微生物学报

Sample names	Sample descriptions	Locations of sample	Sampling time
Ct.T.F	Control group of corm	Fuyuan	October 2022
Ct.S.F	Control group of rhizosphere soil	Fuyuan	October 2022
B.T1.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.T2.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S1.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S2.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
Ct.T.Y	Control group of corm	Yongping	October 2022
Ct.S1.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
Ct.S2.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
B.TO1.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO2.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO3.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI1.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI2.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI3.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S1.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S2.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S3.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022

Sample names	Sample descriptions	Locations of sample	Sampling time
Ct.T.F	Control group of corm	Fuyuan	October 2022
Ct.S.F	Control group of rhizosphere soil	Fuyuan	October 2022
B.T1.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.T2.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S1.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S2.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
Ct.T.Y	Control group of corm	Yongping	October 2022
Ct.S1.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
Ct.S2.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
B.TO1.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO2.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO3.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI1.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI2.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI3.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S1.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S2.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S3.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022

Major phylum	Major detected species	Separated species
Proteobacteria	Pectobacteriumcarotovorum	Pectobacteriumcarotovorum
	Stenotrophomonas maltophilia	Pectobacterium aroidearum
	Lelliottia amnigena	Stenotrophomonas maltophilia
	Enterobacter sp.	Pseudomonas putida
	Bordetella petrii	Pseudomonas pseudoalcaligenes
	Kerstersia gyiorum	Pseudomonas qingdaonensis
	Pseudomonas sp.	Raoultella terrigena
	Achromobacter piechaudii	Klebsiella michiganensis
	Raoultella ornithinolytica	Cedecea lapagei
	Bordetella bronchiseptica	Morganella morganii
	Enterobacter cloacae	Pantoea agglomerans
Bacteroidetes	Dysgonomonas capnocytophagoides	Myroides marinus
	Dysgonomonas sp.
	Dysgonomonas gadei
	Myroides marinus
Acidobacteria	Acidobacteria bacterium	Acidobacteria bacterium
Firmicutes	Paenibacillus polymyxa	Paenibacillus polymyxa
	Paenibacillus amylolyticus	Lactiplantibacillus plantarum
	Lactiplantibacillus plantarum
Ascomycota	Barnettozyma californica	Barnettozyma californica
	Cyberlindnera saturnus	Cyberlindnera saturnus
	Pichia kudriavzevii

Major phylum	Major detected species	Separated species
Proteobacteria	Pectobacteriumcarotovorum	Pectobacteriumcarotovorum
	Stenotrophomonas maltophilia	Pectobacterium aroidearum
	Lelliottia amnigena	Stenotrophomonas maltophilia
	Enterobacter sp.	Pseudomonas putida
	Bordetella petrii	Pseudomonas pseudoalcaligenes
	Kerstersia gyiorum	Pseudomonas qingdaonensis
	Pseudomonas sp.	Raoultella terrigena
	Achromobacter piechaudii	Klebsiella michiganensis
	Raoultella ornithinolytica	Cedecea lapagei
	Bordetella bronchiseptica	Morganella morganii
	Enterobacter cloacae	Pantoea agglomerans
Bacteroidetes	Dysgonomonas capnocytophagoides	Myroides marinus
	Dysgonomonas sp.
	Dysgonomonas gadei
	Myroides marinus
Acidobacteria	Acidobacteria bacterium	Acidobacteria bacterium
Firmicutes	Paenibacillus polymyxa	Paenibacillus polymyxa
	Paenibacillus amylolyticus	Lactiplantibacillus plantarum
	Lactiplantibacillus plantarum
Ascomycota	Barnettozyma californica	Barnettozyma californica
	Cyberlindnera saturnus	Cyberlindnera saturnus
	Pichia kudriavzevii

云南两个花魔芋主产区软腐病害植株腐烂球茎中的菌群组成及特征

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张绍智 ¹ , 田庆红 ² , 董坤 ³ , 杨丽萍 ⁴ , 殷减清 ³^,^* , 张仲凯 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(7): 2434-2452

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(7): 2434-2452

云南两个花魔芋主产区软腐病害植株腐烂球茎中的菌群组成及特征

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张绍智¹, 田庆红², 董坤³, 杨丽萍⁴, 殷减清³^,^*, 张仲凯¹^,^*

作者信息

1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南昆明 650205

2 永平县科技统计和成果转换中心, 云南永平 672600

3 云南省农业科学院富源魔芋研究所, 云南富源 655500

4 云南海萍农业开发有限公司, 云南永平 672600

Composition and characteristics of microflora in the corm ofAmorphophallus konjac K. Koch infected by soft rot in two main konjac production areas in Yunnan

Shaozhi ZHANG¹, Qinghong TIAN², Kun DONG³, Liping YANG⁴, Jianqing YIN³^,^*, Zhongkai ZHANG¹^,^*

Affiliations

1 Biotechnology and Germplasm Resources Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, Yunnan, China

2 Yongping Center of Statistics and Achievements Commercialization of Science and Technology, Yongping 672600, Yunnan, China

3 Fuyuan Research Institute of Konjac, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Fuyuan 655500, Yunnan, China

4 Yunnan Haiping Agricultural Development Co., Ltd., Yongping 672600, Yunnan, China

出版时间: 2024-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230778

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摘要

收起

【目的】软腐病是侵染魔芋的主要病害，其危害性严重，广泛传播会导致花魔芋绝产，尚无有效防控措施。魔芋软腐病的发生及暴发性传播与病原菌及其菌群有较大相关性。本研究旨在明确云南2个主产区的软腐病害花魔芋球茎及其根际土壤中的主要致病菌和优势微生物种类，分析其菌群结构特征，从而为花魔芋软腐病害的防控提供支撑。【方法】研究采集云南富源和永平2个产区的花魔芋软腐病样品，应用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行微生物宏基因组测序和分析。同时采用选择性培养基、多级纯化培养技术以及电镜超微形态解析，分别对病害腐烂球茎中的致病菌及优势菌类进行分离鉴定和观察验证。【结果】两个花魔芋主产区软腐病害植株球茎及土壤中的微生物都非常丰富，共检出107门2 502属15 721种微生物。这2个产区的花魔芋软腐病害主要致病菌均为胡萝卜软腐坚固杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)，此病原菌与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的优势生长是2个产区软腐病害植株腐烂球茎中菌群的主要特征。此外，同产区的病害组织与土壤样品之间的菌群组成差异较大，但这2类样品中的优势菌群组成的区域性差异较小。【结论】两个花魔芋主产区软腐病害球茎组织中菌群与该区土壤菌群的相关性较低，土壤菌群区域性差异比相应的病害组织菌群区域性差异要大。因此，主要病原菌和共生菌的优势生长突破了产地差异影响，成为了病害组织菌群的主要特征，使得2个主产区软腐病害花魔芋球茎中的微生物生态系统具有高度相似性。

关键词

花魔芋 / 宏基因组 / 软腐病 / 病原菌 / 微生物群落

Abstract

收起

[Objective] Soft rot is the main disease ofAmorphophallus konjac K. Koch in konjac production areas. Crop failure can be caused by the wide spreading of soft rot, because the serious destructiveness of the disease can not be effectively prevented and controlled at present. The occurrence and explosive spreading of soft rot are closely related to the microflora and pathogenic bacteria in konjac. This study explored the main pathogenic bacteria and dominant microbial species in rotten corms and rhizosphere soil, and analyzed the structural characteristics of microflora in the samples infected by soft rot in two main konjac production areas of Yunnan, aiming to provide theoretical support for the prevention and control of soft rot in konjac production. [Methods] The konjac samples infected by soft rot were collected from Fuyuan and Yongping in Yunnan. The Illumina NovaSeq 6000 platform was used for metagenomic sequencing, and the sequencing data were analyzed. Meanwhile, the pathogenic bacteria and dominant microorganisms in the rotten corms were isolated by multistage purification using selective medium, and observed by an electron microscop. [Results] Large quantities of microorganisms were detected in the rotten corms of diseased konjac from the two main production areas, including 15 721 species that belonging to 2 502 genera of 107 phyla.Pectobacteriumcarotovorum was the main pathogen in all of the diseased samples infected by soft rot. The main characteristic feature of microflora in rotten corms was that the abundances of pathogen andStenotrophomonas maltophilia were higher than all the other microorganisms. The composition of microflora present great differences between diseased tissue samples and soil samples, in the same production area, whereas, the microflora composition in the diseased tissue samples or soil samples had slight differences between the two production areas. [Conclusion] The microflora composition showed low correlations between the diseased corm and rhizosphere soil, in the two production areas. The regional difference of microflora in soil was larger than that in the diseased tissue. The results showed that the dominant pathogens and saprophytes played a key role in forming the microflora structure by breaking through the regional impact, and resulted in the microbial ecosystems in the konjac corms infected by soft rot were highly similar in two main production areas.

Key words

Amorphophallus konjac K. Koch / metagenomes / soft rot / pathogenic bacteria / microflora

引用本文

张绍智, 田庆红, 董坤, 杨丽萍, 殷减清, 张仲凯. 云南两个花魔芋主产区软腐病害植株腐烂球茎中的菌群组成及特征. 微生物学报, 2024 , 64 (7) : 2434 -2452 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230778

Shaozhi ZHANG, Qinghong TIAN, Kun DONG, Liping YANG, Jianqing YIN, Zhongkai ZHANG. Composition and characteristics of microflora in the corm ofAmorphophallus konjac K. Koch infected by soft rot in two main konjac production areas in Yunnan[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (7) : 2434 -2452 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230778

正文

收起

花魔芋(Amorphophallus konjac K. Koch)是天南星科魔芋属中一种重要经济作物，在我国云南及周边省区大面积种植^[1]。花魔芋属于稀有的葡甘露聚糖高产植物，其成熟球茎中含有丰富的葡甘露聚糖。以葡甘露聚糖为主要成分的魔芋凝胶具有良好的胶凝性、增稠作用和成膜效果，已被有效应用于食品、医药、生物技术以及材料科学领域^[2-3]。然而，花魔芋在种植过程中非常容易感染软腐病。软腐病传播速度快且致病性强，侵染形成后会导致魔芋球茎和叶柄在短期内严重腐烂，暴发性传播可使花魔芋感染率达到80%以上，甚至造成绝收，严重制约了云南花魔芋种植生产和产业化发展^[4-5]。

花魔芋软腐病主要致病菌是坚固杆菌属(Pectobacterium)细菌^[6]。目前已报道引起魔芋软腐病害的坚固杆菌主要种类有胡萝卜软腐坚固杆菌胡萝卜软腐病亚种(P.carotovorum, Pc)、黑腐坚固杆菌(P.atrosepticum)、菊花迪克氏菌(Dickeya chrysanthemi)及天南星坚固杆菌(P.aroidearum)^[7-9]。此外，还有研究报道了镰孢菌属(Fusarium)真菌在早期与Pc复合侵染魔芋球茎时共同引发软腐病害^[9]。除了主要致病菌，魔芋腐烂球茎中还存在种类繁多的共生微生物。共生菌是腐烂球茎中重要的环境微生物，它们与病原菌在病害组织中组成一个庞大的微生物群落，对魔芋软腐病害的发生、传播和破坏力有着重要的影响。致病菌能够通过水流在土壤中产生小范围的区域性扩散和传播，而携带致病菌的种球或病害种球的长距离运输是魔芋软腐病的另一重要传播途径^[10]。尽管长距离传播使得我国西南多省区花魔芋软腐病致病菌的种类较为相似，但云南地理气候条件多样化，东部土地地质特点及环境条件与西部差异大，土壤微生物群落组成也不尽相同，魔芋软腐病害的发生和流行可能随之存在差异。

研究不同产区花魔芋软腐病致病菌的种类，探索潜在的未知病原菌，分析不同产区病害组织中微生物群落组成的差异，以及发掘病原菌的拮抗微生物对花魔芋种植生产和软腐病害的防控有着重要意义。然而，采用常规的方法研究魔芋软腐病致病菌及相关菌群组成存在主观选择性强，分辨水平低，分析种类和数量有限，容易造成遗漏等难题^[11]。基于高通量测序的宏基因组分析方法，通过直接提取病害样本中整个微生物群的总DNA进行测序分析，具有测序通量高、物种信息量大、实验速度快等特点^[12]。研究报道了采用宏基因组高通量测序技术研究魔芋种植生产相关微生物群落的结果：首先是采用宏基因组高通量测序分析揭示了软腐病害的发生提高了魔芋植株根系细菌群落的丰度和α多样性，以及丰富了根系菌群的组成^[13]；其次是采用宏基因组高通量测序技术解析了魔芋种子成熟过程中其内生细菌群落组成和多样性的动态变化^[14]；研究利用宏基因组高通量测序技术证明了增加施用生物肥并降低化学肥料使用量可以提高魔芋根际土壤细菌多样性，降低有害真菌丰度，促进魔芋根际土壤向“细菌型”高肥转化，从而有效提高魔芋产量^[15]。因此，应用宏基因组高通量测序技术能够获取病害组织中更为完整和丰富的微生物种类信息，进行更加精准的病原菌发现和益生菌探索，以及反映样品中微生物群落的整体特征。

本研究采用宏基因组测序分析技术，从物种注释、丰度比较、多样性评估、菌群组成分析等方面深入解析云南省2个魔芋主产区(东部的富源县和西部的永平县)软腐病害花魔芋球茎及其根际土壤中微生物种类多样性、分布特点、群落结构特征和区域性差异，为魔芋软腐病菌拮抗微生物探索以及病害生防技术开发积累基础。

1 材料与方法

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1.1 样品采集

本研究中的软腐病害花魔芋球茎以及相应根际土壤样品，分别在2022年10月采集于云南省曲靖市富源县云南省农业科学院富源魔芋研究所示范种植基地以及大理州永平县云南海萍农业开发有限公司生产种植基地。样品详细信息见表1。

1.2 样品预处理

取50 g软腐病害腐烂球茎组织，用无菌水充分悬浮其中的微生物，用100目尼龙网过滤悬浮液，去除魔芋组织残渣。滤液在室温条件下8 000×g离心10 min，得到腐烂组织中的总微生物沉淀物。针对土壤样品，用无菌水将50 g土壤充分悬浮，将悬浮液自然沉淀1 min，去除大部分密度较高的泥沙，再用100目尼龙网过滤悬浮液去除大颗粒植物残渣，最后采用以上相同条件离心，得到土壤样品中的总微生物沉淀物。

1.3 总DNA提取

参照微生物基因组DNA原位提取技术^[11,16]，采用Omega Bio-tek公司的E.Z.N.A^® Mag-Bind Soil DNA Kit，按照试剂盒使用说明书对总微生物分离物进行总DNA提取。分别用核酸蛋白浓度快速测定仪和1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的浓度和完整性。

1.4 DNA片段化及测序文库构建

采用ThermoFisher Scientific公司的Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit精确定量微生物基因组浓度。用Covaris超声波DNA破碎仪片段化总基因组DNA。用上海翊圣生物科技有限公司DNA片段浓缩回收分选磁珠(Hieff NGS^® DNA Selection Beads)浓缩、回收和纯化片段化后的DNA、DNA连接产物以及文库扩增产物。用New England Biolabs公司的NEBNext^® Ultra^TM DNA Library Prep Kit for Illumina^®构建测序文库。最后分别采用核酸蛋白浓度快速测定仪和2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和文库大小。

1.5 高通量测序及数据处理分析

微生物基宏因组DNA文库的高通量测序由生工生物工程(上海)股份有限公司采用Illumina NovaSeq 6000测序平台完成。针对测序数据结果，分别依次采用FastQC、Trimmomatic、IDBA-UD、Prodigal及CD-HIT软件对测序数据进行质量评估、净化处理、拼接组装、开放阅读框(open reading frame, ORF)预测和去冗余。用Bowtie 2和SAM tools软件分析基因丰度信息。再用Diamond软件将基因集非冗余蛋白序列与NCBI数据库中的微生物源蛋白序列进行同源性对比分析。从而获得物种分类注释信息及相对丰度。

1.6 微生物分离和鉴定

1.6.1 分离纯化培养

将健康花魔芋球茎组织切成小方块(3 cm×3 cm×3 cm)，在超净台洁净条件下用乙醇浸泡消毒5 min，用无菌水洗5次(最后一次浸泡1 h)，然后将消毒球茎块取出置于灭菌小烧杯中。取少量软腐病害花魔芋球茎内部腐烂组织，涂到消毒球茎小块上表面，用灭菌膜封口，28 ℃条件下培养3−5 d，进行致腐微生物的初级筛选培养。当消毒球茎小块发生软化腐烂时，取少量内部腐烂组织，放入2 mL离心管中，加5倍体积无菌水后适当振荡，充分悬浮组织中的微生物。吸取10 μL悬浮液涂布到PDA平板上，28 ℃条件下培养至有菌落长出。根据长出菌落的大小、色泽和形态，挑取单菌落进行悬浮稀释，并继续在PDA平板上划线培养。重复挑取单菌落稀释划线培养，直至初步确认得到单一菌株。最后挑取纯化好的单菌落，用液体PDA培养基进行摇瓶培养，当菌液浓度达到OD₆₀₀值大于2时进行后续实验。

1.6.2 物种鉴定

采用CTAB法^[9]提取所分离纯化到菌株的总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。以总DNA为模板，采用正向引物27F (5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对细菌16S rRNA基因的全长DNA序列进行PCR扩增。PCR反应体系(25.00 μL)：Taq PCR Master Mix (2×, Blue Dye) 12.50 µL，27F和1492R引物(10 µmol/L)各1.00 µL，DNA模板0.50 µL，ddH₂O 10.00 µL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55−62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。DNA产物序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。最后采用NCBI在线分析工具BLAST对所测定的16S rRNA基因进行比对分析和同源性检索，从而获取所分离到菌株的准确物种分类信息。

1.7 微生物超微形态电镜解析

取少量魔芋腐烂球茎组织或菌落，采用常规方法进行固定、漂洗、脱水、干燥和喷金，然后用扫描电镜(HITACHI公司)进行观察解析。针对采用透射电镜观察的样品，继扫描电镜制样过程中的脱水步骤之后，用常规方法进行样品渗透、包埋、聚合、切片和染色^[17]，再用透射电镜(FEI公司)进行观察解析。

2 结果与分析

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2.1 不同分类水平微生物群落的分布、多样性及丰度

采用宏基因组测序从2个主产区软腐病害花魔芋球茎及根际土壤中检测到的微生物多达107门199纲381目750科2 502属。如图1所示，2个产区各类型样品中的微生物组成在门、纲和目3个分类水平上具有较高相似度。变形菌门(Proteobacteria)是门分类水平丰度最高的微生物，占比在36.30%−91.70%之间。拟杆菌门(Bacteroidetes)是分布范围和丰度仅次于变形菌门的第二大菌门(图1A)。伽玛变形菌纲(Gammaproteobacteria)、阿尔法变形菌纲(Alphaproteobacteria)及贝塔变形菌纲(Betaproteobacteria)是纲分类水平丰度较为显著的主要三大纲微生物，它们的生物量总丰度占比高达50.00%−90.00% (图1B)。从目分类水平开始，样品中的微生物分布差异开始变大，较显著的特征为伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)大量分布于所有样品中。肠杆菌目(Enterobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和黄单胞菌目(Xanthomonadales)是分布于大部分样品中且丰度较高的菌目。此外，另一个差异较明显的微生物分布特点是假单胞菌目(Pseudomonadales)大量存在于少数病害球茎及其土壤样品中(图1C)。

不同产区的病害球茎及其土壤样品中菌群组成和丰度在科、属和种分类水平的差异逐级变得更显著(图2)。肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是分布最广且丰度最高的菌群，黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)次之。其他科微生物在大部分样品中分布不均且丰度相对较低，无明显的规律和特征(图2A)。在属分类水平，坚固杆菌属、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)及假单胞菌属(Pseudomonas)微生物在病害魔芋腐烂球茎及少数根系土壤中分布量较大，丰度分别高达20.70%、19.50%和18.20%。此外，在腐烂组织中分布显著的菌群还有假双斧状菌属(Pseudolabrys)、营发酵单胞菌属(Dysgonomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、酸杆菌属(Acidobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)等。Gemmatirosa、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomona)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)则在根际土壤中分布量较大(图2B)。

2.2 主要微生物种类及致病菌

宏基因组测序从2个主产区的软腐病害花魔芋球茎组织中检测到的微生物种类多达15 721种。病害组织菌群最为显著的特征为Pc是所有样品中分布量最高的菌株，其在腐烂球茎样品(B.TI3.Y)中的丰度高达19.28%，同时也大量存在于少数根际土壤(B.S1.F和B.S1.Y)中，属于生物量最大的优势菌(图2C、图3)。许多研究报道Pc是多种魔芋软腐病害的主要致病菌之一^[7-9]。本研究在花魔芋腐烂球茎组织中还检测到了其他种坚固杆菌，包括黑腐坚固杆菌、天南星坚固杆菌、微管束坚固杆菌(P.betavasculorum)以及山嵛菜坚固杆菌(P.wasabiae)。然而，这些坚固杆菌在腐烂球茎样品中的分布量都很少，丰度较高种的占比未达到1.00%，而且微管束坚固杆菌和山嵛菜坚固杆菌在关于魔芋软腐病害方面的报道很少。值得关注的是嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia, Sm)是另一种大量存于腐烂球茎中的菌株，其在腐烂球茎样品(B.TI1.Y)中的丰度高达16.07%，生物量占比仅次于Pc (图2C、图3)。可见，Sm与致病菌共同大量存在于软腐病害花魔芋腐烂球茎组织中，但尚未有关于该菌株的魔芋致病性研究报道。

深入的对比分析进一步证实变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门是所有腐烂组织样品中分布总量最大的几个微生物门(图4A)。这些门所包含微生物也是所有样品中总分布量最高的种类，其中Pc和Sm不仅是某一单个腐烂组织样品中分布量最大的2种菌，而且它们还是所有样品中生物量总和最大的菌类(图4B)。2种细菌在大部分病害组织和根际土壤样品中的丰度相近，都是典型的优势菌。在花魔芋腐烂球茎中分布相对明显的菌株还有假单胞菌(Pseudomonas sp.)、肠杆菌(Enterobacteriaceae sp.)及食棉子糖丙酸螺菌(Propionispira raffinosivorans) (表2)。此外，类二氧化碳营发酵单胞菌(D.capnocytophagoides)还大量存在于少数病害组织及其根际土壤中。可见，少数种优势菌和多种共生菌以不同生物量共同生长和分布于软腐病害花魔芋腐烂球茎组织中，共同组成了一个庞大的微生物生态系统。另一方面，在花魔芋根际土壤中的优势菌类主要有Gemmatirosa kalamazoonesis、假双斧状菌以及Koribacter versatilis。然而，相对于同一个样品中的非优势菌类，它们的占比丰度显著性并不高，并且这些菌在腐烂球茎样品中的分布量极少。因此，大部分土壤样品中优势菌的生物量占比相对于非优势菌的显著性较低。其他许多非优势菌之间丰度差异的显著性也很低，几乎都维持在一个相近的低水平。相对于病害腐烂组织中的微生物，土壤中的优势菌和非优势菌的生物量都较低。

2.3 菌群组成的主要特征

两个主产区软腐病害魔芋样品中微生物群落从门分类水平到种分类水平的相应特征为(图1、图2)：变形菌门是所有样品中的优势菌门，该菌门的丰度占比保持在菌群总生物量的50.00%以上。γ变形菌纲是大部分腐烂球茎样品中的优势菌纲，α变形菌纲和β变形菌纲是少数组织和土壤样品中的优势菌纲。伯克霍尔德氏菌目大量分布于所有样品，肠杆菌目、根瘤菌目和黄单胞菌目在大部分样品中分布量都高，而假单胞菌目仅大量存在于少部分样品(B.S1.F、B.T1.F、B.TI3.Y)中。样品中的菌群组成在科分类水平出现较大差异，分布较广且丰度最高的是肠杆菌科微生物，而黄单胞菌科、丛毛单胞菌科和假单胞菌科微生物则在少部分样品中分布较高，其他科微生物在大部分样品中分布无典型的规律。随着样品类型和特点的不同，菌群分布差异从属分类水平开始变大，并明显呈现出相应的特征。坚固杆菌属、寡养单胞菌属和假单胞菌属在腐烂球茎中生物量最高，Gemmatirosa、鞘氨醇单胞菌属和慢生根瘤菌属在根际土壤中分布量较高，其他属微生物在样品中无典型的分布特征。

菌群分布在种分类水平最为显著的特征是病害腐烂组织中大量分布Pc和Sm。这2种细菌的丰度在大部分腐烂组织中显著高于其他种类，少部分病害样品(B.T1.F和B.TI1.Y)中Sm的生物量接近或稍高于Pc的水平(图5)。柱状图数据分析结果显示，腐烂球茎(B.TI.Y、B.TO.Y、B.T.F)中Pc和Sm的丰度较高，接近群落微生物总量的50.00%。此外，这些样品菌群中生物量相对较高的菌株还包括恶臭假单胞菌、肠杆菌、食棉子糖丙酸螺菌、类二氧化碳营发酵单胞菌、解鸟氨酸柔武氏菌(Raoultella ornithinolytica)等菌株，但它们的丰度均不超过菌群总量的10.00%。尽管在某一个样品中这些菌株的单一生物量比主要优势菌要小很多，但它们群体生物总量的占比却很高。不同的是，在少部分软腐病害株根际土壤(B.S1.F、B.S1.Y、Ct.S.F)中同样大量存在Pc和Sm，原因可能是腐烂球茎组织中的微生物随土壤水流发生了迁移和扩散，所以这类土壤样品中的优势菌组成与病害腐烂组织优势菌种类具有较高的相似性。其他大部分土壤样品中优势微生物主要为争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、G.kalamazoonesis、假双斧状菌、K.versatilis以及马赛莱朗杆菌(Reyranella massiliensis)，并且以这些菌为优势微生物的病害株根际土壤的微生物群落组成与同产区健康对照根际土壤的微生物群落组成无明显差别。

2.4 微生物分离纯化及超微形态解析

为进一步验证宏基因组测序检测到的主要花魔芋软腐病致病菌以及病害腐烂组织中微生物的多样性。实验采用常规培养和选择性培养结合的方法分离培养了病害球茎中的微生物。在常规方法初级分离培养过程中，平板培养基上长出了许多颜色不同和形状各异的菌落，这直接反映了腐烂组织中微生物分布种类的繁多(图6A)。经选择性纯化培养分离到的魔芋软腐病致病菌有Pc和天南星坚固杆菌。常规方法培养分离到的其他微生物主要还有Sm、假单胞、多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、海洋类香味菌(Myroides marinus)等10余种细菌，以及少量霉菌(表2)。然而，常规纯化培养和分析鉴定相对于宏基因组测序检测具有较大的局限性，未能分离到测序检测获得的一些分布量较大的类似争论贪噬菌、食棉子糖丙酸螺菌、G.kalamazoonesis等少数优势生长菌类。

利用扫描电镜观察病害花魔芋腐烂球茎组织发现，淀粉粒及葡甘露聚糖聚集体已大部分被分解利用，只剩下少数纤维状组织。纤维组织上面附着有大量菌株，这些菌高度聚集，以杆状为主，少数为球状和卵形(图6B)。采用超薄切片透射电镜观察腐烂组织中的微生物发现，微生物大小和形状的差异很大，大部分杆状优势生长菌株外表长有许多鞭毛(图6C)。结合其他研究报道分析，长有鞭毛的优势生长菌株为Pc和Sm的可能性最大^[18-19]。进一步利用扫描电镜对分离纯化后的Pc进行观察，此菌株直径约为0.3−0.6 μm，长度约为2.0−4.0 μm，属于典型的杆菌(图6D)。不同的是，由于样品制作过程非常容易使菌株的鞭毛脱落丢失，在用扫描电镜观察的过程中未能看到病原菌和腐生菌的鞭毛。

3 讨论

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3.1 两个主产区病害球茎组织微生物群落的差异

微环境中的微生物群落组成直接受土壤养分、温度、含水量和pH值的影响^[20-22]。此外，其他类似微环境氨氮、有效氮、碳氮比等因素同样能够有效影响微生物群落结构和特征^[23-24]。宏基因组测序分析的方法能够深入了解微环境中微生物的多样性和群落结构，也能为花魔芋软腐病害的防控提供更准确的环境微生物信息。云南地理状况和气候条件多样化，东部和西部差异明显，对2个花魔芋主产区种植地块的土壤微生物组成差异的解析具有重要意义。测序分析结果说明，2个主产区软腐病害花魔芋腐烂球茎中的微生物组成在门、纲和目分类水平非常相似，只有少数样品显示出较小的差异，并且3个分类水平的多数微生物群在2个产区的同类型样品中的丰度水平相近(图1)。2个产区样品微生物群落在科分类水平同样无明显差异，其中肠杆菌科和黄单胞菌科是丰度最高的2个科，假单胞菌科和丛毛单胞菌科在少数样品中也大量存在。2个产区微生物群落在属分类水平和种分类水平的最大相似之处是坚固杆菌属、寡养单胞菌属及假单胞菌属是优势生长菌群。较小的差别在于富源产区病害花魔芋腐烂球茎中Pc的丰度要低于永平产区，该菌在富源产区病害样品中最高丰度只有10.16%，而在永平产区样品中丰度可高达19.30% (图2)。

另一方面，物种相似性分析结果证明富源产区软腐病害花魔芋球茎微生物群落(B.T2.F)，与永平产区同类样品中的微生物群落(B.TI.Y、B.TO.Y)有着较高的相似性，相关性系数分别高达0.89和0.84。同样地，样品B.T1.F与B.TI.Y中微生物群落相关性系数可达到0.57，具有明显的相似性(图7)。这些相似相关性较高的菌群都分布于2个产区的病害魔芋腐烂球茎组织中。可见，魔芋球茎中的物质组成及感染软腐病后物质转化的产物在很大程度上影响并决定了其中的微生物组成，此研究结果与其他研究报道具有较高的相似性^[25-26]。因此，本研究中的主要病原菌和腐生菌的优势生长突破了地域性差异，主导了软腐病害花魔芋腐烂组织中微生物群落的主要特征，这使得不同产区花魔芋球茎感染软腐病后所形成的微生物生态系统具有高度相似性。

3.2 根际土壤与病害球茎中微生物群落的相似相关性

作物根际微生物的组成和多样性反映了土壤生态系统的现状和潜在的发展趋势，并直接影响着作物的健康和生长状况^[26]。本研究中2个主产区的花魔芋根际土壤与病害球茎中微生物群落的差异在门、纲和目分类水平差异较小，相似相关性相对较高。菌群在科、属和种分类水平显示出较明显的差异，相似相关性随之较低。2个产区腐烂球茎中的菌群差异很小，例如肠杆菌科微生物在2个产区的腐烂球茎组织中都是分布丰度最高的菌群。根际土壤菌群组成在科分类水平差异也较小，仅少数科微生物在某一产区样品中的丰度表现得稍显著，例如假单胞菌科和鞘脂单胞菌科在富源的健康对照土壤中(Ct.S.F)丰度较高，酸杆菌科在永平土壤样品中(Ct.S.Y、B.S.Y)丰度较高(图2A)。这在一定程度上说明了土壤菌群区域性差异比相应的腐烂魔芋球茎中菌群的差异要大。这些菌群结构特征及变化类似于其他研究报道^[27-28]，主要原因为环境因子和优势菌群是决定微环境中微生物群落平衡的重要因素，它们在一定程度上主导了该区域微生物群落的组成和结构特征^[27]。

此外，2个产区根际土壤微生物在属和种分类水平的差异表现为大部分土壤样品中的致病菌和优势生长腐生菌的丰度显著低于病害组织。研究发现气候环境因素对微生物群落影响很大，特别是温度可以通过影响微生物的功能基因多样性而调节微生物的代谢速率，进一步影响不同种群间的竞争关系，从而决定微生物的群落结构^[29-30]。本研究采用热图法对宏基因组测序结果进行了物种相似相关性分析，结果显示只有少数土壤菌群与同产区病害组织菌群有较高的相似相关性(图7)。例如B.S1.F样品菌群与B.T1.F和B.T2.F样品菌群的相似相关性稍高，以及B.S1.Y样品菌群与B.TO1.Y、B.TI1.Y、B.TI2.Y和B.TI3.Y样品菌群的相似相关性较明显。少数病害植株根际土壤(B.S1.F、B.S1.Y)中的菌群与腐烂球茎组织菌群极为相似，特别是致病菌丰度很高，近似于腐烂球茎中的水平。这是因为组织中的菌群随雨水在土壤中流动扩散，从而使得病害组织优势菌群在一定程度上影响了土壤微生物群落的原始结构(图2C、图5)。其他大部分土壤菌群与病害组织菌群的相似相关性都保持较低水平。因此，尽管2个花魔芋主产区软腐病害组织中微生物种类非常丰富，包括病原菌在内的优势生长细菌种类很多，但这些菌群与相应的根际土壤菌群相似相关性较低。

4 结论

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本研究采用宏基因组测序、微生物分离纯化和电镜观察联合解析的策略阐述了云南东部和西部2个主产区软腐病害花魔芋球茎中的微生物极其丰富，共有107门2 502属15 721种微生物。其中Pc和Sm是分布范围最广且丰度最高的2种微生物，它们大量存在于病害球茎组织和少数根际土壤中。2种菌显著的优势生长是这2个主产区腐烂魔芋球茎中微生物群落的主要特征。2个产区病害组织中的微生物种类丰富，但都与相应根际土壤菌群相似相关性较低。土壤菌群区域性差异比相应的病害组织菌群区域性差异要大。这说明了2个主产区主要病原菌和腐生菌的优势生长突破了地域性差异的影响而成为病害组织中微生物群落的主要特征，使得不同产区花魔芋球茎感染软腐病后所形成的微生物生态系统具有高度相似性。本研究深入考察了云南东部和西部2个主产区软腐病害花魔芋球茎组织和土壤中的主要病原菌、共生菌、菌群结构特征以及它们的地域性差异，为花魔芋软腐病害的绿色防控增添理论支撑。

基金

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曲靖市张仲凯专家工作站；大理州张仲凯专家工作站；共建中老特色农林作物种质资源联合实验室(202103AF140003)

参考文献

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文献

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https://doi.org/10.1038/ismej.2015.78

2024年第64卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230778

接收时间：2023-12-17
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-07-04

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收稿日期：2023-12-17
录用日期：2024-04-07

基金

Expert Workstation of ZHANG Zhongkai in Qujing, the Expert Workstation of ZHANG Zhongkai in Dali, and the Joint Construction of United Laboratory of Chinese and Laos for the Germplasm Resources of Characteristic Agricultural and Forestry Crops(202103AF140003)

曲靖市张仲凯专家工作站；大理州张仲凯专家工作站；共建中老特色农林作物种质资源联合实验室(202103AF140003)

作者信息

1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南昆明 650205

2 永平县科技统计和成果转换中心, 云南永平 672600

3 云南省农业科学院富源魔芋研究所, 云南富源 655500

4 云南海萍农业开发有限公司, 云南永平 672600

通讯作者:

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20230778

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Sample names	Sample descriptions	Locations of sample	Sampling time
Ct.T.F	Control group of corm	Fuyuan	October 2022
Ct.S.F	Control group of rhizosphere soil	Fuyuan	October 2022
B.T1.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.T2.F	Rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S1.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
B.S2.F	Rhizosphere soil of rotten corm	Fuyuan	October 2022
Ct.T.Y	Control group of corm	Yongping	October 2022
Ct.S1.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
Ct.S2.Y	Control group of rhizosphere soil	Yongping	October 2022
B.TO1.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO2.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TO3.Y	Surface tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI1.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI2.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.TI3.Y	Interior tissue of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S1.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S2.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022
B.S3.Y	Rhizosphere soil of rotten corm	Yongping	October 2022

Sample names

Sample descriptions

Locations of sample

Sampling time

Ct.T.F

Control group of corm

Fuyuan

October 2022

Ct.S.F

Control group of rhizosphere soil

Fuyuan

October 2022

B.T1.F

Rotten corm

Fuyuan

October 2022

B.T2.F

Rotten corm

Fuyuan

October 2022

B.S1.F

Rhizosphere soil of rotten corm

Fuyuan

October 2022

B.S2.F

Rhizosphere soil of rotten corm

Fuyuan

October 2022

Ct.T.Y

Control group of corm

Yongping

October 2022

Ct.S1.Y

Control group of rhizosphere soil

Yongping

October 2022

Ct.S2.Y

Control group of rhizosphere soil

Yongping

October 2022

B.TO1.Y

Surface tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.TO2.Y

Surface tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.TO3.Y

Surface tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.TI1.Y

Interior tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.TI2.Y

Interior tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.TI3.Y

Interior tissue of rotten corm

Yongping

October 2022

B.S1.Y

Rhizosphere soil of rotten corm

Yongping

October 2022

B.S2.Y

Rhizosphere soil of rotten corm

Yongping

October 2022

B.S3.Y

Rhizosphere soil of rotten corm

Yongping

October 2022

Major phylum	Major detected species	Separated species
Proteobacteria	Pectobacteriumcarotovorum	Pectobacteriumcarotovorum
	Stenotrophomonas maltophilia	Pectobacterium aroidearum
	Lelliottia amnigena	Stenotrophomonas maltophilia
	Enterobacter sp.	Pseudomonas putida
	Bordetella petrii	Pseudomonas pseudoalcaligenes
	Kerstersia gyiorum	Pseudomonas qingdaonensis
	Pseudomonas sp.	Raoultella terrigena
	Achromobacter piechaudii	Klebsiella michiganensis
	Raoultella ornithinolytica	Cedecea lapagei
	Bordetella bronchiseptica	Morganella morganii
	Enterobacter cloacae	Pantoea agglomerans
Bacteroidetes	Dysgonomonas capnocytophagoides	Myroides marinus
	Dysgonomonas sp.
	Dysgonomonas gadei
	Myroides marinus
Acidobacteria	Acidobacteria bacterium	Acidobacteria bacterium
Firmicutes	Paenibacillus polymyxa	Paenibacillus polymyxa
	Paenibacillus amylolyticus	Lactiplantibacillus plantarum
	Lactiplantibacillus plantarum
Ascomycota	Barnettozyma californica	Barnettozyma californica
	Cyberlindnera saturnus	Cyberlindnera saturnus
	Pichia kudriavzevii

Major phylum

Major detected species

Separated species

Proteobacteria

Pectobacteriumcarotovorum

Stenotrophomonas maltophilia

Pectobacterium aroidearum

Lelliottia amnigena

Stenotrophomonas maltophilia

Enterobacter sp.

Pseudomonas putida

Bordetella petrii

Pseudomonas pseudoalcaligenes

Kerstersia gyiorum

Pseudomonas qingdaonensis

Pseudomonas sp.

Raoultella terrigena

Achromobacter piechaudii

Klebsiella michiganensis

Raoultella ornithinolytica

Cedecea lapagei

Bordetella bronchiseptica

Morganella morganii

Enterobacter cloacae

Pantoea agglomerans

Bacteroidetes

Dysgonomonas capnocytophagoides

Myroides marinus

Dysgonomonas sp.

Dysgonomonas gadei

Myroides marinus

Acidobacteria

Acidobacteria bacterium

Firmicutes

Paenibacillus polymyxa

Paenibacillus amylolyticus

Lactiplantibacillus plantarum

Ascomycota

Barnettozyma californica

Cyberlindnera saturnus

Pichia kudriavzevii