微生物学报

Name	Sequence (5′→3′)
RT-RAA-F1	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAAGAGATGGATTTACACAGTTTGTTGGAG
RT-RAA-F2	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGGATTTACACAGTTTGTTGGAGTTG
RT-RAA-F3	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGATTTACACAGTTTGTTGGAGTTGGGTAC
RT-RAA-R1	TCAACACACAACGTCAGCAAACCCCCTTCT
RT-RAA-R2	TCCAAGATCAATCCCTGAGTTTATTGCATC
RT-RAA-R3	TAGTAATGCTCAACACACAACGTCAGCAAA
RT-RAA-R4	CAACGTCAGCAAACCCCCTTCTAGGAGATC
T7-crRNA-F	TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA
crRNA1-R	TTCGTAATAAGAAAGTGATA
crRNA2-R	AAATCATCAGGTTAGTATCT
crRNA3-R	ATGCAATAAACTCAGGGATT
crRNA1-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTCAAATAATATCACTTTCTTATTACGAA
crRNA2-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCTGATTACAGATACTAACCTGATGATTT
crRNA3-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCAAGATCAATCCCTGAGTTTATTGCAT
PCR-R	ATTCAATATTATGGGCAAGTTCAACT
PCR-F	AGTCGTTGAATTCTTCGTTTACTGC
Reporter RNA	FAM-20U-Biotin

Name	Sequence (5′→3′)
RT-RAA-F1	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAAGAGATGGATTTACACAGTTTGTTGGAG
RT-RAA-F2	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGGATTTACACAGTTTGTTGGAGTTG
RT-RAA-F3	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGATTTACACAGTTTGTTGGAGTTGGGTAC
RT-RAA-R1	TCAACACACAACGTCAGCAAACCCCCTTCT
RT-RAA-R2	TCCAAGATCAATCCCTGAGTTTATTGCATC
RT-RAA-R3	TAGTAATGCTCAACACACAACGTCAGCAAA
RT-RAA-R4	CAACGTCAGCAAACCCCCTTCTAGGAGATC
T7-crRNA-F	TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA
crRNA1-R	TTCGTAATAAGAAAGTGATA
crRNA2-R	AAATCATCAGGTTAGTATCT
crRNA3-R	ATGCAATAAACTCAGGGATT
crRNA1-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTCAAATAATATCACTTTCTTATTACGAA
crRNA2-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCTGATTACAGATACTAACCTGATGATTT
crRNA3-T	GGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCAAGATCAATCCCTGAGTTTATTGCAT
PCR-R	ATTCAATATTATGGGCAAGTTCAACT
PCR-F	AGTCGTTGAATTCTTCGTTTACTGC
Reporter RNA	FAM-20U-Biotin

基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒核酸检测方法的建立

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闫阔诚 ¹ , 李浩 ¹ , 白萱洋 ² , 韩尧 ¹ , 石大伟 ³ , 贾雷立 ²^,^* , 孙岩松 ¹^,^*

微生物学报 | 技术与方法 2024,64(8): 3073-3085

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微生物学报 | 技术与方法 2024, 64(8): 3073-3085

基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒核酸检测方法的建立

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闫阔诚¹, 李浩¹, 白萱洋², 韩尧¹, 石大伟³, 贾雷立²^,^*, 孙岩松¹^,^*

作者信息

1 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院, 北京 100071

2 中国人民解放军疾病预防控制中心, 北京 100071

3 中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室, 北京 100050

A CRISPR/Cas13a-based nucleic acid detection method for Marburg virus

Kuocheng YAN¹, Hao LI¹, Xuanyang BAI², Yao HAN¹, Dawei SHI³, Leili JIA²^,^*, Yansong SUN¹^,^*

Affiliations

1 Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100071, China

2 Chinese PLA Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100071, China

3 Division Ⅱ of Diagnostic for Infectious Diseases, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

出版时间: 2024-04-28 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240076

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摘要

收起

【目的】建立一种基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 13a, CRISPR/Cas13a)，针对马尔堡病毒核酸的快速检测方法。【方法】根据马尔堡病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)基因保守区序列设计合成特异性的逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(reverse transcription recombinase aided amplification, RT-RAA)引物及CRISPR RNA (crRNA)，利用RT-RAA等温扩增技术对靶序列进行扩增，通过CRISPR/Cas13a系统检测扩增产物，并结合消线法(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)侧流层析试纸进行结果判读。最后利用国家标准品对建立的新方法的灵敏度和特异性进行评估。【结果】筛选出一组针对马尔堡病毒NP基因的高效扩增引物和crRNA，建立了用于马尔堡病毒检测的CRISPR-ERASE方法，可在1 h内检测出浓度为1 copy/μL目标核酸，并与其他多种病原体无交叉反应。【结论】本研究基于CRISPR/Cas13a建立了一种快速、简便、高灵敏度和高特异性的马尔堡病毒核酸检测方法。

关键词

马尔堡病毒 / CRISPR/Cas13a / 核酸检测 / 逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(RT-RAA)

Abstract

收起

[Objective] To develop a rapid nucleic acid detection method for Marburg virus based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 13a (CRISPR/Cas13a). [Methods] According to the conserved region of Marburg virus nucleoprotein (NP) gene, specific primers for reverse transcription recombinase-aided amplification (RT-RAA) and CRISPR RNA (crRNA) were designed and synthesized. RT-RAA was employed to amplify the target sequence. The amplification products were detected by the CRISPR-Cas13a system, and the results were interpreted by easy-readout and sensitive enhanced (ERASE) lateral flow test strips. Finally, the national reference panel was used to evaluate the sensitivity and specificity of the new method. [Results] A set of high-efficiency RT-RAA primers and crRNA targeting Marburg virus NP gene was screened, on the basis of which a CRISPR-ERASE method for the detection of Marburg virus was developed. The target nucleic acid with a concentration of 1 copy/μL could be detected within 1 h, and there was no cross-reaction with other several pathogens. [Conclusion] In this study, a rapid, simple, highly sensitive, and specific nucleic acid detection method for Marburg virus was developed based on CRISPR/Cas13a.

Key words

Marburg virus / CRISPR/Cas13a / nucleic acid detection / reverse transcription recombinase-aided amplification (RT-RAA)

引用本文

闫阔诚, 李浩, 白萱洋, 韩尧, 石大伟, 贾雷立, 孙岩松. 基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒核酸检测方法的建立. 微生物学报, 2024 , 64 (8) : 3073 -3085 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240076

Kuocheng YAN, Hao LI, Xuanyang BAI, Yao HAN, Dawei SHI, Leili JIA, Yansong SUN. A CRISPR/Cas13a-based nucleic acid detection method for Marburg virus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (8) : 3073 -3085 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240076

正文

收起

1967年，马尔堡病毒(Marburg virus, MARV)首次发现于德国马尔堡地区，是一种丝状病毒科单股负链RNA病毒，可感染人类和非人灵长类动物^[1-2]。马尔堡病毒基因组由7个单顺反子基因线性排列组成(3′-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5′)，分别负责编码核蛋白(nucleoprotein, NP)、病毒蛋白35 (viral protein 35, VP35)、病毒蛋白40 (viral protein 40, VP40)、糖蛋白(glycoprotein, GP)、病毒蛋白30 (viral protein 30, VP30)、病毒蛋白24 (viral protein 24, VP24)和RNA聚合酶片段(polymerase, L)^[3]。NP基因编码的核蛋白是形成核衣壳的主要蛋白，不仅包绕病毒基因组RNA，保护其免受损伤，而且在病毒RNA的复制与转录中也发挥关键作用^[4-5]；NP基因在病毒中丰度高，存在高度保守序列^[6]，因此本研究选择NP基因作为检测的靶标基因。马尔堡病毒主要在非洲流行，在安哥拉、肯尼亚、乌干达等国家地区多次暴发疫情，2023年2月与3月，赤道几内亚和坦桑尼亚被证实首次暴发了马尔堡病毒，其暴发与流行对公共健康产生巨大危害^[7-9]。2015年，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将马尔堡病毒列入可能引发大流行需要高度关注的重点传染病；在2018年，该病毒被纳入应急状态下需优先关注的重点传染病清单^{[7, 10]}。马尔堡病毒病患者初始症状为发热、腹泻、呕吐等非特异性症状，可逐渐发展为严重的出血热，病死率高达88%^[11-13]。该病致死率高，临床救治能力薄弱，无批准上市的特效药物及疫苗^{[4, 14-15]}，因此，早期快速、简便地检测马尔堡病毒对疫情的防控具有重要意义。病毒的分离和培养是马尔堡病毒检测的金标准，但其必须在生物安全四级实验室进行，不适用于快速检测^[16]。目前用于马尔堡病毒检测的方法有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)和基因测序等，但这些方法操作烦琐，均依赖专业的实验室和检测人员，难以在经济条件落后的地区大规模配置^[17-18]，因此需要开发一种更简便、快速的马尔堡病毒检测方法。

重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)是一种恒温体外快速扩增核酸技术。在37−39 ℃恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，侵入与引物互补配对的模板DNA位点辅助解链，促使模板与引物之间发生链替换，并在DNA聚合酶作用下延伸合成新的互补链，从而实现对目标序列的扩增^[19]。逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(reverse transcription recombinase aided amplification, RT-RAA)则在此基础上增加了逆转录步骤，先利用逆转录酶将RNA逆转录为DNA再进行RAA扩增，该技术已被应用于多种病原体的检测^[20-21]。近年来，核酸检测技术快速发展，基于成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的核酸检测技术被认为是下一代分子诊断技术^[22-23]。利用Cas13蛋白的“附带切割”活性，结合等温扩增技术，Gootenberg等开发了Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing (SHERLOCK)核酸检测平台^[24]，该技术在检测病毒、细菌等多种病原体时表现出高灵敏性与高特异性^[24-26]。本课题组Li等前期开发了一种基于CRISPR/Cas13a的消线法(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)侧流层析试纸检测方法，该方法利用RAA或RT-RAA对目标核酸进行扩增后，将DNA序列转录为可被CRISPR RNA (crRNA)特异性识别的RNA，当目标RNA与crRNA-Cas13a蛋白复合体特异性结合后，激活Cas13a蛋白的“附带切割”活性，非特异性地切割RNA，从而降解两端分别标记了FAM (fluorescein amidite)基团和生物素(biotin)基团的报告RNA；将反应后的体系滴加到侧向流层析试纸，液体流过胶体金金垫时，标记有FAM抗体的胶体金颗粒会与FAM基团结合；当存在目标核酸时，报告RNA被切割，液体流过包被有链霉亲和素的检测线(T线，test line)，报告RNA的Biotin残基与链霉亲和素结合，不显示条带，胶体金颗粒与包被抗FAM抗体的质控线(C线，control line)结合显示条带；当不存在目标核酸时，结合FAM的胶体金颗粒通过完整的报告RNA与T线结合显色，从而在T线与C线都显示条带(图1)^[27]。利用该技术实现了对多种病原体的检测，包括新型冠状病毒及其变异位点^[27-30]。本研究旨在利用该技术建立一种无需荧光检测仪器的马尔堡病毒核酸快速检测方法。

1 材料与方法

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1.1 主要试剂和仪器

T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit、rNTP混合液、小鼠RNase抑制剂，New England Biolabs公司；RNaseAlert^TM QC System v2、HEPES、MgCl₂，ThermoFisher Scientific公司；RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)，杭州众测生物科技有限公司；LwaCas13a蛋白，GenScript公司；2×Super Pfx Master Mix，江苏康为世纪生物科技股份有限公司；无水乙醇、三氯甲烷，国药集团药业股份有限公司；DNA提取酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；RNAClean XP试剂盒，Beckman Coulter公司；T7 RNA聚合酶、一步法RT-qPCR染料法检测试剂盒，TaKaRa公司；RNase-free ddH₂O，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；ERASE核酸检测试纸，自研。

MiniAmp^TM热循环仪，ThermoFisher Scientific公司；金属浴，COYOTE公司；实时荧光定量PCR仪，Roche公司；全自动核酸提取仪，无锡百泰克生物技术有限公司；台式小型高速离心机，Sigma-Aldrich公司；超微量分光光度计，IMPLEN公司。

1.2 引物设计和crRNA的制备

马尔堡病毒基因序列下载自NCBI网站，使用MAFFT程序(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)比对序列保守性，选定参考株(GenBank编号为AY430365.1)。根据保守序列设计用于RT-RAA与PCR的引物，引物核酸序列由北京天一辉远生物科技有限公司合成(表1)。根据保守序列按碱基互补的原则设计crRNA与用于制备crRNA的序列，根据前期工作基础，按照先进行PCR扩增再进行体外转录的流程制备crRNA，PCR上游引物5′端引入T7启动子序列以便后续进行转录^[31]。利用PCR扩增crRNA模板序列，用于制备crRNA的PCR引物及模板序列均由北京天一辉远生物科技有限公司合成(表1)。PCR反应体系(50 µL)：2×Super Pfx Master Mix 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，模板(crRNA-T) 2 µL，RNase-free ddH₂O 19 µL。充分混匀后放入MiniAmp^TM热循环仪中，设置PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物纯化后使用T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit进行体外转录，转录反应体系(20 μL)：NTP Buffer Mix 10 μL，T7 RNA Polymerase Mix 2 μL，DNA模板1 μg，RNase-free ddH₂O将体系补足至20 μL。转录反应条件：放入恒温培养箱37 ℃孵育至少12 h，孵育完成后利用RNA Clean XP试剂盒纯化crRNA。

1.3 RT-RAA扩增

根据RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)说明书，保持总体积不变的情况下调整各组分含量，优化反应效果。利用RT-RAA反应扩增模板，引物序列具体如表1所示，RT-RAA扩增反应体系(50 µL)：A缓冲液25 µL，B缓冲液2.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，模板10 µL，RNase-free ddH₂O 8.5 µL。盖紧管盖后颠倒6−8次充分混合溶液，将反应体系置于金属浴中，42 ℃孵育30 min。

1.4 CRISPR荧光法检测

取1.3中等温扩增产物5 µL与CRISPR/Cas13a荧光检测体系混合，放入LightCycler 96实时荧光定量PCR仪进行CRISPR荧光法检测。CRISPR荧光检测体系(25 µL)：rNTP混合液(25 mmol/L) 2 µL，RNase抑制剂(40 U/µL) 1 µL，T7 RNA聚合酶(50 U/µL) 0.5 µL，HEPES (1 mol/L) 0.5 µL，MgCl₂ (1 mol/L) 0.25 µL，RNaseAlert^TM QC System v2 (2 nmol/mL) 2.5 µL，crRNA (100 ng/µL) 1.5 µL，Cas13a蛋白(600 nmol/L) 1 µL，RNase-free ddH₂O 10.75 µL，RT-RAA扩增产物5 µL。CRISPR荧光法检测条件：37 ℃孵育60 min，选择FAM通道，激发光波长490 nm，发射光波长520 nm，每2 min采集一次荧光信号，实时监测荧光强度变化。

1.5 CRISPR-ERASE检测

取1.3中等温扩增产物5 µL与CRISPR-ERASE试纸检测体系混合，在金属浴上37 ℃恒温孵育30 min。在孵育结束后，用移液枪将整个反应体系转移到ERASE核酸检测试纸上，等待3−5 min即可肉眼读取检测结果。CRISPR-ERASE试纸检测体系(50 µL)：rNTP混合液(25 mmol/L) 4 µL，RNase抑制剂(40 U/µL) 2 µL，T7 RNA聚合酶(50 U/µL) 1 µL，HEPES (1 mol/L) 1 µL，MgCl₂ (1 mol/L) 0.5 µL，FAM-20U-Biotin (20 nmol/L) 5 µL，Cas13a蛋白(600 nmol/L) 2 µL，crRNA (100 ng/µL) 3 µL，RNase-free ddH₂O 26.5 µL，等温扩增产物5 µL。ERASE试纸结果判读方法：T线不显色、C线显色，判读为阳性；T线、C线均显色，判读为阴性；C线不显色，则结果无效。

1.6 RT-qPCR法检测

使用一步法RT-qPCR染料法检测试剂盒对模板进行检测。RT-qPCR体系(25 µL)：TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 µL，Ex Taq HS (5 U/µL) 0.5 µL，RT enzyme Mix Ⅱ 0.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.5 µL，模板2 µL，RNase-free ddH₂O 8.5 µL。颠倒6−8次充分混合溶液，将其置于实时荧光定量PCR仪中，RT-qPCR检测条件：选择SYBR通道，42 ℃逆转录5 min；95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环，每个循环结束时采集一次应荧光信号。

1.7 马尔堡病毒核酸检测试剂国家参考品与核酸提取

马尔堡病毒核酸检测试剂国家参考品由中国食品药品检定研究院提供(370042-201801)，阳性、最低检出限和精密度参考品为人血浆稀释的包含马尔堡病毒核蛋白基因和糖蛋白基因RNA噬菌体假病毒颗粒，阴性参考品为5种灭活的虫媒病毒培养液和人血浆稀释的包含拉沙热病毒糖蛋白和膜蛋白基因、包含扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白和膜蛋白基因的大肠杆菌菌液制成。

阳性参考品包括：P1-1 (马尔堡病毒1980年分离株/Mt. Elgon-Musoke的全长NP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)、P1-2 (马尔堡病毒1980年分离株/Mt. Elgon-Musoke的全长GP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)、P2-1 (马尔堡病毒2012年分离株/Mbg-422-2012的全长NP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)、P2-2 (马尔堡病毒2012年分离株/Mbg-422-2012的全长GP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)、P3-1 (马尔堡病毒2014年分离株/Kampala-812601的全长NP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)、P3-2 (马尔堡病毒年分离株/Kampala-812601的全长GP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)。

精密度参考品：R (马尔堡病毒2012年分离株/Mbg-422-2012的全长NP和GP基因，浓度约1×10⁵ copies/μL)。

最低检出限参考品包括：S1−S5，其中S1−S4由精密度参考品R用阴性血浆10倍梯度稀释获得，S1浓度为1×10⁴ copies/μL，S2浓度为1×10³ copies/μL，S3浓度为1×10² copies/μL，S4浓度为1×10¹ copies/μL，S5为阴性血浆。

阴性参考品：B1 (拉沙病毒全长NP/GP基因，NP基因浓度为5.81×10⁶ copies/μL，GP基因浓度为5.61×10⁷ copies/μL)、C3-1 (扎伊尔型埃博拉病毒全长NP/GP基因，NP基因浓度为1.84×10⁶ copies/μL，GP基因浓度为2.01×10⁵ copies/μL)、N1 (基孔肯亚病毒，浓度为5.58×10⁸ copies/μL)、N2 (乙型脑炎病毒SA14-14-2株，滴度为0.44 lg PFU/mL)、N3 (森林脑炎病毒senzhang株，滴度为0.64 lg LD₅₀/mL)、N4 (汉坦病毒肾综合征出血热疫苗株，滴度为0.58 lg CCID₅₀/mL)、N5 (黄热病毒17D株，滴度为0.49 lg PFU/mL)。

使用全自动核酸提取仪(无锡百泰克生物技术有限公司)，按操作说明对马尔堡病毒核酸检测试剂国家参考品进行核酸提取，每单管提取反应使用80 μL参考品样本，获得80 μL核酸提取样本。其中精密度参考品R用RNase-free ddH₂O按1:10稀释后提取，其余参考品不需稀释直接提取。稀释后的精密度参考品R需平行提取10次，其余参考品需提取1次。

1.8 crRNA与RT-RAA引物的筛选

将P1-1阳性参考品提取的核酸稀释至浓度为10³ copies/μL，利用1.3中RT-RAA扩增的方法对该浓度样本进行扩增，crRNA按照1.2中的方法进行制备，利用1.4中CRISPR荧光检测的方法分别使用crRNA1、crRNA2、crRNA3对扩增产物进行检测，比较实验结果，选择检测荧光值最高的crRNA进行后续实验。

将P1-1阳性参考品提取的核酸稀释至浓度为10¹ copies/μL，选定crRNA后，将上、下游引物两两配对组合对该浓度样本进行扩增，使用选定的crRNA进行CRISPR荧光法检测，选择检测荧光值最高引物组合进行后续实验。

1.9 灵敏度评价

为了评价检测方法的灵敏度，将提取的NP基因核酸10倍浓度梯度稀释成浓度为10³、10²、10¹、10⁰、10⁻¹ copies/μL的核酸样本作为模板，RNase-free ddH₂O作为阴性对照，分别使用1.4中CRISPR荧光法检测、1.5中CRISPR-ERASE检测和1.6中RT-qPCR方法对模板进行检测，比较3种方法的检测灵敏度。同时，利用CRISPR-ERASE检测方法对参考品S1−S5进行检测。

1.10 特异性和稳定性评价

利用CRISPR-ERASE检测方法检测参考品P1-1、P2-1、P3-1、P1-2、P2-2、P3-2，验证本方法的靶标基因；同时，检测参考品N1−N5、B1、C3-1，对该方法进行特异性评价。利用CRISPR-ERASE检测方法检测重复提取10次的参考品R，评价本方法的稳定性。以上实验均以RNase-free ddH₂O作为阴性对照，特异性评价中以参考品P1-1提取的核酸作为阳性对照。

1.11 统计方法

使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据处理，比较2组间差异是否显著采用t检验，单因素多组间差异比较采用单因素方差分析进行统计学分析。为了保证检测的准确性和重复性，所有实验均设置了至少3个独立的技术重复，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

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2.1 针对马尔堡病毒的特异性扩增引物与crRNA筛选

在NCBI下载马尔堡病毒序列，经比对后选择保守序列NP基因设计引物与crRNA (图2A)。为了筛选出高效的crRNA，对浓度为10³ copies/μL的核酸样本进行RT-RAA扩增，使用同一批扩增产物进行crRNA筛选实验，检测实验开始后3条crRNA的CRISPR检测荧光曲线均呈上升趋势，crRNA1检测体系在30 min进入平台期(图2B)，反应开始30 min时3条crRNA中crRNA1荧光信号最高为(2.098±0.122) a.u. (图2C)，对比阴性对照组具有统计学差异(P<0.000 1)，因此选用crRNA1进行后续实验。为了筛选出高效的等温扩增引物，将设计的上、下游引物两两组合进行实验，对低浓度的目标核酸(1 copy/μL)进行RT-RAA扩增，使用扩增产物进行CRISPR荧光检测。在反应进行30 min时，引物对F2R1荧光值为0.953 a.u. (图2D)，在所有12种引物组合中荧光值最高，因此选择F2R1引物对进行后续实验。初步建立了基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒检测方法。

2.2 基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒检测方法灵敏度评价

为了评价该方法的灵敏度，使用10倍浓度梯度稀释的MARV NP基因核酸作为模板进行检测实验，结果如图3A、3B所示，检测进行10 min时，CRISPR荧光法可检出浓度最低为1 copy/μL的目标核酸，荧光值为(0.950±0.112) a.u.，与阴性对照组相比有显著差异(P<0.000 1)。此外，设计PCR引物进行RT-qPCR检测，最低可检出浓度为1 copy/μL的目标核酸(C_t值为35.69±0.55)。结合消线法侧流试纸建立马尔堡病毒的CRISPR-ERASE检测方法，结果显示该方法可检出浓度为1 copy/μL的目标核酸(图3D)。CRISPR-ERASE方法检测MARV NP基因的灵敏度与CRISPR荧光法和RT-qPCR法一致。

2.3 使用国家参考品评价CRISPR-ERASE检测马尔堡病毒的特异性、最低检出限和稳定性

为了进一步评价该方法的检测性能，使用马尔堡病毒核酸检测试剂国家参考品对本方法进行评价。特异性评价实验结果如图4A、4B所示，阳性对照(positive control, PC)组判读为阳性，阴性参考品(N1-N5、B1、C3-1)与阴性对照(negative control, NC)均判读为阴性；检测靶标序列为MARV NP基因的P1-1、P2-1、P3-1实验组均判读为阳性，检测靶标序列为MARV GP基因P1-2、P2-2、P3-2实验组与阴性对照(NC)判读为阴性。最低检出限评价结果如图4C所示，S1−S4判读为阳性，S5 (阴性血浆)与阴性对照(NC)判读为阴性，符合参考品要求。稳定性评价结果如图4D所示，参考品R使用RNase-freeddH₂O稀释10倍后，重复进行10次病毒RNA提取，对提取的样本进行检测，10次重复结果均判读为阳性。

3 讨论与结论

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马尔堡病毒是一种高致死率的烈性病原体，及时发现并阻断病毒的传播至关重要。研究者针对马尔堡病毒的检测进行了一系列研究。Boisen等利用ELISA法检测马尔堡病毒VP40抗原的检测限可以达到1 ng/mL，相较于核酸检测方法，其操作烦琐、灵敏度较低、用时较长，不利于现场快速检测^[32]。Rieger等开发了检测埃博拉病毒和马尔堡病毒L基因的RT-qPCR试剂盒，使用实时荧光定量PCR仪进行检测灵敏度为95%，单反应可检测到11−67个病毒RNA拷贝，该检测依赖荧光定量PCR仪进行实验，不利于在医疗条件薄弱地区的进行筛查^[33]。全基因组测序的检测方法更加准确，可区分马尔堡病毒的不同毒株，但其对样本要求较高，并且需要专业的仪器进行检测，检测在1−2 d内完成^[34]。Liu等基于qPCR和微流控技术开发了TaqMan阵列卡，2.5 h内可检测6−8个样本，可检测包括马尔堡病毒在内的26种急性发热性疾病相关病原体，检测下限为在每毫升血液中可检测到10⁴个病原体核酸拷贝，检测总体敏感性为88%，特异性为99%，但仍需专业仪器进行检测^[35]。

本研究通过CRISPR荧光检测实验筛选出了针对马尔堡病毒的特异性扩增引物与crRNA，建立了基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒核酸检测技术。该方法检测灵敏度达到了1 copies/μL，对比RT-qPCR检测和CRISPR荧光法具有相同的灵敏度。该方法检测国家参考品中最低检出限参考品S1−S4均检出，符合使用要求。该方法显示了良好的特异性，与拉沙病毒、埃博拉病毒、基孔肯亚病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、黄热病毒均无交叉反应。该方法还显示出良好的稳定性，对10倍浓度稀释的参考品R的10次检测均检出。此外，本研究结合消线法侧流试纸，阳性结果判读标准为“T线”完全消失，避免了因报告RNA自降解或“显线法”试纸的主观判读失误造成假阳性结果，并且可在1 h内完成检测，仅需一个37−42 ℃的恒温加热装置，检测结果使用试纸进行呈现，携带方便，操作简单，无需昂贵的荧光定量PCR等仪器设备，为实现马尔堡病毒的快速检测提供新的核酸检测策略和技术支撑。样本快速前处理技术是实现现场实际检测的关键，近年来，为了实现针对病毒样本的现场快速核酸提取，研究人员专门开发出了热裂解法、基于蛋白酶K的直接裂解法、基于表面活性剂病毒裂解法和基于微流控芯片和磁珠的核酸自动提取等一系列适用于现场病毒核酸快速提取的技术，实现了针对全血、尿液、粪便、唾液中病毒核酸的快速提取^[36-37]。例如，Genoud等使用蛋白酶K和热裂解的方法处理鼻、咽拭子样本，通过qPCR实现了SARS-CoV-2的免核酸提取检测^[38]；黄媛媛等开发了一种免提取的呼吸道病毒处理试剂，可在5 min内完成包膜病毒核酸的释放，获取的样本可直接进行PCR扩增^[39]；Zou等开发了一种使用纤维素基纸进行核酸纯化的方法，该方法通过机械裂解或使用裂解液的方法处理植物、动物和微生物样本，使用纤维素基纸在30 s内获得可用于扩增的核酸^[40]。以上方法为实现马尔堡病毒的CRISPR现场核酸快检提供了诸多候选技术，然而不同的样本处理方法与本方法的适配性和兼容性仍需进一步验证。

综上所述，本研究基于CRISPR/Cas13a，结合消线法侧流试纸建立了一种快速简便、高灵敏度和高特异性的马尔堡病毒核酸检测方法。该方法无需使用专业的荧光检测仪器，操作简单，为及时检测马尔堡病毒提供了新的技术选项。

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2024年第64卷第8期

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作者信息

1 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院, 北京 100071

2 中国人民解放军疾病预防控制中心, 北京 100071

3 中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室, 北京 100050

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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