微生物学报

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Restriction enzyme site (underline)
B739_0093 upP1	CCGCTCGAGCGGGCATTACGGTGCAGACTGTCC	Xho I
B739_0093 upP2	GTGGACATAGTACCGCCGCTAATTTCCCCATC
B739_0093 downP1	GATGGGGAAATTAGCGGCGGTACTATGTCCAC
B739_0093 downP2	GACTAGTCGGAGCGGCATTTATTGCGGGG	Spe I
B739_0093 P1	AACTGCAGAACCAATGCATTGGCTTTATCTATTTCACAATTAGTAAGCAACTGCAGAACCAATGCATTGGCTTTATCTAT	Pst I
B739_0093 P2	GCTCTAGAGCTTATTGTTTTATGATTTTTTTGG	Xba I
B739_0093_T P1	GGAATTCCATATGCAAAATGTGACATTCCTGA	Nde I
B739_0093_T P2	GGGGTACCCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAAAGCGTTACATCATCGCTTG	Kpn I
B739_1871_T P1	GGAATTCCATATGATGAAAAAAATTAAATTACTATTG	Nde I
B739_1871_T P2	CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGCAATATCTGATTTACTTG	Xho I
B739_0093 qRTP1	CAGACGGTAGATGTTTCAGG
B739_0093 qRTP2	CCTAGAAACTCTGCTACATTGG

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Restriction enzyme site (underline)
B739_0093 upP1	CCGCTCGAGCGGGCATTACGGTGCAGACTGTCC	Xho I
B739_0093 upP2	GTGGACATAGTACCGCCGCTAATTTCCCCATC
B739_0093 downP1	GATGGGGAAATTAGCGGCGGTACTATGTCCAC
B739_0093 downP2	GACTAGTCGGAGCGGCATTTATTGCGGGG	Spe I
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B739_0093 qRTP2	CCTAGAAACTCTGCTACATTGG

鸭疫里默氏杆菌九型分泌系统(T9SS)分泌蛋白B739_0093的功能鉴定

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江茵 ¹^,²^,³^,⁴^,^# , 罗睿心 ¹^,²^,³^,⁴^,^# , 程安春 ¹^,²^,³^,⁴^,^* , 刘马峰 ¹^,²^,³^,⁴^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(7): 2407-2418

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(7): 2407-2418

鸭疫里默氏杆菌九型分泌系统(T9SS)分泌蛋白B739_0093的功能鉴定

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江茵¹^,²^,³^,⁴^,^#, 罗睿心¹^,²^,³^,⁴^,^#, 程安春¹^,²^,³^,⁴^,^*, 刘马峰¹^,²^,³^,⁴^,^*

作者信息

1 西南动物疫病防控技术教育部工程研究中心, 四川成都 611130

2 四川省动物疫病防控国际联合研究中心, 四川成都 611130

3 动物疫病与人类健康四川省重点实验室, 四川成都 611130

4 四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心, 四川成都 611130

Roles of B739_0093 as a protein secreted by type Ⅸ secretion system (T9SS) inRiemerella anatipestifer

Yin JIANG¹^,²^,³^,⁴, Ruixin LUO¹^,²^,³^,⁴, Anchun CHENG¹^,²^,³^,⁴^,^*, Mafeng LIU¹^,²^,³^,⁴^,^*

Affiliations

1 Engineering Research Center of Southwest Animal Disease Prevention and Control Technology, Ministry of Education, Chengdu 611130, Sichuan, China

2 International Joint Research Center for Animal Disease Prevention and Control of Sichuan Province, Chengdu 611130, Sichuan, China

3 Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu 611130, Sichuan, China

4 Research Center of Avian Disease, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

出版时间: 2024-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230771

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摘要

收起

【目的】鸭疫里默氏杆菌是引起鸭浆膜炎的一种革兰氏阴性病原菌，该菌编码的九型分泌系统(type Ⅸ secretion system, T9SS)参与滑动、致病等过程。前期研究结果表明，鸭疫里默氏杆菌CH-1株B739_0093基因在限铁培养条件明显上调。序列分析表明，B739_0093编码蛋白含有一个T9SS分泌蛋白保守的C端结构域，然而其具体功能未知。本研究旨在鉴定该基因编码蛋白是否被T9SS分泌，以及在该菌致病中的作用。【方法】用荧光定量PCR检测B739_0093是否被铁离子和铁转运调节子(ferric uptake regulator, Fur)调控；用大肠杆菌表达重组B739_0093截短蛋白制备多克隆抗体，通过Western blotting检测是否由T9SS分泌；构建B739_0093基因缺失株，通过毒力和定殖试验鉴定B739_0093在鸭疫里默氏杆菌致病中的功能。【结果】荧光定量PCR结果表明，B739_0093基因在铁离子限制性培养基明显上调，此调控是由调控蛋白Fur介导的；Western blotting结果显示，B739_0093基因编码蛋白在亲本株RA CH-1主要定位在分泌物中，而在T9SS缺失株定位在菌体且不能在分泌物被检测到；与亲本株RA CH-1相比，RA CH-1ΔB739_0093对雏鸭的致病力减弱，在雏鸭各组织器官的定殖能力明显降低。【结论】B739_0093基因编码蛋白是由鸭疫里默氏杆菌T9SS分泌的，其表达受铁离子及Fur调控，并且参与了该菌的致病。

关键词

鸭疫里默氏杆菌 / 九型分泌系统 / 毒力

Abstract

收起

[Objective] Riemerella anatipestifer (RA) is a Gram-negative pathogen that can cause duck serositis. The type Ⅸ secretion system (T9SS) of this bacterium is involved in sliding and pathogenic processes. The previous study showed that the expression ofB739_0093 inR.anatipestifer CH-1 was significantly up-regulated under the iron-limited condition. The sequence analysis showed that the protein encoded byB739_0093 contained a conserved C-terminal domain of the proteins secreted by T9SS, while its function remained unknown. This study aims to identify whether the protein encoded byB739_0093 is secreted by T9SS and the role of this protein in the pathogenesis of this bacterium. [Methods] qPCR was conducted to determine whether the transcription ofB739_0093 was regulated by iron and the ferric uptake regulator (Fur). The recombinant truncated B739_0093 protein was expressed inEscherichia coli, and the polyclonal antibody was prepared. Western blotting was employed to detect whether the protein was secreted by T9SS. Furthermore, we deletedB739_0093 from RA CH-1 and identified the role ofB739_0093 in the pathogenicity ofR.anatipestifer by virulence and colonization tests in ducklings. [Results] The expression ofB739_0093 was significantly up-regulated in the iron-restricted medium, which was mediated by Fur. Western blotting results showed that the protein encoded byB739_0093 was localized in the secretion of the parent strain RA CH-1, while it was localized in the bacterial lysate and not detected in the secretion of the T9SS-deleted strain. Compared with the parent strain RA CH-1, RA CH-1ΔB739_0093 demonstrated attenuated pathogenicity and reduced colonization ability in various tissues and organs of ducklings. [Conclusion] The protein encoded byB739_0093 is secreted by T9SS and involved in the pathogenicity ofR.anatipestifer, and its expression is regulated by iron and Fur.

Key words

Riemerella anatipestifer / type Ⅸ secretion system (T9SS) / virulence

引用本文

江茵, 罗睿心, 程安春, 刘马峰. 鸭疫里默氏杆菌九型分泌系统(T9SS)分泌蛋白B739_0093的功能鉴定. 微生物学报, 2024 , 64 (7) : 2407 -2418 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230771

Yin JIANG, Ruixin LUO, Anchun CHENG, Mafeng LIU. Roles of B739_0093 as a protein secreted by type Ⅸ secretion system (T9SS) inRiemerella anatipestifer[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (7) : 2407 -2418 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230771

正文

收起

细菌的分泌系统(secretion systems)是一种能够将细菌蛋白质分泌到胞外的特殊装置。截至目前，已经确定了8种不同的分泌系统^[1]。九型分泌系统(type Ⅸ secretion system, T9SS)最早被发现在牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中，通过组学分析发现一些蛋白质的组成成分与已知的分泌系统无序列相似性，由此被鉴定为一种新型的分泌系统；T9SS至少由19种蛋白质组分组成^[2-3]，其功能大多是未知的。在已知的研究中，PorU作为清除C端结构域的肽酶，PorZ协助稳定PorU的定位，PorV作为穿梭体运送蛋白质；PorK和PorN参与质周通道的组成，PorL通过传递质子提供能量^[3]。T9SS产生的分泌蛋白含有N端信号肽和保守的C端结构域(C-terminal domain, CTD)，前者协助蛋白被Sec系统识别并穿越细胞膜，后者发出信号定位外膜转座子促进蛋白分泌至胞外，分泌完成后其N端和C端部分会被相应的酶降解或切割^[4]，分泌蛋白大多为各种效应蛋白，如蛋白酶、黏附素、纤维素酶、几丁质和表面层蛋白，因此T9SS能参与细菌的滑动和蛋白质分泌，以及病原体的毒力因子分泌^[2-3]。例如牙龈卟啉单胞菌的毒力依赖于T9SS分泌的牙龈蛋白酶(RgpA、RgpB和Kgp)，它们对于破坏宿主免疫系统以及获取营养物质和血红素至关重要^[5]。约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)的T9SS中与滑动相关基因的缺失会影响ChiA和SprB的分泌，从而影响细菌的侵袭力^[6]。福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)中T9SS的缺失，使其无法进行表面层蛋白的组装和糖基化^[7]。

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是属于拟杆菌门威克斯菌科的革兰氏阴性菌，易感染幼龄时期的鸭、鹅等禽类，会引起纤维素性心包炎、脑膜炎等临床表现甚至导致死亡，这是影响我国鸭养殖业健康发展的重要病原菌^[8]。目前，已有大量研究表明鸭疫里默氏杆菌编码T9SS，并且参与该菌的毒力。例如在RA Yb2菌株中缺失GldM或GldK会导致细菌的滑动、蛋白质分泌以及侵袭能力受损^[9-10]；在RA Yb2中T9SS分泌蛋白金属磷酸酯酶(metallophosphoesterase, MPPE)参与细菌毒力^[11]，SspA通过水解明胶、纤维蛋白原和杆菌肽LL-37介导细菌毒力^[12]；在RA YM菌株中，SprA和SprT蛋白参与降解细菌明胶和毒力^[13-14]。铁离子是鸭疫里默氏杆菌生存所必需的营养物质，该菌铁摄取基因由铁转运调节子(ferric uptake regulator, Fur)调节；当胞内游离铁充足时，Fur蛋白与铁摄取基因的启动子区结合，抑制其转录；相反，当胞内铁缺乏时，Fur蛋白从铁摄取基因启动子区解离，导致铁摄取基因的转录增加^[15]。前期研究发现，RA CH-1株的B739_0093基因在铁限制性条件下出现明显的转录上调现象^[16]，蛋白序列分析表明B739_0093含有一个T9SS分泌蛋白保守的CTD，推测其为T9SS分泌蛋白。本研究旨在探究B739_0093基因编码的蛋白与T9SS的关系，其表达是否受铁离子及Fur的调控，是否参与鸭疫里默氏杆菌的致病。

1 材料与方法

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1.1 菌株、质粒及试剂

菌株RA CH-1、大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta及质粒pOBS、pET32a、pLMF03均由本实验室保存；RA CH-1ΔB739_0093由本研究构建；菌株RA CH-1ΔT9SS和RA CH-1∆fur由本实验室构建、保存^[15,17]。

细菌总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green I嵌合荧光法专用试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司^[18]；完全佐剂及不完全弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich公司；ECL化学发光试剂盒购自Bio-Rad公司；抗生素购自大连美仑生物技术有限公司[使用浓度：卡那霉素(50 μg/mL)、头孢西丁(1 μg/mL)]。

1.2 引物设计及合成

研究使用的基因序列来自NCBI数据库，引物序列由深圳华大基因股份有限公司合成，见表1。RA CH-1Cfx、SacB、16S rRNA基因和RecA荧光定量的引物信息详见参考文献[18]。

1.3 实验动物

BALB/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司，1日龄雏鸭购自成都克里莫育种有限公司，饲养于四川农业大学成都校区实验动物房。动物实验福利伦理审查同意书编号：20210036，20220072。

1.4 荧光定量PCR

将RA CH-1分别于胰酪大豆胨液体培养基(trypticase soy broth, TSB)、TSB+80 µmol/L铁离子螯合剂乙二胺二邻苯基乙酸(ethydiaminedhephen acetic sodium salt, EDDHA)、TSB+80 µmol/L乙二胺二邻苯基乙酸+1 µmol/L硝酸铁[Fe(NO₃)₃]、TSB+80 µmol/L乙二胺二邻苯基乙酸+10 µmol/L硝酸铁条件中，37 ℃、180 r/min培养3 h至对数期(OD₆₀₀约为1.0−1.5)；将RA CH-1Δfur和RA CH-1Δfur pLMF03::fur于37 ℃恒温摇床180 r/min振荡培养至对数期(OD₆₀₀约为1.0−1.5)。根据参考文献[18]提取总RNA、反转录并进行荧光定量。

1.5 表达菌的构建、诱导表达及纯化

以RA CH-1基因组为模板，使用引物B739_0093_T P1/P2 (表1)扩增B739_0093_T截短片段，纯化回收DNA后，通过双酶切(Nde Ⅰ和Kpn Ⅰ)、连接和转化，将截短片段克隆至表达质粒pET32a中得到重组质粒pET32a: :B739_0093_T，将重组质粒转入表达菌E.coli Rosetta。将表达菌E.coli Rosetta pET32a: :B739_0093_T培养至对数期(OD₆₀₀约为0.6−0.8)，再加入0.5 mmol/L IPTG诱导2 h，收集菌体。根据参考文献[19]对蛋白进行纯化。

表达菌Rosetta pET32a: :B739_1871_T的构建、诱导表达及纯化的操作步骤与Rosetta pET32a: :B739_0093_T一致。

1.6 多克隆抗体的制备

取50 µg蛋白与等体积的完全弗氏佐剂进行乳化后，通过背部皮下注射对小鼠进行免疫，每隔7 d进行一次免疫，一共免疫3次，后两次乳化选用不完全弗氏佐剂。三免结束后每隔7 d对小鼠进行眼缘静脉取血，重复3次，收集血清。

1.7 菌株RA CH-1ΔB739_0093和RA CH-1ΔB739_0093 pLMF03::B739_0093的构建

RA CH-1ΔB739_0093无痕缺失株采用自杀质粒pOBS的方法构建^[20]。具体步骤如下：以RA CH-1基因组为模板分别扩增B739_0093基因的上、下游片段，用融合PCR方法得到B739_0093 up-down，并将其克隆至自杀质粒pOBS中。转入S17-1后，通过接合转移再转入RA CH-1中，通过抗性筛选得到RA CH-1 pOBS: :B739_0093 up-down菌株。随后将其培养至对数期后涂布于含有12.5%蔗糖的血平板进行反向筛选，构建RA CH-1ΔB739_0093菌株。

回补株的构建：以RA CH-1基因组为模板扩增B739_0093基因片段，克隆至回补质粒pLMF03中，将重组质粒转入S17-1，通过接合转移转入RA CH-1ΔB739_0093中，构建回补株RA CH-1ΔB739_0093 pLMF03::B739_0093。

1.8 生长曲线的测定

菌株的生长曲线测定实验参考文献[21]进行操作。记录菌株在TSB及TSB+100 µmol/L乙二胺二邻苯基乙酸条件中12 h的OD₆₀₀值，并绘制成生长曲线，实验重复3次。

1.9 蛋白质印迹(Western blotting)检测

为对比B739_0093和B739_1871编码蛋白分别在RA CH-1和RA CH-1ΔT9SS中的定位情况，将上述菌体在20 mL TSB+80 µmol/L乙二胺二邻苯基乙酸中培养至对数期，各取120 µL菌液经离心得到的菌体，用1×蛋白buffer重悬，并于沸水中水浴10 min制成全菌蛋白样。剩余的菌液按照文献[22]提取分泌蛋白，并将蛋白溶于60 µL 1×蛋白buffer中制成分泌蛋白样。根据参照文献[23]进行Western blotting。

1.10 RA CH-1ΔB739_0093的毒力评估和雏鸭体内定殖能力测定

菌株的毒力评估及在雏鸭体内的定殖实验参照文献[24]进行。计算攻毒7 d内的致死率与攻毒48 h后每克组织的载菌量。

1.11 RA CH-1ΔB739_0093的血清杀菌实验

血清杀菌实验参照文献[25]进行。取培养至对数期的菌株经离心后，用1 mL PBS调整OD₆₀₀为1.0，每种菌株各取100 µL分为2组，分别添加等体积PBS或用PBS稀释的30%非灭活鸭血清，37 ℃恒温孵育1 h。取50 µL通过连续稀释后涂布于TSA板上，统计活菌数并计算存活率，实验重复3次。

1.12 实验数据处理

采用软件GraphPad Prism 8中的t检验对实验数据进行统计学分析，误差条表示3次重复实验结果的标准误差，并使用P值表示数据的统计学显著性。

2 结果与分析

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2.1B739_0093转录受铁离子和Fur调控

前期转录组测序结果表明，B739_0093在铁限制性培养基转录上调^[16]。本研究进一步通过荧光定量PCR方法测定了B739_0093基因是否受铁离子调控，以及是否该调控是由调节蛋白Fur所介导。如图1A所示，与TSB培养条件相比，在限铁培养基(TSB+80 μmol/L乙二胺二邻苯基乙酸)中，B739_0093基因转录显著上调；而在限铁培养条件中额外加入铁离子后，B739_0093基因转录开始下调，随着铁离子含量增加，下调倍数增大。如图1B所示，与亲本株相比，B739_0093基因在fur缺失株中明显上调，在回补株中转录水平恢复至亲本株水平。以上结果表明B739_0093基因的转录受铁离子调控，并且由调节蛋白Fur介导。

2.2 Rosetta pET32a: :B739_0093_T蛋白的诱导表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了后续研究B739_0093蛋白定位，本研究构建了B739_0093截短蛋白表达菌E.coli Rosetta pET32a: :B739_0093_T，检测重组蛋白的表达情况。结果如图2A所示，与空载表达菌相比，重组表达菌在34 kDa位置出现蛋白表达条带，表达蛋白以包涵体的形式出现；进一步对重组蛋白进行纯化，结果如图2B所示，与表达菌中表达的蛋白条带大小相符，表明重组B739_0093截短蛋白纯化成功。用该蛋白免疫小鼠后，制备出抗B739_0093截短蛋白多克隆抗体。

2.3B739_0093基因缺失株及回补株的构建

序列分析表明，B739_0093基因编码一个典型的T9SS分泌蛋白。为研究该基因编码蛋白的功能，本研究在RA CH-1株中构建B739_0093基因缺失株及回补株。通过接合转移的方式将重组质粒pOBS: :B739_0093 up-down转入RA CH-1中，经抗性筛选对长出的克隆进行PCR鉴定。如图3A所示，通过PCR能够扩增出Cfx、SacB和16S rRNA基因片段，表明菌株RA CH-1 pOBS: :B739_0093 up-down构建成功。下一步将上述菌株用含蔗糖培养基进行反向筛选，对长出的克隆进行PCR鉴定。如图3B所示，PCR扩增出B739_0093 up-down片段，而不能扩增出Cfx和SacB基因，表明RA CH-1ΔB739_0093无痕缺失株构建成功。

通过接合转移将质粒pLMF03::B739_0093转入RA CH-1ΔB739_0093中，经抗性筛选对长出的克隆进行PCR鉴定。如图3C所示，PCR能够扩增出B739_0093和16S rRNA基因片段，表明回补株构建成功。

2.4 B739_0093蛋白由T9SS分泌

为探究B739_0093蛋白是否由T9SS分泌系统分泌，本研究分别通过Western blotting鉴定了B739_0093分别在RA CH-1和RA CH-1∆T9SS中的定位，用胞浆蛋白RecA作为阴性对照，用已知鸭疫里默氏杆菌T9SS分泌蛋白B739_1871作为阳性对照^[11]。如图4所示，在亲本株RA CH-1菌体蛋白中，B739_1871不能被检测到，RecA可以被检测到，B739_0093可以被隐约检测到，推测是未来得及分泌出菌体的蛋白(泳道1)。在亲本株RA CH-1的分泌蛋白中，B739_1871和B739_0093均可以被检测到，而RecA不能被检测到(泳道2)；在T9SS缺失株RA CH-1ΔT9SS的菌体蛋白，B739_1871不能被检测到，RecA和B739_0093均可以被检测到，推测是T9SS缺失后，B739_0093不能被分泌，所以在菌体中积累(泳道3)。在T9SS缺失株RA CH-1ΔT9SS的分泌蛋白中，B739_1871、RecA、B739_0093均不能被检测到(泳道4)。重组的B739_1871、RecA、B739_0093蛋白均可以被检测到(泳道5)。综上所述，B739_0093蛋白由T9SS系统分泌。

2.5B739_0093基因缺失对RA CH-1在铁限制条件下的生长无影响

为鉴定B739_0093是否参与铁离子的利用，本研究检测了亲本株、B739_0093缺失株(CH-1ΔB739_0093)和回补株(RA CH-1ΔB739_0093^C)在普通及铁限制性条件下的生长情况。如图5所示，与亲本株相比，B739_0093基因缺失株在普通培养基和铁限制性培养基的生长均无影响。

2.6B739_0093基因参与鸭疫里默氏杆菌的毒力与定殖

T9SS参与毒力因子的分泌，本研究进一步测定了B739_0093是否参与了鸭疫里默氏杆菌的毒力作用。用等剂量的亲本株和B739_0093基因缺失株感染3日龄雏鸭，每组10只，并统计攻毒后7 d的致死率。如图6A所示，与亲本株相比，B739_0093缺失株对雏鸭的致死率减弱，在回补B739_0093基因后恢复至亲本株水平。为进一步研究B739_0093基因缺失株毒力减弱是否与定殖能力减弱有关，本研究进一步测定了亲本株与B739_0093缺失株攻毒雏鸭48 h后，各组织器官中的细菌载量，结果如图6B所示，与亲本株相比，B739_0093缺失株组各脏器的平均载菌量都明显下降，在回补B739_0093基因后恢复至亲本株水平。结果表明，B739_0093在鸭疫里默氏杆菌致病中发挥了重要作用。

2.7B739_0093基因缺失后对非灭活血清敏感性无变化

定殖结果表明B739_0093基因缺失株在血液中的载菌量明显下降，本研究进一步通过非灭活血清杀菌试验检测B739_0093是否参与了对非灭活血清的抵抗，结果如图7所示，与亲本株相比，B739_0093基因缺失株对非灭活鸭血清的敏感性无明显差异。

3 讨论与结论

收起

细菌T9SS通过分泌毒力、营养和滑动所需的蛋白质，确保细菌适应并存活于不同的环境中^[26]。大量研究表明T9SS参与细菌毒力因子的分泌^[27]。在鸭疫里默氏杆菌中T9SS的组分蛋白和分泌产物也被发现参与细菌毒力^[9-14]，然而分泌蛋白未被完全鉴定。在前期研究中，铁限制性条件的转录组测序发现，RA CH-1株的B739_0093基因出现明显的转录上调^[16]，在NCBI数据库B739_0093被注释为假定蛋白，通过蛋白序列比对发现其含有一个T9SS分泌蛋白保守的C端结构域，本研究鉴定了是否B739_0093为T9SS分泌蛋白，是否与该菌铁离子的利用相关，以及是否参与了该菌的毒力和定殖。

本研究通过荧光定量PCR的方式比较了亲本株在富铁和限铁条件下B739_0093基因的转录水平，结果显示限铁条件下B739_0093基因显著上调，而额外添加铁离子后转录水平下调，并且铁离子含量越高，下调倍数越大。在革兰氏阴性菌中，大多数受铁离子调控的基因都是通过调节蛋白Fur来介导^[28]。在铁离子丰富条件下，铁离子与Fur形成Holo-Fur并结合在铁离子转运基因的启动子区域，从而抑制铁转运相关基因的表达；当铁离子缺乏时，铁离子从Fur蛋白解离形成Apo-Fur并从铁离子转运基因的启动子区域解离，从而促进铁转运相关基因的表达^[15]。本研究的结果与这一机制相吻合，显示B739_0093基因在fur缺失株中明显上调，表明该基因受铁离子的调控是由Fur介导。由于B739_0093基因受铁离子调控，本研究推测B739_0093参与铁离子的利用。然而，通过对比亲本株和B739_0093基因在铁离子限制性培养基的生长曲线，并未发现在缺铁条件下B739_0093影响了该菌的生长。B739_0093基因为何受铁离子调控以及B739_0093与铁离子利用的关系需要在将来的研究中进一步探究。

由于该蛋白序列含有一个T9SS分泌蛋白保守的C端结构域，推测B739_0093蛋白为T9SS分泌。由于该蛋白的全长蛋白未能在大肠杆菌表达，本研究构建了截短蛋白B739_0093_T (不含C端保守切割区域)的表达菌，并制备鼠源多克隆抗体。通过比对B739_0093蛋白分别在RA CH-1和RA CH-1∆T9SS的定位来判定B739_0093蛋白是否由T9SS分泌。本研究选取了在鸭疫里默氏杆菌中已被证实的T9SS分泌蛋白Metallophosphoesterase，通过NCBI进行序列分析，在RA CH-1中找到相似度为98%的同源蛋白B739_1871^[11]。B739_1871蛋白并未在菌体和T9SS缺失株的分泌蛋白中被检测到，证明其为T9SS分泌蛋白。而B739_0093在菌体蛋白中有少量的存在，这种现象可解释为细菌蛋白的合成、转运、分泌是一个动态的过程，检测到的蛋白为尚未来得及分泌的蛋白。B739_0093可以在亲本株的分泌蛋白中被检测到，而在T9SS缺失株的分泌蛋白中未被检测到，因此说明该蛋白由T9SS分泌。

T9SS参与毒力因子的分泌，由于B739_0093蛋白是由T9SS分泌，本研究进一步评价了B739_0093基因缺失后对雏鸭的致病和定殖能力的影响。结果表明，B739_0093是鸭疫里默氏杆菌的一种毒力因子。

综上所述，本研究鉴定了鸭疫里默氏杆菌CH-1中B739_0093基因编码蛋白由T9SS分泌，其表达受铁离子及Fur调控，并且参与了鸭疫里默氏杆菌的致病，为进一步揭示该菌的致病机制奠定了基础。

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2024年第64卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230771

接收时间：2023-12-14
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-07-04

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收稿日期：2023-12-14
录用日期：2024-05-08

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作者信息

1 西南动物疫病防控技术教育部工程研究中心, 四川成都 611130

2 四川省动物疫病防控国际联合研究中心, 四川成都 611130

3 动物疫病与人类健康四川省重点实验室, 四川成都 611130

4 四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心, 四川成都 611130

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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