微生物学报

生物塑料聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯)前体的酶催化合成

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龚兰玉 ¹^,² , 马龙 ¹ , 朱蕾蕾 ²^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(8): 2813-2822

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(8): 2813-2822

生物塑料聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯)前体的酶催化合成

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龚兰玉¹^,², 马龙¹, 朱蕾蕾²^,^*

作者信息

1 天津科技大学生物工程学院, 天津 300457

2 中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室, 天津 300308

Enzyme-catalyzed synthesis of precursor of the bioplastic poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate)

Lanyu GONG¹^,², Long MA¹, Leilei ZHU²^,^*

Affiliations

1 School of Biological Engineering, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

2 Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Manufacturing, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

出版时间: 2024-08-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240045

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摘要

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【目的】聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯) [poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate), PBAF]是一种可生物降解的呋喃基共聚酯塑料。化学合成PBAF的过程中，寡聚片段聚合的随机性会生成嵌段共聚物、无规共聚物、交替共聚物等多种复杂聚合物，从而影响生物塑料PBAF的质量。本研究以单体2,5-呋喃二甲酸二甲酯(dimethyl furan-2,5-dicarboxylate, FDME)和1,4-丁二醇(1,4-butanediol, BDO)为底物，通过酶促反应合成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)，为生物塑料PBAF提供可以进行可控聚合反应的生物塑料前体，从而减少副产物生成的问题。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中异源表达来源于嗜橡胶根瘤杆菌(Rhizobacter gummiphilus)的RgPETase，发现RgPETase对底物FDME和BDO具有一定的酰基转移酶活性。深入研究了合成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯的反应条件的优化，包括反应pH、反应温度、底物兼溶剂BDO的含量和反应酶量。【结果】RgPETase的最适反应pH值为8.0，底物兼溶剂BDO的最适含量为30%，最适反应温度区间为25−30 ℃。在最适条件下，即反应温度为30 ℃且酶浓度为6 µmol/L时，RgPETase催化10 mmol/L FDME可产生(2.96±0.01) mmol/L双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯。【结论】RgPETase具有较好的酰基转移酶活性，能通过酰基转移反应有效催化FDME生成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯，为生物塑料PBAF前体的合成提供了一条绿色可持续的途径。

关键词

RgPETase / 酰基转移反应 / 生物塑料 / PBAF前体

Abstract

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[Objective] Poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate) (PBAF) is a biodegradable furan-based copolyester plastic. In the chemical synthesis of PBAF, the randomness of oligomer polymerization leads to the formation of complex polymers, such as block copolymers, random copolymers, and alternating copolymers. In this study, dimethyl furan-2,5-dicarboxylate (FDME) and 1,4-butanediol (BDO) were used as substrates to synthesize bis-BDO ester by enzymatic reaction to provide the bioplastic precursor for controllable polymerization and avoid complex by-products. [Methods] RgPETase from Rhizobacter gummiphilus was heterogeneously expressed in Escherichia coli BL21(DE3). RgPETase exhibited acyltransferase activity for FDME and BDO. The reaction conditions including pH, temperature, content of BDO (as both substrate and solvent), and amount of enzyme for the synthesis of bis-BDO ester were optimized. [Results] The optimum reaction conditions of RgPETase were pH 8.0, BDO content of 30%, and reaction temperature within the range of 25–30 ℃. Under the optimum conditions (30 ℃ and enzyme concentration of 6 μmol/L), RgPETase can catalyze 10 mmol/L FDME to produce (2.96±0.01) mmol/L bis-BDO ester. [Conclusion] RgPETase exhibits high acyltransferase activity and catalyzes the generation of bis-BDO ester from FDME via acyl transfer reaction under mild conditions, which provides a green and sustainable approach for synthesizing the precursor of PBAF.

Key words

RgPETase / acyl transfer reaction / bioplastic / precursor of PBAF

引用本文

龚兰玉, 马龙, 朱蕾蕾. 生物塑料聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯)前体的酶催化合成. 微生物学报, 2024 , 64 (8) : 2813 -2822 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240045

Lanyu GONG, Long MA, Leilei ZHU. Enzyme-catalyzed synthesis of precursor of the bioplastic poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate)[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (8) : 2813 -2822 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240045

正文

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塑料广泛应用于建筑材料、交通工具、服装和食品饮料包装等多个领域。随着全球塑料污染问题日趋严重，寻找替代传统塑料的可持续发展方案是当前科学研究和技术行业的热点问题^[1]。在这一背景下，生物塑料的相关研究备受关注。生物塑料分为两类，一类是指可生物降解的塑料，如聚ε-己内酯(poly-ε-caprolactone, PCL)、聚丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate), PBS]；另一类是指可降解或不可降解的塑料，但单体由生物材料或可再生原料生产，如淀粉、纤维素和植物油^[2-4]。生物塑料在功能上与合成塑料类似，因其具备可持续性，已成为当前研究的重点之一^[5]。目前，全球生物塑料的生产能力仅为400万t，因此生物塑料的发展和增长空间很大^[6]。

聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯) [poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate), PBAF]是由2,5-呋喃二甲酸、己二酸、1,4-丁二醇共聚生成的可生物降解塑料^[7]，在合成PBAF的过程中，己二酸酯(如己二酸二甲酯)与1,4-丁二醇(1,4-butanediol, BDO)的反应比呋喃(甲基或乙基)酯更易发生，这也导致生成不规则的聚合物副产物，影响了PBAF的质量^[8]。因此，若预先合成更活泼的双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)来取代活性较低的呋喃(甲基或乙基)酯，将有望使生物塑料PBAF的聚合过程更为均一和可控。研究发现，混杂水解酶/酰基转移酶能催化酰基转移反应，如酯化和酯交换等^[9-10]。因此，寻找能够在水相条件下催化酰基转移反应的酶催化剂是关键^[11]。

研究发现来源于近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)的脂肪酶CpLIP2能够在水相中催化合成乙二醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的油酯^[12]。来源于担子菌酵母菌(Pseudozyma antarctica)的脂肪酶CAL-A也具有酰基转移酶活性，可在水相中合成脂肪酸甲酯或乙酯(生物燃料)^[13-15]。单突变体(D122L)可以提高CAL-A的酰基转移酶活性，使棕榈仁油与无水乙醇作用，产生高达95%的脂肪酸乙酯^[16]。源于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶MsAcT能够在水相中催化伯醇进行酰基转移反应生成伯醇酯^[17]。来源于嗜橡胶根瘤杆菌(Rhizobacter gummiphilus)的RgPETase具有酯键水解活性^[18-19]，目前尚无文献报道RgPETase具有酰基转移酶活性。如图1所示，以单体2,5-呋喃二甲酸二甲酯(dimethyl furan-2,5-dicarboxylate, FDME)和1,4-丁二醇(BDO)为底物，在RgPETase作用下通过酶促反应合成生物塑料前体双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)。5-(5-羟基戊酰基)呋喃-2-羧酸甲酯(Me BDO ester)和双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)是通过酰基转移反应生成的单酯化产物和双酯化产物，5-(甲氧羰基)呋喃-2-羧酸(Me ester)是通过水解作用生成的水解产物。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

菌株大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)和质粒pET-22b(+)均由本实验室保存；重组质粒pET22b-RgPETase委托苏州金唯智生物科技有限公司天津分公司合成，本研究中RgPETase的序列信息与Sagong等^[20]报道文献中的序列信息一致。

1.1.2 主要试剂

氨苄青霉素(ampicillin, Amp)购自北京兰博利德商贸有限公司；异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)购自北京索莱宝科技有限公司；质粒小提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；1,4-丁二醇(1,4-butanediol, BDO)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,5-呋喃二甲酸二甲酯(dimethyl furan-2,5-dicarboxylate, FDME)购自深圳市益百顺科技有限公司。

1.2 RgPETase的表达及纯化

将重组质粒pET22b-RgPETase转化至Escherichia coli BL21(DE3)中，涂布于LB平板上后过夜孵育，挑取平板上的单克隆菌落至LB培养基中，在37 ℃、220 r/min条件下培养16 h得到种子液，以体积分数2%接种量转接至500 mL LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6–0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，20 ℃诱导表达24 h。表达完成后，4 ℃、5 500 r/min离心40 min，收集上清液得到粗酶液。

使用中空纤维微滤装置(0.45 µm滤膜)将粗酶液过膜处理后，再使用中空纤维超滤装置(5 kDa)浓缩至原体积的10%−20%。0.22 μm滤膜过膜处理后，使用AKTA纯化仪和5 mL HisTrap HP层析柱纯化蛋白，A液为含300 mmol/L NaCl的50 mmol/L NaH₂PO₄缓冲液(pH 8.0)，B液为含300 mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑的50 mmol/L NaH₂PO₄缓冲液(pH 8.0)。利用不同浓度咪唑梯度洗脱的方式得到纯化后的蛋白，再使用50 mL HiPrepTH 26/10脱盐柱将纯酶液置换至Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.0)中，保存于−80 ℃。

1.3 RgPETase催化活性的测定

标准品标准曲线的配制：标准品有2,5-呋喃二甲酸二甲酯(FDME)、双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)、5-(5-羟基戊酰基)呋喃-2-羧酸甲酯(Me BDO ester)、5-(甲氧羰基)呋喃-2-羧酸(Me ester)。分别配制成10 mmol/L母液，将其稀释至50−1 000 µmol/L的梯度标准溶液，通过HPLC检测可得到标准品的标准曲线。

HPLC检测条件：采用高效液相色谱(Thermo UltiΜmate 3000)，EF-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm, 5 µm)，流动相为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ (pH 7.0, 20 mmol/L)缓冲液，内含30%−70%乙腈线性梯度液，流速为0.8 mL/min，上样量为10 µL，检测波长为260 nm。

RgPETase催化活性的测定：在含有50% (体积分数) BDO的Tris-HCl (50 mmol/L, pH 8.0)缓冲液中，将1 µmol/L纯酶与10 mmol/L FDME在30 ℃条件下反应24 h。加入等体积含有25%乙腈的缓冲液终止反应，对样品进行稀释和过膜处理(0.22 μm滤膜)后，用于高效液相色谱分析。

1.4 反应pH的优化

测定不同pH (5.0–10.0)条件下RgPETase对底物FDME的催化活性，以总酯化产物产量作为判断最适pH的依据。实验所用缓冲液如下：Tris-NaH₂PO₄ (pH 5.0–6.0)、Tris-HCl (pH 7.0−8.5)、glycine-NaOH (pH 9.0−10.0)。在含有50% (体积分数) BDO的不同pH缓冲液中，将1 µmol/L纯酶与10 mmol/L FDME在30 ℃条件下反应24 h。HPLC检测方法同1.3。

1.5 反应温度的优化

在含有50% (体积分数) BDO的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0, 50 mmol/L)中，将1 µmol/L纯酶与10 mmol/L FDME在不同温度(18、25、30、37 ℃)下反应24 h，以测定RgPETase对底物FDME的催化活性。HPLC检测方法同1.3。

1.6 1,4丁二醇(BDO)含量的优化

在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0, 50 mmol/L)中，将1 µmol/L纯酶与10 mmol/L FDME在25 ℃和30 ℃条件下反应24 h以测定BDO的含量(体积分数)分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90条件下时RgPETase对底物FDME的催化活性。HPLC检测方法同1.3。

1.7 酶浓度的优化

在含有30% (体积分数) BDO的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0, 50 mmol/L)中，测定不同浓度纯酶与10 mmol/L FDME在30 ℃条件下反应24 h时对底物FDME的催化活性。HPLC检测方法同1.3。

1.8 反应时间对RgPETase催化活性的影响

在含有30% (体积分数) BDO的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0, 50 mmol/L)中，测定10 µmol/L纯酶与10 mmol/L FDME在30 ℃条件下0−24 h的反应时间进程，每隔3 h取一次样品，测定不同时间段RgPETase对底物FDME的催化活性。HPLC检测方法同1.3。

2 结果与分析

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2.1 RgPETase的表达和纯化

根据图2A可知，相比空质粒pET-22b(+)，重组蛋白pET22b-RgPETase在25−35 kDa处有一条明显的蛋白条带，其分子量约为29.7 kDa，与理论上的分子量大小一致。因此，RgPETase在Escherichia coli BL21(DE3)中成功分泌表达。

根据亲和层析原理，使用镍柱以30–250 mmol/L咪唑浓度梯度洗脱蛋白，得到单一且清晰的纯酶RgPETase (图2B)。

2.2 RgPETase酰基转移酶活性的发现

根据图3可知，30 ℃条件下1 μmol/L RgPETase与10 mmol/L FDME在含有50% (体积分数) BDO的Tris-HCl缓冲液中反应24 h后，生成了bis-BDO双酯和Me BDO单酯，说明RgPETase能够催化FDME单酯化及双酯化，生成链长可控的酯化产物Me BDO酯和bis-BDO酯。

2.3 反应pH的优化

由图4可知，RgPETase在碱性条件下更易发生酰基转移反应。随着pH的增加，总酯化产物(bis-BDO双酯和Me BDO单酯)的产量也缓慢增加，在pH 8.0的缓冲条件下作用生成的总酯化产物产量达到最高。然而，当pH值超过8.0后，水解反应占主导作用，主要生成水解产物Me ester。因此，选择pH 8.0作为最适pH进行后续实验。

2.4 反应温度的优化

如图5所示，25 ℃或30 ℃时RgPETase作用下生成的总酯化产物(bis-BDO ester和Me BDO ester)产量最高，均为1.2 mmol/L左右。18 ℃时双酯化产物bis-BDO ester产量最高，30 ℃时单酯化产物Me BDO ester产量最高。考虑到单酯化产物Me BDO酯也会通过酰基转移反应转化为双酯化产物bis-BDO酯，因此以总酯化产物产量作为评价最适温度的指标，后续实验选择在25 ℃或30 ℃条件下进行。

2.5 1,4-丁二醇(BDO)含量的优化

如图6所示，纯水相(不含BDO)条件下只发生水解反应，生成水解产物Me ester。图6A、6B表明25 ℃条件下BDO的含量(体积分数)为30%时，可生成(2.95±0.01) mmol/L双酯化产物bis-BDO ester。图6C、6D表明30 ℃条件下BDO的含量(体积分数)为20%时，可生成(2.44±0.01) mmol/L双酯化产物bis-BDO ester。这表明需要在具有合适的水相与有机相条件下才能发挥RgPETase的酰基转移酶活性，从而实现酯交换生成酯化产物。

2.6 酶浓度的优化

由图7可知，在含有30% (体积分数) BDO的反应体系中，测定30 ℃条件下不同浓度的RgPETase对底物FDME的催化活性，发现酶浓度为6 µmol/L时，双酯化产物bis-BDO ester的产量最高，为(2.96±0.01) mmol/L。增加酶浓度可能促进单酯化产物Me BDO ester向双酯化产物bis-BDO ester转化，这说明酶浓度是RgPETase发挥酰基转移酶活性的重要因素。

2.7 反应时间对RgPETase催化活性的影响

如图8所示，在含有30% (体积分数) BDO和10 μmol/L纯酶的反应体系中，0–9 h时间段内，酯化产物bis-BDO ester和Me BDO ester的产量随着反应时间的增加逐渐得到提升，反应时间超过9 h后，Me BDO ester一方面通过酰基转移反应转化为bis-BDO ester，另一方面又通过水解反应转化为水解产物Me ester，证实了RgPETase作用下，单酯化产物Me BDO ester可通过酰基转移反应转化为双酯化产物bis-BDO ester。

3 讨论与结论

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聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯) (PBAF)是一种可生物降解的呋喃基共聚酯塑料。化学合成PBAF的过程中，寡聚片段聚合的随机性会生成嵌段共聚物、无规共聚物、交替共聚物等多种种类复杂聚合物，从而影响生物塑料PBAF的质量。本研究以单体2,5-呋喃二甲酸二甲酯(FDME)和1,4-丁二醇(BDO)为底物，通过酶促反应合成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester)，为生物塑料PBAF提供可控的生物塑料前体。酶法合成的bis-BDO酯是与脂肪族单体(如乙二酸二甲酯)进行化学催化共聚的非常有前景的生物塑料前体^[12]，使后续生物塑料PBAF的聚合更均一并且更可控。混杂水解酶/酰基转移酶因其能有效催化酰基转移反应来生成酯、硫酯和氨基甲酸酯等而引起人们的关注，是催化酰基转移反应的理想生物催化剂^[10]。目前关于混杂水解酶/酰基转移酶的发现及研究较少，亟须发现这样的酶类。

目前国内外还没有关于RgPETase具有酰基转移活性的报道，本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达了来源于Rhizobacter gummiphilus的RgPETase，发现RgPETase除已报道的酯键水解活性^[20]外，还具有将FDME和BDO转化为bis-BDO双酯和Me BDO单酯的酰基转移酶活性。我们进而通过优化反应体系的pH值、反应温度、BDO的含量及酶浓度，提升将FDME转化为bis-BDO双酯和Me BDO单酯的转化率，进而减少水解副产物的生成。通过优化温度，确定RgPETase发挥酰基转移活性的适宜温度区间为25−30 ℃，较高的温度(37 ℃)对RgPETase的酰基转移活性不利，影响双酯化产物bis-BDO酯的生成，因此酰基转移反应可能更适合在中等温度条件下进行。通过优化BDO的含量发现，RgPETase在30% BDO的条件下表现对酰基转移活性的偏好性，在不含BDO的条件下，底物FDME只发生水解反应生成水解产物；BDO含量超过50%时，基本不影响水解产物Me ester的产量，但酯化产物bis-BDO双酯和Me BDO单酯的产量却明显减少，原因可能是增加有机溶剂BDO的浓度抑制了RgPETase的酶活。我们还发现RgPETase的酶浓度过高时(> 8 μmol/L)，反应更偏好于水解反应生成水解产物Me ester，不利于酰基转移反应的进行。优化条件后，RgPETase可催化10 mmol/L FDME产生(2.96±0.01) mmol/L bis-BDO酯，即bis-BDO酯的转化率能达29.6%以上。本研究为RgPETase转化FDME为酯化产物bis-BDO酯的应用提供了方法，但与其他同源酶^[12]如PETase、TfH、CalB相比，RgPETase的转化效率较低，后续可通过酶分子改造的方式提高RgPETase的活性，提高酯化产物bis-BDO酯的转化率。

基金

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国家重点研发计划(2023YFC3905000)
天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-IJCP-003)
天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-BRFI-005)

参考文献

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文献

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排序方式：

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https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.126075

2024年第64卷第8期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240045

接收时间：2024-01-16
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-08-04

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收稿日期：2024-01-16
录用日期：2024-04-18

基金

National Key Research and Development Program of China(2023YFC3905000)

国家重点研发计划(2023YFC3905000)

Tianjin Synthetic Biotechnology Innovation Capacity Improvement Action(TSBICIP-IJCP-003)

天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-IJCP-003)

Tianjin Synthetic Biotechnology Innovation Capacity Improvement Action(TSBICIP-BRFI-005)

天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-BRFI-005)

作者信息

1 天津科技大学生物工程学院, 天津 300457

2 中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室, 天津 300308

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20240045

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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