微生物学报

Primer name	Sequence of primers (5′→3′)	Purpose	Product length (bp)
Underline indicates the restriction sites; Wavy line indicates the spacer; * indicates that if the construction of pEC-cp40gRNA plasmid is success, the amplified fragment is 593 bp, and the amplified fragment of pECXK99E empty vector is 471 bp;^# indicates that the amplified fragment of thecp40-deleted strain is 1 400 bp, and the amplified fragment of wild type strain is 2 540 bp.
cp40gRNA-F		cp40gRNA amplification	122
gRNA-R	CCCGTCGACCCTGGAAAAAAAGCAC
pECjd-F	CACTCCCGTTCTGGATAAT	Detect whether the pEC-cp40gRNA plasmid was successfully constructed	471/593*
pECjd-R	TCACCGACAAACAACAGATAA
cp40UP-F	CAGGATTGATGGGAAGGGAGAAACCTTTACAGC	Amplification of upstream homologous arm incp40	622
cp40UP-R	ACTACTGGTAGTGCCTGCCCCTTCAAT
cp40DOWN-F	GCAGGCACTACCAGTAGTTTTCCTTTC	Amplification of downstream homologous arm incp40	615
cp40DOWN-R	CGCTTCCGTGCTGGTTGGGCCGGAAAATAAC
pEC-cp40-F	CGGCCCAACCAGCACGGAAGCGGAACACGTAGAAAG	Ring opening of the pEC-cp40gRNA plasmid	7 076
pEC-cp40-R	GTTTCTCCCTTCCCATCAATCCTGCCTATTTG
cp40-JD-F	AGAAACGTCACTAAGCTGCA	Screening forcp40 missing strains	2 540/ 1 400^#
cp40-JD-R	GGTCAAAGTTCAAGTCCAGG

Primer name	Sequence of primers (5′→3′)	Purpose	Product length (bp)
Underline indicates the restriction sites; Wavy line indicates the spacer; * indicates that if the construction of pEC-cp40gRNA plasmid is success, the amplified fragment is 593 bp, and the amplified fragment of pECXK99E empty vector is 471 bp;^# indicates that the amplified fragment of thecp40-deleted strain is 1 400 bp, and the amplified fragment of wild type strain is 2 540 bp.
cp40gRNA-F		cp40gRNA amplification	122
gRNA-R	CCCGTCGACCCTGGAAAAAAAGCAC
pECjd-F	CACTCCCGTTCTGGATAAT	Detect whether the pEC-cp40gRNA plasmid was successfully constructed	471/593*
pECjd-R	TCACCGACAAACAACAGATAA
cp40UP-F	CAGGATTGATGGGAAGGGAGAAACCTTTACAGC	Amplification of upstream homologous arm incp40	622
cp40UP-R	ACTACTGGTAGTGCCTGCCCCTTCAAT
cp40DOWN-F	GCAGGCACTACCAGTAGTTTTCCTTTC	Amplification of downstream homologous arm incp40	615
cp40DOWN-R	CGCTTCCGTGCTGGTTGGGCCGGAAAATAAC
pEC-cp40-F	CGGCCCAACCAGCACGGAAGCGGAACACGTAGAAAG	Ring opening of the pEC-cp40gRNA plasmid	7 076
pEC-cp40-R	GTTTCTCCCTTCCCATCAATCCTGCCTATTTG
cp40-JD-F	AGAAACGTCACTAAGCTGCA	Screening forcp40 missing strains	2 540/ 1 400^#
cp40-JD-R	GGTCAAAGTTCAAGTCCAGG

基于CRISPR/Cas9构建伪结核棒状杆菌cp40敲除株及其生物学特性与致病性研究

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吕红 ^# , 李鑫灿 ^# , 牛禄婷 , 王芝英 , 周作勇 ^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(7): 2453-2464

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(7): 2453-2464

基于CRISPR/Cas9构建伪结核棒状杆菌cp40敲除株及其生物学特性与致病性研究

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吕红^#, 李鑫灿^#, 牛禄婷, 王芝英, 周作勇^*

作者信息

西南大学动物医学院, 重庆 402460

Biological characteristics and pathogenicity ofCorynebacteriumpseudotuberculosiscp40-deleted strains constructed by CRISPR/Cas9

Hong LÜ, Xincan LI, Luting NIU, Zhiying WANG, Zuoyong ZHOU^*

Affiliations

College of Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460, China

出版时间: 2024-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230789

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摘要

收起

【目的】建立更高效的伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis, Cp)靶基因敲除方法，敲除丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40)，并评价其在Cp感染致病中的作用。【方法】以pECXK99E为载体，Cp宣汉株(XH02)cp40为靶基因，设计含CRISPR/Cas9的间隔序列(spacer)、导向RNA (guide RNA, gRNA)和cp40上下游同源臂的表达质粒(pEC-cp40gRNA-HDarm)，转入含pCas9gRNA-ccdB的Cp感受态细胞，构建CRISPR/Cas9基因编辑系统以敲除cp40基因。通过比较cp40敲除株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对J774A.1巨噬细胞活力及白细胞介素(interleukin, IL)-1β分泌，以及体内感染小鼠致死率及脏器载菌水平，研究cp40与该病原感染致病之间的关系。【结果】应用所建立的双质粒CRISPR/Cas9编辑系统成功获得XH02的cp40敲除株(XH02Δcp40)。与XH02相比，XH02Δcp40在菌落形态及生长曲线上无明显差异，但XH02Δcp40感染J774A.1巨噬细胞的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放(P=0.06)、碘化丙锭(propidium iodide, PI)染色比例均降低(P < 0.01)，体内感染小鼠致死率下降50%，并且被感染小鼠肝脏和肾脏中Cp含量显著降低(P < 0.001)。【结论】本研究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统可较高效敲除Cp基因，证实cp40是该病原感染致病相关基因，为后续基于该基因研究Cp感染致病机制奠定基础。

关键词

CRISPR/Cas9 / 伪结核棒状杆菌 / 丝氨酸蛋白酶 / 基因敲除 / 致病性

Abstract

收起

[Objective] To establish a more efficient knockout method for the serine protease coding gene (cp40) ofCorynebacteriumpseudotuberculosis and evaluate the role of this gene in the pathogenicity ofC.pseudotuberculosis. [Methods] A vector pEC-cp40gRNA-HDarm, with guide RNA, upstream and downstream sequences flankingcp40 ofC.pseudotuberculosis Xuanhan strain (XH02), and spacer, was constructed from pECXK99E. The recombinant vector pEC-cp40gRNA-HDarm was transferred intoC.pseudotuberculosis competent cells carrying pCas9gRNA-ccdB to form the CRISPR/Cas9 gene editing system for the deletion ofcp40. The roles ofcp40 in the pathogenicity ofC.pseudotuberculosis were evaluated by comparison of the colony morphology and growth curves between thecp40-deleted (Δcp40) strain and wild type (WT) strain, the viability and interleukin (IL)-1β secretion of J774A.1 macrophages infected with Δcp40 and WTinvitro, and the mortality and organ bacterial loads in mice infected with Δcp40 and WTinvivo. [Results] We successfully constructed thecp40-deleted strain XH02Δcp40 by using the established dual-plasmid CRISPR/Cas9 editing system. Compared with WT (XH02), XH02Δcp40 showed no obvious difference in the colony morphology or growth curve. However, the J774A.1 cells infected with XH02Δcp40 showed decreased lactate dehydrogenase (LDH) release (P=0.06) and propidium iodide (PI) staining ratio (P < 0.01) compared with those infected with XH02. The mortality of XH02Δcp40-infected mice reduced by 50% and the bacterial loads in the liver and kidney of XH02Δcp40-infected mice significantly reduced compared with those of XH02-infected mice (P < 0.001). [Conclusion] The CRISPR/Cas9 gene editing system established in this study can effectively deletecp40 ofC.pseudotuberculosis. The results confirm thatcp40 is a virulence-related gene, providing a foundation for subsequent research on the infection ofC.pseudotuberculosis based on this gene.

Key words

CRISPR/Cas9 / Corynebacteriumpseudotuberculosis / serine protease / gene deletion / pathogenicity

引用本文

吕红, 李鑫灿, 牛禄婷, 王芝英, 周作勇. 基于CRISPR/Cas9构建伪结核棒状杆菌cp40敲除株及其生物学特性与致病性研究. 微生物学报, 2024 , 64 (7) : 2453 -2464 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230789

Hong LÜ, Xincan LI, Luting NIU, Zhiying WANG, Zuoyong ZHOU. Biological characteristics and pathogenicity ofCorynebacteriumpseudotuberculosiscp40-deleted strains constructed by CRISPR/Cas9[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (7) : 2453 -2464 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230789

正文

收起

伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis, Cp)是重要的兼性胞内寄生人兽共患病原菌，主要引起羊体表及内脏器官脓肿和干酪性淋巴结炎，给羊养殖业带来严重的经济损失^[1]。同时该病原菌感染可引起人的淋巴结炎^[2-3]、嗜酸性肺炎^[4]等，对公共卫生安全构成潜在威胁。敲除毒力/假定毒力基因是研究Cp感染致病机理和制定防控措施的重要途径。目前，细菌基因敲除方式主要包括同源重组技术和CRISPR/Cas9编辑技术等^[5]。同源重组技术存在操作烦琐的不足，需要2轮筛选，并且需要引入抗生素抗性基因作为筛选标记等。本实验室前期利用同源重组技术部分敲除Cp宣汉株(XH02)磷脂酶D基因(pld)，发现敲除的速度慢、效率很低^[6]。因此，深入研究能够更高效敲除Cp靶基因的新方法显得尤为重要。CRISPR/Cas9是源于古细菌抵御噬菌体入侵的获得性免疫机制，能准确、高效地修改基因组中的特定位置，具有操作简单、效率高、作用靶点多等优势。通过将人工设计的引导RNA (guide RNA, gRNA)与Cas9结合，将其导向到靶向DNA序列上，Cas9便会切割该DNA序列，产生双链断裂位点，随后，细胞的自身修复机制介入，通过不同的修复途径，实现对靶基因的编辑^[5]。目前CRISPR/Cas9已在大肠杆菌(Escherichiacoli)^[7]、布氏杆菌^[8]、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)^[9]等原核生物中成功应用。本研究构建了CRISPR/Cas9基因编辑系统，成功获得Cp的丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40)敲除株，并对其生物学特性及致病性进行评价，为Cp的工程菌改造及致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

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1.1 主要试剂

LB肉汤、LB营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；小牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；Opti-MEM培养基购自Gibco公司；氯霉素、卡那霉素、pEASY^®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、2×TransFast^®Taq PCR SuperMix (+dye)和质粒小提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；IPTG、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；庆大霉素、碘化丙锭(propidium iodide, PI)购自北京索莱宝科技有限公司；PrimeSTAR高保真酶、DNA Ligation Kit和DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；鼠白细胞介素(interleukin, IL)-1β ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 试验动物及细胞

昆明系小鼠购自西南医科大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(渝) 2019-0003]，J774A.1巨噬细胞为本实验室保存。

1.3 菌株、质粒、培养基和抗生素

Cp宣汉株(XH02)和E.coli DH5α均由本实验室保存，E.coli Trans1-T1购自北京全式金生物技术股份有限公司。大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pECXK99E和pCas9gRNA-ccdB由中国科学院天津工业生物技术研究所孙际宾研究团队惠赠，pEC-cp40gRNA和pEC-cp40gRNA-HDarm由本研究构建。

LB平板：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0 g/L，配置时加入5%兔血。LB肉汤(g/L)：胰蛋白胨8.0 g/L，酵母浸粉2.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，含10%小牛血清和0.1%吐温80。

抗生素：氯霉素终浓度为20 mg/L，卡那霉素终浓度为50 mg/L。

1.4 PCR引物

根据GenBank公布的cp40 (OL347712.1)序列，用SnapGene软件设计引物(表1)，并送往北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.5 pEC-cp40gRNA质粒的构建

通过网站http://crispor.tefor.net/设计cp40的间隔序列(spacer)，并将间隔序列的20 bp序列连同EcoR I酶切位点加入引物cp40gRNA-F的5′端。以质粒pCas9gRNA-ccdB为模板，cp40gRNA-F和gRNA-R (5′端带有Sal I酶切位点)为引物，使用PrimeSTAR扩增cp40gRNA，凝胶电泳鉴定并回收PCR产物，以EcoR I和Sal I双酶切cp40gRNA和pECXK99E，用DNA Ligation Kit连接酶切后的cp40gRNA和pECXK99E质粒，连接产物化学转化至E.coli DH5α感受态细胞，小提质粒，用pECjd-F/R鉴定，将构建好的质粒命名为pEC-cp40gRNA (图1A)。

1.6 pEC-cp40gRNA-HDarm质粒的构建

以XH02基因组为模板，cp40UP-F/R和cp40 DOWN-F/R为引物，使用PrimeSTAR扩增cp40上、下游同源臂。以pEC-cp40gRNA为模板，pEC-cp40-F/R为引物扩增片段1，PCR反应体系(25 μL)：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。电泳鉴定、回收产物，用cp40UP-F和cp40DOWN-R为引物将cp40上、下游同源臂用Overlap PCR方法扩增连接，作为同源修复DNA模板，PCR产物经电泳鉴定、回收，用无缝克隆试剂盒连接片段1和同源修复DNA模板。连接产物化学转化至Trans1-T1感受态细胞，将构建好的质粒命名为pEC-cp40gRNA-HDarm (图1A)。

1.7cp40基因敲除及验证

参照文献[10]制备感受态细胞，将pCas9gRNA-ccdB电转化至XH02感受态细胞，涂布在含有氯霉素的LB平板上，再制备含pCas9gRNA-ccdB的感受态细胞(培养时加入终浓度为20 mg/L的氯霉素)。将pEC-cp40gRNA-HDarm电转化至带有pCas9gRNA-ccdB的感受态细胞，涂布在含有氯霉素、卡那霉素以及0.05 mmol/LIPTG的LB平板，37 ℃培养48 h。用引物cp40-JD-F和cp40-JD-R鉴定单克隆，并将其PCR产物送北京擎科生物科技股份有限公司测序验证(图1B)。

1.8 质粒的消除

将鉴定正确的cp40敲除株接种至LB肉汤中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h，传代5 d后分别涂布含有氯霉素和卡那霉素平板上，若在氯霉素和卡那霉素平板上均没有菌落长出，则证明pCas9gRNA-ccdB质粒和pEC-cp40gRNA-HDarm质粒均已被消除。

1.9 敲除cp40对Cp菌落形态及生长曲线的影响

将XH02和XH02Δcp40接种于LB平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落形态。挑取单克隆至1.5 mL LB肉汤，37 ℃、200 r/min培养18 h，调整OD₅₉₅为0.2，吸取100 μL菌液于30 mL LB肉汤中，37 ℃、200 r/min培养，每6 h测定一次OD₅₉₅值，绘制生长曲线。

1.10 体外试验评价敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力和IL-1β分泌影响

1.10.1 Cp感染J774A.1细胞LDH释放水平检测

取J774A.1接种于48孔板，2.5×10⁵细胞/孔，37 ℃培养过夜。将XH02和XH02Δcp40以感染复数为10 (MOI=10)侵染J774A.1，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的Opti-MEM培养基，培养12 h。根据LDH检测试剂盒说明书检测LDH释放水平。

1.10.2 Cp感染J774A.1细胞的碘化丙锭(PI)染色比例检测

将J774A.1接种于12孔细胞板，1×10⁶细胞/ 孔，37 ℃培养过夜。将XH02和XH02Δcp40以MOI=10侵染J774A.1细胞，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的DMEM培养液，培养12 h。弃上清，PBS洗2次后，加入100 μL稀释后的PI溶液(10 μg/mL)，37 ℃培养10 min后再以PBS洗2次，加入50 μL抗荧光淬灭封片液(含DAPI)。参考文献[11]的方法，通过荧光显微镜拍照，每组随机选择6个视野，统计细胞总数和PI染成红色的细胞数，计算PI染色细胞百分比：PI染色细胞百分比=PI染成红色的细胞数/细胞总数×100%。判断敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞膜损伤影响情况。

1.10.3 Cp感染J774A.1细胞IL-1β分泌水平检测

将J774A.1接种于12孔细胞板，1×10⁶细胞/孔，37 ℃培养过夜。用XH02和XH02Δcp40按MOI=10侵染J774A.1细胞，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的DMEM培养液，培养24 h。收集细胞上清，用IL-1β检测试剂盒检测IL-1β分泌水平。

1.11 体内感染试验评价敲除cp40对Cp感染小鼠致病性及脏器载菌水平的影响

1.11.1 生存曲线试验

将24只昆明系小鼠[体重(18±2) g]随机均分为3组(XH02组、XH02Δcp40组和PBS对照组)，每组8只。以PBS将菌液稀释为8×10⁷ CFU/mL，感染组小鼠分别腹腔注射XH02或XH02Δcp40菌液(0.2 mL/只)，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS。在注射后记录14 d内小鼠的死亡情况，绘制生存曲线。

1.11.2 脏器载菌量试验

将9只昆明系小鼠[体重(25±1) g]随机均分为XH02组、XH02Δcp40组和PBS对照组，每组3只。以PBS将菌液稀释为8×10⁷ CFU/mL，感染组小鼠分别腹腔注射XH02或XH02Δcp40菌液(0.2 mL/只)，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS。参考文献[6]的方法，于感染后72 h无菌摘取小鼠的肝脏、脾脏和肾脏，加入灭菌PBS，用匀浆机充分匀浆，以PBS稀释涂板计数。

1.12 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0.1作图，以双尾非配对t检验统计分析。试验结果用平均数±标准误(x±SE)表示。P < 0.05为差异显著。

2 结果与分析

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2.1cp40敲除结果

成功构建出pEC-cp40gRNA和pEC-cp40gRNA-HDarm，DNA扩增片段证实所构建质粒正确(图2、图3)。挑取单个菌落进行PCR鉴定，XH02野生株的PCR扩增条带为2 540 bp，而XH02Δcp40敲除株PCR扩增条带为1 400 bp (图4)。在所挑取的33个单菌落中，有4个菌落PCR扩增条带符合预期，敲除效率为12.12% (4/33)。测序比对证实成功敲除了XH02的cp40全部序列。

2.2 XH02、XH02Δcp40菌落形态及生长曲线的测定

在LB平板上，XH02和XH02Δcp40均为圆形、乳白色、干燥菌落，无明显差异(图5A、5B)。生长曲线测定显示，XH02与XH02Δcp40在液体培养基中生长状态基本一致(图5C)。

2.3 敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力的影响

本研究检测XH02、XH02Δcp40感染J774A.1的LDH释放情况及PI染色的细胞比例，评价敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力的影响。与XH02感染细胞相比，XH02Δcp40感染J774A.1细胞的LDH释放水平下降(图6A)，PI染色的细胞百分比显著降低(图6B)。

2.4 敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞IL-1β分泌水平的影响

Cp感染巨噬细胞后可引起促炎细胞因子IL-1β的分泌水平升高，本研究评价了敲除cp40对Cp感染J774A.1分泌IL-1β水平的影响。结果显示，与XH02感染细胞相比，XH02Δcp40感染J774A.1细胞的IL-1β分泌水平显著降低(图7)。

2.5 敲除cp40对Cp体内感染小鼠生存曲线和脏器载菌量的影响

致病力试验显示，XH02感染组小鼠在注射后第2天出现死亡，在14 d内死亡率达到75% (6/8)，而XH02Δcp40组仅在感染后第3天和第4天各死亡1只，死亡率为25%，相较于XH02组，XH02Δcp40组小鼠死亡率下降50% (图8A)。脏器载菌量检测显示，除了脾脏载菌量无显著差异外，XH02Δcp40感染小鼠肝和肾的载菌量均显著低于XH02感染小鼠(图8B−8D)。

3 讨论与结论

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3.1 构建Cp靶基因敲除的CRISPR/Cas9编辑系统需要同源修复模板

CRISPR/Cas9以其高效的基因编辑效率广泛应用于真核和原核生物中，在gRNA和Cas9蛋白的参与下，待编辑的DNA将被看作病毒或外源DNA，进而被精确剪切。在谷氨酸棒状杆菌中，已有基于CRISPR/Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR/Cas9和ReCT的耦合重组系统等，可快速、高效、无痕敲除多个基因^[9,12-14]，这为同为棒状杆菌属微生物的Cp靶基因敲除提供了参考。与经典的同源重组技术敲除Cp基因需要2次筛选和效率低相比，CRISPR/Cas9编辑技术只需要一次筛选，并且具有较高的敲除效率。由于谷氨酸棒状杆菌缺乏有效的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复途径，不能很好地修复因Cas9切割产生双链断裂(double stand breaks, DSB)^[14-15]，推测在Cp中可能没有NHEJ修复途径。因此，本研究后续构建CRISPR/Cas9编辑系统时，采用同源重组(homology-directed repair, HR)进行修复。构建CRISPR/Cas9编辑系统有多种方案，可以将Cas9、gRNA和同源修复模板置于一个质粒或不同的质粒上，也可通过外源提供单链DNA (single stranded DNA, ssDNA)修复模板^[9]。在试验前期，本研究尝试将Cas9和gRNA设计在同一载体上，修复模板置于另一载体上，但由于在Cp中Ptac启动子控制下的Cas9泄漏表达导致获得的转化子数很少，未筛选到敲除株，因此改为将gRNA和同源修复模板置于同一载体上。最终以pCas9gRNA-ccdB为表达Cas9的载体，以大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pECXK99E为载体骨架，构建pEC-cp40gRNA-HDarm以提供引导Cas9切割的cp40gRNA和切割后修复基因组的上、下游同源臂HDarm，成功建立了敲除cp40的CRISPR/Cas9双质粒编辑系统。

3.2 关于CRISPR/Cas9编辑系统对Cp靶基因敲除效率的探索

本研究前期曾探究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统对Cp的pld基因敲除效率较经典同源重组技术是否有提升，发现在0.05 mmol/L IPTG诱导下pld基因的敲除效率为3.0%，远高于实验室前期以经典同源重组敲除pld的效率(< 0.1%，数据未展示)，但低于同样以双质粒模型进行谷氨酸棒状杆菌基因敲除的效率(16.7%−83.3%)^[16]，也低于用单质粒模型的敲除效率(55.1%−91.3%)^[9]。影响该系统编辑效率的因素主要考虑为PAM位点、gRNA设计、IPTG浓度以及同源臂的长度^[16]。在cp40敲除中我们提升了IPTG浓度到0.05 mmol/L，发现诱导得到的转化子数明显减少，编辑效率得到了提高，达到12.12%。若要对编辑效率进一步优化可以尝试增加同源臂长度、更换gRNA和PAM位点等。

3.3cp40在Cp感染致病中的作用

cp40编码丝氨酸蛋白酶CP40，该蛋白是Cp中研究最多的蛋白之一，但这些研究主要是表达获得CP40重组蛋白或融合蛋白制备疫苗进行免疫保护研究^[17-18]，尚无明确证据直接表明该蛋白是Cp的毒力因子。有文献报道，丝氨酸蛋白酶在肺炎球菌的黏附、定殖和扰乱宿主细胞免疫中发挥着至关重要的作用^[19]。此外，丝氨酸蛋白酶是幽门螺杆菌重要的毒力因子，可扰乱胃上皮细胞，使幽门螺杆菌能够跨上皮迁移^[20]。Cp为一种兼性胞内寄生菌，可引起内脏器官脓肿、干酪性淋巴结炎、嗜酸性肺炎等炎性病变^[1-4]，该病原菌感染巨噬细胞的特征之一是引起促炎细胞因子IL-1β分泌增加^[21]。本研究发现，敲除cp40基因后，Cp感染巨噬细胞促炎因子IL-1β的分泌水平显著下降，提示cp40在Cp感染促炎中发挥作用。Cp感染可造成巨噬细胞死亡，其特征为LDH释放增加^[6]。本研究发现，敲除cp40的Cp感染巨噬细胞LDH释放水平降低，由于LDH释放与死亡或受损细胞数量成正比^[22]，提示cp40与该病原菌感染引起巨噬细胞死亡有关。同时，本研究还通过PI染色观察评价敲除cp40对Cp感染损伤巨噬细胞的影响，PI是一种不渗透膜的红色荧光染料，可穿透受损的细胞染色DNA，PI染色细胞比例常被认为是细胞膜受损的指标^[23]，结果显示敲除cp40的Cp感染巨噬细胞后，PI染色细胞比例显著低于野生株，进一步证实敲除cp40可降低Cp对被感染巨噬细胞的致病力。综上所述，本研究发现被感染巨噬细胞LDH释放和PI染色细胞比例均低于野生株，提示CP40与Cp感染损伤巨噬细胞有关。此外，本研究发现，XH02Δcp40体内感染小鼠存活率高于XH02感染小鼠，被XH02Δcp40感染小鼠肝、肾的脏器载菌量显著减少，提示缺失敲除cp40可降低Cp对肝、肾的入侵，降低Cp对小鼠的致病力，证实CP40是Cp的毒力因子之一，但该蛋白在Cp感染过程如何促进其致病的详细机制有待于进一步研究。

综上，本研究基于CRISPR/Cas9技术在Cp中成功构建cp40敲除菌株，为该病原菌其他毒力基因敲除及功能研究提供了技术储备。同时，证实cp40是Cp致病相关基因，为深入探究cp40感染致病作用机制奠定了基础。

基金

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重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxmX0884)
重庆市现代农业产业技术体系(CQMAITS202313)
中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2020B016)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

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2024年第64卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230789

接收时间：2023-12-21
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-07-04

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收稿日期：2023-12-21
录用日期：2024-03-20

基金

Natural Science Foundation of Chongqing(cstc2021jcyj-msxmX0884)

重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxmX0884)

Chongqing Modern Agricultural Industry Technology System(CQMAITS202313)

重庆市现代农业产业技术体系(CQMAITS202313)

Fundamental Research Funds for the Central Universities(XDJK2020B016)

中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2020B016)

作者信息

西南大学动物医学院, 重庆 402460

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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