微生物学报

克雷伯氏菌CW-D3T菌株硫酸盐厌氧呼吸对水中PHE-Cd²⁺的修复特性

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许晓毅 ¹^,^* , 季凡 ¹ , 吴兵党 ¹ , 庄金龙 ¹ , 黄天寅 ¹ , 白净 ² , 张明乐 ¹

微生物学报 | 研究报告 2024,64(9): 3419-3435

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(9): 3419-3435

克雷伯氏菌CW-D3T菌株硫酸盐厌氧呼吸对水中PHE-Cd²⁺的修复特性

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许晓毅¹^,^*, 季凡¹, 吴兵党¹, 庄金龙¹, 黄天寅¹, 白净², 张明乐¹

作者信息

1 苏州科技大学环境科学与工程学院, 江苏苏州 2150092

2 苏州科技大学化学与生命科学学院, 江苏苏州 215009

Bioremediation characteristics of PHE-Cd²⁺ in water by anaerobic respiration of the sulfate-reducing bacterium Klebsiella sp. CW-D3T

Xiaoyi XU¹^,^*, Fan JI¹, Bingdang WU¹, Jinlong ZHUANG¹, Tianyin HUANG¹, Jing BAI², Mingle ZHANG¹

Affiliations

1 School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China

2 School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China

出版时间: 2024-05-10 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240136

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摘要

收起

【目的】针对菲(phenanthrene, PHE)-Cd²⁺污染体系，探究一株兼性厌氧克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.) CW-D3T菌株利用硫酸盐作为末端电子受体厌氧呼吸耦合降解目标污染物，解析硫酸盐还原体系中该菌株对不同Cd²⁺赋存浓度的响应机制以及PHE的厌氧代谢途径。【方法】构建硫酸盐初始浓度为20 mmol/L的还原反应体系，以促进功能菌的生长代谢活性并强化修复PHE-Cd²⁺污染；分析胞外聚合物分泌量变化以及特征峰的振动特征，探讨体系中Cd²⁺梯度浓度胁迫时细胞自身的响应行为；借助GC-MS和HPLC对硫酸盐还原体系中PHE的代谢产物进行定性和定量分析。【结果】Cd²⁺胁迫浓度为0.5−50 mg/L条件下，Klebsiella sp. CW-D3T菌株的硫酸盐厌氧还原体系可以良好强化去除目标化合物；Cd²⁺胁迫浓度不高于10 mg/L时，PHE和Cd²⁺去除率均高于70.00%。随着Cd²⁺胁迫浓度的增加，胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)中胞外多糖分泌含量较胞外蛋白更高，菌体细胞表面的多糖和蛋白骨架官能团特征峰的谱峰强度增强。Cd²⁺胁迫下PHE在硫酸盐还原体系中初始活化步骤更倾向于羧基化产生2-菲甲酸，初始Cd²⁺浓度分别为10 mg/L和50 mg/L时，2-菲甲酸含量在第5天均达到峰值(15.56 μg/L和10.23 μg/L)，与未添加Cd²⁺对照组相比分别降低了27.56%和52.37%，Cd²⁺胁迫浓度对周期内与周期末2-菲甲酸含量具有显著影响。【结论】利用硫酸盐作为电子受体显著促进Cd²⁺赋存下Klebsiella sp. CW-D3T菌株对PHE的生物降解，胞外多糖和蛋白的解毒调控机制对提高微生物抗Cd²⁺胁迫具有积极作用。

关键词

PHE-Cd²⁺复合污染 / 兼性厌氧菌 / 硫酸盐耦合 / 胞外聚合物 / 代谢特性

Abstract

收起

[Objective] A facultative anaerobic bacterium Klebsiella sp. CW-D3T utilizing sulfate as the terminal electron acceptor for anaerobic respiration was used for degradation of target pollutants in the system with phenanthrene (PHE)-Cd²⁺ co-contamination. The response mechanism of the strain to different Cd²⁺ concentrations in the sulfate reduction system and the anaerobic metabolic pathways of the strain for degrading PHE were studied. [Methods] A sulfate reduction system with an initial sulfate concentration of 20 mmol/L was developed to enhance the growth and metabolic activity of functional bacteria and improve the bacterial performance for remediating PHE-Cd²⁺ co-contamination. The changes in extracellular polymer secretion and the vibrational characteristics of characteristic peaks were analyzed to explore the cellular responses to different Cd²⁺ concentrations. Furthermore, qualitative and quantitative analyses of the metabolic products of PHE in the sulfate reduction system were conducted by GC-MS and HPLC. [Results] In the presence of 0.5–50.0 mg/L Cd²⁺, the sulfate reduction system of Klebsiella sp. CW-D3T enhanced the remediation efficiency of target compounds, with the PHE and Cd²⁺ removal rates above 70.00% when the initial Cd²⁺ concentration was below 10 mg/L. As the concentration of Cd²⁺ increased, the secretion of extracellular polysaccharides in extracellular polymeric substances (EPS) was more than that of extracellular proteins, and the intensity of characteristic peaks of polysaccharides and protein functional groups on the surface of bacterial cells was enhanced. The initial activation of PHE in the sulfate reduction system tended to favor carboxylation to produce 2-phenanthroic acid under Cd²⁺ stress. When the initial Cd²⁺ concentrations were 10 mg/L and 50 mg/L, the content of 2-phenanthroic acid peaked at 15.56 μg/L and 10.23 μg/L on day 5, respectively, which decreased by 27.56% and 52.37% compared with that of the control group without the addition of Cd²⁺. Cd²⁺ stress significantly affected the 2-phenanthroic acid content within the cycle and at the end of the cycle. [Conclusion] The biodegradation efficiency of PHE by Klebsiella sp. CW-D3T was significantly improved when sulfate was used as an electron acceptor in the presence of Cd²⁺. The extracellular polysaccharides and proteins played a positive role in enhancing the microbial tolerance to Cd²⁺ stress by regulating the detoxification process.

Key words

PHE-Cd²⁺ co-contamination / facultative anaerobic bacteria / sulfate coupling / extracellular polymeric substances (EPS) / metabolic characteristics

引用本文

许晓毅, 季凡, 吴兵党, 庄金龙, 黄天寅, 白净, 张明乐. 克雷伯氏菌CW-D3T菌株硫酸盐厌氧呼吸对水中PHE-Cd²⁺的修复特性. 微生物学报, 2024 , 64 (9) : 3419 -3435 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240136

Xiaoyi XU, Fan JI, Bingdang WU, Jinlong ZHUANG, Tianyin HUANG, Jing BAI, Mingle ZHANG. Bioremediation characteristics of PHE-Cd²⁺ in water by anaerobic respiration of the sulfate-reducing bacterium Klebsiella sp. CW-D3T[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (9) : 3419 -3435 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240136

正文

收起

自然环境中的持久性有机物-无机物复合污染往往通过协同、叠加等联合作用产生更强的“三致”效应和生态毒性^[1-2]。多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和重金属(heavy metals, HMs)污染来源广泛且能在土壤中长期累积，约有5亿hm²的土壤检测出PAHs-重金属复合污染，部分调查场地的污染物浓度高于生态安全阈值水平^[3-4]。目前，PAHs的微生物修复因具有成本低、降解彻底、无二次污染等优势而备受推崇^[5-6]。由于大气沉降、冲刷积累效应，PAHs-Cd²⁺复合污染在土壤、河流(湿地)沉积物或滨岸带等厌氧或低氧环境中存在^[7-9]，在缺少氧气作为末端电子受体或开环酶底物的环境介质中，微生物厌氧呼吸速率显著降低的同时^[10-11]，降解菌对重金属约束下的代谢行为响应存在差异。因此，探索相应的强化机制和策略是微生物修复技术保障的重要前提。

研究已经证实了克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等兼性厌氧菌能够在厌氧环境中形成稳定的种群规模和新陈代谢活动^[12-13]，在硫酸盐、硝酸盐、金属离子和产甲烷还原体系中微生物不仅可以矿化PAHs，同时还能够有效降低电子受体化合物本身导致的污染负荷^[14-16]。已有文献报道硫酸盐对强化PAHs的厌氧降解具有显著作用，硫酸盐消耗率与PAHs的生物转化呈正相关^[17]。研究表明，微生物以PAHs作为碳源和电子供体，通过硫酸盐还原驱动很好地实现了PAHs降解^[18-19]。Chang等^[20]发现加入20 mmol/L的硫酸盐可促进石油化工污泥中菲(phenanthrene, PHE)、芘等5种PAHs混合物的生物降解能力。在10 mg/L的菲作为单一污染物体系中，硫酸盐促进了克雷伯氏菌的生长能力和菲的降解效果^[21]。硫酸盐还原体系已被证实具有较完整的PAHs厌氧代谢转化路径，产生更少的中间代谢体积累^[22]。Koelschbach等^[23]研究表明，萘可在硫酸盐还原体系中通过开环作用逐步分解成较易被兼氧微生物所利用的化合物结构。在微生物修复PAHs-重金属机制层面，一方面，重金属胁迫会不同程度破坏生物降解酶的生理生化功能，进而导致复合污染修复效果的降低^[24-26]；另一方面，微生物细胞具有较多的官能团，可通过分泌胞外聚合物的解毒调控机制增强重金属胁迫下PAHs的生物降解^[27-28]。Liu等^[29]研究发现，高浓度Pb²⁺ (100−300 mg/L)通过破坏菌株的酶活性和蛋白质含量进而抑制PHE的生物降解进程。目前，有关微生物厌氧修复PAHs-重金属复合污染的现状研究成果较为缺乏，厌氧环境中微生物对重金属胁迫的响应特征，以及细胞生态行为的关联机制仍有待深入探讨。功能菌厌氧呼吸耦合PAHs-重金属复合污染修复特性对进一步挖掘菌株资源具有实际意义。

选取生态毒性强且普遍存在于PAHs污染的环境介质中的Cd²⁺为典型重金属，以兼具K区和湾区特征的PHE作为PAHs模型化合物体系，构建Klebsiella sp. CW-D3T硫酸盐强化厌氧降解体系，探讨Cd²⁺胁迫下功能菌利用末端电子受体厌氧呼吸强化PHE的生物降解特性，同时结合功能菌的表型特征和代谢活性，分析厌氧条件下功能菌的解毒机制，阐释Cd²⁺共存体系中功能菌厌代谢PHE的转化途径。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 培养基

LB液体培养基(g/L)：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母膏5.0，加蒸馏水定容至1 L，调pH至7.0±0.2，121 ℃灭菌30 min。

无机盐溶液(g/L)：NaNO₃ 2.00，NaCl 5.00，MgSO₄·7H₂O 0.25，K₂HPO₄·3H₂O 6.30，KH₂PO₄ 4.00，(NH4)₂SO₄ 1.00，Tween-80 0.20，加蒸馏水定容至1 L，调pH至7.0±0.2，121 ℃灭菌30 min，添加一定量的PHE和Cd²⁺，配制不同初始浓度的无机盐溶液，摇匀后置于通风橱中待用。

1.1.2 供试菌株及其菌悬液的制备

Klebsiella sp. CW-D3T菌株为革兰氏阴性，兼性厌氧菌，呈直杆状，细胞大小为(0.3−1.0)× (0.6−6.0) μm，从中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC, http://cctcc.whu.edu.cn/)获取，保藏号为CCTCC AB 206144T，高效降解萘、菲、芘等多种PAHs化合物，萘的平均降解率为73.0%^[30]。

将菌株CW-D3T接种于新鲜的LB液体培养基中，28 ℃、120 r/min培养18 h至对数生长期，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗后重悬，调整菌液OD₆₀₀值至1.0，制成菌悬液备用。所有操作过程均在无菌条件下进行。

1.2 批次实验

批次实验在厌氧瓶中进行。Cd²⁺初始梯度浓度分别为0、0.5、10、25、50 mg/L，PHE初始浓度均为30 mg/L；还原反应体系中硫酸盐电子受体浓度为20 mmol/L，设置不添加硫酸盐的空白对照组^[31]。

菌液按体积分数10%接种于设定Cd²⁺、PHE初始浓度的系列厌氧瓶中，高纯氮气吹扫处理后，使厌氧瓶内溶解氧含量趋于零。在30 ℃、120 r/min摇床中避光振荡10 d，同时根据水位线补充灭菌去离子水，于周期反应时间第1、3、5、7、10天取样并检测相关指标。

1.3 菌株抗性和耐受性检测

重金属最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的测定，菌液按体积分数1%添加至液体LB培养基中，28 ℃、120 r/min扩培12 h后，接种于不同浓度CdCl₂的新鲜灭菌LB培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养24−36 h，接种至LB琼脂平板上，结合OD₆₀₀测量值，完全抑制细菌生长的Cd²⁺最低浓度确定为MIC^[32-33]。

以微生物生长滞后期表示重金属耐受性。将扩培接种液添加到不同浓度CdCl₂的新鲜LB液体培养基中，设置初始OD₆₀₀约为0.01，每隔2 h测定一次OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到0.1时定义为细胞开始生长^[33-34]。

1.4 PHE和Cd²⁺指标的检测

PHE浓度测定采用高效液相色谱仪(Agilent公司)，待测样品溶液中加入等体积无水乙醇，超声促溶20 min，用0.22 μm有机滤膜过滤。色谱检测条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Micron公司)，254 nm波长测定，温度25 ℃，保留时间18 min；流动相为超纯水: 乙腈=8:2 (体积比)，1.5 mL/min的流速，进样量5 μL。Cd²⁺浓度通过电感耦合等离子体质谱法测定，待测样品过0.22 μm有机滤膜。SO₄²⁻浓度采用铬酸钡分光光度法测定。SO₄²⁻消耗量计算以电子转移量为比较基准，单位时间SO₄²⁻转移电子摩尔数转化为H₂S，按公式(1)计算。

(1)

式中，N_e(SO₄²⁻)为单位时间内SO₄²⁻转移电子的摩尔数(mmol/d)；m₀(SO₄²⁻)为初始SO₄²⁻的质量(mg)；m_t(SO₄²⁻)为试验结束时SO₄²⁻的质量(mg)；t为周期反应天数(d)；8为1 mol的SO₄²⁻转化为1 mol的H₂S过程中电子转移数，96为SO₄²⁻的相对分子质量(g/mol)。

1.5 电子传递体系活性检测

生物的电子传递体系活性测定参考Gu等^[35]的方法，通过提供过量的电子供体(NADH与琥珀酸)，以人工添加的碘硝基氯化四氮唑蓝(iodonitrotetrazolium chloride, INT)为电子受体，微生物将INT还原为甲臜(iodonitrotetrazolium chloride formazan, INTF)的速率来指示微生物的电子传递体系活性。

1.6 细胞特性检测

1.6.1 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)分析

周期反应第5天的菌悬液于4 ℃、5 000 r/min离心5 min，得到的菌体用2.5%戊二醛固定12 h (4 ℃)后，再次离心富集菌体，采用0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液清洗3次，用梯度浓度(包括30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%)乙醇溶液逐级脱水，每次20 min。临界点干燥并喷金处理。采用扫描电子显微镜(ThermoFisher Scientific公司)下观察细胞表型特征。

1.6.2 胞外聚合物分析

取30 mL待测样于冷冻离心机中，4 ℃、4 500 r/min离心15 min获得菌体，用磷酸盐缓冲溶液二次离心清洗，将菌体重悬于0.9%的氯化钠溶液60 ℃加热30 min，再次离心15 min (4 ℃, 10 000 r/min)。上清液用0.22 μm滤膜过滤，转移到透析袋中(分子量为4 000 Da，24 h)，透析得到纯净EPS于−20 ℃保存。蛋白含量以考马斯亮蓝法测定，多糖以蒽酮比色法测定。

1.6.3 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR)分析

待测溶液以10 000 r/min转速离心，用0.9%的无菌生理盐水洗涤离心管底部菌体3次后冷冻干燥。在波长400−4 000 cm⁻¹下采用傅里叶变换红外光谱仪(ThermoFisher Scientific公司)检测，以分析菌株在Cd²⁺胁迫前后的细胞表面官能团的变化。

1.7 PHE代谢产物的定性定量检测

中间代谢产物的定性检测：反应体系整瓶萃取，采用乙酸乙酯在中性和酸化条件下提取2次后，用无水Na₂SO₄干燥，萃取物用旋转蒸发器完全蒸发，正己烷重新溶解定样。提取物用BSTFA-TMCs (99:1)在68 ℃下衍生化1 h，用气相色谱-质谱仪(Agilent公司)分析。测定条件：进样量为1 μL，柱速为1.0 mL/min。升温程序为：初始温度50 ℃，3 min，10 ℃/min升温至250 ℃，保持10 min，10 ℃/min，升温至280 ℃，保温1 min。进口温度和离子源温度分别设置为280 ℃和200 ℃。

中间代谢产物的定量分析：样品溶液倒入分液漏斗中，加入等体积二氯甲烷，充分混匀后静置5 min，将有机相接入旋蒸瓶内，待瓶内溶液挥发至1 mL，加入1 mL二氯甲烷充分振荡并置于分液漏斗内再次萃取后倒入旋蒸瓶。旋蒸瓶内溶液挥发至1 mL后加入等体积乙腈，在超声波清洗仪中促溶5 min后旋蒸，待瓶内溶液全部挥发后，加入2 mL乙腈，旋蒸瓶内样品过0.22 μm滤膜，采用高效液相色谱仪测定。

1.8 数据分析

各批次实验均设置平行实验组(n=3)。数据处理以及图形绘制使用Excel 2019、OriginPro 2018c进行，利用One-way ANOVA法于SPSS分析不同处理组间差异显著性。

2 结果与分析

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2.1 菌株CW-D3T厌氧呼吸耦合时的PHE-Cd²⁺去除特性

2.1.1 Cd²⁺胁迫下PHE的厌氧降解率

设置Cd²⁺梯度浓度为0、100、200、300、400、500、600、700、800和900 mg/L，当Cd²⁺浓度为700 mg/L时，菌株CW-D3T停止生长(以细胞生长量计)，结果表明Cd²⁺抗性区间为500 mg/L < MIC < 700 mg/L，菌株的抗Cd²⁺特性优良。图1A为菌株在各梯度Cd²⁺浓度赋存时的生长曲线，微生物在重金属胁迫下的耐受性可用微生物生长前的滞后期长短来表征。与无Cd²⁺添加对照组相比，不同梯度Cd²⁺浓度胁迫后，该菌株出现不同程度的生长滞后；随着Cd²⁺初始浓度的升高，停滞适应期时长增加。可能原因为重金属损害细胞膜表面蛋白，进入胞内导致离子调节功能紊乱，进而影响微生物正常的生长代谢^[36]。

图1B为各梯度Cd²⁺浓度赋存时菌株CW-D3T对PHE的厌氧降解率。Cd²⁺胁迫浓度为0.5 mg/L时，较无Cd²⁺添加对照组，0−3 d时PHE降解率略微升高(4.35%, P < 0.05)，反应周期末的降解率与对照组相当。供试菌株细胞呈负电性，菌体细胞表面电负荷被一定程度中和，可略微促进微生物对PAHs的吸附去除^[37]。初始Cd²⁺浓度为10−50 mg/L时，PHE的降解率为59.31%−45.39%，相较于对照组下降了5.10%−19.02%。结果表明，硫酸盐强化前的反应体系中，不同Cd²⁺浓度胁迫下，菌株CW-D3T对PHE的周期末降解效果均具有显著性差异(P < 0.05)，菌株CW-D3T受高浓度Cd²⁺胁迫效应的冲击影响较大。

反应周期结束时，各Cd²⁺浓度周期末去除率如图1C所示。Cd²⁺初始浓度为0.5、10、25和50 mg/L时，反应周期结束时相应的剩余Cd²⁺浓度分别为0.145、4.010、11.435和23.390 mg/L，相应的去除率分别为71.00%、59.90%、54.26%和53.22%。

2.1.2 硫酸盐强化去除PHE-Cd²⁺污染

图2A为Cd²⁺胁迫下添加硫酸盐强化菌株CW-D3T对PHE的厌氧降解。相较于无添加硫酸盐的实验结果(图1B)，强化反应体系中不同Cd²⁺浓度条件下，PHE周期末降解率增加了8.75%−13.69%，均具有显著性差异(P < 0.05)。硫酸盐强化反应体系中，Cd²⁺赋存浓度0.5 mg/L时PHE降解率(76.36%)与未添加Cd²⁺实验组相当，低浓度Cd²⁺ (0.5 mg/L)对PHE的硫酸盐强化厌氧生物降解影响不显著(P > 0.05)；当Cd²⁺胁迫浓度 > 10 mg/L时，周期末的PHE降解率分别为70.06%、64.02%、54.14%。Cd²⁺胁迫浓度为10− 50 mg/L时，菌株CW-D3T周期末的PHE去除速率显著降低，PHE周期末降解效果具有显著性差异(P < 0.05)。较高浓度Cd²⁺胁迫条件下，硫酸盐作为外源电子受体可明显促进菌株CW-D3T厌氧呼吸并对同步强化对PHE的生物降解。

图2B为菌株CW-D3T在反应周期内的Cd²⁺去除特性。Cd²⁺初始浓度为0.5、10、25和50 mg/L时，反应周期结束时剩余Cd²⁺浓度分别为0.074、2.785、8.500和20.220 mg/L，相应的Cd²⁺最高去除率分别为85.20%、72.15%、66.00%和59.56%，与无硫酸盐添加对照组相比，Cd²⁺去除率分别提高了14.20%、12.25%、11.74%、6.34%，均具有显著性差异(P < 0.05)。

图2C−2E为硫酸盐强化反应体系中，在Cd²⁺浓度0、10和50 mg/L胁迫下菌株CW-D3T的表型特征图。结果表明，细胞结构在0 mg/L Cd²⁺浓度下形态完整，仅部分菌体出现塌陷和断裂的情况；随着Cd²⁺浓度的逐渐升高，菌体表面变得粗糙，颗粒感加剧，Cd²⁺浓度50 mg/L时功能菌应激反应表现更为强烈，菌体形态变形占比较高，功能菌细胞间的黏附性和聚集性增强，推测是因为微生物抵御恶劣环境分泌胞外聚合物的解毒调控机制开始启动^[38]。

2.1.3 Cd²⁺胁迫下硫酸盐的消耗量分析

电子受体是微生物代谢过程中的必需物质，计算菌株CW-D3T对硫酸盐的利用情况以及消耗外加电子受体时的电子转移数，结果如图3所示。反应周期第10天，Cd²⁺初始胁迫浓度为0−50 mg/L时，SO₄²⁻的消耗率分别为45.33%、32.47%、25.49%、18.95%、6.70%。随着Cd²⁺浓度的上升，周期内同一取样时间点的各实验组硫酸盐的消耗量呈下降趋势。

根据计算结果，SO₄²⁻周期第10天单位时间内转移的电子摩尔数分别为7.253 0、5.195 7、4.078 8、3.031 4和1.072 5 mmol/d，表明菌株CW-D3T在厌氧降解PHE的过程中利用了硫酸盐进行生长代谢活动。随着Cd²⁺初始赋存浓度的增加，转移电子数呈下降趋势，推测是由于Cd²⁺对菌株CW-D3T细胞生长行为的胁迫效应，阻碍了微生物利用硫酸盐作为电子受体进行自身厌氧呼吸。

2.2 硫酸盐还原体系中功能菌抗Cd²⁺胁迫的响应机制

2.2.1 Cd²⁺胁迫对电子传递活性的影响

当存在底物、环境因子等胁迫时，微生物脱氢酶活性受到影响，进而破坏微生物电子传递体系的活性并影响微生物正常的生长代谢^[39]。Cd²⁺对菌株电子传递体系活性(electron transport system activity, ETSA)影响如图4所示，各Cd²⁺浓度条件下，菌株CW-D3T的ETSA值在降解的中期(5 d)处于较高水平，7 d后其ETSA值不同程度降低。各实验组周期内菌株ETSA的活性抑制效应随着Cd²⁺浓度的增加而升高。Cd²⁺浓度为0.5 mg/L时，ETSA活性最高值为494.5 mmol/(g·min)与对照组[503.5 mmol/(g·min)]相当；Cd²⁺浓度高于0.5 mg/L时，ETSA活性的抑制效应显著增加，Cd²⁺浓度50 mg/L时的ETSA活性最大值[345.5 mmol/(g·min)]较对照组降低了31.38%。结合2.1.2节中污染物的去除效果，实验条件下，PHE的降解率与微生物细胞ETSA活性呈现较为一致的变化规律^[39]。

2.2.2 Cd²⁺胁迫对胞外聚合物的影响

图5为硫酸盐还原体系中菌株CW-D3T的EPS分泌量及其对Cd²⁺的吸附去除占比，EPS组成包括松散型蛋白(LB-PN)、紧密型蛋白(TB-PN)及松散型多糖(LB-PS)、紧密型多糖(TB-PS)。随着Cd²⁺胁迫浓度的增加，反应周期内PN、PS均呈现上升趋势，各实验组在周期结束时达到峰值，并主要以松散型为主。相较于未添加Cd²⁺的反应体系，Cd²⁺赋存对菌株胞外多糖分泌含量的影响更为显著。Cd²⁺浓度为0.5−50 mg/L时，实验周期末胞外多糖分泌量峰值分别为53.60、59.60、60.10和62.70 mg/L，为不添加Cd²⁺对照体系的1.35−1.58倍。根据实验结果，Cd²⁺初始浓度为10 mg/L条件下，周期内胞外多糖分泌量优于其他实验组，可能由于较低或较高Cd²⁺赋存浓度产生的生物毒性对细胞表面属性及其功能的改变均存在细胞解毒机制启动的延缓或抑制效应^[40]。

硫酸盐强化反应体系中，Cd²⁺胁迫浓度为0.5−50 mg/L时，周期末EPS对Cd²⁺吸附去除占比分别为76.29%、60.21%、56.77%、54.67%，推测反应体系中Cd²⁺的去除途径主要为EPS胞外吸附。随着Cd²⁺胁迫浓度的升高，总去除率中的吸附去除占比呈下降趋势。

2.2.3 Cd²⁺胁迫对表面官能团的影响

如图6所示，菌株CW-D3T厌氧呼吸的硫酸盐还原体系中，各初始Cd²⁺浓度条件下红外光谱中特征峰的位置基本一致，但较不添加Cd²⁺的对照组，各谱峰强度均有所加强，吸收峰强度与赋存的Cd²⁺浓度成正比，细胞生理结构总体未被破坏。3 100−3 500 cm⁻¹处出现的吸收峰，可能是缔合羟基O−H或酰胺Ⅱ带的N−H伸缩振动，这2个官能团通常为多糖、脂肪酸等^[41]。2 800−3 000 cm⁻¹处出现弱吸收峰，是CH₃、CH₂、CH的C−H伸缩振动引起。这些吸收峰的变化可能是脂肪酸、各种膜及细胞组分的亲水脂分子与镉结合所引起的^[42]。1 500−1 590 cm⁻¹的较强吸收峰由酰胺Ⅱ带的N−H弯曲振动导致，这是蛋白质骨架的特征吸收峰^[43]。900−1 200 cm⁻¹处强特征吸收峰来自C−O、C−C、C−O−P振动引起，是多糖的特征峰。这些特征峰表明细胞表面的蛋白质和多糖是参与目标污染物去除过程中的重要组分^[44]。在0.5 mg/L Cd²⁺浓度条件下，菌株CW-D3T的特征峰与对照组无显著差异，表明该浓度下菌株CW-D3T细胞组分几乎未受到Cd²⁺胁迫的不利影响；Cd²⁺胁迫浓度10 mg/L和25 mg/L时，O−H或N−H峰位由原来对照组的3 272cm⁻¹处位移至3 276 cm⁻¹处；Cd²⁺胁迫浓度50 mg/L时，该峰更是位移至3 280 cm⁻¹处。

2.3 硫酸盐还原体系中PHE的生物代谢特性

2.3.1 PHE的生物转化途径

图7为在Cd²⁺初始浓度0、10和50 mg/L的硫酸盐还原反应体系中，基于代谢产物检测的PHE生物转化途径分析图。根据实验结果，各反应体系均检测出3种物质(Ⅰ−Ⅲ)，分别鉴定为2-菲甲酸、2-甲基-5-羟基苯甲醛、对甲酚，苯酚(代谢产物Ⅳ)仅在未添加Cd²⁺的反应体系中检出。中间代谢体Ⅰ为PHE通过羧基化和逐步环还原的初始步骤分解而成，此外还检测出了六氢-2-菲甲酸等其他PHE羧基化代谢产物，可以推测2-菲甲酸逐步环还原向六氢-2-菲甲酸转化的过程^[45-46]。代谢产物Ⅱ主要经由一系列水合和水解反应导致PHE开环形成。代谢产物Ⅲ进一步通过脱羧基反应生成，其可经由连续的甲基氧化步骤代谢转化为苯酚(代谢产物Ⅳ)，进而最终完成PHE的矿化^[47]。由于苯酚(代谢产物Ⅳ)未在添加Cd²⁺的反应体系中检出，表明Cd²⁺对PHE的生物代谢转化速率和矿化进程具有显著的不利影响，周期结束时(10 d)，Cd²⁺胁迫体系中的中间代谢产物尚不能满足矿化作用反应的要求。

2.3.2 两种中间代谢产物定量分析

图8为不同Cd²⁺初始浓度下硫酸盐还原体系内2-菲甲酸(A)和2-甲基-5-羟基苯甲醛(B)在反应周期内的含量变化。未添加Cd²⁺对照组、10 mg/L Cd²⁺和50 mg/L Cd²⁺的降解体系中2-菲甲酸含量均在周期反应的第5天达到最大值，分别为21.48、15.56和10.23 μg/L。2-菲甲酸含量和2-甲基-5-羟基苯甲醛在周期内随Cd²⁺初始浓度的增加呈下降趋势，反应周期结束时，未添加Cd²⁺对照组中2种代谢中间体含量均比Cd²⁺添加组低，Cd²⁺对反应体系中PHE的矿化具有不利影响。初始Cd²⁺浓度为50 mg/L的降解体系中，仅在前3天检出2-甲基-5-羟基苯甲醛(1.08−2.02 μg/L)，推测高浓度Cd²⁺胁迫作用下以2-甲基-5-羟基苯甲醛为中间体的代谢途径相对较弱。

3 讨论

收起

目前，微生物修复厌氧环境中PAHs-重金属复合污染的关键在于菌株高效的生长代谢活动以及抗重金属胁迫的调控机制。截至目前已分离纯化出许多具有微生物降解功能的兼性厌氧菌，如克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacilli sp.)和红球菌属(Rhodococcus sp.)等^[48-51]。这些菌株可以依赖不同的电子受体厌氧呼吸同步对污染物进行生物降解。因此，本研究选取了一株抗Cd²⁺性能优良的兼性厌氧菌Klebsiella sp. CW-D3T利用硫酸盐作为末端电子受体厌氧呼吸并实现了目标污染物的强化降解。

PHE的生物降解率随Cd²⁺胁迫浓度的升高而降低，相较于无硫酸盐添加对照组，硫酸盐电子受体能够削减Cd²⁺胁迫对PHE降解的不利影响，同步刺激功能菌的厌氧呼吸作用，并强化菌株对PHE的降解转化能力。不同电子受体还原体系的研究对比表明，硫酸盐还原体系对红树林沉积物PAHs的生物降解率促进最为显著，硫酸盐的得电子能力高于Fe³⁺等其他电子受体^[20]。硫酸盐强化体系中，当Cd²⁺初始浓度为0 mg/L时，反应周期末PHE的降解率为77.19%，相较于无硫酸盐添加对照组提高了12.78%，Cd²⁺去除率也增加14.20%。高浓度Cd²⁺ (50 mg/L)胁迫浓度的反应体系中，相较于无硫酸盐添加体系，PHE、Cd²⁺周期末去除效果分别为54.14%、59.56%。研究表明，硫酸盐可显著促进海底沉积物中萘的厌氧降解，13 d萘的矿化率为66%^[52]。Tsai等^[53]以养猪场废水污泥为接种物，培养的硫酸盐还原菌在21 d后对5 mg/L菲的生物转化率约65%。Mu等^[31]发现在海洋沉积物中投加硫酸盐作为末端电子受体时微生物对苯并(A)芘的降解率为69.26%。本研究中采用硫酸盐作为微生物厌氧代谢过程的末端电子受体，兼性厌氧菌Klebsiella sp.对PHE-Cd²⁺复合污染的修复效果优良。另一方面，PAHs-重金属复合污染的微生物修复过程中，重金属胁迫浓度是影响微生物对目标化合物去除的关键因素。顾玲峰等^[54]从油污土壤中分离出2株高效芘降解菌与一株耐Cr(Ⅵ)菌构建混菌体系，对50 mg/L芘和25 mg/L Cr⁶⁺的去除率分别为46.4%和40.2%。本研究随着Cd²⁺胁迫浓度的升高，体系中硫酸盐消耗量呈下降趋势，菌株CW-D3T生长繁殖和代谢活性降低，可能是由于重金属的生态毒性干扰了细胞稳态，功能菌解毒抗Cd²⁺胁迫的生理机制启动导致厌氧呼吸速率减缓^[36]。

ETSA活性与细胞代谢行为密切相关，本实验条件下，Cd²⁺赋存浓度为10−50 mg/L时对细胞ETSA活性的抑制作用显著(P < 0.05)。Czarny等^[55]和Li等^[39]研究发现重金属胁迫使ETSA活性降低，进而导致微生物酶失活。硫酸盐还原体系中菌株CW-D3T的SEM结果表明，菌株细胞结构的完整程度随着Cd²⁺浓度的升高而降低，菌体间的聚集性也随之增强，推测EPS存在动态变化。Cd²⁺胁迫条件下，促进功能菌分泌胞外多糖和蛋白吸附重金属离子，可以降低其对自身的迫害作用^[56]。基于EPS含量的变化和Cd²⁺胞外吸附去除的占比分析，结果表明反应体系中EPS随Cd²⁺胁迫浓度的增加而增加，EPS胞外吸附是Cd²⁺的主要去除途径，本研究条件下，随着Cd²⁺浓度的增加，Cd²⁺胞外吸附去除的占比呈下降趋势。根据现有文献报道，微生物对重金属的去除机制主要包括胞外吸附、胞外络合以及胞内积累^[28]，其中胞外吸附主要依靠EPS完成^[57]。同时微生物对重金属的去除机制中还存在不同程度的价态转化，Kang等^[43]和Su等^[58]的研究表明，EPS分泌量的增加对Au³⁺和Cr⁶⁺等重金属的还原和解毒能力具有重要作用。硫酸盐强化的厌氧反应体系中，红外光谱中特征峰的伸缩振动证实了胞外多糖和胞外蛋白介导了功能菌对Cd²⁺的吸附去除过程，并且特征峰的谱峰强度与Cd²⁺赋存浓度成正比。表明重金属离子可通过与细胞表面官能团的直接配位而被吸附，进一步实现微生物对重金属的累积作用和去除效应^[27]。

基于硫酸盐还原菌群厌氧降解菲的转化途径研究表明，羧化和甲基化是硫酸盐还原的初始活化反应步骤^[59-60]。研究发现2-菲甲酸为羧化反应后的逐步还原产物^[61]，在本研究各降解体系中均检测到这一重要的中间代谢体，随后经由一系列反应逐步生成较易被微生物降解利用的取代苯系物。苯酚未在Cd²⁺添加组中检出，这可能是Cd²⁺的抑制作用导致中间代谢产物长期积累，初始环还原之后并未来得及发生后续环裂解。中间代谢产物定量分析结果表明：各降解体系中2-菲甲酸含量高于2-甲基-5-羟基苯甲醛含量，推测PHE在硫酸盐还原体系中更倾向于转化为2-菲甲酸。2种中间代谢产物在周期内随Cd²⁺初始浓度的增加呈下降趋势，Su等^[58]和Yin等^[62]发现PAHs的好氧代谢通路不会因为Cr⁶⁺、Cd²⁺和Pb²⁺的胁迫作用而发生变化，但会减少中间代谢产物的产量。

4 结论

收起

(1) PAHs-HMs为环境介质中的典型复合污染，兼性厌氧菌利用硫酸盐作为末端电子受体强化厌氧呼吸可强化修复PHE-Cd²⁺复合污染。

(2) 硫酸盐作为终端电子受体的还原反应体系中，Cd²⁺初始赋存浓度为不高于10 mg/L时，硫酸盐还原体系中菌株对PHE、Cd²⁺的去除率均大于70.00%。添加硫酸盐可以显著降低高浓度Cd²⁺胁迫下PHE的生物降解，此强化策略可为微生物厌氧修复PAHs-重金属复合污染提供参考。

(3) 反应周期内菌株的ETSA值在周期反应5 d时处于较高水平，7 d后有所下降，高浓度Cd²⁺赋存对ETSA活性的抑制作用更为显著。ETSA代表了细菌综合代谢水平，与细胞自身生长代谢联系更为紧密，与目标污染物降解特性规律一致。

(4) 胞外聚合物分泌量的增加可以提高菌株Cd²⁺抗性以及菌体间的黏附性。同时细胞官能团的伸缩振动证实了胞外多糖和蛋白参与了菌株对Cd²⁺的吸附去除过程。

基金

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国家自然科学基金(52070138)

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2024年第64卷第9期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240136

接收时间：2024-03-04
首发时间：2026-03-20
出版时间：2024-05-10

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作者

出版历史

收稿日期：2024-03-04
录用日期：2024-05-06

基金

National Natural Science Foundation of China(52070138)

国家自然科学基金(52070138)

作者信息

1 苏州科技大学环境科学与工程学院, 江苏苏州 2150092

2 苏州科技大学化学与生命科学学院, 江苏苏州 215009

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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