微生物学报

Items	Strain
The different letters indicate significant differences of organic acid contents among strains atP < 0.05 level.
Oxalic acid	369.5±12.2a	381.7±7.3a	315.0±31.6b	196.8±3.5c	211.0±2.0c
Malic acid	269.6±10.1e	1 444.1±48.1b	1 336.7±35.8c	1 766.9±2.6a	1 014.9±47.8d
Tartaric acid	222.8±10.7b	186.1±36.4c	42.0±6.6d	444.7±2.8a	436.0±7.7a
Lactic acid	94.8±2.7e	487.2±5.9a	397.8±4.2c	413.5±1.6b	122.0±3.5d
Quinic acid	93.8±80.1a	62.4±56.8a	30.1±1.5a	23.5±1.6a	15.4±0.8a
Shikimic acid	43.3±0.4a	33.9±0.3c	38.0±1.1b	8.4±0.4d	6.6±0.1e
Malonic acid	18.9±2.8d	52.4±0.9c	52.7±4.8c	597.5±32.3a	509.9±5.9b
Citric acid	14.80±2.56c	74.90±10.21a	6.6±1.5d	38.0±1.8b	9.8±0.4d
Succinic acid	2.6±0.2d	25.0±1.6b	14.3±4.3c	11.1±1.6c	84.9±1.2a
Maleic acid	0.57±0.01c	1.98±0.01a	1.43±0.24b	1.62±0.08b	0.55±0.01c
Fumaric acid	1.22±0.06a	0.82±0.01b	1.15±0.18a	0.49±0.02c	0.19±0.01d
Total organic acids	1 131.9±63.6e	2 750.6±148.6b	2 235.8±32.8d	3 502.6±34.0a	2 411.1±56.6c

Items	Strain
The different letters indicate significant differences of organic acid contents among strains atP < 0.05 level.
Oxalic acid	369.5±12.2a	381.7±7.3a	315.0±31.6b	196.8±3.5c	211.0±2.0c
Malic acid	269.6±10.1e	1 444.1±48.1b	1 336.7±35.8c	1 766.9±2.6a	1 014.9±47.8d
Tartaric acid	222.8±10.7b	186.1±36.4c	42.0±6.6d	444.7±2.8a	436.0±7.7a
Lactic acid	94.8±2.7e	487.2±5.9a	397.8±4.2c	413.5±1.6b	122.0±3.5d
Quinic acid	93.8±80.1a	62.4±56.8a	30.1±1.5a	23.5±1.6a	15.4±0.8a
Shikimic acid	43.3±0.4a	33.9±0.3c	38.0±1.1b	8.4±0.4d	6.6±0.1e
Malonic acid	18.9±2.8d	52.4±0.9c	52.7±4.8c	597.5±32.3a	509.9±5.9b
Citric acid	14.80±2.56c	74.90±10.21a	6.6±1.5d	38.0±1.8b	9.8±0.4d
Succinic acid	2.6±0.2d	25.0±1.6b	14.3±4.3c	11.1±1.6c	84.9±1.2a
Maleic acid	0.57±0.01c	1.98±0.01a	1.43±0.24b	1.62±0.08b	0.55±0.01c
Fumaric acid	1.22±0.06a	0.82±0.01b	1.15±0.18a	0.49±0.02c	0.19±0.01d
Total organic acids	1 131.9±63.6e	2 750.6±148.6b	2 235.8±32.8d	3 502.6±34.0a	2 411.1±56.6c

Strains	5% PEG6000	10% PEG6000	20% PEG6000	25% PEG6000
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same PEG6000 concentration atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different PEG6000 concentrations atP < 0.05 level.
i5	459.0±12.6Ab	302.3±23.5Bc	271.5±16.9BCc	238.8±17.5Cbc
i6	341.5±19.9Ac	231.8±23.4Bd	182.8±12.2Cd	167.0±15.9Cc
i9L	193.1±14.1Ad	185.6±35.1Ad	159.5±27.6Ad	198.7±11.7Ac
Qb	588.8±50.9Aa	543.0±25.4Ab	414.2±9.8Bb	327.5±39.3Cb
Qo	683.0±115.1Aa	640.1±47.9Aa	593.2±6.8Aa	519.7±116.6Aa

Strains	5% PEG6000	10% PEG6000	20% PEG6000	25% PEG6000
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same PEG6000 concentration atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different PEG6000 concentrations atP < 0.05 level.
i5	459.0±12.6Ab	302.3±23.5Bc	271.5±16.9BCc	238.8±17.5Cbc
i6	341.5±19.9Ac	231.8±23.4Bd	182.8±12.2Cd	167.0±15.9Cc
i9L	193.1±14.1Ad	185.6±35.1Ad	159.5±27.6Ad	198.7±11.7Ac
Qb	588.8±50.9Aa	543.0±25.4Ab	414.2±9.8Bb	327.5±39.3Cb
Qo	683.0±115.1Aa	640.1±47.9Aa	593.2±6.8Aa	519.7±116.6Aa

Strains	5 ℃	10 ℃	15 ℃	20 ℃
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same temperature atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different temperature atP < 0.05 level.
i5	328.0±3.2Aa	329.6±12.3Ab	328.6±1.5Ab	305.9±0.9Ba
i6	264.3±65.1Bb	283.3±7.3ABd	344.5±9.3Aa	301.8±21.9ABa
i9L	343.5±16.6Aa	307.0±5.6Bc	312.6±7.6Bc	303.9±0.0Ba
Qb	354.3±13.9Aa	371.7±10.8Aa	311.6±8.6Bc	261.7±7.1Cb
Qo	356.8±8.5Ba	375.8±11.6Aa	274.1±1.8Cd	275.6±7.9Cb

Strains	5 ℃	10 ℃	15 ℃	20 ℃
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same temperature atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different temperature atP < 0.05 level.
i5	328.0±3.2Aa	329.6±12.3Ab	328.6±1.5Ab	305.9±0.9Ba
i6	264.3±65.1Bb	283.3±7.3ABd	344.5±9.3Aa	301.8±21.9ABa
i9L	343.5±16.6Aa	307.0±5.6Bc	312.6±7.6Bc	303.9±0.0Ba
Qb	354.3±13.9Aa	371.7±10.8Aa	311.6±8.6Bc	261.7±7.1Cb
Qo	356.8±8.5Ba	375.8±11.6Aa	274.1±1.8Cd	275.6±7.9Cb

青藏高原多年冻土区解磷菌筛选及抗逆能力评价

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张晗昱 ¹^,² , 李丹丹 ¹^,^* , 郑瑾 ¹ , 樊金娟 ² , 王清威 ¹ , 杜显元 ¹ , 任金蔓 ³ , 宋权威 ¹ , 吴慧君 ¹ , 谢加才 ¹

微生物学报 | 极端环境微生物 2024,64(6): 1876-1890

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微生物学报 | 极端环境微生物 2024, 64(6): 1876-1890

青藏高原多年冻土区解磷菌筛选及抗逆能力评价

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张晗昱¹^,², 李丹丹¹^,^*, 郑瑾¹, 樊金娟², 王清威¹, 杜显元¹, 任金蔓³, 宋权威¹, 吴慧君¹, 谢加才¹

作者信息

1 中国石油天然气集团有限公司安全环保技术研究院石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206

2 沈阳农业大学生物科学技术学院, 辽宁沈阳 110866

3 大庆油田水务环保公司, 黑龙江大庆 163712

Screening of phosphorus-solubilizing strains with stress tolerance in the permafrost region of the Qinghai-Xizang Plateau

Hanyu ZHNG¹^,², Dandan LI¹^,^*, Jin ZHENG¹, Jinjuan FAN², Qingwei WANG¹, Xianyuan DU¹, Jinman REN³, Quanwei SONG¹, Huijun WU¹, Jiacai XIE¹

Affiliations

1 State Key Laboratory of Petroleum Pollution Control, China National Petroleum Corporation Research Institute of Safety and Environment Technology, Beijing 102206, China

2 College of Bioscience and Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China

3 Daqing Oilfield Water and Environmental Protection Company, Daqing 163712, Heilongjiang, China

出版时间: 2024-06-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230677

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摘要

收起

【目的】本研究旨在从青藏高原多年冻土区土壤中分离筛选高效解磷菌，为青藏高原土壤中难利用性磷的活化提供菌株资源。【方法】以青藏高原唐古拉山口附近的多年冻土区土壤为研究对象，利用有机磷和无机磷选择性培养基通过平板划线法分离解磷菌，通过16S rRNA基因系统发育分析对菌株进行鉴定，并对解磷菌的解磷能力和抗逆能力进行评价。【结果】分离筛选的5株解磷菌应归于假单胞菌属(Pseudomonas)，包括3株解无机磷菌(i5、i6、i9L)和2株解有机磷菌(Qb和Qo)；30 ℃培养条件下，Qb和Qo上清液有效磷含量分别为534.8 mg/L和723.7 mg/L，显著高于i5、i6、i9L上清液有效磷含量(166.9–210.5 mg/L)；利用不同浓度的聚乙二醇(PEG6000)对菌株进行模拟干旱培养，5株解磷菌在PEG6000处理下均可正常生长，而且Qo上清液有效磷含量最高(519.7–683.0 mg/L)；不同培养温度下，Qb和Qo在5 ℃和10 ℃培养下解磷能力要强于其他菌株的解磷能力。【结论】菌株Qo的耐低温和干旱能力强于其他4株菌，是青藏高原等高寒地区菌肥开发和植被恢复研究重要菌种资源。

关键词

青藏高原 / 多年冻土区 / 解磷菌 / 低温胁迫 / 干旱胁迫

Abstract

收起

[Objective] To isolate efficient phosphorus-solubilizing strains from soils in the permafrost region of the Qinghai-Xizang Plateau and provide strain resources for the activation of unavailable phosphorus in the soil of the Plateau. [Methods] The selective media with organic and inorganic phosphorus were used to isolate phosphorus-solubilizing strains from the soil samples collected in the permafrost region around the Tanggula Pass of the Qinghai-Xizang Plateau by the plate streaking method. The phylogenetic tree was built based on the 16S rRNA gene sequences to identify the strains, and then the phosphorus-solubilizing abilities and stress tolerance of the strains were determined. [Results] Five strains belonging toPseudomonas were isolated, including three inorganic phosphorus-solubilizing strains (i5, i6, and i9L) and two organic phosphorus-solubilizing strains (Qb and Qo). After 7 days of incubation in shake flasks at 30 ℃, the content of available phosphorus in the supernatants of Qb and Qo was 534.8 mg/L and 723.7 mg/L, respectively, which was significantly higher than that (166.9–210.5 mg/L) in the supernatants of i5, i6, and i9L. The available phosphorus content in the supernatant of Qo was the highest (519.7–683.0 mg/L) among the five isolates under different concentrations of PEG6000. The phosphorus-solubilizing abilities of Qb and Qo were stronger than those of the other strains at 5 ℃ and 10 ℃. [Conclusion] Qo outperformed the other strains in terms of tolerance to low temperature and drought stress, serving the development of microbial fertilizers and vegetation restoration in alpine regions such as the Qinghai-Xizang Plateau.

Key words

Qinghai-Xizang Plateau / permafrost region / phosphorus-solubilizing strain / low temperature stress / drought stress

引用本文

张晗昱, 李丹丹, 郑瑾, 樊金娟, 王清威, 杜显元, 任金蔓, 宋权威, 吴慧君, 谢加才. 青藏高原多年冻土区解磷菌筛选及抗逆能力评价. 微生物学报, 2024 , 64 (6) : 1876 -1890 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230677

Hanyu ZHNG, Dandan LI, Jin ZHENG, Jinjuan FAN, Qingwei WANG, Xianyuan DU, Jinman REN, Quanwei SONG, Huijun WU, Jiacai XIE. Screening of phosphorus-solubilizing strains with stress tolerance in the permafrost region of the Qinghai-Xizang Plateau[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (6) : 1876 -1890 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230677

正文

收起

青藏高原位于我国干旱半干旱地区，约占全国陆地总面积的27%。其区域内平均海拔在4 000 m以上，是全球中低纬度地区海拔最高、面积最大的冻土区^[1]。由于特殊的地理环境以及高寒、干旱的气候条件等因素，青藏高原冻土区对环境变化反应极为敏感，是极其脆弱的生态系统^[1-2]。自20世纪末，随着西部大开发的积极推进，青藏公路、青藏铁路、石油管道等工程在青藏高原开始实施，导致青藏高原出现大面积草地退化。目前，对这些遭到破坏的高寒草地进行快速恢复成为青藏高原生态环境保护领域的研究热点。

磷元素参与植物体的新陈代谢过程，是限制植物生长的重要元素之一。然而，土壤中的磷大多以有机态形式存在，这些有机态的磷组分往往不能被植物直接吸收利用^[3-4]。此外，土壤中含量较低的无机磷多以闭蓄态以及非闭蓄态的磷酸铁、磷酸钙或磷酸铝等难溶性磷酸盐形式存在，这些难溶性磷也无法被植物直接利用^[5-6]。因此，大多数生态系统往往受磷元素限制，这意味着磷是制约植被恢复的关键营养元素之一。基于此，将土壤中不溶性或难利用性磷转化为植物可利用性磷对促进青藏高原地区植被恢复具有重要现实意义。

土壤中存在丰富的解磷微生物，这类微生物可以释放有机酸分子将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷，也可以分泌磷酸酶矿化有机磷，从而提高土壤中植物可利用磷含量^[7-8]。随着微生物分子生态学研究技术的快速发展，特别是高通量测序技术的应用，极大地促进了解磷微生物原位分析能力^[9-10]。目前，基于微生物基因组学技术方法已发现具有解磷作用的微生物类群主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮杆菌属(Azotobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)等^[11-13]。开发和利用这些解磷微生物，尤其是对极端生境下解磷菌株的资源挖掘，不仅可以丰富人类利用微生物的种类，还能为生态环保领域发展提供关键的技术支撑。

目前，高寒区解磷菌株的分离筛选工作已受到研究者关注。例如：王亚艺等^[14]从青海省农耕区石灰性土壤中筛选出可提高油菜产量的解磷菌。蔺宝珺等^[15]从青海省高寒草甸根际土中分离获得以假单胞菌(Pseudomonas sp.)为优势种的解磷菌，其解磷量为156.2–511.3 μg/mL。杨婉秋等^[16]在川西北高寒地区筛选出不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratiac)和芽孢杆菌属(Bacillus)等6个属49株解磷菌，其解磷量为10.58–90.27 μg/mL。叶震等^[17]在祁连山高寒草地生态系统筛选出13株解磷菌，其解磷量为130–11 842 μg/mL。不同地区土壤结构、土壤类型和质地条件有所不同，自然环境中微生物的种类也存在差异，这导致不同研究中筛选的解磷菌种类及其解磷能力存在着显著差异。先前这些研究重点关注高寒区解磷菌株分离，然而对于青藏高原冻土区解磷微生物的筛选及菌株抗逆能力研究鲜有报道。

本研究以青藏高原多年冻土区土壤为研究对象，利用有机磷和无机磷选择性培养基分离解磷菌，通过测定菌株的溶磷圈、菌液中pH和上清液有效磷含量等指标分析解磷菌的解磷能力，结合不同干旱梯度和温度梯度培养实验评价菌株的抗逆能力，以期为解决青藏高原冻土区磷限制问题提供优良的菌株资源，将对干旱半干旱冻土区生态恢复具有重要意义。

1 材料与方法

收起

1.1 研究区域和样品采集

研究区域位于西藏自治区那曲市安多县唐古拉山口附近(32°33′10.66′′N, 91°50′3.97′′E)，是典型多年冻土分布区。该区域海拔5 100 m，全年大风日约100 d，年均降水量293–430 mm，年均气温−1.3–2.9 ℃^[18]。区域内主要植被为紫花针茅(Stipa basiplumosa)、火绒草(Leontopodium leontopodioides)、羽柱针茅(Stipa subsessiliflora)、青藏苔草(Carex moorcroftii)和垫状驼绒藜(Krascheninnikovia compacta)。土壤发育程度较低，多为石灰性土。

2022年8月，在唐古拉山口附近，距109国道垂直距离100–150 m范围内采集0–10 cm的土壤样品。通过五点取样法采集2 kg土样，并按四分法对采集的土样进行混匀。混匀后的土样分成2份：一份4 ℃保存用于解磷菌株分离；另一份土样风干后过2 mm筛，用于全量养分测定。土壤pH值为8.2，有机碳含量为4.31 g/kg，全氮含量为3.08 mg/kg，全磷含量为0.53 g/kg。

1.2 培养基

无机磷选择性液体培养基(g/L)^[19]：葡萄糖10.00，Ca₃(PO₄)₂ 5.00，(NH₄)₂SO₄ 0.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO₄·7H₂O 0.30，FeSO₄·7H₂O 0.03，MnSO₄·4H₂O 0.03，酵母浸粉0.50，pH 7.0–7.5。

有机磷选择性液体培养基(g/L)^[20]：葡萄糖10.00，植酸钙5.00，MgCl₂·6H₂O 5.00，MgSO₄·7H₂O 0.25，KCl 0.20，(NH₄)₂SO₄ 0.10，pH 6.8–7.0。

肉汤培养基(LB) (g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0–7.2。

固体培养基：在液体培养基中加入15.0 g/L琼脂。

在进行实验前，上述所有培养基以及实验过程中所需的蒸馏水和涂布器等需要121 ℃灭菌20 min。

1.3 解磷菌的分离及纯化

将5 g鲜土加入到45 mL已灭菌的蒸馏水中，在180 r/min下振荡培养30 min。取1 mL混匀液分别加入到100 mL有机磷和无机磷选择性液体培养基中，在30 ℃、180 r/min下富集培养7 d。采用10倍稀释法，分别吸取80 μL 10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶的土悬液，均匀涂布于有机磷和无机磷固体培养基上，每个稀释度均设置3个重复。涂好后的平板在室温下静置5–10 min，待菌液吸附到培养基内，用封口膜封口。平板倒置于30 ℃恒温培养箱中培养5–7 d，有透明圈产生的菌落初步确定为具有解磷能力的菌株。挑选可产生透明圈且菌落大小和形态不同的单菌落进行纯化5次。最后，将纯化后获得的单菌接种在LB斜面培养基上，放置于4 ℃冰箱保存。

1.4 菌株16S rRNA基因序列分析

采用DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取解磷菌的基因组DNA。采用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′)进行PCR扩增^[21]。PCR反应体系(20 μL)：10×Ex Taq buffer 2.0 µL，Ex Taq 0.2 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 1.6 μL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 13.7 µL。PCR反应条件：95 ℃预处理5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25个循环；72 ℃延伸10min。将扩增的PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因测序。利用SeqMan进行序列拼接，使用EzBioCloud数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行16S rRNA基因序列比对。利用MEGA 11.0软件，采用neighbor-joining方法通过Kimura 2-parameter模型构建系统发育树，设置bootstrap=1 000进行检验评估^[22]。

1.5 菌株生长曲线绘制

取OD₆₀₀为0.1的菌悬液1 mL，转接于50 mL的LB液体培养基中，在5、10、15、20、30 ℃条件下振荡培养(180 r/min)，测定不同培养时间下菌液的OD₆₀₀值，并分别以培养时间和OD₆₀₀值为横坐标和纵坐标绘制菌株生长曲线。

1.6 菌株解磷能力的测定

1.6.1 溶磷指数测定

将4 ℃保存的菌株接种于LB液体培养基中，在30 ℃、180 r/min下培养过夜。将培养后的菌液浓度调整OD₆₀₀为1.0，取7 μL菌悬液接种于选择性固体培养基上，在30 ℃培养箱中倒置培养。培养7 d后，根据透明圈直径(H)和菌落直径(h)的比值计算溶磷指数(H/h)，初步评价菌株解磷能力。

1.6.2 pH测定

取OD₆₀₀为1.0的菌液0.5 mL，加入50 mL有机磷和无机磷选择性液体培养基中，置于30 ℃、180 r/min的摇床中培养。培养7 d后，经10 000 r/min离心15 min，用pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定上清液pH值。将不接种菌株的液体培养基设置为对照组，每组3个重复。

1.6.3 有效磷含量测定

采用钼锑抗比色法测定菌株的解磷量^[15]。取1.6.2节获得的上清液2.5 mL置于50 mL容量瓶中，加入2滴2-硝基苯酚指示剂，再滴加稀硫酸直至无色，最后加入5 mL钼锑抗显色剂，用蒸馏水定容。室温条件下反应30 min后，用酶标仪(北京伯腾仪器有限公司)测定OD₇₂₀的吸光值。

1.7 菌株分泌有机酸能力测定

取1.6.2节获得的上清液1 mL，过0.22 μm水系滤膜后，利用高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)对5株解磷菌分泌的有机酸组分含量进行测定。色谱柱为TSKgel ODS-100V (4.6 mm×250 mm, 5.0 μm)，检测器(variable wavelength detector, VWD)，流动相为100.0%–0.1%磷酸水解液等度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为30 μL，检测波长设定210 nm^[23-24]。

1.8 菌株耐低温和耐干旱能力测定

耐低温能力测定：取OD₆₀₀为0.1的菌悬液1 mL，以2%的接种量接种于选择性液体培养基中，分别置于5、10、15、20 ℃培养箱中振荡培养7 d。采用钼锑抗比色法^[15]测定4个培养温度下上清液中有效磷含量。

耐干旱能力测定：聚乙二醇(PEG6000)浓度设置为5%、10%、20%和25%，用于解磷菌抗干旱能力评价研究。取OD₆₀₀为0.1的菌悬液1 mL，以2%的接种量接种于含有PEG6000的选择性液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养7 d后，采用钼锑抗比色法^[15]测定上清液中有效磷含量。

1.9 数据分析

数据均以平均值±标准差(standard deviation, SD)表示。采用单因素方差分析，通过Duncan检验对5株解磷菌的解磷能力和分泌有机酸能力进行显著性分析。利用Spearman相关分析评价菌株上清液中有效磷含量与有机酸含量之间的关系。所有统计分析采用P < 0.05表示显著差异。利用Origin 2022进行作图，运用SPSS 27对数据进行方差分析。

2 结果与分析

收起

2.1 解磷菌16S rRNA基因序列测定及其分析

利用无机磷和有机磷选择性培养基从青藏高原多年冻土区土壤中分离得到7株解无机磷菌和19株解有机磷菌。通过H/h比值选择溶磷圈明显且具有稳定解磷能力的菌株5株，包括3株解无机磷菌(i5、i6和i9L)和2株解有机磷菌(Qb和Qo) (图1)。

基于16S rRNA基因的系统发育分析，5株解磷菌应归于假单胞菌属(Pseudomonas) (图2)。其中，i5菌株与西里西亚假单胞菌(Pseudomonassilesiensis) A3相似度达99.65%；i6菌株与米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae) NBRC 103157相似度达99.29%；i9L菌株与Pseudomonas crudilactis UCMA 17988相似度达99.29%，Qb和Qo菌株与Pseudomonas cyclaminis MAFF 301449相似度分别为100.00%和99.79% (图2)。5株解磷菌的16S rRNA基因序列已提交至GenBank数据库。i5、i6、i9L、Qb和Qo登录号分别为OR591261、OR591260、OR591262、OR591263和OR591264。

2.2 菌株生长曲线特征

菌株在不同培养温度下的生长曲线如图3所示。在30 ℃时，5株解磷菌在培养12–22 h后进入稳定期(图3A)。在10、15、20 ℃时，i6、i9L、Qb和Qo在培养50 h后进入稳定期(图3B、3C、3D)。在5 ℃时，i6、i9L、Qb和Qo进入到稳定期大约需要培养100 h，i5则需要培养140 h左右进入稳定期(图3E)。进入稳定期的5株解磷菌OD₆₀₀值比较结果显示：Qb和Qo的OD₆₀₀值在5–20 ℃时高于i5、i6和i9L的OD₆₀₀值，在30 ℃时则低于i5、i6和i9L的OD₆₀₀值。不同培养温度下，进入稳定期的Qb和Qo的OD₆₀₀值在15 ℃时最高(图3)。

2.3 解磷菌的解磷能力分析

通过溶磷指数(H/h)可以看出，i5、i6和i9L菌株的溶磷圈直径与菌落直径的比值低于Qb和Qo (图4A)。5株菌的上清液pH变化范围为4.8–5.8，Qb和Qo上清液的pH显著低于i5、i6和i9L (P < 0.05，图4B)。从菌株的解磷量上来看，菌株i5、i6和i9L上清液中有效磷含量为166.9–210.5 mg/L，显著均低于菌株Qb (534.8 mg/L)和Qo (723.7 mg/L)上清液中有效磷含量(图4C)。

2.4 解磷菌分泌有机酸种类及其含量

如表1所示，5株解磷菌均可分泌草酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、奎宁酸、莽草酸、丙二酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸和富马酸。解磷菌分泌总有机酸的量为Qb > i6 > Qo > i9L > i5。苹果酸、草酸、乳酸和酒石酸是解无机磷菌分泌的主要有机酸组分；苹果酸、丙二酸、酒石酸和乳酸是解有机磷菌分泌的主要有机酸组分。相关分析结果显示，菌株上清液中有效磷含量与酒石酸和丙二酸含量呈显著正相关(P < 0.01，图5)。

2.5 干旱胁迫下菌株的解磷量分析

不同浓度PEG6000干旱胁迫处理下，Qo上清液中有效磷含量最高(P < 0.05，表2)。随着PEG6000浓度的增加，5株解磷菌上清液中有效磷含量大体呈现下降趋势。与浓度为5% PEG6000相比，25% PEG6000处理下的i5、i6、Qb和Qo上清液中有效磷含量分别降低了48%、51%、44%和24% (表2)。

2.6 不同培养温度下菌株的解磷量分析

如表3所示，解有机磷菌Qb和Qo在10 ℃培养时上清液中有效磷含量显著高于该菌株在其他培养温度下上清液中有效磷含量(P < 0.05)。菌株i9L和菌株i6分别在5 ℃和15 ℃培养时上清液中有效磷含量最高，高于其他培养温度下上清液中有效磷含量。此外，菌株i5在5、10和15 ℃培养时上清液中有效磷含量相近，但显著高于20 ℃培养时上清液中有效磷含量(P < 0.05)。不同菌株在相同培养温度下的解磷量分析发现，解有机磷在低温5 ℃和10 ℃培养时上清液中有效磷含量显著高于解无机磷菌，而在20 ℃培养时显著低于解无机磷菌上清液中有效磷含量(P < 0.05)。

3 讨论

收起

本研究通过选择性培养基首次从西藏多年冻土区土壤中筛选出3株解无机磷菌和2株解有机磷菌，均为假单胞菌属，这可能是因为假单胞菌属的细菌在环境中分布广泛，而且具有较强的环境适应能力^[25]。马福林等^[26]确实也从西藏沙棘根瘤中分离出4株具有促生作用的假单胞菌；李明源等^[27]在祁连山高寒地区筛选出的87株植物促生细菌(plant growth promoting bacteria, PGPB)，其中85%以上的菌株为假单胞菌。李琦等^[28]从青海省高寒草地燕麦根际处也筛选出以假单胞菌为优势种且具有解磷功能的菌株。本研究和先前这些研究结果表明了假单胞菌在高寒地区广泛分布，而且较其他属的菌株更易分离获得。此外，还考虑到高寒地区特殊生境中微生物活性较弱且生长速度较慢等因素^[7]，因此在解磷菌分离过程中选择大部分微生物代谢功能最活跃的适宜温度(30 ℃)培养，并在培养基中添加少量成分的酵母浸粉，这将有利于微生物的快速生长。较高的培养温度及丰富的营养液组分可能会刺激生长速度较快的假单胞菌属的微生物繁殖。在未来的研究中，我们将改变富集培养条件试图分离纯化获得更丰富的解磷菌株资源。

尽管本研究中所分离的解磷菌均为假单胞菌属，但5株菌的解磷能力存在显著差异。根据溶磷圈直径(H)与菌落直径(h)的比值初步评价菌株解磷能力，其比值越大往往说明菌株的解磷能力越强^[29-30]。解有机磷菌株Qb和Qo的H/h比值大于解无机磷菌株i5、i6和i9L的H/h比值。在30 ℃条件下培养7 d后，Qb和Qo上清液有效磷含量分别为534.8 mg/L和723.7 mg/L，显著高于菌株i5 (198.7 mg/L)、i6 (166.9 mg/L)和i9L (210.5 mg/L)上清液中有效磷含量。该研究发现解有机磷菌在30 ℃培养条件下比解无机磷菌具有更强的解磷能力。此外，菌株Qb和Qo上清液有效磷的含量高于相同培养条件下的马福林等^[26]、高亚敏等^[31]和蔺宝珺等^[15]从高寒草甸土壤中分离的解磷菌。这可能是因为地理环境的不同导致解磷菌种类及其产酸能力和代谢途径等生理功能存在差异，进而表现出不同的解磷能力^[32]。

产酸是解磷菌解磷的主要途径之一。有机酸一方面可以降低环境pH，另一方还可以与钙、铝、铁和镁等金属阳离子螯合，从而将难溶性磷转化为可溶性磷。一些研究中也证实了解磷菌的解磷能力与pH呈显著负相关^[33-34]。本研究中也发现了5株菌的解磷能力随着上清液的pH值降低而显著增强。通过有机酸组成分析可以看出，5株菌均可分泌草酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、奎宁酸、莽草酸、丙二酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸和富马酸。5株解磷菌分泌总有机酸的量在1 131.9–3 502.6 mg/L之间，显著高于蔺宝珺等^[15]报道的4株解磷菌分泌的总有机酸量(522.0–900.0 mg/L)。已有研究指出葡萄糖酸在解磷菌解磷过中发挥主要作用^[35-37]。此外，也有研究发现吲哚乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、苯乙酸、乳酸、琥珀酸、延胡索酸和富马酸等物质也是解磷菌分泌的重要有机酸组分^[38]。本研究中发现苹果酸是5株解磷菌分泌量较高的有机酸组分，这与蔺宝珺等^[15]关于高寒区土壤解磷菌分泌有机酸组分测定的研究结果相一致。由于不同类型的有机酸分子与金属离子之间的结合能力存在差异，因此不能仅通过有机酸分泌量来判断菌株的解磷能力^[37]。相关分析结果显示菌株上清液中有效磷含量与酒石酸和丙二酸含量呈显著正相关(P < 0.01)，表明酒石酸和丙二酸是影响该研究区域解磷菌解磷能力的关键有机酸组分。与解无机磷菌株相比，解有机磷菌具有更强的分泌酒石酸和丙二酸的能力。然而，解磷菌不仅依赖于分泌有机酸，还会通过分泌磷酸酶或释放H⁺、NH₄⁺、CO₂等途径调控解磷过程^[3]。因此，在未来的研究中我们将在关注解磷菌的解磷能力的基础上进一步对解磷机制开展更深入的研究。

PEG6000可以通过调节细胞渗透势以及细胞代谢来营造干旱环境^[39]。本研究分别设置轻度干旱胁迫(PEG6000浓度为5%和10%)、中度干旱胁迫(PEG6000浓度为20%)和重度干旱胁迫(PEG6000浓度为25%)培养实验进一步评价所筛选的5株解磷菌的耐干旱能力。5株菌上清液中有效磷含量大体随着PEG6000浓度的增高而呈下降趋势，这可能是因为高浓度PEG6000处理会抑制菌株的生长。吉泽等^[40]研究也发现了马铃薯内生益生细菌的生存能力在PEG6000干旱胁迫下会显著降低。一般来说，微生物处于干旱环境下会导致其细胞功能会发生不可逆损伤。然而，微生物在干旱加剧环境下也会进化出相应的适应机制。耐干旱菌株通常会分泌更多的胞外多糖，该物质有利于微生物向环境极大程度获取并储存水分，有助于保护胞内的水分流失^[41-42]。在本研究中，Qo上清液有效磷含量在不同浓度PEG6000处理下均显著高于其他4株解磷菌，进一步说明该菌株在所分离的高活性解磷菌中具有较强的抗旱能力。

本研究还发现5株解磷菌在5–15 ℃条件下的解磷能力要强于20 ℃条件下的解磷能力，表明菌株具有较好的适应低温能力。先前也有研究从深海沉积、雪冰、极地土壤以及其他寒冷环境中分离获得适应低温的微生物^[43-44]。这些微生物能在低温条件下存活并保持较高活性，主要是依赖于其长期生存在低温环境下并能够形成与环境相适应的独特的细胞膜膜脂结构来实现的。低温往往会降低常温环境下菌株的细胞膜流动性，导致微生物的生理功能丧失。然而，耐低温菌株会通过提高细胞膜不饱和脂肪酸比例、缩短脂肪酸链平均链长、增加甲基分支以及顺式脂肪酸比例等方式来防止细胞膜从液晶态转变到凝胶态，从而维持膜的流动性^[45-47]。因此，本研究中所分离的5株解磷菌来源于西藏高寒多年冻土区土壤，不同于从常温环境中分离的解磷菌，其解磷能力在适宜生长温度条件下随着培养温度的升高而增强^[48-49]。本研究还发现，5株解磷菌生长到稳定期所需时间随着培养温度的降低而延长，这与孙健等^[50]研究结果一致。在5–20 ℃条件下，进入稳定期的Qb和Qo的OD₆₀₀值要高于解无机磷菌的OD₆₀₀值，这反映了解有机磷菌可能具有更强的耐低温能力。此外，菌株Qb和Qo上清液有效磷含量仅在5 ℃和10 ℃培养时显著高于其他菌株上清液有效磷含量，进一步表明解磷菌在低温条件下的生物量积累不能完全代表菌株的解磷能力。已有研究指出，耐低温菌株在低温环境下维持较高活性往往与其自身能够产生对热不稳定的低温酶有密切关系；这类耐低温酶大多属于环状结构，通过增加表面电荷以及减少盐键、氢键和疏水键等方法来提高酶的柔韧性，进而保证其功能活性的稳定^[51]。

4 结论

收起

本研究利用选择性培养基从青藏高原多年冻土区土壤中筛选出3株解无机磷菌(i5、i6和i9L)和2株解有机磷菌(Qb和Qo)。基于16S rRNA基因系统发育分析结果表明，5株解磷菌均为假单胞菌属(Pseudomonas)。然而，5株菌在解磷能力、抗干旱和耐低温能力等方面存在显著的差异。通过解磷菌的溶磷指数、上清液pH和有效磷含量的测定，揭示了Qb和Qo解磷能力强于i5、i6和i9L的解磷能力。通过PEG6000模拟干旱胁迫处理以及低温培养实验发现，菌株Qo较其他菌株具备更强的耐干旱和低温的能力。本研究将为青藏高原多年冻土区土壤难利用性磷活化提供重要菌株资源，对于支撑青藏高原冻土区土壤修复和植物生长具有重要意义。

基金

收起

中国石油天然气集团有限公司安全环保技术研究院有限公司科学研究与技术开发项目(RISE2022KY08)
中国博士后科学基金(2022M713468)
中国石油天然气集团有限公司科技项目(2023ZZ1303)
中国石油天然气集团有限公司基础科学和战略储备技术研究基金(2022DQ03-A5)

参考文献

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文献

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2024年第64卷第6期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230677

接收时间：2023-11-03
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-06-04

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收稿日期：2023-11-03
录用日期：2024-04-17

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Scientific Research and Technology Development Program of China National Petroleum Corporation Research Institute of Safety and Environment Technology(RISE2022KY08)

中国石油天然气集团有限公司安全环保技术研究院有限公司科学研究与技术开发项目(RISE2022KY08)

China Postdoctoral Science Foundation(2022M713468)

中国博士后科学基金(2022M713468)

Science and Technology Program of China National Petroleum Corporation(2023ZZ1303)

中国石油天然气集团有限公司科技项目(2023ZZ1303)

Basic Science and Strategic Reserves Technology Research Fund Program of China National Petroleum Corporation(2022DQ03-A5)

中国石油天然气集团有限公司基础科学和战略储备技术研究基金(2022DQ03-A5)

作者信息

1 中国石油天然气集团有限公司安全环保技术研究院石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206

2 沈阳农业大学生物科学技术学院, 辽宁沈阳 110866

3 大庆油田水务环保公司, 黑龙江大庆 163712

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20230677

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Items	Strain
The different letters indicate significant differences of organic acid contents among strains atP < 0.05 level.
Oxalic acid	369.5±12.2a	381.7±7.3a	315.0±31.6b	196.8±3.5c	211.0±2.0c
Malic acid	269.6±10.1e	1 444.1±48.1b	1 336.7±35.8c	1 766.9±2.6a	1 014.9±47.8d
Tartaric acid	222.8±10.7b	186.1±36.4c	42.0±6.6d	444.7±2.8a	436.0±7.7a
Lactic acid	94.8±2.7e	487.2±5.9a	397.8±4.2c	413.5±1.6b	122.0±3.5d
Quinic acid	93.8±80.1a	62.4±56.8a	30.1±1.5a	23.5±1.6a	15.4±0.8a
Shikimic acid	43.3±0.4a	33.9±0.3c	38.0±1.1b	8.4±0.4d	6.6±0.1e
Malonic acid	18.9±2.8d	52.4±0.9c	52.7±4.8c	597.5±32.3a	509.9±5.9b
Citric acid	14.80±2.56c	74.90±10.21a	6.6±1.5d	38.0±1.8b	9.8±0.4d
Succinic acid	2.6±0.2d	25.0±1.6b	14.3±4.3c	11.1±1.6c	84.9±1.2a
Maleic acid	0.57±0.01c	1.98±0.01a	1.43±0.24b	1.62±0.08b	0.55±0.01c
Fumaric acid	1.22±0.06a	0.82±0.01b	1.15±0.18a	0.49±0.02c	0.19±0.01d
Total organic acids	1 131.9±63.6e	2 750.6±148.6b	2 235.8±32.8d	3 502.6±34.0a	2 411.1±56.6c

Items

Strain

i9L

The different letters indicate significant differences of organic acid contents among strains atP < 0.05 level.

Oxalic acid

369.5±12.2a

381.7±7.3a

315.0±31.6b

196.8±3.5c

211.0±2.0c

Malic acid

269.6±10.1e

1 444.1±48.1b

1 336.7±35.8c

1 766.9±2.6a

1 014.9±47.8d

Tartaric acid

222.8±10.7b

186.1±36.4c

42.0±6.6d

444.7±2.8a

436.0±7.7a

Lactic acid

94.8±2.7e

487.2±5.9a

397.8±4.2c

413.5±1.6b

122.0±3.5d

Quinic acid

93.8±80.1a

62.4±56.8a

30.1±1.5a

23.5±1.6a

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Shikimic acid

43.3±0.4a

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Malonic acid

18.9±2.8d

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52.7±4.8c

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Citric acid

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Succinic acid

2.6±0.2d

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Maleic acid

0.57±0.01c

1.98±0.01a

1.43±0.24b

1.62±0.08b

0.55±0.01c

Fumaric acid

1.22±0.06a

0.82±0.01b

1.15±0.18a

0.49±0.02c

0.19±0.01d

Total organic acids

1 131.9±63.6e

2 750.6±148.6b

2 235.8±32.8d

3 502.6±34.0a

2 411.1±56.6c

Strains	5% PEG6000	10% PEG6000	20% PEG6000	25% PEG6000
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same PEG6000 concentration atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different PEG6000 concentrations atP < 0.05 level.
i5	459.0±12.6Ab	302.3±23.5Bc	271.5±16.9BCc	238.8±17.5Cbc
i6	341.5±19.9Ac	231.8±23.4Bd	182.8±12.2Cd	167.0±15.9Cc
i9L	193.1±14.1Ad	185.6±35.1Ad	159.5±27.6Ad	198.7±11.7Ac
Qb	588.8±50.9Aa	543.0±25.4Ab	414.2±9.8Bb	327.5±39.3Cb
Qo	683.0±115.1Aa	640.1±47.9Aa	593.2±6.8Aa	519.7±116.6Aa

Strains

5% PEG6000

10% PEG6000

20% PEG6000

25% PEG6000

Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same PEG6000 concentration atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different PEG6000 concentrations atP < 0.05 level.

459.0±12.6Ab

302.3±23.5Bc

271.5±16.9BCc

238.8±17.5Cbc

341.5±19.9Ac

231.8±23.4Bd

182.8±12.2Cd

167.0±15.9Cc

i9L

193.1±14.1Ad

185.6±35.1Ad

159.5±27.6Ad

198.7±11.7Ac

588.8±50.9Aa

543.0±25.4Ab

414.2±9.8Bb

327.5±39.3Cb

683.0±115.1Aa

640.1±47.9Aa

593.2±6.8Aa

519.7±116.6Aa

Strains	5 ℃	10 ℃	15 ℃	20 ℃
Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same temperature atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different temperature atP < 0.05 level.
i5	328.0±3.2Aa	329.6±12.3Ab	328.6±1.5Ab	305.9±0.9Ba
i6	264.3±65.1Bb	283.3±7.3ABd	344.5±9.3Aa	301.8±21.9ABa
i9L	343.5±16.6Aa	307.0±5.6Bc	312.6±7.6Bc	303.9±0.0Ba
Qb	354.3±13.9Aa	371.7±10.8Aa	311.6±8.6Bc	261.7±7.1Cb
Qo	356.8±8.5Ba	375.8±11.6Aa	274.1±1.8Cd	275.6±7.9Cb

Strains

5 ℃

10 ℃

15 ℃

20 ℃

Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference in the available phosphorus content among strains under the same temperature atP < 0.05 level. Different uppercase letters in the same row indicate the difference in the available phosphorus for the same strains under different temperature atP < 0.05 level.

328.0±3.2Aa

329.6±12.3Ab

328.6±1.5Ab

305.9±0.9Ba

264.3±65.1Bb

283.3±7.3ABd

344.5±9.3Aa

301.8±21.9ABa

i9L

343.5±16.6Aa

307.0±5.6Bc

312.6±7.6Bc

303.9±0.0Ba

354.3±13.9Aa

371.7±10.8Aa

311.6±8.6Bc

261.7±7.1Cb

356.8±8.5Ba

375.8±11.6Aa

274.1±1.8Cd

275.6±7.9Cb