoluteorin synthesis of Pf-5. [Conclusion] CbrB plays a role in regulating the growth, biofilm formation, motility, antifungal activity, and pyoluteorin synthesis of P. protegens Pf-5, thus regulating the biocontrol performance of this strain. This study provides a theoretical basis for the biocontrol capabilities of strains by genetic engineering and lays a foundation for probing into the biosynthesis of pyoluteorin.

Key words

Pseudomonas protegens / CbrB / biocontrol / pyoluteorin / motility / biofilm formation

引用本文

饶光耀, 万成, 石红璆, 董小林, 查代明. CbrB在防御假单胞菌Pf-5生物防治中的作用. 微生物学报, 2024 , 64 (9) : 3506 -3520 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240168

Guangyao RAO, Cheng WAN, Hongqiu SHI, Xiaolin DONG, Daiming ZHA. Role of CbrB in the biocontrol strain Pseudomonas protegens Pf-5[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (9) : 3506 -3520 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240168

正文

收起

绿水青山就是金山银山，生态文明建设离不开农业的可持续发展^[1]。可持续发展理念的提倡以及公众对化学农药对人类健康造成潜在危害的关注，激发了人们对植物病虫害生物防治研究的兴趣，迫切希望寻找更环保、更健康的病虫害防治策略。目前研究热点之一的植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)通过产生促生物质促进植物生长，同时分泌生物活性物质和竞争病原菌生态位抑制土壤中的植物病原菌，其生物防治的主要能力在于通过分泌抗生素、运动和定殖竞争生态位等实现^[2-4]。本研究聚焦的模式生物防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) Pf-5以抑制植物病害和广谱的生防活性而著称，它能够分泌一系列具有生防活性的次级代谢产物，如藤黄绿脓菌素、2, 4-二乙酰基间苯三酚、硝吡咯菌素、氰化氢、铁载体、脂肽A等^[5-7]。这些生防活性物质能有效抵抗多种农作物土传病原菌，如大麻霉斑病、玉米褐斑病、棉花和甜菜立枯病、番茄根腐病等病原菌^[8-9]，在生物防治和生防菌剂的开发及应用方面具有巨大潜力。

藤黄绿脓菌素(pyoluteorin, Plt)作为一种芳香族聚酮类抗生素，其对多种真菌尤其卵菌属真菌具有显著抑制作用^[9-11]。此外Plt还具有抗肿瘤活性，可在体外诱导人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231发生细胞凋亡^[12]。菌株Pf-5中负责Plt合成和转运的基因簇由两对相反转录的操纵子pltRM-pltLABCDEFG^[5]和pltZ-pltIJKNOP^[13]构成，其中LysR家族的调控蛋白PltR在转录水平上激活合成操纵子pltLABCDEFG^[14]，TetR家族的调控蛋白PltZ则负调控转运操作子pltIJKNOP^[15]，Plt生物合成还受全局调控系统GacS/A-RsmXYZ-RsmE、RNA伴侣蛋白Hfq与非典型调控蛋白(Lon、RpoS和RpoN)的调节，除了上述参与假单胞菌抗生素生物合成的调控系统和因子，碳分解代谢阻遏调控系统CbrA/B-CrcY/Z-Crc也可能参与控制假单胞菌抗生素生物合成^[16-17]。

目前假单胞菌CbrB功能的研究主要集中在碳氮代谢相关的基因表达调控机制。CbrB最早于1985年在菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi) 3937中被发现，cbr基因簇编码的CbrA是一个蛋白激酶，感受外界信号磷酸化后活化相应的调节子CbrB^[18]。2001年在铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中发现CbrA/B双组分系统控制菌体碳氮代谢，cbrA和cbrB基因突变体不能使用精氨酸、组氨酸和脯氨酸等氨基酸及胍丁胺作为氮源，也无法使用甘露醇、葡萄糖、丙酮酸和柠檬酸作为碳源^[19]。2009年在铜绿假单胞菌中发现了新的sRNA CrcZ，同时揭示了Crc蛋白功能与CbrA/B系统密切相关，碳分解代谢阻遏调控系统赋予细菌灵活适应多种碳源的能力^[20]。2011年在铜绿假单胞菌中发现CbrA和CbrB协同调节细菌毒力相关过程，包括生物膜形成、细胞毒性和对抗生素的耐药性^[21]。2011年在铜绿假单胞菌中发现RsmY和RsmZ既是GacS/A信号转导通路中的中心调控元件，也是CbrA/B信号转导通路中的关键调节因子^[22]。2012年在恶臭假单胞菌(P. putida)中发现CbrA/B双组分系统激活CrcZ转录，CrcY/Z协同作用阻遏翻译抑制因子Crc蛋白^[23]。2013年在恶臭假单胞菌中发现响应调节蛋白CbrB是RpoN依赖性启动子的激活剂，它直接控制恶臭假单胞菌中sRNA CrcZ和CrcY的表达，但仍有部分CrcY的产生来自独立于CbrB的上游启动子^[24]。2016年利用转座子突变构建了恶臭假单胞菌的cbrB缺失突变体，全基因组测序检测到lapG和lapD中的另外2个点突变，这些效应组合产生了生物膜过量表达的表型^[25]。2017年在假单胞菌科的固氮杆菌瓦恩兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)中发现葡萄糖转运蛋白GluP的表达受到CbrA/CbrB和Crc/Hfq系统控制^[26]。2021年在荧光假单胞菌(P. fluorescens)中发现局部转录因子HutC通过hut启动子处2个双组分系统NtrB/C和CbrA/B间的相互作用维持菌体碳氮稳态^[27]。2022年在铜绿假单胞菌中发现CbrA/B系统是常见变异株lasR⁻出现的关键，损伤肺功能的化合物以CbrB控制的形式促进lasR⁻谱系细胞生长^[28]。2022年在铜绿假单胞菌中发现双GGDEF/EAL结构域蛋白RmcA与CbrB蛋白相互作用，CbrB参与RmcA对生物膜形成和Ⅲ型分泌系统基因的表达，拓展了对细菌二级信号分子环二鸟苷酸信号传导调控网络的理解^[29]。目前，CbrB对防御假单胞菌Pf-5生物防治功能的影响尚不清楚。

本研究从根际促生细菌生物防治功能出发，检测了CbrB对防御假单胞菌Pf-5生长、运动性、生物膜形成、抗真菌活性和抗生素生物合成的影响，研究结果为利用基因工程技术优化生防菌株生物防治能力提供理论依据^[30]。此外，野生型Pf-5中藤黄绿脓菌素等生防活性物质的产量通常较低，本研究通过敲除cbrB有效增强了藤黄绿脓菌素的表达，为深度发掘藤黄绿脓菌素生物合成关键基因奠定了基础^[17]。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

本研究所使用的菌株和质粒如表1所示。

1.1.2 主要试剂

PrimeSTAR^® HS (Premix)、限制性内切酶和T4 DNA Ligase均购自TaKaRa公司；2×Es Taq MasterMix (Dye)、Gel Extraction Kit和PurePlasmid Mini Kit均购自康为世纪生物科技股份有限公司；氨苄青霉素钠(Amp)、硫酸庆大霉素(Gm)、硫酸阿布拉霉素(Am)、硫酸卡那霉素(Km)、X-Gal、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.00，酵母提取物5.00，NaCl 10.00；固体培养基另加琼脂粉15.00 g/L。M9-葡萄糖培养基(g/L)：Na₂HPO₄ 7.10，KH₂PO₄ 2.72，NaCl 0.58，NH₄Cl 1.07，MgSO₄ 0.19，CaCl₂ 0.01，葡萄糖20.00。运动性培养基(g/L)：胰蛋白胨10.00，NaCl 5.00，琼脂粉3.00/5.00。PDA培养基(g/L)：马铃薯100.00，葡萄糖20.00，琼脂粉15.00。38号固体培养基(g/L)：酵母提取物4.00，葡萄糖4.00，麦芽浸粉5.00，琼脂粉15.00。必要时培养基中添加的Amp、Gm、Am、Km和X-Gal终浓度分别为100、50、50、30和200 μg/mL。

1.1.4 引物

本研究所使用的引物如表2所示，其合成由武汉天一华煜基因科技有限公司完成，后续质粒测序由北京擎科生物科技股份有限公司武汉分公司完成。

1.2 cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274的构建

为了探究CbrB对菌株Pf-5生物防治能力的影响，采用基于pJQ200SK的二次同源重组法^[35]构建cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274，其构建图谱如图1A所示。以野生型菌株Pf-5基因组DNA为模板，利用2对引物cbrBU-U-Xba Ⅰ/cbrBU-L-Xho Ⅰ与cbrBD-U-Xho Ⅰ/cbrBD-L-Spe Ⅰ分别扩增cbrB开放阅读框的上、下游DNA片段，然后将这2个双酶切的DNA片段同时克隆到pJQ200SK的Xba Ⅰ−Spe Ⅰ位点，得到重组质粒pJQΔcbrB。将pJQΔcbrB转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，通过双亲本杂交将pJQΔcbrB从大肠杆菌ET12567(pUZ8002)接合转移至防御假单胞菌Pf-5中；第1次同源重组在包含Amp和Gm的LB固体培养基上进行，用引物cbrBF/cbrBR筛选能同时扩增出2条带的单菌落，因为pJQ200SK不能在假单胞菌中复制，在Gm选择压力下通过第1次同源重组事件将重组质粒整合到基因组上进行复制；第2次同源重组在包含Amp和蔗糖的LB固体培养基上进行，用引物cbrBF/cbrBR筛选仅扩增出小条带的单菌落，因为在蔗糖压力下通过第2次同源重组事件消除基因组中的pJQ200SK序列，从而解除SacB的蔗糖致死效应并达到删除靶序列的目的；最后在包含Gm的LB固体培养基中过夜培养以验证pJQ200SK的消除，无Gm抗性的菌株即为cbrB缺失突变菌株Pf5274。

1.3 cbrB互补菌株的构建

为了对cbrB缺失突变菌株进行互补实验，使用引物cbrBF-Hind Ⅲ/cbrBR-Xba Ⅰ扩增包含完整cbrB开放阅读框的DNA片段，纯化后的DNA片段用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ进行双酶切，然后克隆到pBBR1Am的Hind Ⅲ−Xba Ⅰ位点得到cbrB过表达质粒pAm-cbrB，将其转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，通过双亲本杂交将pAm-cbrB分别转移至Pf-5和Pf5274中得到重组菌株Pf-5 pAm-cbrB和Pf5274 pAm-cbrB，通过同样的方法同时得到对照菌株Pf-5 pBBR1Am和Pf5274 pBBR1Am。

1.4 pltL'-'lacZ融合报告菌株的构建

为了检测CbrB对藤黄绿脓菌素生物合成基因簇pltL-G表达的影响，使用引物pltL-PF-Xba Ⅰ/pltL'-PR-Xho Ⅰ扩增包含pltL启动子和部分开放阅读框的DNA片段，将双酶切的DNA片段克隆到pBBR001的Xba Ⅰ−Xho Ⅰ位点得到pBBR-pltL'-'lacZ，然后将其转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，通过双亲本杂交将pBBR-pltL'-'lacZ转入到Pf-5及其衍生菌。

1.5 生长曲线的检测

将Pf-5及其衍生菌株划线培养2 d，挑取单菌落分别接种到添加了Amp或Am的10 mL LB培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀为1.0左右；取2 mL菌液，5 000 r/min离心5 min收集菌体。用新鲜的LB液体培养基洗2次并重新悬浮，随后调节种子液的浓度为OD₆₀₀为1.0；将种子液按1:1 000的比例转接到装有100 mL新鲜LB培养基或M9-葡萄糖培养基的500 mL锥形瓶中，28 ℃、120 r/min振荡培养；接种6 h时取1 mL菌液离心后重悬在等体积去离子水中，以去离子水作空白对照，检测OD₆₀₀值，随后每隔12 h取样，绘制生长曲线；培养基中根据需要添加适量抗生素。

1.6 菌株生物膜形成的检测

生物膜形成的检测参照Gu等^[9]的方法并作适当修改，使用结晶紫染色法评估玻璃试管中菌株生物膜的形成能力。Pf-5及其衍生菌株培养参考1.5节，取10 µL调节后的种子液接种到含有10 mL LB培养基的试管中，28 ℃静置培养2 d，轻柔地倒出培养基并用0.9%的生理盐水清洗3次去除非贴壁细胞；附着在管壁上的生物膜自然晾干，用11 mL 1%结晶紫溶液室温染色20 min；再用0.9%的生理盐水清洗3遍，洗去未被生物膜结合的多余结晶紫；试管自然晾干后加入5 mL无水乙醇溶解与生物膜结合的结晶紫；测量溶液在结晶紫吸收峰595 nm处的吸光值并采集试管图像。

1.7 菌株运动性的检测

运动性的检测参照Liu等^[36]的方法并作适当修改，使用琼脂平板法检测菌株的运动性。Pf-5及其衍生菌株培养参考1.5节，取2 µL调节后的种子液垂直接种于不同琼脂浓度(0.3%、0.5%)的运动性培养基中央内部，28 ℃条件下培养2 d，测量迁移区直径并采集平板图像。

1.8 平板对峙培养

植物病原菌选用终极腐霉ACCC 37386，使用平板对峙法评估CbrB对菌株Pf-5抗真菌活性的影响，参照李哲等^[37]的方法并作适当修改。将终极腐霉接种在PDA培养基上，28 ℃培养2 d得到活化菌体，使用打孔器切取直径5 mm的终极腐霉菌饼接种到含有38号固体培养基的培养皿中培养24 h，然后将1 µL调节后的种子液接种于距菌饼5 cm处，28 ℃静置培养48 h，测量抑菌带宽度并采集平板图像。

1.9 β-半乳糖苷酶活力的测定

为了检测CbrB是否影响pltL-G的表达，各pltL'-'lacZ融合报告菌株所表达的β-半乳糖苷酶的活力采用Miller法^[38]进行测定。将各报告菌株按1:1 000的比例分别接种至装有50 mL新鲜LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，在28 ℃、120 r/min条件下培养，每隔4 h取样500 µL检测细胞密度、取样500 µL反应5 min检测β-半乳糖苷酶活力，绘制Pf-5和cbrB缺失突变菌株的酶活力曲线，测定互补菌株对数期及稳定期的酶活力，辅助验证CbrB的影响。根据公式(1)使用Miller U计算β-半乳糖苷酶活力。

(1)

1.10 统计分析

本研究中的每个实验分别进行了3次以上，使用IBM SPSS Statistics 26统计软件分析数据、Origin 2022软件进行图表制作；在每个实验中，至少包含了3次重复的平行样本，所有数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示；数据采用Student’s t-test法比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

收起

2.1 cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274的构建

为了研究CbrB的功能，采用基于pJQ200SK的二次同源重组法构建了cbrB编码区无痕缺失突变菌株Pf5274，其构建流程如图1A所示。利用引物cbrBF/cbrBR进行cbrB缺失突变菌株的PCR鉴定，以Pf-5基因组为对照，缺失突变菌株Pf5274可扩增出658 bp条带，Pf-5可扩增出1 543 bp条带，与图1B所示结果相符，表示缺失突变菌株构建成功。

2.2 CbrB调控菌株Pf-5的生长

通过检测菌液的OD₆₀₀值反映CbrB对菌株Pf-5生长的影响，Pf-5及其衍生菌株的生长曲线如图2所示。

在LB培养基中，cbrB缺失突变菌株Pf5274的OD₆₀₀值最高为3.090，较野生型菌株Pf-5显著性上升了12.7% (图2A)。从互补实验结果可知，在Pf-5和Pf5274中过表达cbrB会导致菌株的OD₆₀₀值分别显著性降低13.2%和9.2%，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对菌株生长的影响，Pf5274较Pf-5的OD₆₀₀值显著性上升了12.9% (图2B)。这些结果表明，CbrB在天然培养基LB条件下显著性负调控菌株Pf-5的生长。

在M9-葡萄糖培养基中，Pf5274的OD₆₀₀最高值为1.514，较Pf-5显著性下降了33.1% (图2C)。从互补实验结果可知，在Pf-5中过表达cbrB会导致菌株OD₆₀₀值显著性上升11.7%，而在Pf5274中过表达cbrB仅能部分恢复生长，较Pf-5 pBBR1Am的OD₆₀₀值仍下降了20.8%，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对菌株生长的影响，Pf5274较Pf-5的OD₆₀₀值显著性下降了29.2% (图2D)。这些结果表明，CbrB在基础培养基M9-葡萄糖条件下显著性正调菌株Pf-5的生长。

此外，CbrB在对数生长期和稳定期对菌株Pf-5生长的调控趋势相同，而且各菌株的生长曲线不相交，表明CbrB对Pf-5生长的调控在整个细胞周期上具有连续性。

2.3 CbrB负调控菌株Pf-5的生物膜形成

细菌定殖植物的过程中，生物膜形成起着决定性作用，是许多细菌毒力的决定因素^[39]，生物膜形成的检测结果如图3所示。cbrB缺失突变菌株Pf5274的OD₅₉₅值为0.674，较野生型菌株Pf-5上升了41.0%，而且生物膜结构厚度也有所增加；尽管Pf5274的生物膜形成量较Pf-5提升了41.0%，但其OD₆₀₀的增长率仅为12.7%，这表明生物膜形成量的增加不是由于生长速度加快导致的。从互补实验结果可知，在Pf-5和Pf5274中过表达cbrB会导致菌株的生物膜形成量分别显著性下降23.9%和17.7%，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对菌株生物膜形成的影响，Pf5274较Pf-5的生物膜形成量上升了17.6%。这些结果表明，CbrB显著抑制菌株Pf-5的生物膜形成。

2.4 CbrB正调控菌株Pf-5的运动性

很多细菌都具有运动性，这一特性在生态学和病理学具有重要的意义，影响着生物防治菌株的防治能力，细菌的运动性主要包括浮泳运动(swim motility)和群集运动(swarm motility)两种方式^[40]。运动性检测结果如图4所示，无论是浮泳运动还是群集运动，cbrB缺失后菌株的运动能力急剧降低(Pf5274 vs. Pf-5)，而过表达cbrB则显著提高菌株的运动能力(Pf-5/Pf5274 pAm-cbrB vs. Pf-5/Pf5274 pBBR1Am)，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对菌株运动性的影响，Pf5274较Pf-5的运动能力显著性降低。以上结果表明，CbrB显著促进菌株Pf-5的运动性。

2.5 CbrB负调控菌株Pf-5的抗真菌活性

Pf-5及其衍生菌株对终极腐霉的抑制效果显著，平板对峙培养结果如图5所示。cbrB缺失菌株Pf5274的抑菌带宽度为18 mm，较野生型菌株Pf-5显著性增加了18.7%，而过表达cbrB则导致菌株的抑菌带宽度显著性缩小26.7% (Pf-5 pAm-cbrB vs. Pf-5 pBBR1Am)或18.3% (Pf5274 pAm-cbrB vs. Pf5274 pBBR1Am)，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对菌株生防活性的影响，Pf5274较Pf-5的抑菌带宽度显著性增加了10.8%。以上结果表明，CbrB显著抑制菌株Pf-5的抗真菌活性。

2.6 CbrB负调控Plt合成操纵子pltL-G的表达

通过检测pltL'-'lacZ融合报告菌株的β-半乳糖苷酶活力，可以反映CbrB对Plt合成操纵子pltL-G表达的影响。如图6所示，cbrB缺失突变菌株Pf5274的β-半乳糖苷酶活力显著高于野生型菌株Pf-5，而过表达cbrB则显著降低报告菌株的β-半乳糖苷酶活力(Pf-5/Pf5274 pAm-cbrB vs. Pf-5/Pf5274 pBBR1Am)，Pf-5和Pf5274中包含空载质粒pBBR1Am不会干扰CbrB对报告菌株β-半乳糖苷酶活力的影响，Pf5274较Pf-5的β-半乳糖苷酶活力显著提高。以上结果表明，CbrB通过直接或间接途径显著抑制Plt合成操纵子pltL-G的表达。

3 讨论与结论

收起

作为碳分解代谢阻遏调控系统CbrA/B- CrcY/Z-Crc中的关键调控因子，CbrB在假单胞菌属的不同菌株中发挥着多种生物学功能，主要涉及碳氮代谢的调控、生物膜形成、运动性以及对环境适应性的基因表达调控。在铜绿假单胞菌中，CbrB显著影响着菌体的碳氮代谢，cbrB缺失突变体表现出对多种氨基酸和糖类的利用障碍^[19]；此外，CbrB还参与调控细菌的毒力相关过程，如生物膜形成、细胞毒性和对抗生素的耐药性，cbrB的缺失会增强细菌毒性并提高对抗生素的耐药性^[21]。在恶臭假单胞菌中，CbrB作为RpoN依赖型启动子的激活剂，直接调控sRNA CrcY和CrcZ的转录，并抑制生物膜形成^[25]。在瓦恩兰德固氮菌中，CbrB通过调节葡萄糖转运蛋白GluP的表达影响菌体的碳源利用和能量代谢^[26]。在荧光假单胞菌中，CbrB与局部转录因子HutC相互作用，通过与hut启动子处的双组分系统NtrB/C相互作用，共同维持菌体碳氮代谢的稳态^[27]。

碳分解代谢阻遏调控级联系统能保证细菌处于混合碳源时优先利用速效碳源中的单碳化合物^[41]。我们的结果表明，在天然培养基LB条件下CbrB显著负调控菌株Pf-5的生长，而在基础培养基M9-葡萄糖条件下CbrB对菌株Pf-5的生长具有显著正调控作用，这一发现与同属假单胞菌科的固氮杆菌瓦恩兰德固氮菌的报道相一致，当葡萄糖是唯一碳源时，Crc蛋白的过表达会抑制细胞生长^[26]。研究报道，在碳分解代谢阻遏调控级联系统中CbrA/B双组分系统会激活CrcY/Z sRNAs的表达，这反过来隔离翻译抑制因子Crc蛋白并消除其对靶标mRNA的抑制^[17]。本研究结果和以上报道联系起来，暗示了CbrB是通过碳分解代谢阻遏调控级联系统抑制Crc蛋白，从而解除Crc蛋白对生长的抑制，进而正调控防御假单胞菌生长。

生防菌株在固体表面形成坚固的生物膜使其便于定殖在植物根际，在定殖早期菌株的运动性也发挥着重要作用，众所周知定殖能力强的生防菌株往往运动性并不突出。本研究结果表明，CbrB负调控菌株Pf-5生物膜形成的同时正调控其运动性，这与恶臭假单胞菌的报道相一致^{[25, 42]}。杨国环等^[43]认为假单胞菌属细菌在藤黄绿脓菌素生物合成与转运基因簇上有包括防御假单胞菌(Pf-5、CHA0和H78)和铜绿假单胞菌(M18和LESB58)在内的两种不同进化起源，它们虽然在合成及转运基因簇上具有共同的基因组成和布局，然而其在核苷酸序列上以及合成与转运基因簇之间包含多个顺式作用元件的非编码区上有很大差异。本研究结果和以上报道联系起来，提示了CbrB在防御假单胞菌和恶臭假单胞菌中生物膜形成和运动性的调控模式具有相似性，暗示这2种假单胞菌在进化方向上的高同源性。

Howell等^[44]发现菌株Pf-5的主要次级代谢产物藤黄绿脓菌素在抑制终极腐霉等植物病原菌中起着较大作用。本研究结果表明，CbrB负调控菌株Pf-5的拮抗终极腐霉活性。Gu等^[9]通过HPLC分析鉴定出菌株Pf-5抑制玉米叶褐腐病的菠萝泛菌(Pantoea ananatis) DZ-12的主要抑菌成分为藤黄绿脓菌素、2, 4-二乙酰基间三苯酚(2, 4-diacetylphloroglucinol, 2, 4-DAPG)和脂肽A这3种主要成分，其中藤黄绿脓菌素表现出最强烈的抗生素特性，可有效抑制DZ-12生长。通过pltL′-′lacZ融合报告菌株，发现CbrB负调控Plt的表达，进一步证明CbrB是通过抑制Plt的合成从而降低拮抗终极腐霉的活性。

综上所述，本研究首次揭示了CbrB在防御假单胞菌Pf-5中调控生物膜形成、运动性、抗真菌活性和藤黄绿脓菌素合成方面的作用，并提供了CbrB通过碳代谢调控细菌生长的新见解。这为利用基因工程技术提高生防菌株生物防治能力提供理论依据，并为深度发掘藤黄绿脓菌素生物合成奠定基础。

基金

收起

国家自然科学基金(31760534)
江西省自然科学基金(20202BAB213022)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

巩前文, 李学敏. 农业绿色发展指数构建与测度: 2005−2018年[J]. 改革, 2020, 1:133-145. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-REFO202001011.htm

GONG QW, LI XM. Construction and measurement of agricultural green development index: 2005−2018[J]. Reform, 2020, 1:133-145 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-REFO202001011.htm

[2]

FOX AR, SOTO G, VALVERDE C, RUSSO D, LAGARES A Jr, ZORREGUIETA Á, ALLEVA K, PASCUAN C, FRARE R, MERCADO-BLANCO J, DIXON R, AYUB ND. Major cereal crops benefit from biological nitrogen fixation when inoculated with the nitrogen-fixing bacterium Pseudomonas protegens Pf-5 X940[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18 (10):3522-3534.

https://doi.org/10.1111/1462-2920.13376

[3]

JING XS, CUI QW, LI XC, YIN J, RAVICHANDRAN V, PAN D, FU J, TU Q, WANG HL, BIAN XY, ZHANG YM. Engineering Pseudomonas protegens Pf-5 to improve its antifungal activity and nitrogen fixation[J]. Microbial Biotechnology, 2020, 13 (1):118-133.

https://doi.org/10.1111/1751-7915.13335

[4]

但汉鸿, 王道本. 植物促生菌的防病机制[J]. 世界农业, 1995, 1:40-41. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SJNY501.017.htm

DAN HH, WANG DB. Disease prevention mechanism of plant growth-promoting bacteria[J]. World Agriculture, 1995, 1:40-41 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SJNY501.017.htm

[5]

PAULSEN IT, PRESS CM, RAVEL J, KOBAYASHI DY, MYERS GSA, MAVRODI DV, DeBOY RT, SESHADRI R, REN QH, MADUPU R, DODSON RJ, DURKIN AS, BRINKAC LM, DAUGHERTY SC, SULLIVAN SA, ROSOVITZ MJ, GWINN ML, ZHOU LW, SCHNEIDER DJ, CARTINHOUR SW, et al. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5[J]. Nature Biotechnology, 2005, 23:873-878.

https://doi.org/10.1038/nbt1110

[6]

YAN Q, PHILMUS B, HESSE C, KOHEN M, CHANG JH, LOPER JE. The rare codon AGA is involved in regulation of pyoluteorin biosynthesis in Pseudomonas protegens Pf-5[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7:497.

[7]

LOPER JE, KOBAYASHI DY, PAULSEN IT. The genomic sequence of Pseudomonas fluorescens Pf-5: insights into biological control[J]. Phytopathology, 2007, 97 (2):233-238.

https://doi.org/10.1094/PHYTO-97-2-0233

[8]

BALTHAZAR C, ST-ONGE R, LÉGER G, LAMARRE SG, JOLY DL, FILION M. Pyoluteorin and 2, 4-diacetylphloroglucinol are major contributors to Pseudomonas protegens Pf-5 biocontrol against Botrytis cinerea in cannabis[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13:945498.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.945498

[9]

GU Q, QIAO JQ, WANG RY, LU J, WANG ZQ, LI PP, ZHANG LL, ALI Q, KHAN AR, GAO XW, WU HJ. The role of pyoluteorin from Pseudomonas protegens Pf-5 in suppressing the growth and pathogenicity of Pantoea ananatis on maize[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23 (12):6431.

https://doi.org/10.3390/ijms23126431

[10]

KRAUS J, LOPER JE. Characterization of a genomic region required for production of the antibiotic pyoluteorin by the biological control agent Pseudomonas fluorescens Pf-5[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61 (3):849-854.

https://doi.org/10.1128/aem.61.3.849-854.1995

[11]

何延静, 胡洪波, 许煜泉, 张雪洪. 新型生物农药藤黄绿脓菌素[J]. 农药, 2006, 45 (3):155-157.

https://doi.org/10.3969/j.issn.1006-0413.2006.03.004

HE YJ, HU HB, XU YQ, ZHANG XH. A new biological pesticide, pyoluteorin[J]. Agrochemicals, 2006, 45 (3):155-157 (in Chinese).

https://doi.org/10.3969/j.issn.1006-0413.2006.03.004

[12]

DING T, YANG LJ, ZHANG WD, SHEN YH. Pyoluteorin induces cell cycle arrest and apoptosis in human triple-negative breast cancer cells MDA-MB-231[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2020, 72 (7):969-978.

https://doi.org/10.1111/jphp.13262

[13]

WU DQ, YE J, OU HY, WEI X, HUANG XQ, HE YW, XU YQ. Genomic analysis and temperature-dependent transcriptome profiles of the rhizosphere originating strain Pseudomonas aeruginosa M18[J]. BMC Genomics, 2011, 12 (1):438.

https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-438

[14]

LI SN, HUANG XQ, WANG GH, XU YQ. Transcriptional activation of pyoluteorin operon mediated by the LysR-type regulator PltR bound at a 22 bp lys box in Pseudomonas aeruginosa M18[J]. PLoS One, 2012, 7 (6):e39538.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039538

[15]

GUO DD, LUO LM, MA HL, ZHANG SP, XU H, ZHANG HH, WANG Y, YUAN YN, WANG Z, HE YX. The regulator PltZ regulates a putative ABC transporter system PltIJKNOP of Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 in response to the antimicrobial 2, 4-diacetylphloroglucinol[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11:1423.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01423

[16]

WANG Z, HUANG XQ, LIU YJ, YANG GH, LIU Y, ZHANG XH. GacS/GacA activates pyoluteorin biosynthesis through Gac/Rsm-RsmE cascade and RsmA/RsmE-driven feedback loop in Pseudomonas protegens H78[J]. Molecular Microbiology, 2017, 105 (6):968-985.

https://doi.org/10.1111/mmi.13749

[17]

SHI HM, HUANG XQ, WANG Z, GUAN YJ, ZHANG XH. Improvement of pyoluteorin production in Pseudomonas protegens H78 through engineering its biosynthetic and regulatory pathways[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103 (8):3465-3476.

https://doi.org/10.1007/s00253-019-09732-z

[18]

MAHÉ B, MASCLAUX C, RAUSCHER L, ENARD C, EXPERT D. Differential expression of two siderophore-dependent iron-acquisition pathways in Erwinia chrysanthemi 3937: characterization of a novel ferrisiderophore permease of the ABC transporter family[J]. Molecular Microbiology, 1995, 18 (1):33-43.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1995.mmi_18010033.x

[19]

NISHIJYO T, HAAS D, ITOH Y. The CbrA-CbrB two-component regulatory system controls the utilization of multiple carbon and nitrogen sources in Pseudomonas aeruginosa[J]. Molecular Microbiology, 2001, 40 (4):917-931.

https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2001.02435.x

[20]

SONNLEITNER E, ABDOU L, HAAS D. Small RNA as global regulator of carbon catabolite repression in Pseudomonas aeruginosa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (51):21866-21871.

[21]

YEUNG ATY, BAINS M, HANCOCK REW. The sensor kinase CbrA is a global regulator that modulates metabolism, virulence, and antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193 (4):918-931.

https://doi.org/10.1128/JB.00911-10

[22]

SONNLEITNER E, HAAS D. Small RNAs as regulators of primary and secondary metabolism in Pseudomonas species[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91 (1):63-79.

https://doi.org/10.1007/s00253-011-3332-1

[23]

MORENO R, FONSECA P, ROJO F. Two small RNAs, CrcY and CrcZ, act in concert to sequester the Crc global regulator in Pseudomonas putida, modulating catabolite repression[J]. Molecular Microbiology, 2012, 83 (1):24-40.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2011.07912.x

[24]

GARCÍA-MAURIÑO SM, PÉREZ-MARTÍNEZ I, AMADOR CI, CANOSA I, SANTERO E. Transcriptional activation of the CrcZ and CrcY regulatory RNAs by the CbrB response regulator in Pseudomonas putida[J]. Molecular Microbiology, 2013, 89 (1):189-205.

https://doi.org/10.1111/mmi.12270

[25]

AMADOR CI, LÓPEZ-SÁNCHEZ A, GOVANTES F, SANTERO E, CANOSA I. A Pseudomonas putida cbrB transposon insertion mutant displays a biofilm hyperproducing phenotype that is resistant to dispersal[J]. Environmental Microbiology Reports, 2016, 8 (5):622-629.

https://doi.org/10.1111/1758-2229.12414

[26]

QUIROZ-ROCHA E, MORENO R, HERNÁNDEZ-ORTÍZ A, FRAGOSO-JIMÉNEZ JC, MURIEL-MILLÁN LF, GUZMÁN J, ESPÍN G, ROJO F, NÚÑEZ C. Glucose uptake in Azotobacter vinelandii occurs through a GluP transporter that is under the control of the CbrA/CbrB and Hfq-Crc systems[J]. Scientific Reports, 2017, 7:858.

https://doi.org/10.1038/s41598-017-00980-5

[27]

NAREN NR, ZHANG XX. Role of a local transcription factor in governing cellular carbon/nitrogen homeostasis in Pseudomonas fluorescens[J]. Nucleic Acids Research, 2021, 49 (6):3204-3216.

https://doi.org/10.1093/nar/gkab091

[28]

MOULD DL, STEVANOVIC M, ASHARE A, SCHULTZ D, HOGAN DA. Metabolic basis for the evolution of a common pathogenic Pseudomonas aeruginosa variant[J]. eLife, 2022, 11:e76555.

https://doi.org/10.7554/eLife.76555

[29]

KONG WN, LUO W, WANG YY, LIU Y, TIAN QQ, ZHAO C, LIANG HH. Dual GGDEF/EAL-domain protein RmcA controls the type Ⅲ secretion system of Pseudomonas aeruginosa by interaction with CbrB[J]. ACS Infectious Diseases, 2022, 8 (12):2441-2450.

https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.2c00212

[30]

刘正强. 利用核糖体工程技术提高荧光假单胞菌Pf-5菌株活性次级代谢产物产量[D]. 长沙: 湖南师范大学硕士学位论文, 2016.

LIU ZQ. Improving the production of active secondary metabolites in Pseudomonas protegens pf-5 by using ribosome engineering[D]. Changsha: Master's Thesis of Hunan Normal University, 2016 (in Chinese).

[31]

MacNEIL DJ, OCCI JL, GEWAIN KM, MacNEIL T, GIBBONS PH, RUBY CL, DANIS SJ. Complex organization of the Streptomyces avermitilis genes encoding the avermectin polyketide synthase[J]. Gene, 1992, 115 (1/2):119-125.

[32]

HOWELL CR. Control of Rhizoctonia solanion cotton seedlings with Pseudomonas fluorescens and with an antibiotic produced by the bacterium[J]. Phytopathology, 1979, 69 (5):480.

https://doi.org/10.1094/Phyto-69-480

[33]

QUANDT J, HYNES MF. Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negative bacteria[J]. Gene, 1993, 127 (1):15-21.

https://doi.org/10.1016/0378-1119(93)90611-6

[34]

KOVACH ME, ELZER PH, HILL DS, ROBERTSON GT, FARRIS MA, ROOP RM 2nd, PETERSON KM. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes[J]. Gene, 1995, 166 (1):175-176.

https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00584-1

[35]

ZHA DM, XU L, ZHANG HJ, YAN YJ. The two-component GacS-GacA system activates lipA translation by RsmE but not RsmA in Pseudomonas protegens Pf-5[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80 (21):6627-6637.

https://doi.org/10.1128/AEM.02184-14

[36]

LIU XX, YE YF, ZHU Y, WANG LF, YUAN LY, ZHU JL, SUN AH. Involvement of RpoN in regulating motility, biofilm, resistance, and spoilage potential of Pseudomonas fluorescens[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12:641844.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.641844

[37]

李哲, 李璇, 崔婷婷, 任云. 绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3在木霉生物防治作用中的功能分析[J]. 微生物学报, 2023, 63 (9):3560-3573.

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230006

LI Z, LI X, CUI TT, REN Y. Role of Trichoderma viride histone deacetylase gene TvRpd3 in the biocontrol of Trichoderma[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63 (9):3560-3573 (in Chinese).

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230006

[38]

SAMBROOK J, FRITSCH EF, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

[39]

DANHORN T, FUQUA C. Biofilm formation by plant-associated bacteria[J]. Annual Review of Microbiology, 2007, 61:401-422.

https://doi.org/10.1146/annurev.micro.61.080706.093316

[40]

丁莉莎, 王瑶. 鞭毛介导的运动性与细菌生物膜的相互关系[J]. 微生物学报, 2009, 49 (4):417-422. https://actamicro.ijournals.cn/actamicrocn/article/abstract/xb20090402?st=search

https://doi.org/10.3321/j.issn:0001-6209.2009.04.002

DING LS, WANG Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria: a review[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2009, 49 (4):417-422 (in Chinese). https://actamicro.ijournals.cn/actamicrocn/article/abstract/xb20090402?st=search

https://doi.org/10.3321/j.issn:0001-6209.2009.04.002

[41]

ROJO F. Carbon catabolite repression in Pseudomonas: optimizing metabolic versatility and interactions with the environment[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2010, 34 (5):658-684.

https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2010.00218.x

[42]

AMADOR CI, CANOSA I, GOVANTES F, SANTERO E. Lack of CbrB in Pseudomonas putida affects not only amino acids metabolism but also different stress responses and biofilm development[J]. Environmental Microbiology, 2010, 12 (6):1748-1761.

https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02254.x

[43]

杨国环, 王正, 吴玲玉, 张雪洪, 黄显清. Pseudomonas protegens H78中抗真菌剂藤黄绿菌素的合成及其基因簇分析[J]. 基因组学与应用生物学, 2015, 34 (4):680-684. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GXNB2022Z1008.htm

YANG GH, WANG Z, WU LY, ZHANG XH, HUANG XQ. The pyoluteorin (plt) biosynthesis and gene cluster analysis in Pseudomonas protegens H78[J]. Genomics and Applied Biology, 2015, 34 (4):680-684 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GXNB2022Z1008.htm

[44]

HOWELL CR. Suppression of Pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin[J]. Phytopathology, 1980, 70 (8):712.

https://doi.org/10.1094/Phyto-70-712

2024年第64卷第9期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240168

接收时间：2024-03-19
首发时间：2026-03-20
出版时间：2024-06-05

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-03-19
录用日期：2024-06-03

基金

National Natural Science Foundation of China(31760534)

国家自然科学基金(31760534)

Natural Science Foundation of Jiangxi Province(20202BAB213022)

江西省自然科学基金(20202BAB213022)

作者信息

1 长江大学农学院, 农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建), 湖北荆州 434025

2 九江学院药学与生命科学学院, 江西九江 332005

通讯作者:

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20240168

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

Strains and plasmids	Relevant characteristics	Sources
Escherichia coli
Top10	mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araD139Δ(ara-leu) 7697galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG, used for cloning	Invitrogen
ET12567(pUZ8002)	dam-13T: : Tn9 dcm-6 hsdM cml^R, kan^R, used for biparental mating	[31]
Pseudomonas protegens
Pf-5	Rhizosphere isolate, Amp^r	[32]
Pf5274	ΔcbrB derivative of Pf-5, Amp^r	This study
Pf-5 pBBR1Am	Pf-5 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pBBR1Am	Pf5274 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf-5 pAm-cbrB	Pf-5 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pf5274 pAm-cbrB	Pf5274 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r	This study
Pythium ultimum
ACCC 37386	Soil isolate	Agricultural culture collection of China
Plasmids
pJQ200SK	Suicide vector with sacB counter-selectable marker used for homologous recombination, Gm^r	[33]
PJQΔcbrB	pJQ200SK carrying a 2 067 bp Xba Ⅰ/Spe Ⅰ insert with a deletion in the coding region of cbrB; Gm^r	This study
pBBR1MCS-5	Broad-host-range vector; Gm^r	[34]
pBBR001	pBBR1MCS-5 with a translational 'lacZ fusion, Gm^r	[35]
pBBR-pltL'-'lacZ	pBBR001 with a translational pltL'-'lacZ fusion; Gm^r	This study
pBBR1Am	Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ-digested apramycin resistance cassette subcloned in pBBR1MCS-5 digested with the same endonucleases, Am^r	This study
pAm-cbrB	pBBR1Am carrying a 1 504 bp Xba Ⅰ/Hind Ⅲ insert with the coding region of cbrB, Am^r	This study

Strains and plasmids

Relevant characteristics

Sources

Escherichia coli

Top10

mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araD139Δ(ara-leu) 7697galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG, used for cloning

Invitrogen

ET12567(pUZ8002)

dam-13T: : Tn9 dcm-6 hsdM cml^R, kan^R, used for biparental mating

[31]

Pseudomonas protegens

Pf-5

Rhizosphere isolate, Amp^r

[32]

Pf5274

ΔcbrB derivative of Pf-5, Amp^r

This study

Pf-5 pBBR1Am

Pf-5 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r

This study

Pf5274 pBBR1Am

Pf5274 harboring pBBR1Am plasmid, Amp^r and Am^r

This study

Pf-5 pAm-cbrB

Pf-5 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r

This study

Pf5274 pAm-cbrB

Pf5274 harboring pAm-cbrB plasmid, Amp^r and Am^r

This study

Pythium ultimum

ACCC 37386

Soil isolate

Agricultural culture collection of China

Plasmids

pJQ200SK

Suicide vector with sacB counter-selectable marker used for homologous recombination, Gm^r

[33]

PJQΔcbrB

pJQ200SK carrying a 2 067 bp Xba Ⅰ/Spe Ⅰ insert with a deletion in the coding region of cbrB; Gm^r

This study

pBBR1MCS-5

Broad-host-range vector; Gm^r

[34]

pBBR001

pBBR1MCS-5 with a translational 'lacZ fusion, Gm^r

[35]

pBBR-pltL'-'lacZ

pBBR001 with a translational pltL'-'lacZ fusion; Gm^r

This study

pBBR1Am

Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ-digested apramycin resistance cassette subcloned in pBBR1MCS-5 digested with the same endonucleases, Am^r

This study

pAm-cbrB

pBBR1Am carrying a 1 504 bp Xba Ⅰ/Hind Ⅲ insert with the coding region of cbrB, Am^r

This study

Name	Sequences (5′→3′)	Usage
小写字母为保护碱基和限制性内切酶酶切位点 Lowercase letters represent protecting bases and restriction enzyme cleavage sites.
cbrBU-U-Xba Ⅰ	cctctagATCTCGCGTATCGTCCAGT	Upstream homologous arm of cbrB
cbrBU-L-Xho Ⅰ	gtactcgaGATTTCGCCATTGTTGTTG
cbrBD-U-Xho Ⅰ	gtactcGAGCTGGCACGCAAACT	Downstream homologous arm of cbrB
cbrBD-L-Spe Ⅰ	gactagTGGGGGTGATATTGAGCAG
cbrBF	TACATCGCCAAGCCGTTC	Verification of cbrB deletion
cbrBR	TGACCTTTCGATCCAACCAG
cbrBF-Hind Ⅲ	ctcaagcttATGCCGCATATTCTGAT	Coding region of cbrB
cbrBR-Xba Ⅰ	ctctctagaCCTGTTACGTGCGATG
pltL-PF-Xba Ⅰ	ccttctagaGCCAAGTAGTCTTCCTGTTTC	Promoter and partial coding region of pltL
pltLʹ-PR-Xho Ⅰ	catctcgaGCCCGATCAAATCTTCCATG

Name

Sequences (5′→3′)

Usage

小写字母为保护碱基和限制性内切酶酶切位点
Lowercase letters represent protecting bases and restriction enzyme cleavage sites.

cbrBU-U-Xba Ⅰ

cctctagATCTCGCGTATCGTCCAGT

Upstream homologous arm of cbrB

cbrBU-L-Xho Ⅰ

gtactcgaGATTTCGCCATTGTTGTTG

cbrBD-U-Xho Ⅰ

gtactcGAGCTGGCACGCAAACT

Downstream homologous arm of cbrB

cbrBD-L-Spe Ⅰ

gactagTGGGGGTGATATTGAGCAG

cbrBF

TACATCGCCAAGCCGTTC

Verification of cbrB deletion

cbrBR

TGACCTTTCGATCCAACCAG

cbrBF-Hind Ⅲ

ctcaagcttATGCCGCATATTCTGAT

Coding region of cbrB

cbrBR-Xba Ⅰ

ctctctagaCCTGTTACGTGCGATG

pltL-PF-Xba Ⅰ

ccttctagaGCCAAGTAGTCTTCCTGTTTC

Promoter and partial coding region of pltL

pltLʹ-PR-Xho Ⅰ

catctcgaGCCCGATCAAATCTTCCATG