微生物学报

Primer name	Sequences (5′→3′)
The underlined sections represent the restriction sites forNde Ⅰ andXho Ⅰ.
NCasn5-F	TAAGAAGGAGATATACATATGGAATTGATGGATAAGATACTAGTTGTTTTAACTGGAG
NCasn5-R	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAATTCCTCATAATACATTGTGTTGTTTATATC

Primer name	Sequences (5′→3′)
The underlined sections represent the restriction sites forNde Ⅰ andXho Ⅰ.
NCasn5-F	TAAGAAGGAGATATACATATGGAATTGATGGATAAGATACTAGTTGTTTTAACTGGAG
NCasn5-R	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAATTCCTCATAATACATTGTGTTGTTTATATC

Type	Source	Optimum pH	Optimum temperature (℃)	K_m (mmol/L)	Specific activity (U/mg)	Application	References
–: None or not mentioned in the literature.
Unknown	Nycticebus pygmaeus faecal metagenome	8.0	60	3.33±0.21	645.73	69.35	QGY-7703, A-375	This study
	Enterobacter cloacae	7.0–8.0	35–40	1.58	105.07	–	HL60, MOLT4, MDAMB231, T47D	[34]
	Palaeococcus ferrophilus	8.5	95	5.00	1 631.00	79.00	–	[35]
Ⅰ	Fish gut microbiome	8.0	30	3.01	478.81	63.00	K562, MCF7	[21]
	Acinetobacter soli	8.0	40	3.22	400.00	55.90	–	[36]
	Mycobacterium gordonae	9.0	50	6.03	486.65	65.09	–	[37]
	Thermococcus zilligii	8.5	90	6.08	5 278.00	80.50	–	[38]
Ⅱ	Soil metagenome	7.0	35	2.00	696.00	–	HL60, MOLT3, MOLT4	[20]
	Caspian Sea metagenome	7.5	–	0.15	100.00	–	Jurkat	[19]
	Bacillus velezensis	7.5	37	0.04	31.77	–	MDAMB231, MCF7	[12]
	Bacillus licheniformis	6.5	37	49.99	36.08	–	HepG2, MCF7	[39]
	Geobacillus kaustophilus	8.5	55	0.49	250.60	–	Hep3B, HCC SNU387	[40]
	Melioribacter roseus	9.3	70	1.40	1 530.00	–	K562, Jurkat, LnCap, SCOV-3	[41]
	Corynebacterium glutamicum	9.0	45	4.66	1 979.08	84.00	–	[42]
	Cobetia amphilecti	7.0	60	2.05	778.00	81.93	–	[9]
	Pseudomonas sp. PCH182	8.5	45	0.52	41.50	73.00	–	[10]
	Aquabacterium sp. A7-Y	9.0	60	1.80	458.90	88.20	–	[43]

Type	Source	Optimum pH	Optimum temperature (℃)	K_m (mmol/L)	Specific activity (U/mg)	Application	References
–: None or not mentioned in the literature.
Unknown	Nycticebus pygmaeus faecal metagenome	8.0	60	3.33±0.21	645.73	69.35	QGY-7703, A-375	This study
	Enterobacter cloacae	7.0–8.0	35–40	1.58	105.07	–	HL60, MOLT4, MDAMB231, T47D	[34]
	Palaeococcus ferrophilus	8.5	95	5.00	1 631.00	79.00	–	[35]
Ⅰ	Fish gut microbiome	8.0	30	3.01	478.81	63.00	K562, MCF7	[21]
	Acinetobacter soli	8.0	40	3.22	400.00	55.90	–	[36]
	Mycobacterium gordonae	9.0	50	6.03	486.65	65.09	–	[37]
	Thermococcus zilligii	8.5	90	6.08	5 278.00	80.50	–	[38]
Ⅱ	Soil metagenome	7.0	35	2.00	696.00	–	HL60, MOLT3, MOLT4	[20]
	Caspian Sea metagenome	7.5	–	0.15	100.00	–	Jurkat	[19]
	Bacillus velezensis	7.5	37	0.04	31.77	–	MDAMB231, MCF7	[12]
	Bacillus licheniformis	6.5	37	49.99	36.08	–	HepG2, MCF7	[39]
	Geobacillus kaustophilus	8.5	55	0.49	250.60	–	Hep3B, HCC SNU387	[40]
	Melioribacter roseus	9.3	70	1.40	1 530.00	–	K562, Jurkat, LnCap, SCOV-3	[41]
	Corynebacterium glutamicum	9.0	45	4.66	1 979.08	84.00	–	[42]
	Cobetia amphilecti	7.0	60	2.05	778.00	81.93	–	[9]
	Pseudomonas sp. PCH182	8.5	45	0.52	41.50	73.00	–	[10]
	Aquabacterium sp. A7-Y	9.0	60	1.80	458.90	88.20	–	[43]

粪便微生物宏基因组来源L-天冬酰胺酶的性质表征及应用研究

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梁师思 ¹ , 夏娆 ¹ , 高艳 ¹ , 蒋海波 ¹ , 张呈波 ² , 黄遵锡 ¹^,²^,³ , 许波 ¹^,²^,³^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(7): 2539-2553

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(7): 2539-2553

粪便微生物宏基因组来源L-天冬酰胺酶的性质表征及应用研究

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梁师思¹, 夏娆¹, 高艳¹, 蒋海波¹, 张呈波², 黄遵锡¹^,²^,³, 许波¹^,²^,³^,^*

作者信息

1 云南师范大学生命科学学院, 云南昆明 650500

2 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心, 云南昆明 650500

3 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室, 云南昆明 650500

Characterization and application of an L-asparaginase derived from the metagenome of fecal microbiota

Shisi LIANG¹, Rao XIA¹, Yan GAO¹, Haibo JIANG¹, Chengbo ZHANG², Zunxi HUANG¹^,²^,³, Bo XU¹^,²^,³^,^*

Affiliations

1 School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650500, Yunnan, China

2 Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, Kunming 650500, Yunnan, China

3 Key Laboratory of Yunnan for Biomass Energy and Biotechnology of Environment, Kunming 650500, Yunnan, China

出版时间: 2024-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240007

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摘要

收起

L-天冬酰胺酶是氨基酸代谢的关键酶，广泛应用于食品和医药领域，肠道菌群及其产生的L-天冬酰胺酶与宿主健康和疾病关系密切。【目的】获取肠道微生物来源的新型L-天冬酰胺酶，并对其进行性质表征和应用研究。【方法】以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组为模板，克隆L-天冬酰胺酶基因，并在大肠杆菌中表达；对表达出的酶进行酶学性质研究，并用于处理薯条和癌细胞。【结果】克隆获得L-天冬酰胺酶基因NCasn5，全长996 bp，重组酶NCasn5分子量大小为37.296 kDa，最适pH为8.0，最适温度为60 ℃，K_m和V_max值分别为(3.33±0.21) mmol/L和(836.30±13.91) µmol/(min·mg)，37 ℃体外血清半衰期约69 h。NCasn5能降低薯条中69.35%的丙烯酰胺含量，抑制人肝癌细胞QGY-7703和人恶性黑色素瘤细胞A-375细胞的生长。【结论】本研究获得的新型L-天冬酰胺酶，具有良好的热稳定性和较长的血清半衰期，不仅无谷氨酰胺酶活性，还能减少油炸薯条中丙烯酰胺的含量，也能诱导癌细胞QGY-7703和A-375凋亡，在食品加工及医药领域具有潜在的应用价值。

关键词

L-天冬酰胺酶 / 粪便微生物宏基因组 / 丙烯酰胺抑制 / 抗肿瘤活性

Abstract

收起

L-asparaginase, a key enzyme in amino acid metabolism, is widely used in the food and pharmaceutical industries. The gut microbiota and its product L-asparaginase are closely associated with host health and diseases. [Objective] This study aims to acquire a novel L-asparaginase gene from gut microbiota and explore its enzymatic characteristics and potential applications. [Methods] An L-asparaginase gene was cloned from the metagenome of the fecal microbiota ofNomascus concolor and heterologously expressed inEscherichia coli BL21(DE3). The enzymatic properties of the expressed protein were determined. Furthermore, the potential applications of this protein were explored, including processing potato chips and treating cancer cells. [Results] The cloned L-asparaginase gene,NCasn5, was 996 bp. It encoded the recombinant enzyme NCasn5 with a molecular weight of 37.296 kDa, optimal activity at pH 8.0 and 60 ℃,K_m of (3.33±0.21) mmol/L,V_max of (836.30±13.91) µmol/(min·mg), and a serum half-life of about 69 hin vitro at 37 ℃. NCasn5 reduced the acrylamide content in potato chips by 69.35% and inhibited the growth of human liver cancer cells (QGY-7703) and human melanoma cells (A-375). [Conclusion] We obtained a novel L-asparaginase demonstrating good thermal stability and a prolonged serum half-life. This enzyme lacks the glutaminase activity and reduces acrylamide levels in potato chips. Moreover, it can induce apoptosis in the cancer cell lines QGY-7703 and A-375. These findings suggest the potential applicability of L-asparaginase in both food processing and pharmaceutical industries.

Key words

L-asparaginase / metagenome of fecal microbiota / acrylamide mitigation / antitumor activity

引用本文

梁师思, 夏娆, 高艳, 蒋海波, 张呈波, 黄遵锡, 许波. 粪便微生物宏基因组来源L-天冬酰胺酶的性质表征及应用研究. 微生物学报, 2024 , 64 (7) : 2539 -2553 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240007

Shisi LIANG, Rao XIA, Yan GAO, Haibo JIANG, Chengbo ZHANG, Zunxi HUANG, Bo XU. Characterization and application of an L-asparaginase derived from the metagenome of fecal microbiota[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (7) : 2539 -2553 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240007

正文

收起

L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, L-ASNase, E.C 3.5.1.1)是氨基酸代谢途径的关键酶，影响赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的生物合成^[1]。其水解L-天冬酰胺(L-asparagine, L-Asn)的过程分为两个阶段，首先，酶活性中心的Thr对底物酰胺键上的碳原子进行亲核攻击，形成共价酶-底物酰基中间体并生成氨(NH₃)，随后在水分子的攻击下释放L-天冬氨酸(L-aspartic acid, L-Asp)^[2]。在尿素循环中L-Asp与精氨酸共同作用生成尿素和富马酸，后者进入三羧酸循环，因此L-ASNase在维持细胞内氮平衡和能量代谢方面具有重要意义^[3]。

L-ASNase广泛存在于细菌、古菌和真核生物，细菌L-ASNase主要来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和放线菌属(Actinomycetes)等^[4]。基于结构及理化性质差异，细菌L-ASNase分为Ⅰ、Ⅱ两型，L-ASNase Ⅰ的拓扑结构类似环形，在细胞质中表达，对底物L-Asn的亲和力较低，无抗肿瘤活性，仅应用于食品加工中^[5-7]。如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) Ⅰ型L-ASNase能降低样品中58.39%的丙烯酰胺含量^[8]。L-ASNase Ⅱ的拓扑结构高度对称，类似球形，经分泌途径转运至细胞周质空间表达，由于其对底物L-Asn的亲和力更高，可用于食品加工与医药领域^[2]。来源于大肠杆菌(Escherichia coli)和菊花迪克氏菌(Dickeya chrysanthemi) L-ASNase的K_m极低(0.010−0.012 mmol/L)，已被用于治疗淋巴细胞白血病^[5]；海绵科贝特氏菌(Cobetia amphilecti)^[9]和假单胞菌(Pseudomonas sp.) PCH182^[10]等Ⅱ型L-ASNase也可抑制食品丙烯酰胺的生成。

当前，L-ASNase的研究主要集中于环境微生物新酶基因的筛选、酶的高效表达、结构性质探究和酶的改造及应用。通过常规分离培养，已从海洋、盐湖及土壤等环境中筛选到产生L-ASNase的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)^[11]、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)^[12]、链霉菌(Streptomyces spp.)^[13]等。为实现大规模生产，研究者利用深层发酵、固态发酵提高酶的生产效率，Plackett-Burman设计法、人工神经网络和响应面法等优化生产参数，以及重组DNA技术提高酶的表达量^[4]。大多数细菌L-ASNase为同源四聚体，该结构由两个紧密相连的二聚体组成；每个亚基通过约20−25个氨基酸残基的连接子，将一个较大的N-末端(约195个氨基酸残基)和一个较小的C-末端(约120个氨基酸残基)相连；在N-末端附近有一个活性位点柔性环，是L-ASNase的催化核心^[6]。研究表明许多L-ASNase在pH 6.0−9.5活性较高，最适反应温度为30−60 ℃^[1]。在应用方面，L-ASNase主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、肝癌、黑色素瘤等疾病^[14]。此外，L-ASNase还能降低食品中L-Asn的含量，减少潜在致癌物丙烯酰胺的生成，被用于烘焙、烤制和油炸含淀粉食品中丙烯酰胺的去除^[15]。目前L-ASNase面临的主要挑战包括L-谷氨酰胺酶活性引起的副作用(超敏反应、神经毒性及高氨血症等)及在血液系统中较短的半衰期。此外，该酶窄的pH范围和热不稳定性限制了它在食品领域的应用^[7]。尽管研究者应用化学修饰(聚乙二醇化和糖基化等)、生物酶工程策略(定点突变、定向进化、融合蛋白连接体等)以及固定化技术(交联、物理包封和共价结合等)对其进行改造^[16]，但优化效果仍依赖于酶分子本身的特性^[17]。因此需要不断探索新的L-ASNase来源，以期发现具有更优稳定性和较少副作用的酶。

宏基因组技术避开微生物的分离培养，有助于从环境样本中发现新型L-ASNase，近年来研究者开始关注环境微生物宏基因组来源的L-ASNase。2018年，Haldar等^[18]分析红树林沉积物宏基因组发现，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)和依利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)能产生L-ASNase。Sobat等^[19]和Arjun等^[20]分别从里海和土壤微生物组中获得能抑制癌细胞增殖的L-ASNase。2022年，Johny等^[21]从鱼肠道宏基因组中获得L-ASNase SlpA，不仅能抑制癌细胞增殖，还能降低食品中丙烯酰胺的含量。

厌氧肠道环境定殖有丰富的微生物群落，通过分离培养已获得具有新特征或改良特性的L-ASNase，如霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)能产耐盐和高温的L-ASNase^[22]；唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)能高产底物专一性强的L-ASNase^[23]；Actinomycete LA-29的L-ASNase能有效抑制大鼠白血病细胞的生长^[24]。此外，肠道菌群来源的L-ASNase与宿主健康关系密切。例如，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)胞外囊泡富含ASNase，影响宿主细胞的生物合成途径并维持胃肠道稳态^[25]；嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)促进肠道向肝脏运输L-Asp的水平，从而改善异常的胆汁酸代谢^[26]。

因此，发现并鉴定肠道微生物来源的L-ASNase，对肠道菌群与宿主健康和疾病关系的深入研究具有重要意义，同时为食品和医药领域新型L-ASNase的开发提供酶及基因资源。前期宏基因组功能注释发现，西黑冠长臂猿(Nomascus concolor)粪便样本中氨基酸生物合成相关基因丰度较高，因此从中筛选、克隆和异源表达L-ASNase，并对其进行酶学性质和功能表征。

1 材料与方法

收起

1.1 样品、菌株和细胞

西黑冠长臂猿粪便宏基因组DNA和pEASY-E2表达载体本实验室保存。QGY-7703 (人肝癌细胞)和A-375 (人恶性黑色素瘤细胞)购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂

商业L-ASNase (Acrylaway^®)购自Novozymes Investment Co Ltd.；底物、Nessler试剂和三氯乙酸购自上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清购自伊娃(苏州)生物医药科技有限公司；C18柱购自湖南比克曼生物科技有限公司；PCR引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 序列分析

从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组文库中筛选含有完整序列的L-ASNase基因NCasn5。使用ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质理化性质；BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比较氨基酸序列相似性；MEGA 6.0构建系统发育进化树；ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行多序列对比。

1.4 天冬酰胺酶基因的克隆

西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA采用QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN公司)提取，并以此为模板扩增目的基因NCasn5，引物设计如表1所示。

NCasn5的PCR反应体系：DNA模板5 μL，Ex Taq (5 U/μL) 0.5 μL，NCasn5-F (10 µmol/L) 1.5 μL，NCasn5-R (10 µmol/L) 1.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，ddH₂O补足50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。

1.5 载体构建及重组酶的表达

PCR产物与pEASY-E2载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组体BL21(DE3)/NCasn5，并测序验证。重组体在含100 μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中37 ℃、180 r/min培养12 h活化，随后取2 mL转入200 mL同条件的培养基培养至OD₆₀₀为0.5−0.7。加入终浓度0.5 mmol/L IPTG在25 ℃、180 r/min下诱导20 h后，菌体用50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)悬浮，150 W超声波破碎。在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min后的上清经Ni-NTA柱纯化，用12% SDS-PAGE分析目标蛋白。

1.6 重组天冬酰胺酶活性测定

采用Nessler试剂测定重组酶的酶活力。首先制备200 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和200 μL 200 mmol/L L-Asn混合液，37 ℃孵育5 min后加入50 μL稀释酶液(0.25 mg/mL)，继续反应10 min，再加入50 μL 1.5 mol/L三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)终止反应，4 ℃、12 000 r/min离心10 min后，收集200 μL上清液与1.2 mL双蒸水(ddH₂O)混合制得待显色样品。最后加入100 μL Nessler试剂静置10 min后测定OD₄₅₀值。一个酶活单位(U)定义为在1 min内催化生成1 μmol氨的酶量。

1.7 重组天冬酰胺酶酶学性质分析

1.7.1 最适pH及pH稳定性测定

为了确定重组酶的最适pH，在pH 4.0−11.0的不同缓冲液(pH 4.0−6.0：0.5 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 7.0−8.0：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液；pH 9.0−11.0：0.5 mol/L甘氨酸-氢氧化钠溶液)中测试其催化活性，以最适pH下的酶活定义为100%。此外，为了评估酶的pH稳定性，将重组酶置于缓冲液(pH 5.0−11.0)中37 ℃孵育1 h，以未处理的酶液作为对照，在最适反应条件下测试其酶活，将对照组的酶活定义为100%。

1.7.2 最适温度及温度稳定性测定

为确定重组酶的最适温度，在30−70 ℃下测试其酶活力。为了测试温度稳定性，将酶分别置于30、35、40、45、50、55、60 ℃中孵育1 h，以0 min的酶活为对照，于最适反应条件下测定相对酶活力。

1.7.3 底物特异性及动力学参数测定

在最适条件下，以终浓度为200 mmol/L的L-天冬酰胺(L-Asn)、d-天冬酰胺(d-asparagine, d-Asn)、L-谷氨酰胺(L-glutamine, L-Gln)、L-天冬氨酸(L-Asp)、d-天冬氨酸(d-aspartic acid, d-Asp)、L-谷氨酸(L-glutamic acid, L-Glu)和d-谷氨酸(d-glutamic acid, d-Glu)作为底物，分析其底物特异性活力。此外，以2−40 mmol/L的L-Asn作为底物，于最适反应条件下测试酶活力，利用GraphPad Prism 5计算米氏常数(K_m)及最大反应速度(V_max)值。

1.8 体外血清半衰期测试

将L-ASNase与2.4 mL动物血清混合，用力摇匀，在水浴锅中37 ℃孵育，每隔12 h测一次酶活力。

1.9 重组天冬酰胺酶处理对薯条中丙烯酰胺含量的影响

1.9.1 样品处理

新鲜马铃薯清洗、去皮，切成0.5 cm×0.5 cm×7 cm条状，用ddH₂O冲洗表面淀粉。在样品中分别加入0−50 U/mL NCasn5和商业酶L-ASNase，35 ℃孵育30 min，以加ddH₂O处理的样品作为对照。处理结束后用ddH₂O洗净酶液，60 ℃烘干20 min，160 ℃油炸3 min后室温冷却，用纸巾吸取表面油脂后备用。

1.9.2 样品中丙烯酰胺的提取及检测

参考郝亚楠等^[27]方法，称取1 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇混合均匀后，8 000 r/min离心15 min，收集上清液，此步骤共重复3次。吸取5 mL上清液先过0.45 μm聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride, PVDF)滤膜，再过预活化的C18柱(先后用2 mL甲醇和2 mL ddH₂O洗柱)，弃去前0.5 mL滤液，余液用于分析测定，并进行独立样本t检验(α=0.05)。

1.10 重组天冬酰胺酶抑制癌细胞增殖

1.10.1 细胞培养

QGY-7703和A-375细胞分别用含有10%新生牛血清(newborn bovine serum, NCS)、1% L-Gln、10%青霉素和10%链霉素溶液的RPMI-1640和DMEM完全培养基在37 ℃、5% CO₂培养箱(Eppendorf公司)中培养。

1.10.2 MTT法测试NCasn5对细胞的毒性

参考Ameen等^[28]方法，略有改动。将5×10⁴个细胞接种至96孔板中，贴壁后用2−10 U/mL的NCasn5处理24 h。弃去培养基后用PBS清洗2遍，加入20 μL的MTT染料(5 mg/mL)及180 μL培养基继续培养4 h。移除液体，加入100 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)后置摇床上缓慢摇匀10 min溶解结晶，用酶标仪在490 nm处测定其光吸收值，计算细胞的存活率，采用t检验进行数据分析(α=0.05)。

1.10.3 DAPI荧光染色的细胞核形态

为探究NCasn5对细胞凋亡的作用，在24孔板中培养约1.5×10⁵个细胞，并用2−10 U/mL浓度的NCasn5处理后在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。用PBS (pH 7.0)洗涤，再用4%多聚甲醛固定细胞10 min，0.1% Triton X-100和PBS洗涤各3次。加入1.25 μg/mL 4′, 6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸(4′, 6-diamino-2-phenylindole dihydrochloric acid, DAPI)染色10 min，在倒置荧光显微镜(放大100倍)下观察拍照。

2 结果与分析

收起

2.1 序列分析

从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中筛选获得L-ASNase基因NCasn5，编码331个氨基酸，理论分子量为37.296 kDa，等电点为5.18。BLAST结果显示，与NCasn5氨基酸序列相似度最高的依次是真杆菌(Eubacterium sp.) (MBS4868370)、梭菌(Clostridia bacterium) (MDO4300458)和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium) (MBR5799555)的L-ASNase，序列相似性分别为80.36%、63.25%和46.61%，上述序列均来自动物胃肠道宏基因组测序数据，尚无相关研究报道。选取不同细菌来源的L-ASNase氨基酸序列构建系统进化树(图1)，其中第1个和第2个分支分别为Ⅱ型和Ⅰ型L-ASNase，而NCasn5与上述3个L-ASNases以100%置信度单独聚为一个分支。此外，多序列对比发现(图2)，虽然NCasn5与其他L-ASNase具有多个保守区域，如T-G-G-T-I、H-G-[ST]-D-T和P-V-V，然而，第26、88和159位点的关键催化氨基酸残基并不同。因此，NCasn5可能属于新型的L-ASNase。

2.2 天冬酰胺酶基因的克隆与表达

以西黑冠长臂猿粪便微生物基因组为模板扩增得到NCasn5基因(GenBank登录号：OR905595)，琼脂糖凝胶电泳检测显示条带大小约1 000 bp，符合理论值996 bp (图3A)。将目的基因与pEASY-E2载体连接，构建重组质粒pEASY-E2/NCasn5，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达后获得NCasn5粗酶，经Ni-NTA Agarose纯化后，在12% SDS-PAGE下分析，NCasn5的分子量在29.0−44.3 kDa之间，与理论值相符(图3B)。

2.3 重组天冬酰胺酶NCasn5的酶学性质表征

2.3.1 pH及温度对NCasn5的影响

研究表明，NCasn5最适pH值为8.0 (图4A)，随pH值增加酶活性逐渐下降。在pH 5.0−11.0孵育1 h后测定重组酶的稳定性发现(图4B)，NCasn5在较宽的pH范围内(pH 5.0−10.0)均保持70%以上酶活力，稳定性较好。

NCasn5最适温度为60 ℃，在40−60 ℃条件下保持70%以上的酶活，而在65−70 ℃条件下酶活力不足40% (图4C)。温度稳定性研究表明，NCasn5在中至较高温度范围内表现出良好的稳定性，在30−55 ℃下保温1 h后仍保持90%左右酶活力，但在60 ℃时酶活力急速下降(图4D)。

2.3.2 底物特异性和动力学参数

纯化后的NCasn5对L-Asn有最高特异性，酶活为162.13 U/mL，比活力为645.73 U/mg；对d-Asn、L-Asp、d-Asp、L-Gln、L-Glu和d-Glu均无活性。使用GraphPad Prism 5计算其K_m和V_max值分别为(3.33±0.21) mmol/L和(836.3±13.91) µmol/(min·mg)。

2.3.3 体外血清半衰期

NCasn5在37 ℃血清中孵育约12 h，其相对酶活力维持在约90%。随着孵育时间的延长，酶活力逐渐下降，在孵育约69 h后下降至初始活性的50% (图5)。

2.4 NCasn5对炸薯条中丙烯酰胺含量的影响

用不同浓度的NCasn5和商业酶处理后，薯条中的丙烯酰胺含量与对照组相比显著降低(P < 0.05)，并随着酶浓度的增加，呈现先下降后平缓的趋势(图6)。在10−40 U/mL范围内，NCasn5与同等浓度的商业酶相比有显著差异(P < 0.05)。NCasn5处理后的丙烯酰胺含量分别降低了27.76%、48.78%、57.30%和64.83%；经相同浓度的商业酶处理后，丙烯酰胺降解率分别为52.92%、66.86%、72.17%和73.34%。而将酶浓度提高至45 U/mL和50 U/mL时，两种酶的降解率差异不再显著。NCasn5和商业酶处理后的丙烯酰胺降低率分别为67.58%−69.35%和73.73%−74.96%。

2.5 NCasn5的抑癌活性

2.5.1 MTT法测试NCasn5的抑癌活性

用MTT法评估了NCasn5对人肝癌细胞QGY-7703和人恶性细胞瘤细胞A-375的毒性作用(图7)。与对照组相比，2 U/mL NCasn5处理的QGY-7703细胞未记录到显著的细胞毒活性，而对A-375细胞抑制率为35%；用4 U/mLNCasn5处理后，QGY-7703和A-375细胞的存活率都降至约54%。这表明不同浓度的NCasn5对两种癌细胞展示出了不同程度的抑制作用，并以剂量依赖的方式影响细胞系的活力(P < 0.05)。

2.5.2 细胞形态及DAPI染色评估

在倒置荧光显微镜下观察NCasn5对癌细胞的抑制作用(图8)。NCasn5处理后的细胞数量减少，显示出凋亡的细胞核形态学迹象，如细胞核波纹状、染色质高度凝聚和细胞核碎裂成大小不等的圆形小体。然而，对照组细胞核呈现均匀的荧光分布，形状为规则的椭圆形或圆形，这表明在L-ASNase处理下，细胞凋亡可能是细胞死亡的主要方式。

3 讨论与结论

收起

本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中获得L-ASNase NCasn5，系统发育树上聚类于独立的未知类型分支，与未表征的真杆菌(Eubacterium sp.) L-ASNase同源性最高(图1)。真杆菌是人类肠道的核心微生物、丁酸盐的主要产生菌，该属多个物种是微生物治疗中有前景的靶点，对调节宿主炎症、血糖水平、免疫反应和胆固醇稳态等有重要作用^[29]。Zielezinski等^[30]构建细菌L-ASNase的系统发育树后发现，一些细菌L-ASNase的氨基酸序列与已知类型L-ASNase相似性低，可能是细菌间水平基因转移或酶功能区域的序列变异所致，是目前尚未被发现的新型L-ASNase。

多序列对比显示，不同细菌L-ASNase中第88位亲核氨基酸残基(Thr)高度保守，本研究的NCasn5在此位点的氨基酸为Ser (图2)。Palm等^[31]将E.coli L-ASNase相应位点的Thr突变为Ser后发现，Ser仍可以通过亲核攻击与底物形成共价酰-酶中间体，促进产物释放。因此，NCasn5的S88可能不影响其催化功能。此外，NCasn5第26位和第159位的催化氨基酸残基也不同于其他L-ASNase，可能与低频率的氨基酸替换有关^[30]。

研究表明，已报道细菌L-ASNase的最适pH介于6.0−9.5，多数属于中温酶^[32]，本研究获得的NCasn5最适pH为8.0，与用于治疗的胡萝卜软腐坚固杆菌(Pectobacterium carotovorum) L-ASNase一致^[5]。NCasn5在缓冲液(pH 5.0−9.0)中37 ℃孵育1 h仍保持80%以上酶活力，与巴伦氏类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii) L-ASNase的稳定性相似^[33]。NCasn5不仅在生理pH范围内高度稳定，而且在弱酸性(pH5.0−6.0)条件下也保持良好活性，突出了NCasn5作为食品加工和医疗领域候选剂的潜力。NCasn5最适温度为60 ℃，与水杆状菌(Aquabacterium sp.) A7-Y和C.amphilecti L-ASNase一致(表2)，但低于小宝岛热球菌(Thermococcus kodakarensis) L-ASNase (85 ℃)^[44]，可能是NCasn5中催化和非催化氨基酸残基之间的相互作用影响了其催化结构域及最适温度^[45]。NCasn5在30−55 ℃孵育1 h后酶活力几乎不变，与鱼肠道微生物组来源的SlpA在40 ℃孵育1 h后仅有60%以上酶活相比，表现出更好的热稳定性^[21]。而谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) L-ASNase孵育温度超过35 ℃时急剧下降，40 ℃ 5 min后完全失活^[42]。由于L-ASNase治疗癌症是通过注射给药，血清会降低其生物利用度，因此高稳定和较长的半衰期能减少多次给药引起的过敏反应和酶活性损失^[34]。37 ℃条件下，NCasn5的体外血清半衰期约69 h，比阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) L-ASNase (约39 h)^[34]和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) L-ASNase (约44 h)^[46]更长，为其用于医药领域提供可能。

NCasn5对底物L-Asn高度专一，可能与其N末端柔性环内负责底物结合的氨基酸残基间的相互作用有关，此作用引起的构象限制可能影响了酶对底物的特异性^[47]。研究表明，一些L-ASNase因具有谷氨酰胺酶活性，可能在食品加工过程中促进丙烯酰胺的形成^[48]，这些酶在临床治疗中也可能引发过敏反应、神经毒性及胰腺炎等副作用^[14]。因此，无谷氨酰胺酶活性的NCasn5成为制药和食品工业中潜在的候选制剂。此外，NCasn5的K_m为(3.33±0.21) mmol/L，低于齐氏热球菌(Thermococcus zilligii)和戈登分枝杆(Mycobacterium gordonae)等来源的L-ASNase，但比大部分L-ASNase Ⅱ高(表2)。不同微生物L-ASNase的K_m值范围在0.012−35.000 mmol/L之间^[15]，该值可能受到酶的来源、底物类型和实验条件等因素的影响^[49]。

L-ASNase可降低不同食品中约55.90%−88.20%的丙烯酰胺含量(表2)，一些L-ASNases Ⅱ对各种类型的癌细胞有抑制作用，如白血病(K562、HL60、MOLT3、MOLT4和Jurkat)、乳腺癌(MCF7、MDAMB231和T47D)、肝癌(HepG2和Hep3B)、卵巢癌(SCOV-3)及前列腺癌(LnCap)的细胞。本研究用不同浓度的NCasn5处理薯条，可以明显减少油炸过程中丙烯酰胺的生成。40 U/mL NCasn5可使丙烯酰胺减少64.83%，而增加NCasn5的浓度至45−50 U/mL时，与商业酶L-ASNase的降解率相比无显著差异。用50 U/mL酶液处理0.5 h后，丙烯酰胺降解率最高可达69.35%，高于M.gordonae和鱼肠道来源的SlpA的降解率，但低于T.zilligii、C.glutamicum和C.amphilecti (表2)。这可能是由于60 ℃条件下酶的稳定性不佳，无法同时对薯条进行酶水解和热烫处理，进而限制了丙烯酰胺的减少^[50]。此外，NCasn5以浓度依赖性抑制QGY-7703和A-375细胞的生长，其作用机制已被阐明，L-ASNase通过消耗血清中合成糖蛋白及其他营养物质所必需的L-Asn，抑制了癌细胞的代谢活性，从而诱导癌细胞凋亡^[51]。

本研究从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中成功获得新型的L-ASNase NCasn5，该酶无谷氨酰胺酶活性，在37 ℃血清中具有高稳定性(T_1/2：约69 h)，抑制肝癌细胞及人恶性黑色素瘤细胞的增殖，并能减少油炸薯条中丙烯酰胺的含量，为L-ASNase在药物开发及食品工业领域提供了一个新的方向。为提高其应用潜力，需要进一步通过生物信息学分析、结构诱变和固定化等方法提高重组酶的稳定性和与底物的亲和力。

基金

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国家自然科学基金(32360034)

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https://doi.org/10.1007/BF00685615

2024年第64卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240007

接收时间：2024-01-04
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-07-04

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收稿日期：2024-01-04
录用日期：2024-03-18

基金

National Natural Science Foundation of China(32360034)

国家自然科学基金(32360034)

作者信息

1 云南师范大学生命科学学院, 云南昆明 650500

2 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心, 云南昆明 650500

3 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室, 云南昆明 650500

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参考文献

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Primer name	Sequences (5′→3′)
The underlined sections represent the restriction sites forNde Ⅰ andXho Ⅰ.
NCasn5-F	TAAGAAGGAGATATACATATGGAATTGATGGATAAGATACTAGTTGTTTTAACTGGAG
NCasn5-R	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAATTCCTCATAATACATTGTGTTGTTTATATC

Primer name

Sequences (5′→3′)

The underlined sections represent the restriction sites forNde Ⅰ andXho Ⅰ.

NCasn5-F

TAAGAAGGAGATATACATATGGAATTGATGGATAAGATACTAGTTGTTTTAACTGGAG

NCasn5-R

GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAATTCCTCATAATACATTGTGTTGTTTATATC

Type	Source	Optimum pH	Optimum temperature (℃)	K_m (mmol/L)	Specific activity (U/mg)	Application	References
–: None or not mentioned in the literature.
Unknown	Nycticebus pygmaeus faecal metagenome	8.0	60	3.33±0.21	645.73	69.35	QGY-7703, A-375	This study
	Enterobacter cloacae	7.0–8.0	35–40	1.58	105.07	–	HL60, MOLT4, MDAMB231, T47D	[34]
	Palaeococcus ferrophilus	8.5	95	5.00	1 631.00	79.00	–	[35]
Ⅰ	Fish gut microbiome	8.0	30	3.01	478.81	63.00	K562, MCF7	[21]
	Acinetobacter soli	8.0	40	3.22	400.00	55.90	–	[36]
	Mycobacterium gordonae	9.0	50	6.03	486.65	65.09	–	[37]
	Thermococcus zilligii	8.5	90	6.08	5 278.00	80.50	–	[38]
Ⅱ	Soil metagenome	7.0	35	2.00	696.00	–	HL60, MOLT3, MOLT4	[20]
	Caspian Sea metagenome	7.5	–	0.15	100.00	–	Jurkat	[19]
	Bacillus velezensis	7.5	37	0.04	31.77	–	MDAMB231, MCF7	[12]
	Bacillus licheniformis	6.5	37	49.99	36.08	–	HepG2, MCF7	[39]
	Geobacillus kaustophilus	8.5	55	0.49	250.60	–	Hep3B, HCC SNU387	[40]
	Melioribacter roseus	9.3	70	1.40	1 530.00	–	K562, Jurkat, LnCap, SCOV-3	[41]
	Corynebacterium glutamicum	9.0	45	4.66	1 979.08	84.00	–	[42]
	Cobetia amphilecti	7.0	60	2.05	778.00	81.93	–	[9]
	Pseudomonas sp. PCH182	8.5	45	0.52	41.50	73.00	–	[10]
	Aquabacterium sp. A7-Y	9.0	60	1.80	458.90	88.20	–	[43]

Type

Source

Optimum pH

Optimum temperature (℃)

K_m (mmol/L)

Specific activity (U/mg)

Application

References

Acrylamide reduction (%)

Cancer type

–: None or not mentioned in the literature.

Unknown

Nycticebus pygmaeus faecal metagenome

8.0

3.33±0.21

645.73

69.35

QGY-7703, A-375

This study

Enterobacter cloacae

7.0–8.0

35–40

1.58

105.07

–

HL60, MOLT4, MDAMB231, T47D

[34]

Palaeococcus ferrophilus

8.5

5.00

1 631.00

79.00

–

[35]

Ⅰ

Fish gut microbiome

8.0

3.01

478.81

63.00

K562, MCF7

[21]

Acinetobacter soli

8.0

3.22

400.00

55.90

–

[36]

Mycobacterium gordonae

9.0

6.03

486.65

65.09

–

[37]

Thermococcus zilligii

8.5

6.08

5 278.00

80.50

–

[38]

Ⅱ

Soil metagenome

7.0

2.00

696.00

–

HL60, MOLT3, MOLT4

[20]

Caspian Sea metagenome

7.5

–

0.15

100.00

–

Jurkat

[19]

Bacillus velezensis

7.5

0.04

31.77

–

MDAMB231, MCF7

[12]

Bacillus licheniformis

6.5

49.99

36.08

–

HepG2, MCF7

[39]

Geobacillus kaustophilus

8.5

0.49

250.60

–

Hep3B, HCC SNU387

[40]

Melioribacter roseus

9.3

1.40

1 530.00

–

K562, Jurkat, LnCap, SCOV-3

[41]

Corynebacterium glutamicum

9.0

4.66

1 979.08

84.00

–

[42]

Cobetia amphilecti

7.0

2.05

778.00

81.93

–

[9]

Pseudomonas sp. PCH182

8.5

0.52

41.50

73.00

–

[10]

Aquabacterium sp. A7-Y

9.0

1.80

458.90

88.20

–

[43]