微生物学报

Primers name	Sequences (5′→3′)	Descriptions	Products (bp)
The restriction enzyme sites are underlined.
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葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738介导单增李斯特菌毒力的作用研究

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沈云勤 ¹^,^# , 王建峰 ²^,^# , 应煜 ¹ , 翁艳岚 ¹ , 郝云 ¹ , 黄丽英 ¹ , 韩月 ¹ , 孙静 ¹ , 赵秀玲 ² , 宋厚辉 ¹ , 徐加利 ¹^,^* , 程昌勇 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(8): 2671-2683

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(8): 2671-2683

葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738介导单增李斯特菌毒力的作用研究

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沈云勤¹^,^#, 王建峰²^,^#, 应煜¹, 翁艳岚¹, 郝云¹, 黄丽英¹, 韩月¹, 孙静¹, 赵秀玲², 宋厚辉¹, 徐加利¹^,^*, 程昌勇¹^,^*

作者信息

1 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室, 浙江杭州 311300

2 宁波检验检疫科学技术研究院宁波海关技术中心, 浙江宁波 315100

The glucoside transporter Lmo0738 contributes to virulence of Listeria monocytogenes

Yunqin SHEN¹^,^#, Jianfeng WANG²^,^#, Yu YING¹, Yanlan WENG¹, Yun HAO¹, Liying HUANG¹, Yue HAN¹, Jing SUN¹, Xiuling ZHAO², Houhui SONG¹, Jiali XU¹^,^*, Changyong CHENG¹^,^*

Affiliations

1 Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics & Advanced Technology, Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management, China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, College of Animal Science and Technology & College of Veterinary Medicine, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

2 Technical Center of Ningbo Customs, Ningbo Academy of Quarantine & Inspection Science and Technology, Ningbo 315100, Zhejiang, China

出版时间: 2024-05-07 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240010

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摘要

收起

【目的】以单增李斯特菌葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738为研究对象，研究其介导细菌毒力发挥的生物学作用。【方法】通过细菌同源重组技术构建lmo0738基因缺失株和回补株，研究它们在生长、溶血、细胞黏附与侵袭以及胞间迁移等方面与野生株的差异。同时，采用荧光定量PCR和Western blotting方法检测Δlmo0738毒力相关基因的转录水平和毒力相关蛋白的表达情况。【结果】缺失lmo0738后，李斯特菌体外生长能力、溶血能力、黏附和侵袭能力以及胞间迁移能力均显著减弱，溶血素O (listeriolysin O, LLO)蛋白毒力表达水平和关键毒力基因转录水平均显著降低。【结论】本研究证实缺失lmo0738能够降低单增李斯特菌毒力，为完善包括单增李斯特菌在内的重要食源性病原菌磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)糖分解代谢及感染机制奠定了关键基础。

关键词

单增李斯特菌 / 葡萄糖苷转运蛋白 / 毒力

Abstract

收起

[Objective] To investigate the biological role played by the glucoside transporter Lmo0738 in the virulence of Listeria monocytogenes. [Methods] The lmo0738-deleted mutant (Δlmo0738) and complementation mutant (CΔlmo0738) were constructed by homologous recombination. The growth, hemolytic activity, cellular adhesion and invasion, and intracellular migration of the wild type strain and the mutants were assessed by the growth curves, sheep red blood cell hemolysis assay, infection of human epithelial cells (Caco-2), and infection of mouse fibroblastic cells (L929), respectively. Additionally, the mRNA and protein levels of the virulence factor listeriolysin O (LLO) were determined by real-time quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) and Western blotting, respectively. [Results] The L. monocytogenes strain with the deletion of lmo0738 demonstrated weakened growth and diminished hemolytic activity. Notably, Δlmo0738 exhibited significantly reduced cell adhesion, invasion, and intracellular migration compared with the wild type strain. In addition, the mRNA and protein levels of LLO were significantly down-regulated in Δlmo0738. [Conclusion] This study provides the evidence that the absence of lmo0738 attenuates the virulence of L. monocytogenes, laying a crucial foundation to illustrate the mechanism of the phosphotransferase system (PTS) in regulating the sugar catabolism and the infection mechanism of major food-borne pathogens including L. monocytogenes.

Key words

Listeria monocytogenes / glucoside transporter / virulence

引用本文

沈云勤, 王建峰, 应煜, 翁艳岚, 郝云, 黄丽英, 韩月, 孙静, 赵秀玲, 宋厚辉, 徐加利, 程昌勇. 葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738介导单增李斯特菌毒力的作用研究. 微生物学报, 2024 , 64 (8) : 2671 -2683 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240010

Yunqin SHEN, Jianfeng WANG, Yu YING, Yanlan WENG, Yun HAO, Liying HUANG, Yue HAN, Jing SUN, Xiuling ZHAO, Houhui SONG, Jiali XU, Changyong CHENG. The glucoside transporter Lmo0738 contributes to virulence of Listeria monocytogenes[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (8) : 2671 -2683 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240010

正文

收起

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种能够在严酷的环境(如低温、氧化、高盐度)中生存的革兰氏阳性、食源性胞内致病菌^[1-3]，为了在多变环境中生存，细菌可以根据外界可利用营养物质的类型和数量的不同，灵活运用多种转录调节系统，使细胞代谢适应环境变化。磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)是存在于大多数细菌中的碳水化合物转运系统。PTS主要由组氨酸磷酸载体蛋白(histidine-containing phosphocarrier protein, HPr)、酶I (enzyme I, EI)和酶II (enzyme II, EII)复合物等组成^[4]。单增李斯特菌Lmo0738属于EII，它具有碳水化合物特异性^[5]。碳水化合物在生物体内含量丰富，是病原体的重要碳源，也是微生物引发不同致病反应的信号。例如，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)使用l-阿拉伯糖来调节沙门氏菌致病岛1中基因的表达，在全身感染期间调控至关重要的3型分泌系统^[6]。许多真菌病原体依赖于碳水化合物代谢途径(特别是海藻糖)在不同宿主中存活^[7-9]。frwC编码肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) PTS系统中的EII，能够影响细菌生长、黏性和毒力^[10]。在革兰氏阴性布鲁氏菌中，研究发现缺失ptsN和ptsH基因(与PTS相关)能减弱细菌毒力^[11]。在革兰氏阳性菌的PTS中，HPr并不具有直接自我磷酸化丝氨酸位点的活性，需要通过磷酸化蛋白酶转化为活性形式磷酸化丝氨酸位点的磷酸载体蛋白(phosphorylated serine of HPr, P-Ser-HPr)^[12]。P-Ser-HPr与碳分解代谢物蛋白A (catabolite control protein, CcpA)结合^[13]，消除碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression, CCR)。P-Ser-HPr在作为革兰氏阳性菌碳代谢的关键调节因子的同时，对特定病原菌的毒力也起着重要影响作用。在不存在糖源诱导的情况下，EII可参与磷酸化P-Ser-HPr，从而改变它们的活性^[14]。

在单增李斯特菌中，正调节蛋白A (positve regulatory factor A, PrfA)是主要的毒力中枢调控蛋白^[15]之一，在单增李斯特菌重要毒力基因感染宿主细胞过程中的转录和表达中具有关键作用^[16-17]。在感染过程中，PrfA可以调控单增李斯特菌表面蛋白内化素A (intemalin A, InlA)和内化素B (intemalin B, InlB)、溶血素O (listeriolysin O, LLO)、磷脂酶A (phospholipase A, PlcA)和磷脂酶B (phospholipase B, PlcB)、肌动蛋白A (actin assembly-inducing protein, ActA)，以及包含其他潜在毒力因子在内的约140个毒力蛋白的表达^[18]。在上述毒力蛋白的作用下，单增李斯特菌得以黏附、侵袭细胞，逃离吞噬小泡，进入细胞周质，感染邻近细胞，从而在细胞内运动、定植和增殖。PTS通过CCR途径控制调节PrfA的活性^[19]。PTS组分中酶的表达水平和P-Ser-HPr磷酸化水平会影响PrfA表达水平^[20-21]。当HPr转化为P-Ser-HPr后，单增李斯特菌毒力基因转录激活因子PrfA活性受到极大抑制^[21]。

PTS系统在调节碳氮代谢^[22]、调控毒力^[23]、维持金属离子平衡和介导抗应激反应等方面发挥着重要作用^[24]，特别重要的是通过调控PrfA活性影响细菌的毒力，而葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738属于PTS系统中重要的磷酸转移酶EII，一定程度上在细菌的生理、生存和毒力进程中发挥着重要作用。研究表明，lmo0738影响单增李斯特菌在d-allose富集肉汤中的生长速率，这种影响与糖代谢过程有关^[25]。然而，葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738的生物学功能和分子机制尚不清晰。本研究主要通过lmo0738基因缺失株与回补株构建、溶血试验及细胞试验等对葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738在单增李斯特菌中感染生物学功能进行研究，为后续进一步探究Lmo0738介导细菌感染的分子机制与如何通过影响环境适应解析其存在的生物学意义奠定基础。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、培养条件及产物

本研究所用菌株均为本实验室保存。野生株EGD-e需要使用牛脑心浸出液(brain and heart infusion broth, BHI)培养，大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株需要使用肉汤培养基(Luria- Bertani, LB)培养，于37 ℃恒温培养箱培养。本研究中所使用的抗生素为氨苄霉素(终浓度为100 μg/mL)、卡那霉素(终浓度为50 μg/mL)和氯霉素(终浓度为10 μg/mL)。本研究所用到的传代细胞均为本实验室所有。人肠上皮细胞(human epithelial cells, Caco-2)使用含有14%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的1640培养基(Roswell Park Memorial Institute 1640, RPMI 1640)培养，小鼠成纤维细胞(mouse fibroblastic cells, L929)使用含有14% FBS DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)培养，两者均放置于37 ℃细胞培养箱保存。本研究涉及引物见表1。

1.1.2 主要试剂

2×KOD PCR MasterMix，东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性核酸内切酶，New England Biolabs公司；高浓度质粒小提试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公司；DNA纯化试剂盒，广州艾基生物技术有限公司；RPMI 1640培养基，武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基，苏州海星生物科技有限公司；FBS，北京缔一生物科技有限公司；0.25% Trypsin-EDTA，北京诺为生物技术有限公司；BHI、LB培养基，OXOID公司；本研究所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 Δlmo0738缺失株重组质粒的构建

从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站下载lmo0738基因序列，参照文献[26]单增李斯特菌缺失株的构建方法，用SnapGene软件设计分别扩增lmo0738基因缺失的上、下游同源臂引物。以野生株EGD-e的全基因组(GenBank登录号为NC_003210.1)为模板，分别利用引物对pSL2624-Pst I-a-fwd/pSL2624-b-rev和pSL2624- c-fwd/pSL2624-Kpn I-d-rev扩增上、下游同源臂，利用Overlap PCR将上、下游同源臂进行融合。PCR反应体系(50 μL)：2×KOD PCR MasterMix 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 22 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性5 s，58 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，35个循环；68 ℃终延伸5 min。将融合的同源臂和质粒pKSV7进行酶切连接转化，经PCR验证条带大小正确后，提取质粒送北京擎科生物科技股份有限公司测序，测序结果正确的质粒命名为pSL2624。所用引物序列见表1。

1.3 Δlmo0738缺失株的筛选和验证

将测序正确的pSL2624质粒电转至野生株EGD-e感受态中，通过温敏型质粒pKSV7将同源臂整合至目的基因附近，添加氯霉素抗性和不同温度(42 ℃或30 ℃)环境共同刺激进行上、下游同源臂同源重组。利用内部引物(lmo0738-In-1/ lmo0738-In-2)和外部引物(pSL3943-a/pSL3943-d)对筛选出的阳性克隆菌株进行PCR验证，条带大小正确的送北京擎科生物科技股份有限公司测序，最终通过测序验证正确的阳性菌株为lmo0738基因缺失株，并将其命名为Δlmo0738。所用引物序列见表1。

1.4 CΔlmo0738回补株的构建

通过Biocyc (https://www.biocyc.org)网站查询lmo0738的启动子区所处的位置，然后通过Softberry (http://www.softberry.com/)网站预测lmo0738基因启动子，以野生株EGD-e基因组为模板，通过SnapGene设计引物对pSL3943-a/ pSL3943-b扩增lmo0738基因的上游启动子区，设计引物对pSL3943-c/pSL3943-d扩增lmo0738基因的编码区(coding sequence, CDS)。随后通过Overlap PCR使启动子区与lmo0738基因拼接成目的片段，将目的片段和pIMK2载体进行重组转化，经PCR验证条带大小正确后送北京擎科生物科技股份有限公司测序，测序正确后命名pSL3943。将pSL3943重组质粒电转至单增李斯特菌Δlmo0738缺失株感受态中，涂布菌液到带有卡那霉素的BHI平板上，PCR验证目的条带大小正确的PCR产物送北京擎科生物科技股份有限公司测序，测序结果正确的对应菌株即为CΔlmo0738回补株。所用引物序列见表1。

1.5 细菌生长曲线测定

挑取BHI固体培养基上的野生株EGD-e、缺失株Δlmo0738和回补株CΔlmo0738单菌落，然后分别接种于BHI液体培养基中，在37 ℃、200 r/min振荡条件下培养12 h，取1 mL菌液，使用10 mmol/L PBS洗涤2次，将菌液浓度调整至OD₆₀₀为0.6，取菌液按照1:100加入到1 mL新鲜BHI液体培养基中，振荡混匀，从中取200 µL加入到96孔板，计为0 h数据，之后放入37 ℃培养箱培养12 h，每隔1 h用酶标仪测量OD₆₀₀后，进行细菌生长曲线的绘制。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件中的t检验进行统计分析。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.05具有统计学意义。

1.6 溶血活性试验

细菌培养同1.5方法进行操作。取1 mL过夜培养菌液，12 000 r/min离心2 min，取上清与PBS (含1 mmol/L二硫苏糖醇)等比例混匀，37 ℃孵育10 min。在圆底的96孔板中第1孔加入200 μL处理后的菌液上清，然后取100 μL进行倍比稀释，共倍比稀释11次。分别以1% Triton-100和10 mmol/L PBS作为阳性对照和阴性对照，每孔加入100 μL 5%绵羊血红细胞-生理盐水溶液混合，37 ℃孵育30 min。孵育完成后，1 000 r/min离心5 min，离心完成后小心吸出100 μL转移到新的96孔板，经酶标仪测定OD₅₅₀。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件进行统计。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.05具有统计学意义。

1.7 人肠上皮细胞(Caco-2)黏附和侵袭试验

细菌培养与OD₆₀₀设置同1.5方法进行操作。Caco-2细胞铺板密度为2.5×10⁵个/mL，以MOI=10感染Caco-2细胞。具体步骤参见文献[26]。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件中的t检验进行统计分析。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.05具有统计学意义。

1.8 小鼠成纤维细胞(L929)蚀斑试验

细菌培养与OD₆₀₀设置同1.5方法进行操作。L929细胞铺板密度为1.2×10⁶个/mL，以MOI=0.2感染6孔细胞板中的L929细胞。具体步骤参见文献[26]。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件中的t检验进行统计分析。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.05具有统计学意义。

1.9 毒力蛋白表达水平检测

细菌培养同1.5方法进行操作，将过夜菌液按1:100转接至新培养基中，置于37 ℃培养箱内振荡培养。当菌液OD₆₀₀到0.6左右时，4 ℃、3 700 r/min离心20 min收集菌体，弃上清。向沉淀中加入50 mmol/L PBS涡旋振荡后，4 ℃、3 700 r/min离心20 min，随后加入1 mL Listeria Lysis Buffer，重悬沉淀，混匀后加入5 mm锆珠。使用均质仪对菌体进行裂解，裂解后将样品4 ℃、14 000 r/min离心5 min，收集上清。采用BCA蛋白定量试剂盒测定全菌蛋白浓度。取40 μg总蛋白上样，经10% SDS-PAGE 2 h，转膜1 h，封闭液封闭1 h，洗膜3次，每次15 min。加入一抗LLO兔抗(1:1 000)孵育2 h，漂洗步骤同上。加入二抗P60兔抗(1:1 000)孵育50 min，漂洗步骤同上。之后将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)化学发光液的A液和B液按1:1比例混合配制成化学发光液，加入配制好的化学发光液显色，免疫印迹成像后读取灰度值，目的蛋白的相对表达量为目的条带与内参条带的平均灰度值的比值。GAPDH为本研究的内参。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件中的t检验进行统计分析。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.01具有统计学意义。

1.10 毒力基因转录水平检测

细菌培养与OD₆₀₀设置同1.9方法进行操作之后，取6 mL菌液，4 ℃、3 700 r/min离心20 min收集菌体沉淀。利用TRIzol法分别提取EGD-e、Δlmo0738和CΔlmo0738的RNA，反转录得到cDNA。本研究根据GenBank中inlA、inlB、plcA、plcB、prfA和hly基因序列(Gene ID分别是985151、986892、987032、987036、987031和985502)，采用Integrated DNA technologies (https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/)网站设计检测上述基因荧光定量PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)引物对inlA-RT-fwd/inlA-RT-rev、inlB-RT-fwd/inlB- RT-rev、plcA-RT-fwd/plcA-RT-rev、plcB-RT-fwd/ plcB-RT-rev、prfA-RT-fwd/prfA-RT-rev、hly-RT-fwd/ hly-RT-rev。采用上述引物，通过RT-qPCR方法研究Lmo0738对毒力因子转录水平的影响，所用引物序列见表1。试验数据由GraphPad Prism 9.0绘图软件中的t检验进行统计分析。涉及到的试验结果均进行了3次以上平行试验，数据结果表示为means±SD，P < 0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

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2.1 Δlmo0738和CΔlmo0738菌株PCR验证

通过同源重组的方法、利用PCR验证和DNA测序方法验证Δlmo0738缺失株构建是否成功。如图1A、1B所示，以EGD-e为扩增模板时，利用外部引物对pSL2624-Pst I-a-fwd/ pSL2624-Kpn I-d-rev PCR扩增出的目的条带大小为2 877 bp (图1A，泳道1)；以Δlmo0738缺失株为扩增模板时，PCR扩增出的目的条带大小为1 053 bp (图1A，泳道2)。以EGD-e为扩增模板时，利用内部引物对lmo0738-In-1/ lmo0738-In-2 PCR扩增出的目的条带大小为427 bp (图1B，泳道1)；以Δlmo0738缺失株为扩增模板时，则无扩增条带(图1B，泳道2)。将PCR产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，测序结果经比对完全正确，表明成功获得基因缺失株Δlmo0738。

将测序正确的pSL3943重组质粒电转到缺失株Δlmo0738感受态，获得带有卡那霉素抗性的阳性克隆，用引物对pSL-3943-a/pSL-3943-b扩增出条带大小为213 bp (图1C，泳道1)的启动子区域，用引物对pSL-3943-c/pSL-3943-d扩增出条带大小为1 854 bp (图1C，泳道2)的lmo0738基因目的片段扩增片段，用引物对pSL-3943-a/pSL-3943-d扩增出条带大小为2 086 bp的目的片段(图1C，泳道3)，扩增片段大小均与理论值一致，经DNA测序比对，表明获得回补株CΔlmo0738。

2.2 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后体外生长能力检测

对EGD-e、Δlmo0738和CΔlmo0738进行了37 ℃培养下的生长曲线测定。结果如图2所示，与野生株EGD-e相比，缺失lmo0738基因后单增李斯特菌在对数生长期和平台期生长速率都显著降低(P < 0.01)。

2.3 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后溶血活性检测

由于单增李斯特菌能够分泌LLO，因此具有很强的溶血活性。为了验证单增李斯特菌缺失lmo0738基因是否影响细菌溶血活性，本研究对EGD-e、Δlmo0738和CΔlmo0738进行了溶血活性比较。结果如图3A、3B所示，单增李斯特菌缺失lmo0738基因后溶血能力降低。

2.4 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后黏附侵袭能力检测

单增李斯特菌是一种可以在低pH等多种极端条件生存的食源性致病菌，在感染生物体的过程中首先入侵肠道。人源肠上皮细胞(Caco-2)是实验室常用的细胞模型，体外培养时其在形态结构和生化功能上的分化与肠道细胞类似，是研究单增李斯特菌黏附侵袭能力的良好工具。本研究使用EGD-e、Δlmo0738和CΔlmo0738分别感染Caco-2细胞，从而探究单增李斯特菌在宿主体内侵袭过程中Lmo0738发挥的作用。结果如图4所示，单增李斯特菌感染Caco-2细胞0.5 h和1.5 h后，Δlmo0738较EGD-e感染细胞的黏附率和侵袭率均显著降低(P < 0.05)。

2.5 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后胞间迁移能力检测

将EGD-e、Δlmo0738和CΔlmo0738这3种菌株分别感染小鼠成纤维细胞L929，并检测其在细胞间的迁移能力，结果如图5所示，Δlmo0738空斑直径和数量显著小于EGD-e和CΔlmo0738，而Δhly则不形成蚀斑(图5A)。经统计学分析发现，Δlmo0738空斑直径显著变小(P < 0.001) (图5B)，同时，Δlmo0738产生的空斑数量也显著减少(P < 0.05) (图5C)。试验结果表明，缺失lmo0738基因后单增李斯特菌在L929细胞中的胞内增殖能力、胞间迁移能力均显著下降。

2.6 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后LLO蛋白表达水平检测

本研究选择了6个主要毒力蛋白(InlA、InlB、LLO、PlcA、PlcB和PrfA)进行检测。结果如图6所示，LLO在Δlmo0738中的表达水平显著低于野生株EGD-e (P < 0.001)，解释了图3中单增李斯特菌缺失lmo0738后的溶血能力降低的原因。

2.7 单增李斯特菌缺失lmo0738基因后毒力基因转录水平检测

为进一步探究单增李斯特菌关键毒力基因转录水平，本研究以EGD-e和Δlmo0738作为研究对象进行实时荧光定量PCR检测。结果如图7所示，Δlmo0738较EGD-e、inlB、plcA、plcB和prfA基因的转录水平显著降低(P < 0.05)；hly基因的转录水平有降低，但数据统计分析其差异不显著；inlA基因的转录水平未见明显差异。以上结果表明，单增李斯特菌缺失lmo0738基因后，重要毒力因子相关基因plcA、inlB、plcB和prfA的转录水平降低，可能是导致细菌在细胞中的黏附、侵袭能力下降的重要因素，其具体作用机制仍需后续进行研究。

3 讨论与结论

收起

单增李斯特菌之所以能够在各种极端条件下生长，其中一个重要原因是它能够灵活利用各种糖类。在单增李斯特菌中，识别到了迄今为止在细菌物种中数量最多的PTS相关基因^[27]。PTS系统相关蛋白能够介导细菌毒力，单增李斯特菌将碳源(葡萄糖、果糖等)转运入胞内时，会抑制毒力基因激活因子PrfA的作用，从而抑制毒力基因的表达^[23]。葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738是PTS系统中重要成分。因此，研究Lmo0738介导细菌毒力发挥的生物学作用，对深入了解单增李斯特菌PTS系统所发挥的生物学功能及意义具有十分重要的作用。

本研究通过构建lmo0738基因缺失株Δlmo0738和回补株CΔlmo0738，利用分子生物学和细胞生物学等手段，比较了野生株和缺失株的体外生长能力、溶血活性、细胞黏附、侵袭及胞间迁移能力。单增李斯特菌InlA和InlB同属于内化素家族，在感染宿主细胞侵袭过程中发挥着重要作用，而缺失lmo0738基因后，细菌感染Caco-2细胞的黏附和侵袭能力显著降低，表明lmo0738基因的缺失影响了细菌表面内化素蛋白的转录表达。InlB含有甘氨酸色氨酸(glycine-tryptophan, GW)结构，可以通过非共价键的形式锚定在细菌的细胞壁上，与Clq受体(gClqR)、糖胺聚糖(GAGs)和Met结合，促进单增李斯特菌进入宿主细胞^[28-29]。InlB与Met结合后，能够导致Met瞬时磷酸化，招募并磷酸化Cbl、Gab1、Shc和CrkⅡ等接头蛋白，最终激活PI3激酶(PI3K)^[30]。在正常培养条件下，发现缺失lmo0738基因后单增李斯特菌inlB的转录水平显著下降，由此，推测缺失lmo0738基因后，使Met与其接头蛋白磷酸化水平降低，从而降低inlB转录水平，后续需要进一步开展试验进行验证。

在L929小鼠成纤维细胞胞间迁移试验中，胞间迁移和增殖能力显著减弱，这可能由于缺失lmo0738基因后影响了与细菌逃逸相关的毒力蛋白，例如LLO。LLO是由单增李斯特菌主要毒力基因hly编码的一种成孔毒素，具有膜穿孔活性和逃逸吞噬体的能力^[31]，在单增李斯特菌中，LLO的表达受到PrfA调控。本研究结果表明，单增李斯特菌缺失lmo0738基因后，细菌溶血活性显著降低，Western blotting结果也表明与野生株相比，LLO蛋白表达量显著降低，而hly基因的转录水平未显著降低。在化脓性链球菌中，溶血素S (streptolysin S, SLS)是最重要的毒力蛋白之一，SLS表达受sag操纵子调控，pstl基因可编码EI，在小鼠皮下感染模型中，缺失株ΔptsI造成感染的面积比化脓性链球菌标准菌株大，毒力显著增强，缺失株ΔptsI中sag转录水平显著增加，这表明EI抑制了SLS的表达^[32]。据此推测，Lmo0738可能增强了LLO的表达和分泌能力，但对其转录水平的影响并不显著，后续需要进一步试验进行探究。

综上所述，本研究证实了葡萄糖苷转运蛋白Lmo0738影响细菌的体外生长能力和溶血能力，降低其感染细胞的黏附侵袭能力以及迁移能力，揭示了Lmo0738参与单增李斯特菌的毒力作用，但其具体分子机制有待后续深入研究。本研究结果为进一步完善重要胞内致病菌的PTS系统及侵入机体机制打下重要基础，对抵制人畜共患的细菌感染并确保人类健康至关重要。

基金

收起

国家重点研发计划(2023YFD1801800)
国家自然科学基金(32172849)
国家自然科学基金(32302961)
浙江省自然科学基金(LY23C180002)
宁波市自然科学基金(2022J200)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

SCHAEFER K, AUSTHOF E, BOYD K, ARMSTRONG A, HOFFMAN S, POGREBA- BROWN K.Septicemia due to Listeria monocytogenes infection: a systematic review and meta-analysis[J].Foodborne Pathogens and Disease,2022,19(2):104-114.

https://doi.org/10.1089/fpd.2021.0046

[2]

SCHLECH WF 3rd, LAVIGNE PM, BORTOLUSSI RA, ALLEN AC, HALDANE EV, WORT AJ, HIGHTOWER AW, JOHNSON SE, KING SH, NICHOLLS ES, BROOME CV.Epidemic listeriosis: evidence for transmission by food[J].The New England Journal of Medicine,1983,308(4):203-206.

https://doi.org/10.1056/NEJM198301273080407

[3]

GABALLA A, GUARIGLIA-OROPEZA V, WIEDMANN M, BOOR KJ.Cross talk between SigB and PrfA in Listeria monocytogenes facilitates transitions between extra- and intracellular environments[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR,2019,83(4):e00034-19.

[4]

STOLL R, GOEBEL W. The major PEP-phosphotransferase systems (PTSs) for glucose, mannose and cellobiose of Listeria monocytogenes, and their significance for extra- and intracellular growth[J]. Microbiology, 2010, 156(Pt 4): 1069-1083.

[5]

BARABOTE RD, JR SAIER MH.Comparative genomic analyses of the bacterial phosphotransferase system[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2005,69(4):608-634.

https://doi.org/10.1128/MMBR.69.4.608-634.2005

[6]

LÓPEZ-GARRIDO J, PUERTA-FERNÁNDEZ E, COTA I, CASADESÚS J.Virulence gene regulation by l-arabinose in Salmonella enterica[J].Genetics,2015,200(3):807-819.

https://doi.org/10.1534/genetics.115.178103

[7]

TOURNU H, FIORI A, van DIJCK P.Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions[J].PLoS Pathogens,2013,9(8):e1003447.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003447

[8]

LOWE RGT, LORD M, RYBAK K, TRENGOVE RD, OLIVER RP, SOLOMON PS.Trehalose biosynthesis is involved in sporulation of Stagonospora nodorum[J].Fungal Genetics and Biology,2009,46(5):381-389.

https://doi.org/10.1016/j.fgb.2009.02.002

[9]

NGAMSKULRUNGROJ P, HIMMELREICH U, BREGER JA, WILSON C, CHAYAKULKEEREE M, KROCKENBERGER MB, MALIK R, DANIEL HM, TOFFALETTI D, DJORDJEVIC JT, MYLONAKIS E, MEYER W, PERFECT JR.The trehalose synthesis pathway is an integral part of the virulence composite for Cryptococcus gattii[J].Infection and Immunity,2009,77(10):4584-4596.

https://doi.org/10.1128/IAI.00565-09

[10]

林迪斯, 徐丽, 李飞雨, 汪静杰, 李蓓.肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统EⅡC编码基因frwC缺失株的构建及表型分析[J].西安交通大学学报(医学版),2018,39(6):788-792. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XAYX201806004.htm

LIN DS, XU L, LI FY, WANG JJ, LI B.Construction of mutant strain of Klebsiella pneumoniae fructose-specific phosphotransferase systemsubunit ⅡC encoded by frwC gene and analysis of its phenotypes[J].Journal of Xi'an Jiaotong University (Medical Sciences),2018,39(6):788-792 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XAYX201806004.htm

[11]

WU QM, PEI JW, TURSE C, FICHT TA.Mariner mutagenesis of Brucella melitensis reveals genes with previously uncharacterized roles in virulence and survival[J].BMC Microbiology,2006,6:102.

https://doi.org/10.1186/1471-2180-6-102

[12]

CHRISTENSEN DP, BENSON AK, HUTKINS RW.Mutational analysis of the role of HPr in Listeria monocytogenes[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(5):2112-2115.

https://doi.org/10.1128/AEM.65.5.2112-2115.1999

[13]

DEUTSCHER J, FRANCKE C, POSTMA PW.How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2006,70(4):939-1031.

https://doi.org/10.1128/MMBR.00024-06

[14]

SUNDAR GS, ISLAM E, GERA K, Le BRETON Y, McIVER KS.A PTS EII mutant library in group A Streptococcus identifies a promiscuous man-family PTS transporter influencing SLS-mediated hemolysis[J].Molecular Microbiology,2017,103(3):518-533.

https://doi.org/10.1111/mmi.13573

[15]

SCORTTI M, MONZÓ HJ, LACHARME-LORA L, LEWIS DA, VÁZQUEZ-BOLAND JA.The PrfA virulence regulon[J].Microbes and Infection,2007,9(10):1196-1207.

https://doi.org/10.1016/j.micinf.2007.05.007

[16]

de LAS HERAS A, CAIN RJ, BIELECKA MK, VÁZQUEZ-BOLAND JA.Regulation of Listeria virulence: PrfA master and commander[J].Current Opinion in Microbiology,2011,14(2):118-127.

https://doi.org/10.1016/j.mib.2011.01.005

[17]

HANSEN S, HALL M, GRUNDSTRÖM C, BRÄNNSTRÖM K, SAUER-ERIKSSON AE, JOHANSSON J.A novel growth-based selection strategy identifies new constitutively active variants of the major virulence regulator PrfA in Listeria monocytogenes[J].Journal of Bacteriology,2020,202(11):e00115-20.

[18]

dos SANTOS PT, THOMASEN RSS, GREEN MS, FÆRGEMAN NJ, KALLIPOLITIS BH.Free fatty acids interfere with the DNA binding activity of the virulence regulator PrfA of Listeria monocytogenes[J].Journal of Bacteriology,2020,202(15):e00156-20.

[19]

JOSEPH B, MERTINS S, STOLL R, SCHÄR J, UMESHA KR, LUO Q, MÜLLER-ALTROCK S, GOEBEL W.Glycerol metabolism and PrfA activity in Listeria monocytogenes[J].Journal of Bacteriology,2008,190(15):5412-5430.

https://doi.org/10.1128/JB.00259-08

[20]

MERTINS S, JOSEPH B, GOETZ M, ECKE R, SEIDEL G, SPREHE M, HILLEN W, GOEBEL W, MÜLLER-ALTROCK S.Interference of components of the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system with the central virulence gene regulator PrfA of Listeria monocytogenes[J].Journal of Bacteriology,2007,189(2):473-490.

https://doi.org/10.1128/JB.00972-06

[21]

DEUTSCHER J, HERRO R, BOURAND A, MIJAKOVIC I, PONCET S.P-Ser-HPr: a link between carbon metabolism and the virulence of some pathogenic bacteria[J].Biochimica et Biophysica Acta,2005,1754(1/2):118-125.

[22]

KENTACHE T, MILOHANIC E, CAO TN, MOKHTARI A, AKÉ FM, MA PHAM QM, JOYET P, DEUTSCHER J.Transport and catabolism of pentitols by Listeria monocytogenes[J].Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2016,26(6):369-380.

[23]

CAO TN, JOYET P, AKÉ FMD, MILOHANIC E, DEUTSCHER J.Studies of the Listeria monocytogenes cellobiose transport components and their impact on virulence gene repression[J].Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2019,29(1/2/3/4/5/6):10-26.

[24]

刘倩钰, 吴丽雯, 牛建军, 赵西林.细菌磷酸转移酶系统(PTS)的组成与功能研究进展[J].微生物学通报,2020,47(7):2266-2277. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSWT202007028.htm

LIU QY, WU LW, NIU JJ, ZHAO XL.Research progress of the composition and function of bacterial phosphotransferase system[J].Microbiology China,2020,47(7):2266-2277 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSWT202007028.htm

[25]

ZHANG L, WANG Y, LIU DX, LUO LJ, WANG Y, YE CY.Identification and characterization of als genes involved in d-allose metabolism in lineage II strain of Listeria monocytogenes[J].Frontiers in Microbiology,2018,9:621.

[26]

江文玲, 徐加利, 董欣楠, 沈云勤, 陈丹丹, 江玲丽, 宋厚辉, 程昌勇.单增李斯特菌末端氧化酶亚基QoxB的生物学功能探究[J].微生物学报,2023,63(2):656-669.

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220418

JIANG WL, XU JL, DONG XN, SHEN YQ, CHEN DD, JIANG LL, SONG HH, CHENG CY.Biological functions of terminal oxidase subunit QoxB in Listeria monocytogenes[J].Acta Microbiologica Sinica,2023,63(2):656-669 (in Chinese).

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220418

[27]

GLASER P, FRANGEUL L, BUCHRIESER C, RUSNIOK C, AMEND A, BAQUERO F, BERCHE P, BLOECKER H, BRANDT P, CHAKRABORTY T, CHARBIT A, CHETOUANI F, COUVÉ E, de DARUVAR A, DEHOUX P, DOMANN E, DOMÍNGUEZ-BERNAL G, DUCHAUD E, DURANT L, DUSSURGET O, et al.Comparative genomics of Listeria species[J].Science,2001,294(5543):849-852.

[28]

JONQUIÈRES R, PIZARRO-CERDÁ J, COSSART P.Synergy between the N- and C-terminal domains of InlB for efficient invasion of non-phagocytic cells by Listeria monocytogenes[J].Molecular Microbiology,2001,42(4):955-965.

[29]

BRAUN L, GHEBREHIWET B, COSSART P.gC1q-R/p32, a C1q-binding protein, is a receptor for the InlB invasion protein of Listeria monocytogenes[J].EMBO Journal,2000,19(7):1458-1466.

[30]

IRETON K, PAYRASTRE B, CHAP H, OGAWA W, SAKAUE H, KASUGA M, COSSART P.A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion[J].Science,1996,274(5288):780-782.

[31]

NGUYEN BN, PETERSON BN, PORTNOY DA.Listeriolysin O: a phagosome-specific cytolysin revisited[J].Cellular Microbiology,2019,21(3):e12988.

[32]

GERA K, LE T, JAMIN R, EICHENBAUM Z, McIVER KS.The phosphoenolpyruvate phosphotransferase system in group A Streptococcus acts to reduce streptolysin S activity and lesion severity during soft tissue infection[J].Infection and Immunity,2014,82(3):1192-1204.

2024年第64卷第8期

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接收时间：2024-01-05
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-05-07

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收稿日期：2024-01-05
录用日期：2024-04-28

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National Natural Science Foundation of China(32302961)

国家自然科学基金(32302961)

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浙江省自然科学基金(LY23C180002)

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

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The restriction enzyme sites are underlined.
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Primers name

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Descriptions

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