微生物学报

Strains	Descriptions	Sources
DH10B	str. K-12 F^–, lacZ	Lab preservation
MG1655-ΔrecA	MG1655 strain with recA disrupted	[23]
ZY01	MG1655-ΔrecA containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY02	DH10B containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY03	In MG1655-ΔrecA, IS1A is inserted into the LshCas13a system	This study
ZY04	In DH10B, IS10R is inserted into the LshCas13a system	This study

Strains	Descriptions	Sources
DH10B	str. K-12 F^–, lacZ	Lab preservation
MG1655-ΔrecA	MG1655 strain with recA disrupted	[23]
ZY01	MG1655-ΔrecA containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY02	DH10B containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY03	In MG1655-ΔrecA, IS1A is inserted into the LshCas13a system	This study
ZY04	In DH10B, IS10R is inserted into the LshCas13a system	This study

Plasmids	Descriptions	Sources
pC003-LshC2C2 locus into pACYC184 for spacer cloning	The template plasmid for amplifying the LshCas13a gene	[5]
pCasY-3-ΔSIM-kan	Template plasmid used to amplify vectors	[23]
pLshCas13a-zy	Plasmid associated with the LshCas13a interference system	This study
p15A-cm	Ori (p15A), chl	[23]
p15A-control	The crRNA cassette without any spacer sequence cloned into plasmid p15A-cm	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting one region of the lacZ gene (200−400 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : polA	The expression cassette targeting one region of the polA gene (400−600 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : polA	The expression cassette targeting two regions of the polA gene (400−600 bp and 1 000−1 200 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting two regions of the lacZ gene (200−400 bp and 600−800 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
pBluescript SK(+)	ColE, lacZ, bla, orif1	This study

Plasmids	Descriptions	Sources
pC003-LshC2C2 locus into pACYC184 for spacer cloning	The template plasmid for amplifying the LshCas13a gene	[5]
pCasY-3-ΔSIM-kan	Template plasmid used to amplify vectors	[23]
pLshCas13a-zy	Plasmid associated with the LshCas13a interference system	This study
p15A-cm	Ori (p15A), chl	[23]
p15A-control	The crRNA cassette without any spacer sequence cloned into plasmid p15A-cm	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting one region of the lacZ gene (200−400 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : polA	The expression cassette targeting one region of the polA gene (400−600 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : polA	The expression cassette targeting two regions of the polA gene (400−600 bp and 1 000−1 200 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting two regions of the lacZ gene (200−400 bp and 600−800 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
pBluescript SK(+)	ColE, lacZ, bla, orif1	This study

Primers	Sequences (5′→3′)
Uppercase plus underscores indicate homology arms, restriction endonuclease have been noted in parentheses and its recognition site is indicated in capital italics.
LshCas-F	ACCCGGGATAACAATTTCACACCCTAGGCCGCAAAGAGGAGAAAGGATCTATGGGAAATTTATTTGGAC (Sma Ⅰ)
LshCas-R	ACCCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAATCTTATAACGTATCATTCG (Sma Ⅰ)
Lsh-sk-F	TTCCCAGTCACGACGTTGT
Lsh-sk-R	CTATCTCTATTTCTTCTTC
Lsh-SK-WF1	TAAGAATAATAGAAAATG
Lsh-SK-WF2	GGAAATTGTGATACAG
Lsh-SK-WF3	TACAAGGAACGCAAGA
Lsh-SK-WF4	GCAACATCAGTTTGGTT
Lsh-SK-WF5	AAATACATAATATGCTCTAAC
5500-F	CGCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTG
5500-R	TGCGGCCTAGGGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT
spe-Lsh-F	GGCCTCGCGCGCAGATCAGT
spe-Lsh-R	ATACAACTTCTTCTGTTTCC
tet-Lsh-F	AAGAAATCCGTTTGCTGA
tet-Lsh-R	GCAAGGCTATGTGCCATC
Lsh-IS-R	CGGAACACGTAGAAAGCCAG
Lsh-IS-F	GGCCGCAAAGAGGAGAAAGG
Lsh-1-R	CCATAAAATTAGTCAAAATA
Lsh-2-F	CGCTAAAGAGGAATTGGATT
Lsh-3-F	GAAAAAAGTAATAGAATGTT
Lsh-4-F	GGCTGATGCAAAATTTTTAT
Lsh-5-F	GCAGAACAAATTGATAGAGT
P15A-F	CAAGGCGACAAGGTGCTGAT
P15A-R	GGTAGCTCAGAGAACCTTCGA

Primers	Sequences (5′→3′)
Uppercase plus underscores indicate homology arms, restriction endonuclease have been noted in parentheses and its recognition site is indicated in capital italics.
LshCas-F	ACCCGGGATAACAATTTCACACCCTAGGCCGCAAAGAGGAGAAAGGATCTATGGGAAATTTATTTGGAC (Sma Ⅰ)
LshCas-R	ACCCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAATCTTATAACGTATCATTCG (Sma Ⅰ)
Lsh-sk-F	TTCCCAGTCACGACGTTGT
Lsh-sk-R	CTATCTCTATTTCTTCTTC
Lsh-SK-WF1	TAAGAATAATAGAAAATG
Lsh-SK-WF2	GGAAATTGTGATACAG
Lsh-SK-WF3	TACAAGGAACGCAAGA
Lsh-SK-WF4	GCAACATCAGTTTGGTT
Lsh-SK-WF5	AAATACATAATATGCTCTAAC
5500-F	CGCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTG
5500-R	TGCGGCCTAGGGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT
spe-Lsh-F	GGCCTCGCGCGCAGATCAGT
spe-Lsh-R	ATACAACTTCTTCTGTTTCC
tet-Lsh-F	AAGAAATCCGTTTGCTGA
tet-Lsh-R	GCAAGGCTATGTGCCATC
Lsh-IS-R	CGGAACACGTAGAAAGCCAG
Lsh-IS-F	GGCCGCAAAGAGGAGAAAGG
Lsh-1-R	CCATAAAATTAGTCAAAATA
Lsh-2-F	CGCTAAAGAGGAATTGGATT
Lsh-3-F	GAAAAAAGTAATAGAATGTT
Lsh-4-F	GGCTGATGCAAAATTTTTAT
Lsh-5-F	GCAGAACAAATTGATAGAGT
P15A-F	CAAGGCGACAAGGTGCTGAT
P15A-R	GGTAGCTCAGAGAACCTTCGA

CRISPR spacer name	Targeted regions in crRNA (5′→3′)	PFS
lacZ (200−400 bp)	CCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCT	C
lacZ (600−800 bp)	AAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACAT	C
polA (400−600 bp)	TCATGGTATTGATAAGCGTAATATTTGG	C
polA (1 000−12 00 bp)	ACCAGGTTAGCAGAGATGTTATCAAGGC	C

CRISPR spacer name	Targeted regions in crRNA (5′→3′)	PFS
lacZ (200−400 bp)	CCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCT	C
lacZ (600−800 bp)	AAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACAT	C
polA (400−600 bp)	TCATGGTATTGATAAGCGTAATATTTGG	C
polA (1 000−12 00 bp)	ACCAGGTTAGCAGAGATGTTATCAAGGC	C

CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象

PDF下载

张悦 ¹^,²^,³ , 许杰 ²^,³ , 王珩瑜 ²^,³ , 盛勇 ²^,³ , 欧一新 ²^,³ , 王斌 ¹ , 张蓓 ¹ , 康前进 ²^,³^,^* , 张丽 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(8): 2998-3013

收起

微生物学报 | 研究报告 2024, 64(8): 2998-3013

CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象

全屏

张悦¹^,²^,³, 许杰²^,³, 王珩瑜²^,³, 盛勇²^,³, 欧一新²^,³, 王斌¹, 张蓓¹, 康前进²^,³^,^*, 张丽¹^,^*

作者信息

1 青岛大学青岛医学院基础医学院, 山东青岛 266071

2 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240

3 上海交通大学代谢与发育国际联合合作实验室, 上海 200240

Escape phenomenon of CRISPR/Cas13a system during RNA editing in Escherichia coli

Yue ZHANG¹^,²^,³, Jie XU²^,³, Hengyu WANG²^,³, Yong SHENG²^,³, Yixin OU²^,³, Bin WANG¹, Bei ZHANG¹, Qianjin KANG²^,³^,^*, Li ZHANG¹^,^*

Affiliations

1 School of Basic Medicine, Qingdao Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong, China

2 State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

3 Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

出版时间: 2024-04-08 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

文章导航

摘要

收起

【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统，通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA，分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a，构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒，选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法，设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA (crRNA)序列，考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象，结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence, IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落，通过监测OD₆₀₀进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA，发现靶向lacZ时，MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸；靶向polA时，MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat, DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了E. coli宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象，包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

关键词

大肠杆菌 / CRISPR/LshCas13a / 质粒干扰系统 / 逃逸现象 / 插入序列

Abstract

收起

[Objective] The plasmid interference system of CRISPR/LshCas13a was constructed in Escherichia coli MG1655-ΔrecA and Escherichia coli DH10B to analyze the escape phenomenon in RNA editing experiments by targeting the non-essential gene lacZ and the essential gene polA. [Methods] An inducible CRISPR/LshCas13a RNA editing system- associated plasmid was designed with LshCas13a from Leptotrichia shahii. MG1655-ΔrecA and DH10B were selected as the research objects. The Crisporo algorithm was employed to design the CRISPR RNA (crRNA) sequences targeting lacZ and polA, and the LshCas13a plasmid interference experiment was carried out to study the escape phenomena targeting lacZ and polA. The escape phenomenon of the LshCas13a system was evaluated based on the number and sequences of escaped colonies. PCR and Sanger sequencing were conducted to explore the escape events of the LshCas13a system. The escaped colonies carrying the LshCas13a system disrupted by the insertion sequence (IS) were selected, and OD₆₀₀ was measured to evaluate the growth recovery of the strains. [Results] The LshCas13a system was used to target lacZ and polA in MG1655-ΔrecA and DH10B. MG1655-ΔrecA escaped through point mutation of LshCas13a and IS-mediated transposition when lacZ was targeted. When polA was targeted, MG1655-ΔrecA and DH10B escaped by point mutation of LshCas13a, IS-mediated transposition, and mutation of the direct repeat (DR) sequence of crRNA. The mutation of LshCas13a promoted the recovery of strain growth. [Conclusion] The LshCas13a plasmid interference system successfully revealed the diversified escape phenomena during the RNA editing of E. coli, including IS-mediated the transposition of LshCas13a, point mutation of LshCas13a, and DR sequence mutation or recombination of crRNA. The results laid a foundation for optimization of the CRISPR/LshCas13a gene editing system.

Key words

Escherichia coli / CRISPR/LshCas13a / plasmid interference system / escape phenomenon / insertion sequence

引用本文

张悦, 许杰, 王珩瑜, 盛勇, 欧一新, 王斌, 张蓓, 康前进, 张丽. CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象. 微生物学报, 2024 , 64 (8) : 2998 -3013 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

Yue ZHANG, Jie XU, Hengyu WANG, Yong SHENG, Yixin OU, Bin WANG, Bei ZHANG, Qianjin KANG, Li ZHANG. Escape phenomenon of CRISPR/Cas13a system during RNA editing in Escherichia coli[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (8) : 2998 -3013 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

正文

收起

CRISPR/Cas13a系统属于2类Ⅵ型CRISPR/Cas适应性免疫系统^[1]，保护原核生物免受外来核酸物质(如病毒和质粒)的侵袭，该系统介导的适应性免疫过程包括了3个阶段，即适应、表达和干扰。(1) 在适应阶段，外源核酸片段被加工成新的间隔区，整合到CRISPR基因簇中^[2]；(2) 表达阶段包括转录CRISPR阵列，将前体转录物加工为成熟的CRISPR RNA (crRNA)，然后与Cas13a蛋白组装成CRISPR核糖核蛋白复合物^[3]；(3) 在干扰阶段，Cas13a在crRNA的引导下识别和切割目标RNA，从而使外源的RNA降解^[4]。当外来核酸物质入侵宿主时，Cas13a切割crRNA前体产生成熟的crRNA，并与其结合产生CRISPR-crRNA监测复合物，在crRNA的引导下，使得Cas13a发挥降解外源RNA的功能^[5]。

Cas13a蛋白是由识别瓣叶(recognition lobe, REC)和核酸酶瓣叶(nuclease lobe, NUC)组成的两瓣叶结构，REC瓣叶包括N端结构域(N-terminal domain, NTD)和Helical-1结构域，NUC瓣叶包括2个保守的负责crRNA成熟的高等真核生物和原核生物核苷酸结合(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding domain, HEPN)结构域、连接2个HEPN结构域的连接结构域和1个Helical-2结构域^[6]。CRISPR/Cas13a系统依赖于crRNA，作为一种导航系统，通过识别入侵的外源核酸和结合Cas13a蛋白来特异性切割和破坏外源核酸。目标RNA与crRNA结合后诱导Cas13a构象发生改变，形成crRNA-靶RNA双结合通道^[7]，crRNA的直接重复(direct repeat, DR)序列与Cas13a也形成了新的相互作用，目标RNA和Cas13a之间的相互作用对于crRNA指导的RNA切割是必不可少的^[8]。实际上，目标RNA是一个激活剂，通过与crRNA的引导区形成双链并将催化残基靠近在一起来激活HEPN结构域内的2个催化位点，活化的HEPN催化该位点的单链核糖核酸(single-stranded ribonucleic acid, ssRNA)裂解。

CRISPR/Cas13a系统的特征是不仅可以切割底物RNA，还具有反式RNA切割活性来切割游离的单链RNA，这一发现使研究者对开发核酸检测的新型生物传感技术产生了更大兴趣^[5]，并有望在CRISPR诊断方面取得重大进展^[9]。目前，CRISPR/Cas13a系统已经被成功开发用于检测多种病原体，如细菌^[10]、病毒^[11]和癌细胞^[12]，还可用于噬菌体基因组编辑^[13]，表现出了高灵敏度和高特异性的优越特征^[14]。在植物^[15]和真菌^[16]中使用CRISPR/Cas13a技术也大大加快了农业研究的步伐和进程。此外，CRISPR/Cas13a基因检测技术还可用于癌症的早期检测和肿瘤相关标志物的快速检测，以及肿瘤治疗和基因治疗^[17]，展现了较好的应用潜力。

LshCas13a蛋白属于CRISPR/Cas13a家族，在基因组编辑和RNA干扰中发挥关键作用。与其他Cas13a蛋白相比，LshCas13a蛋白具有更高的特异性、稳定性^[18]和广泛的应用前景。此外，LshCas13a蛋白可以高效调控靶标RNA的水平，有效地沉默靶标基因的表达^[19]，从而为研究人员提供了一个强大的工具来研究基因功能和疾病机制^[20]。总的来说，LshCas13a蛋白相较于其他Cas13a蛋白具有更高的特异性、精准性和广泛的研究基础，使其在基因组编辑和RNA干扰领域具有重要的应用意义。然而，CRISPR/LshCas13a系统对被编辑的宿主造成了一定的生理负担^[5]，该系统介导的基因编辑过程也存在着逃逸的问题^[21]。LshCas13a系统靶向RNA分子时会引发非特异性RNA分子的剪切和降解，从而干扰基因表达和细胞代谢过程，可能会对细胞或生物体产生毒性作用。逃逸效应可能会导致意外的副作用，甚至引起不必要的细胞死亡或损伤，影响了基因编辑的效果。

本研究以LshCas13a系统为研究对象，选择大肠杆菌(Escherichia coli)中recA基因的敲除突变株MG1655-ΔrecA和重组缺陷recA的DH10B作为研究的宿主菌，构建LshCas13a质粒干扰系统，通过靶向大肠杆菌的非必需基因lacZ和必需基因polA研究LshCas13a系统的多样化逃逸现象，旨在为开发高效能的CRISPR/LshCas13a基因编辑技术提供参考。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器

胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、甘油、异丙醇、三氯甲烷、无水乙醇、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和冰醋酸均购自国药集团化学试剂股份有限公司；琼脂购自青岛华东化玻仪器有限公司；卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素、四环素和大观霉素均购自西格玛奥德里奇(无锡)生化科技有限公司；Gibson重组试剂盒购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；质粒小提试剂盒、质粒中提试剂盒和胶回收试剂盒均购自Omega Engineering公司；DNA连接酶和高保真DNA聚合酶均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；琼脂糖和限制性核酸内切酶均购自ThermoFisher Scientific公司。

恒温振荡摇床和电子精密天平均购自上海知楚仪器有限公司；生化培养箱购自韶关市泰宏医疗器械有限公司；电转仪购自Eppendorf公司；微波炉购自广东美的微波炉制造有限公司；双向磁力搅拌器购自常州荣华仪器制造有限公司；4 ℃冰箱购自青岛澳柯玛控股集团有限公司；NanoDrop、PCR仪、离心机、−30 ℃冰箱、−80 ℃冰箱均购自ThermoFisher Scientific公司；制冰机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；电泳仪购自上海天能科技有限公司；生物安全柜购自江苏埃德伯格电气有限公司；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；电热恒温鼓风干燥箱和水浴锅均购自上海一恒科学仪器有限公司；高压灭菌锅购自上海实维实验仪器技术有限公司。

1.1.2 培养基

大肠杆菌培养基采用LB液体培养基(g/L)^[22]：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，用5 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，加水定容至1 000 mL，120 ℃灭菌15 min，4 ℃保存。

LB固体培养基需要将LB液体培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装250 mL LB液体培养基和3.75 g琼脂，120 ℃灭菌15 min。将液体倒入平皿中，每个平皿倒入20 mL，4 ℃保存，2周内使用。

1.1.3 菌株、质粒和引物

本研究所用菌株见表1，所用质粒见表2，所用引物见表3 (所用引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成)。

1.2 构建CRISPR/LshCas13a干扰系统相关质粒

1.2.1 PCR扩增LshCas13a基因片段

在本研究中以质粒pC003-LshC2C2 (武汉淼灵生物科技有限公司)作为模板，该质粒含有完整的LshCas13a基因，使用引物对LshCas-F/ LshCas-R进行PCR扩增，经胶回收纯化后获得PCR扩增产物。将4.5 μL的回收产物与0.5 μL pBluescript SK(+)载体和5 μL连接酶加入反应体系中，在16 ℃条件下反应2 h后，将总体积为10 μL的反应产物通过化学转化法转入感受态细胞E. coli DH10B中。挑取验证成功的菌株进行测序，选择序列正确的菌液进行质粒的提取。使用Sma Ⅰ消化质粒，经胶回收获得线性化含有同源臂的LshCas13a基因片段(图1B)。

1.2.2 PCR扩增载体片段

以pCasY-3-ΔSIM-kan质粒作为模板，使用引物对5500-F/5500-R进行PCR扩增，取50 μL的PCR产物在130 V的条件下电泳30 min，胶回收纯化后获得带有同源臂的载体片段(图1B)。

1.2.3 Gibson重组

将LshCas13a基因片段和载体片段以摩尔比1:1加入到离心管中进行重组反应，在50 ℃的条件下反应10 min，取20 μL的反应产物化学转化到感受态细胞E. coli DH10B中(图1A)。转化结束后加入四环素和大观霉素涂布于LB平板，在30 ℃条件下孵育12 h，然后在LB平板上挑取单克隆菌落于3 mL含四环素和大观霉素LB液体培养基，30 ℃、220 r/min振荡培养12 h。用引物对spe-Lsh-F/R和tet-Lsh-F/R进行PCR验证，挑选出正确的克隆。接着，再提取正确克隆的质粒，利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切验证，获得正确的目标质粒，命名为pLshCas13a-zy (图1C)。

1.3 crRNA的设计

考虑到LshCas13a-crRNA复合物与目标RNA结合时，crRNA识别3′原型间隔区侧翼位点(protospacer-flanking site, PFS)偏好于碱基C^[24]，以及LshCas13a蛋白的裂解位点主要定位于ssRNA的富尿嘧啶区域或ssRNA-dsRNA连接处^[5]，并且LshCas13a系统的靶向区域偏好AT含量高的区域，因此选择靶向lacZ基因的200−400 bp和600−800 bp 2个区域，靶向polA基因的400−600 bp和1 000−1 200 bp 2个区域进行crRNA的选择。利用Crisporo算法(http://bioinfolab.miamioh.edu/ct-finder)分别设计靶向lacZ基因和polA基因的crRNA序列，靶向位点和PFS等信息见表4。crRNA序列全部由北京擎科生物科技股份有限公司合成，并克隆到载体p15-cm载体中。

1.4 电转化CRISPR/LshCas13a干扰系统相关质粒

将质粒pLshCas13a-zy分别电转化到MG1655-ΔrecA和DH10B中。分别挑取MG1655-ΔrecA和DH10B单个菌落于3 mL的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养12 h。然后，利用低温冷冻离心机，4 ℃、12 000 r/min将MG1655-ΔrecA和DH10B离心5 min，再用预冷的无菌水洗涤细胞2次，制备电感受态细胞。最后，加入40 μL无菌水和1−3 μL浓度为50−100 ng/μL的pLshCas13a-zy质粒与电转感受态细胞轻轻混合后，迅速加入至预冷的1 mm电转杯中；电转仪参数设置为25 μF、200 Ω和1.8 kV同时电击5 ms，电击结束后迅速向电转杯中加入1 mL预冷的LB液体培养基重悬细胞，30 ℃、220 r/min振荡培养1 h；然后加入四环素和大观霉素后均匀涂布于LB固体培养基上，倒置放置在30 ℃恒温培养箱中培养12 h，筛选正确的菌株分别命名为ZY01和ZY02。

1.5 CRISPR/LshCas13a质粒干扰实验

在LshCas13a系统中，LshCas13a蛋白的表达由IPTG诱导的启动子P_Trc驱动，首先将质粒pLshCas13a-zy电转化到菌株中，然后再电转入crRNA的质粒后进行表达。在抗生素选择压力下孵育后，IPTG诱导LshCas13a蛋白表达，LshCas13a系统作用于目标RNA后降低基因表达并非特异性降解RNA。

将ZY01和ZY02制成电感受态细胞，分别将质粒p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : lacZ、p15A-cm- Lsh-2-crRNA: : lacZ、p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : polA、p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : polA电转化到电感受态细胞中。电转化完毕后，30 ℃、220 r/min振荡培养1 h，然后涂布于含有氯霉素、四环素、大观霉素和IPTG的LB平板上，将平板放置在30 ℃培养箱中培养16 h。

1.6 菌株活化及生长曲线的测定

将ZY01和ZY02在含有四环素和大观霉素的3 mL的LB液体培养基中在30 ℃、220 r/min条件下振荡培养14 h后，将菌液浓度统一调整至OD₆₀₀为0.05，然后接种于含有四环素和大观霉素的5 mL的LB液体培养基中，分别在IPTG和无IPTG的条件下，30 ℃、220 r/min振荡培养，每2 h取样检测一次，连续监测14 h。每个实验均进行3次生物学重复，将测得的结果进行线性化处理。

1.7 数据处理

实验数据均为3组平行，采用平均值±标准差表示。用GraphPad Prism 9.4.1对数据进行整理，用SPSS 26.0软件进行显著性分析(P<0.01)，通过Adobe Illustrator 2020软件进行作图分析及图片的整理。

2 结果与分析

收起

2.1 诱导表达LshCas13a蛋白对细菌生存影响的分析

为了考察LshCas13a系统对大肠杆菌的生理状况的影响，在缺乏crRNA引导的情况下，分别在含有质粒pLshCas13a-zy的MG1655-ΔrecA (菌株ZY01)和DH10B (菌株ZY02)中诱导表达LshCas13a蛋白，通过分别测量IPTG诱导组(+)和无IPTG组(−)细菌的生长曲线来判断诱导表达LshCas13a蛋白是否对ZY01和ZY02的生长产生影响(图2)。

结果显示，与不添加诱导剂的条件相比，在添加诱导剂的生长条件下，ZY01和ZY02的生长速度均有不同程度的减慢。如图2A所示，ZY01在培养4 h后，不添加诱导剂时菌株的OD₆₀₀始终大于添加诱导剂的情况。当培养8 h时，在不同诱导条件下的OD₆₀₀差距最大，差距为0.25。培养14 h后，ZY01在不同诱导条件下的OD₆₀₀的差异仍然存在，差距为0.22。如图2B所示，ZY02在不添加诱导剂的条件下菌株的OD₆₀₀始终大于添加诱导剂的情况。在培养8 h时，在不同诱导条件下的OD₆₀₀差距最大，差距为0.47。尽管随着培养时间的不断延长，不同诱导条件下的OD₆₀₀差异逐渐减小，在培养14 h结束时，ZY02的生长状态相对较弱。该研究结果表明，LshCas13a蛋白的表达对菌株产生了一定的生理负担。

2.2 考察CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统靶向非必需基因lacZ的情况

将LshCas13a干扰系统相关质粒pLshCas13a-zy电转化到菌株中，再将目标为lacZ的crRNA的质粒继续电转化到该菌株中。在转化后的MG1655-ΔrecA中，LshCas13a复合物通过与目标lacZ的序列互补结合，引发LshCas13a蛋白的活性，从而靶向lacZ，以实现对lacZ基因的功能控制或沉默，产生白色菌落(图3A)。

当LshCas13a系统在MG1655-ΔrecA中靶向lacZ后，在添加IPTG和X-Gal的培养条件下，出现了白色菌落，说明成功构建LshCas13a干扰系统靶向lacZ。在添加诱导剂的条件下，比较靶向lacZ的1个区域和2个区域时蓝色菌落与白色菌落的数量，通过统计菌落数发现数量比例均在0.4−0.5波动(图3B)。与转化质粒p15A-control转化效率相比，在添加诱导剂的条件下，靶向lacZ的1个区域和2个区域时转化效率均下降了50%左右，而在不添加诱导剂的条件下，转化效率基本没有变化(图3C)。表明LshCas13a系统操纵子的诱导表达可能对宿主产生了遗传毒性胁迫。

2.3 CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统靶向必需基因polA的逃逸情况

在E. coli的染色体中，polA基因是一个重要基因，编码DNA聚合酶Ⅰ^[25]，参与细胞中的核酸代谢，包括DNA合成、DNA修复和RNA加工，对于维持基因组的稳定性和功能起着至关重要的作用。E. coli中的polA基因以单拷贝的形式存在，如果缺少polA基因，将无法产生DNA聚合酶Ⅰ，从而导致DNA复制和修复过程受到严重影响，甚至会导致细胞死亡^[26]。为了进一步增加LshCas13a系统对宿主的生存压力，选择靶向必需基因polA，进而考察大肠杆菌对该基因编辑系统的逃逸能力和多样性分析。

通过对质粒干扰实验中存活的菌落数量分析，发现在MG1655-ΔrecA和DH10B中利用LshCas13a系统靶向polA，在不同的诱导条件下，与对照质粒p15A的转化效率相比，都显著降低(P<0.01) (图4A、4B)。在LshCas13a系统靶向polA的实验中，即使在不添加诱导剂的培养条件下，转化效率依然明显小于靶向lacZ的转化效率，这表明即使LshCas13a系统的启动子有较少的渗漏表达，依然对菌株产生了生存压力。同时，以MG1655-ΔrecA为研究对象，与转化质粒p15A-control转化效率相比，在添加诱导剂的条件下，靶向polA的1个区域和2个区域时转化效率均下降了70%左右。以DH10B为研究对象，靶向polA时，与转化质粒p15A-control转化效率相比，在添加诱导剂的条件下，靶向1个区域和2个区域时转化效率均下降了75%左右。这表明LshCas13a系统靶向polA对宿主产生了更大的生存压力时，仍然有较多存活的菌落。因此，进一步探讨了LshCas13a系统逃逸情况产生的可能原因。

2.4 逃逸事件的捕捉

当LshCas13a系统靶向lacZ和polA时，均出现了大量能够逃避LshCas13a系统的逃逸菌落，针对这些菌株探索了其逃逸发生的可能情况。

2.4.1 靶向lacZ基因的逃逸情况分析

在MG1655-ΔrecA中，当LshCas13a系统靶向lacZ基因的1个区域时，随机选取50个存活的菌落，对LshCas13a系统的作用元件进行分析，结果显示在添加诱导剂的情况下LshCas13a区域突变发生了22次，在不添加诱导剂的条件下LshCas13a区域突变发生了21次。当LshCas13a系统靶向lacZ基因的2个区域时，随机选取50个存活的菌落，结果显示在添加诱导剂的情况下LshCas13a区域突变发生了5次，在不添加诱导剂的条件下LshCas13a区域突变发生了17次。

然而，在添加诱导剂的条件下，通过PCR扩增LshCas13a区域，意外地发现LshCas13a区域相较于原始LshCas13a区域变大，测序结果显示是由于菌株基因组中具有转座功能的插入序列(insertion sequence, IS)元件转移到了LshCas13a编码区域，破坏了LshCas13a系统，致使宿主逃脱LshCas13a系统的切割反应。在添加诱导剂的条件下，当LshCas13a系统靶向lacZ基因1个区域时IS转座发生了2次，靶向lacZ基因2个区域时IS转座发生了6次(图5D)。

2.4.2 靶向polA基因的逃逸情况分析

研究显示当LshCas13a系统靶向polA时，仍然有许多E. coli存活。为了探讨LshCas13a系统的逃逸情况，随机选取大量幸存的菌落，对LshCas13a系统的作用元件进行分析，PCR扩增LshCas13a区域，通过琼脂糖凝胶电泳发现其中大部分的LshCas13a的PCR产物比预期条带变大(图6C)。测序结果显示，这些条带变大的LshCas13a区域是因为IS元件的插入，从而破坏了LshCas13a系统，致使菌株可以存活。

在MG1655-ΔrecA和DH10B中，当LshCas13a系统靶向polA基因的2个区域时(图6A)，通过PCR随机检测50个存活的菌落，结果均显示在添加诱导剂的情况下IS转座发生了50次(图6D、6E)。不添加诱导剂的情况下，当LshCas13a系统靶向polA基因的2个区域时，IS转座发生的次数分别为6次和16次，测序结果显示IS插入的类型主要是IS1和IS10。从IS插入数目来看，不同的诱导情况，IS转座事件发生的数量也不同，添加诱导剂相较于不加诱导剂IS转座事件发生得更多，表明IS转座可能是作为靶向必需基因时菌落的主要逃逸机制。

此外，针对PCR检测存在LshCas13a区域没有变大的幸存菌落，通过测序分析LshCas13a编码区域发现发生了点突变，或者在crRNA的DR区域的3个碱基发生突变并插入3个碱基(图6B)，这些突变均导致了LshCas13a基因编辑系统的功能丧失。

2.5 IS插入CRISPR/LshCas13a系统后菌株的生长情况

通过对大肠杆菌逃逸菌株的系统分析，发现了LshCas13a编码区域存在大量的IS元件插入热点(图7A)。为了进一步探讨IS对逃逸菌株生长的影响，选取LshCas13a系统作用后LshCas13a区域含IS插入后的菌落，通过测量细菌生长曲线来验证菌株生长情况的恢复。

通过对菌株MG1655-ΔrecA中IS1A插入LshCas13a (ZY03)和在DH10B中IS10R插入LshCas13a区域(ZY04)的生长情况的分析，分别检测了IPTG诱导组(+)和无IPTG组(−)的OD₆₀₀值，绘制了相关菌株的生长曲线。在不同诱导条件下，IPTG和无IPTG组的生长曲线无明显差异。这表明当IS元件转座到LshCas13a区域后，ZY03和ZY04恢复了生长，在不同诱导条件下，生长状况几乎一致(图7B、7C)。说明破坏LshCas13a系统后MG1655-ΔrecA和DH10B生长良好，宿主可以与靶向染色体的质粒共存，有效地消除LshCas13a系统诱导的遗传毒性。

3 讨论与结论

收起

CRISPR/LshCas13a是一种RNA介导的靶向RNA的基因编辑技术，但该系统不仅可以切割靶RNA，还可以非特异性地切割其他的RNA^[27]。然而这种混乱的RNA切割活性引起了细胞生理的压力，甚至导致生长受限^[28]。细菌为了躲避基因编辑系统带来的生理胁迫，对基因编辑系统进行了不同程度的遗传修饰^[29]，导致基因编辑过程中出现多样化的逃逸问题^[30]。

基于此，本研究在E. coli构建了CRISPR/ LshCas13a的质粒干扰系统，展开对LshCas13a系统逃逸现象的系统分析。为了避免recA介导的远端同源序列之间或微同源序列之间的重组来修复基因组损伤，以及降低细胞通过recA介导的SOS反应逃避LshCas13a系统诱导的细胞死亡^[31]，选择了recA基因的敲除突变株MG1655-ΔrecA和重组缺陷recA的DH10B作为实验菌株，比较分析了LshCas13a系统在大肠杆菌中靶向非必需基因lacZ和必需基因polA时的逃逸现象。通过分析逃逸菌落的数量、LshCas13a基因编码序列以及crRNA的突变情况，发现了IS转座、LshCas13a基因突变和crRNA序列改变等逃逸现象。显示当LshCas13a系统靶向polA时，IS转座逃逸事件的发生频率较高。通过筛选了IS转座事件，其中，IS1和IS10几乎占据了主要转座事件的发生。通过转座发生后的菌株生长曲线的比较分析，转座破坏后的LshCas13a系统消除了对细胞的遗传毒性。

IS转座元件是可移动的一个基因盒，具有简单的遗传构造，通常只编码与基因转移有关的功能结构，能够插入到目标分子的多个位点^[32]。转座事件的发生率在正常情况下为10⁻⁸，但当基因组重排的高活性和伴随的诱变效应对宿主细胞是有害时，转位通常保持较高的发生率^[33]。IS在不同生物中的普遍存在表明，IS的转位能力对宿主的环境适应性和生物遗传的多样性是不可或缺的，IS转座对于驱动宿主与各种免疫障碍之间的相互适应，具有广泛的生理学意义。系统探索IS在生物进化中的作用，不仅有助于理解IS对原核生物环境适应的驱动作用，而且有助于菌株遗传工作改造和基因组编辑等应用技术的深度开发。为了更好地研究IS的转座插入特征，需要构建高效的LshCas13a捕获系统来进一步细致研究IS元件插入转座的热点序列特征，相关工作也是我们下一步研究的重点工作。

此外，为了进一步优化LshCas13a系统的编辑效率，可以通过在不破坏LshCas13a蛋白功能的基础上，利用密码子的简并性特征，通过改变LshCas13a基因上IS转座热点区域等方法进一步降低LshCas13a系统的逃逸事件的发生概率，提高LshCas13a编辑系统的编辑效率。

综上所述，本研究针对LshCas13a系统在E. coli的逃逸现象的多样性进行了分析，结果显示LshCas13a系统在RNA编辑过程中不仅要考虑脱靶效应，还要考虑宿主染色体中编码的内源性IS元件特征、Cas13a编码基因突变和crRNA基因组靶点改变对LshCas13a系统功能的潜在干扰效应。针对不同的特征，对基因编辑技术开展有针对性的优化，加快LshCas13a系统的高效应用。总之，本研究利用了质粒干扰实验，在E. coli中分析了LshCas13a系统的逃逸事件，为CRISPR/Cas13a技术的应用和RNA编辑等技术应用提供了借鉴作用。

基金

收起

国家重点研发计划(2021YFC2100600)
上海市农业科技创新项目(202302080012F04596)
合成生物学海河实验室重大攻关类项目(22HHSWSS00001)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

EAST-SELETSKY A, O'CONNELL MR, KNIGHT SC, BURSTEIN D, CATE JHD, TJIAN R, DOUDNA JA.Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J].Nature,2016,538: 270-273.

https://doi.org/10.1038/nature19802

[2]

MOHANRAJU P, MAKAROVA KS, ZETSCHE B, ZHANG F, KOONIN EV, van der OOST J.Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems[J].Science,2016,353(6299):aad5147.

https://doi.org/10.1126/science.aad5147

[3]

ZHOU J, YIN LJ, DONG YN, PENG L, LIU GZ, MAN SL, MA L.CRISPR-Cas13a based bacterial detection platform: sensing pathogen Staphylococcus aureus in food samples[J].Analytica Chimica Acta,2020,1127: 225-233.

https://doi.org/10.1016/j.aca.2020.06.041

[4]

TAKEUCHI N, WOLF YI, MAKAROVA KS, KOONIN EV.Nature and intensity of selection pressure on CRISPR-associated genes[J].Journal of Bacteriology,2012,194(5):1216-1225.

https://doi.org/10.1128/JB.06521-11

[5]

ABUDAYYEH OO, GOOTENBERG JS, KONERMANN S, JOUNG J, SLAYMAKER IM, COX DBT, SHMAKOV S, MAKAROVA KS, SEMENOVA E, MINAKHIN L, SEVERINOV K, REGEV A, LANDER ES, KOONIN EV, ZHANG F.C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J].Science,2016,353(6299):aaf5573.

https://doi.org/10.1126/science.aaf5573

[6]

LIU L, LI XY, WANG JY, WANG M, CHEN P, YIN ML, LI JZ, SHENG G, WANG YL.Two distant catalytic sites are responsible for C2c2 RNase activities[J].Cell,2017,168(1/2):121-134.e12.

[7]

WANG BB, ZHANG TL, YIN J, YU Y, XU WH, DING JP, PATEL DJ, YANG H.Structural basis for self-cleavage prevention by tag: anti-tag pairing complementarity in type Ⅵ Cas13 CRISPR systems[J].Molecular Cell,2021,81(5):1100-1115.e5.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.033

[8]

BOT JF, van der OOST J, GEIJSEN N.The double life of CRISPR-Cas13[J].Current Opinion in Biotechnology,2022,78: 102789.

https://doi.org/10.1016/j.copbio.2022.102789

[9]

ZHAO L, QIU M, LI X, YANG J, LI J.CRISPR-Cas13a system: a novel tool for molecular diagnostics[J].Frontiers in Microbiology,2022,13: 1060947.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1060947

[10]

KIGA K, TAN XE, IBARRA-CHÁVEZ R, WATANABE S, AIBA Y, SATO'O Y, LI FY, SASAHARA T, CUI BT, KAWAUCHI M, BOONSIRI T, THITIANANPAKORN K, TAKI Y, AZAM AH, SUZUKI M, PENADÉS JR, CUI LZ.Development of CRISPR-Cas13a-based antimicrobials capable of sequence-specific killing of target bacteria[J].Nature Communications,2020,11: 2934.

https://doi.org/10.1038/s41467-020-16731-6

[11]

MYHRVOLD C, FREIJE CA, GOOTENBERG JS, ABUDAYYEH OO, METSKY HC, DURBIN AF, KELLNER MJ, TAN AL, PAUL LM, PARHAM LA, GARCIA KF, BARNES KG, CHAK B, MONDINI A, NOGUEIRA ML, ISERN S, MICHAEL SF, LORENZANA I, YOZWIAK NL, MacINNIS BL, et al.Field- deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13[J].Science,2018,360(6387):444-448.

https://doi.org/10.1126/science.aas8836

[12]

HONG JS, SON T, CASTRO CM, IM H.CRISPR/Cas13a-based microRNA detection in tumor-derived extracellular vesicles[J].Advanced Science,2023,10(24):e2301766.

https://doi.org/10.1002/advs.202301766

[13]

ADLER BA, HESSLER T, CRESS BF, LAHIRI A, MUTALIK VK, BARRANGOU R, BANFIELD J, DOUDNA JA.Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing[J].Nature Microbiology,2022,7: 1967-1979.

https://doi.org/10.1038/s41564-022-01258-x

[14]

WESSELS HH, MÉNDEZ-MANCILLA A, GUO XY, LEGUT M, DANILOSKI Z, SANJANA NE.Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design[J].Nature Biotechnology,2020,38: 722-727.

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0456-9

[15]

AMAN R, ALI Z, BUTT H, MAHAS A, ALJEDAANI F, KHAN MZ, DING SW, MAHFOUZ M.RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants[J].Genome Biology,2018,19(1):1.

https://doi.org/10.1186/s13059-017-1381-1

[16]

LEWIS KM, KE AL.Building the class 2 CRISPR-Cas arsenal[J].Molecular Cell,2017,65(3):377-379.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.01.024

[17]

ALI Z, MAHAS A, MAHFOUZ M.CRISPR/Cas13 as a tool for RNA interference[J].Trends in Plant Science,2018,23(5):374-378.

https://doi.org/10.1016/j.tplants.2018.03.003

[18]

ZHAO X, LIU L, LANG JY, CHENG KM, WANG YW, LI XY, SHI J, WANG YL, NIE GJ.A CRISPR-Cas13a system for efficient and specific therapeutic targeting of mutant KRAS for pancreatic cancer treatment[J].Cancer Letters,2018,431: 171-181.

https://doi.org/10.1016/j.canlet.2018.05.042

[19]

JIAO BL, HAO XY, LIU ZM, LIU MB, WANG JY, LIU L, LIU N, SONG R, ZHANG JX, FANG YL, XU Y.Engineering CRISPR immune systems conferring GLRaV-3 resistance in grapevine[J].Horticulture Research,2022,9: uhab023.

https://doi.org/10.1093/hr/uhab023

[20]

ZHANG N, BEWICK B, XIA GB, FURLING D, ASHIZAWA T.A CRISPR-Cas13a based strategy that tracks and degrades toxic RNA in myotonic dystrophy type 1[J].Frontiers in Genetics,2020,11: 594576.

https://doi.org/10.3389/fgene.2020.594576

[21]

TAMBE A, EAST-SELETSKY A, KNOTT GJ, DOUDNA JA, O'CONNELL MR.RNA binding and HEPN-nuclease activation are decoupled in CRISPR-Cas13a[J].Cell Reports,2018,24(4):1025-1036.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.06.105

[22]

韩舒婷, 马婧贤, 盛勇, 王珩瑜, 邢利, 罗晓霞, 白林泉, 邓子新, 康前进.Nonomuraea candida HMC10^T中新结构套索肽noncaromin生物合成基因簇的克隆及异源表达[J]. 微生物学报,2022,62(12):4927-4942.

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220221

HAN ST, MA JX, SHENG Y, WANG HY, XING L, LUO XX, BAI LQ, DENG ZX, KANG QJ.Cloning and heterologous expression of the new biosynthetic gene cluster of noncaromin from Nonomuraea candida HMC10^T[J].Acta Microbiologica Sinica,2022,62(12):4927-4942 (in Chinese).

https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220221

[23]

SHENG Y, WANG HY, OU YX, WU YY, DING W, TAO MF, LIN SJ, DENG ZX, BAI LQ, KANG QJ.Insertion sequence transposition inactivates CRISPR-Cas immunity[J].Nature Communications,2023,14: 4366.

https://doi.org/10.1038/s41467-023-39964-7

[24]

KNOTT GJ, EAST-SELETSKY A, COFSKY JC, HOLTON JM, CHARLES E, O'CONNELL MR, DOUDNA JA.Guide-bound structures of an RNA-targeting A-cleaving CRISPR-Cas13a enzyme[J].Nature Structural & Molecular Biology,2017,24: 825-833.

[25]

OLIVERA BM, BONHOEFFER F.Replication of Escherichia coli requires DNA polymerase Ⅰ[J].Nature,1974,250: 513-514.

https://doi.org/10.1038/250513a0

[26]

LEHMAN IR, UYEMURA DG.DNA polymerase Ⅰ: essential replication enzyme[J].Science,1976,193(4257):963-969.

https://doi.org/10.1126/science.781842

[27]

WIEDENHEFT B, ZHOU KH, JINEK M, COYLE SM, MA W, DOUDNA JA.Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense[J].Structure,2009,17(6):904-912.

https://doi.org/10.1016/j.str.2009.03.019

[28]

BIKARD D, EULER CW, JIANG WY, NUSSENZWEIG PM, GOLDBERG GW, DUPORTET X, FISCHETTI VA, MARRAFFINI LA.Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials[J].Nature Biotechnology,2014,32: 1146-1150.

https://doi.org/10.1038/nbt.3043

[29]

ZHOU JS, LI BH, PENG CJ, WANG FF, FU ZQ, ZHOU CY, HONG D, YE F, LÜ WG, XIE X.Inhibition of cervical cancer cell growth in vitro and in vivo by lentiviral-vector mediated shRNA targeting the common promoter of HPV16 E6 and E7 oncogenes[J].Antiviral Research,2013,98(2):305-313.

https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.03.010

[30]

CARROLL D.Genome engineering with zinc-finger nucleases[J].Genetics,2011,188(4):773-782.

https://doi.org/10.1534/genetics.111.131433

[31]

MOREB EA, HOOVER B, YASEEN A, VALYASEVI N, ROECKER Z, MENACHO-MELGAR R, LYNCH MD.Managing the SOS response for enhanced CRISPR-Cas-based recombineering in E. coli through transient inhibition of host RecA activity[J].ACS Synthetic Biology,2017,6(12):2209-2218.

https://doi.org/10.1021/acssynbio.7b00174

[32]

SIGUIER P, FILÉE J, CHANDLER M.Insertion sequences in prokaryotic genomes[J].Current Opinion in Microbiology,2006,9(5):526-531.

https://doi.org/10.1016/j.mib.2006.08.005

[33]

FEHÉR T, CSEH B, UMENHOFFER K, KARCAGI I, PÓSFAI G.Characterization of cycA mutants of Escherichia coli. An assay for measuring in vivo mutation rates[J].Mutation Research,2006,595(1/2):184-190.

2024年第64卷第8期

PDF下载

129

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

接收时间：2024-01-31
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-04-08

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-01-31
录用日期：2024-04-02

基金

National Key Research and Development Program of China(2021YFC2100600)

国家重点研发计划(2021YFC2100600)

Agricultural Science and Technology Innovation Program of Shanghai(202302080012F04596)

上海市农业科技创新项目(202302080012F04596)

"Major Project" of Haihe Laboratory of Synthetic Biology(22HHSWSS00001)

合成生物学海河实验室重大攻关类项目(22HHSWSS00001)

作者信息

1 青岛大学青岛医学院基础医学院, 山东青岛 266071

2 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240

3 上海交通大学代谢与发育国际联合合作实验室, 上海 200240

通讯作者:

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

Strains	Descriptions	Sources
DH10B	str. K-12 F^–, lacZ	Lab preservation
MG1655-ΔrecA	MG1655 strain with recA disrupted	[23]
ZY01	MG1655-ΔrecA containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY02	DH10B containing plasmid pLshCas13a-zy	This study
ZY03	In MG1655-ΔrecA, IS1A is inserted into the LshCas13a system	This study
ZY04	In DH10B, IS10R is inserted into the LshCas13a system	This study

Strains

Descriptions

Sources

DH10B

str. K-12 F^–, lacZ

Lab preservation

MG1655-ΔrecA

MG1655 strain with recA disrupted

[23]

ZY01

MG1655-ΔrecA containing plasmid pLshCas13a-zy

This study

ZY02

DH10B containing plasmid pLshCas13a-zy

This study

ZY03

In MG1655-ΔrecA, IS1A is inserted into the LshCas13a system

This study

ZY04

In DH10B, IS10R is inserted into the LshCas13a system

This study

Plasmids	Descriptions	Sources
pC003-LshC2C2 locus into pACYC184 for spacer cloning	The template plasmid for amplifying the LshCas13a gene	[5]
pCasY-3-ΔSIM-kan	Template plasmid used to amplify vectors	[23]
pLshCas13a-zy	Plasmid associated with the LshCas13a interference system	This study
p15A-cm	Ori (p15A), chl	[23]
p15A-control	The crRNA cassette without any spacer sequence cloned into plasmid p15A-cm	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting one region of the lacZ gene (200−400 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : polA	The expression cassette targeting one region of the polA gene (400−600 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : polA	The expression cassette targeting two regions of the polA gene (400−600 bp and 1 000−1 200 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : lacZ	The expression cassette targeting two regions of the lacZ gene (200−400 bp and 600−800 bp) was cloned into p15A-cm plasmid	This study
pBluescript SK(+)	ColE, lacZ, bla, orif1	This study

Plasmids

Descriptions

Sources

pC003-LshC2C2 locus into pACYC184 for spacer cloning

The template plasmid for amplifying the LshCas13a gene

[5]

pCasY-3-ΔSIM-kan

Template plasmid used to amplify vectors

[23]

pLshCas13a-zy

Plasmid associated with the LshCas13a interference system

This study

p15A-cm

Ori (p15A), chl

[23]

p15A-control

The crRNA cassette without any spacer sequence cloned into plasmid p15A-cm

This study

p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : lacZ

The expression cassette targeting one region of the lacZ gene (200−400 bp) was cloned into p15A-cm plasmid

This study

p15A-cm-Lsh-1-crRNA: : polA

The expression cassette targeting one region of the polA gene (400−600 bp) was cloned into p15A-cm plasmid

This study

p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : polA

The expression cassette targeting two regions of the polA gene (400−600 bp and 1 000−1 200 bp) was cloned into p15A-cm plasmid

This study

p15A-cm-Lsh-2-crRNA: : lacZ

The expression cassette targeting two regions of the lacZ gene (200−400 bp and 600−800 bp) was cloned into p15A-cm plasmid

This study

pBluescript SK(+)

ColE, lacZ, bla, orif1

This study

Primers	Sequences (5′→3′)
Uppercase plus underscores indicate homology arms, restriction endonuclease have been noted in parentheses and its recognition site is indicated in capital italics.
LshCas-F	ACCCGGGATAACAATTTCACACCCTAGGCCGCAAAGAGGAGAAAGGATCTATGGGAAATTTATTTGGAC (Sma Ⅰ)
LshCas-R	ACCCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAATCTTATAACGTATCATTCG (Sma Ⅰ)
Lsh-sk-F	TTCCCAGTCACGACGTTGT
Lsh-sk-R	CTATCTCTATTTCTTCTTC
Lsh-SK-WF1	TAAGAATAATAGAAAATG
Lsh-SK-WF2	GGAAATTGTGATACAG
Lsh-SK-WF3	TACAAGGAACGCAAGA
Lsh-SK-WF4	GCAACATCAGTTTGGTT
Lsh-SK-WF5	AAATACATAATATGCTCTAAC
5500-F	CGCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTG
5500-R	TGCGGCCTAGGGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT
spe-Lsh-F	GGCCTCGCGCGCAGATCAGT
spe-Lsh-R	ATACAACTTCTTCTGTTTCC
tet-Lsh-F	AAGAAATCCGTTTGCTGA
tet-Lsh-R	GCAAGGCTATGTGCCATC
Lsh-IS-R	CGGAACACGTAGAAAGCCAG
Lsh-IS-F	GGCCGCAAAGAGGAGAAAGG
Lsh-1-R	CCATAAAATTAGTCAAAATA
Lsh-2-F	CGCTAAAGAGGAATTGGATT
Lsh-3-F	GAAAAAAGTAATAGAATGTT
Lsh-4-F	GGCTGATGCAAAATTTTTAT
Lsh-5-F	GCAGAACAAATTGATAGAGT
P15A-F	CAAGGCGACAAGGTGCTGAT
P15A-R	GGTAGCTCAGAGAACCTTCGA

Primers

Sequences (5′→3′)

Uppercase plus underscores indicate homology arms, restriction endonuclease have been noted in parentheses and its recognition site is indicated in capital italics.

LshCas-F

ACCCGGGATAACAATTTCACACCCTAGGCCGCAAAGAGGAGAAAGGATCTATGGGAAATTTATTTGGAC (Sma Ⅰ)

LshCas-R

ACCCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAATCTTATAACGTATCATTCG (Sma Ⅰ)

Lsh-sk-F

TTCCCAGTCACGACGTTGT

Lsh-sk-R

CTATCTCTATTTCTTCTTC

Lsh-SK-WF1

TAAGAATAATAGAAAATG

Lsh-SK-WF2

GGAAATTGTGATACAG

Lsh-SK-WF3

TACAAGGAACGCAAGA

Lsh-SK-WF4

GCAACATCAGTTTGGTT

Lsh-SK-WF5

AAATACATAATATGCTCTAAC

5500-F

CGCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTG

5500-R

TGCGGCCTAGGGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT

spe-Lsh-F

GGCCTCGCGCGCAGATCAGT

spe-Lsh-R

ATACAACTTCTTCTGTTTCC

tet-Lsh-F

AAGAAATCCGTTTGCTGA

tet-Lsh-R

GCAAGGCTATGTGCCATC

Lsh-IS-R

CGGAACACGTAGAAAGCCAG

Lsh-IS-F

GGCCGCAAAGAGGAGAAAGG

Lsh-1-R

CCATAAAATTAGTCAAAATA

Lsh-2-F

CGCTAAAGAGGAATTGGATT

Lsh-3-F

GAAAAAAGTAATAGAATGTT

Lsh-4-F

GGCTGATGCAAAATTTTTAT

Lsh-5-F

GCAGAACAAATTGATAGAGT

P15A-F

CAAGGCGACAAGGTGCTGAT

P15A-R

GGTAGCTCAGAGAACCTTCGA

CRISPR spacer name	Targeted regions in crRNA (5′→3′)	PFS
lacZ (200−400 bp)	CCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCT	C
lacZ (600−800 bp)	AAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACAT	C
polA (400−600 bp)	TCATGGTATTGATAAGCGTAATATTTGG	C
polA (1 000−12 00 bp)	ACCAGGTTAGCAGAGATGTTATCAAGGC	C

CRISPR spacer name

Targeted regions in crRNA (5′→3′)

PFS

lacZ (200−400 bp)

CCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCT

lacZ (600−800 bp)

AAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACAT

polA (400−600 bp)

TCATGGTATTGATAAGCGTAATATTTGG

polA (1 000−12 00 bp)

ACCAGGTTAGCAGAGATGTTATCAAGGC