微生物学报

Region	Number of samples	Water content (%)	pH	Nitrogen salt dry weight of soil(μg/g)		Percentage of soil particle size (%)	Total phosphorus, sulfate ions, and chloride ions dry weight of soil (μg/g)		Metal element dry weight of soil (mg/g)
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. /: No detection.
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Region	Number of samples	Water content (%)	pH	Nitrogen salt dry weight of soil(μg/g)		Percentage of soil particle size (%)	Total phosphorus, sulfate ions, and chloride ions dry weight of soil (μg/g)		Metal element dry weight of soil (mg/g)
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. /: No detection.
1	35	10.8	6.8	5.97	3.87	720	22.6	14.9	11.8	26.9	9.9	13.9	377.1	49.9	29.1	77.2	36.9	21.3	7.7	11.0	10.2	0.677	0.094	0.020
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Sampling area	Mcystis	Msarcina	Mbacter	Mcaldum	Msinus	RPC-2	USC-γ	RPCs	USC-α	JRC-3	LWs	JR3	JR2
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. Mcystis:Methylocystis; Msarcina:Methylosarcina; Mbacter:Methylobacter; Mcaldum:Methylocaldum; Msinus:Methylosinus; RPC-2: Rice paddy cluster-2; USC-γ: Upland soil cluster-γ; RPCs: Rice paddy clusters; USC-α: Upland soil cluster-alpha; JRC-3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; LWs: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR2: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs. /: No detection.
1	Gas field	41.5	4.8	0.5	0.2	/	29.7	2.1	15.5	1.6	/	/	/	/
Background	2.5	0.9	0.1	0.1	/	2.1	88.2	0.4	3.2	/	/	/	/
2	Oil field	84.9	2.5	/	/	1.6	3.3	/	3.0	0.1	0.0	/	/	/
Background	16.1	3.7	/	1.9	52.9	1.4	/	5.3	0.6	11.2	/	/	/
3	Oil field	29.7	4.5	/	0.9	47.2	1.6	/	2.4	0.6	6.4	/	/	/
Background	44.2	9.0	/	/	0.8	1.8	/	7.5	25.7	0.2	/	/	/
4	Oil field	1.3	/	0.1	2.9	42.6	0.2	37.3	1.5	/	/	0.0	/	/
Background of oil field	2.3	/	74.6	4.2	3.3	1.5	3.1	5.3	/	/	0.4	/	/
Gas field	14.5	/	2.9	3.4	7.9	9.6	1.3	46.5	/	/	1.3	/	/
Background of gas field	1.5	/	15.3	0.3	0.2	15.0	0.8	39.2	/	/	20.3	/	/
5	Oil field	2.0	1.4	/	/	28.5	/	53.8	1.3	/	6.1	/	3.2	0.1
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6	Oil field	2.4	2.7	/	/	29.2	/	5.4	1.4	/	6.6	/	1.3	43.5
Background	3.8	1.2	/	/	34.0	/	49.9	1.6	/	4.8	/	0.1	0.1
7	Gas field	2.6	1.0	/	/	39.2	/	45.3	1.2	/	4.3	/	2.4	0.1
Background	1.5	1.0	/	/	19.9	/	46.5	1.7	/	2.9	/	23.7	0.2

Sampling area	Mcystis	Msarcina	Mbacter	Mcaldum	Msinus	RPC-2	USC-γ	RPCs	USC-α	JRC-3	LWs	JR3	JR2
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. Mcystis:Methylocystis; Msarcina:Methylosarcina; Mbacter:Methylobacter; Mcaldum:Methylocaldum; Msinus:Methylosinus; RPC-2: Rice paddy cluster-2; USC-γ: Upland soil cluster-γ; RPCs: Rice paddy clusters; USC-α: Upland soil cluster-alpha; JRC-3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; LWs: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR2: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs. /: No detection.
1	Gas field	41.5	4.8	0.5	0.2	/	29.7	2.1	15.5	1.6	/	/	/	/
Background	2.5	0.9	0.1	0.1	/	2.1	88.2	0.4	3.2	/	/	/	/
2	Oil field	84.9	2.5	/	/	1.6	3.3	/	3.0	0.1	0.0	/	/	/
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4	Oil field	1.3	/	0.1	2.9	42.6	0.2	37.3	1.5	/	/	0.0	/	/
Background of oil field	2.3	/	74.6	4.2	3.3	1.5	3.1	5.3	/	/	0.4	/	/
Gas field	14.5	/	2.9	3.4	7.9	9.6	1.3	46.5	/	/	1.3	/	/
Background of gas field	1.5	/	15.3	0.3	0.2	15.0	0.8	39.2	/	/	20.3	/	/
5	Oil field	2.0	1.4	/	/	28.5	/	53.8	1.3	/	6.1	/	3.2	0.1
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6	Oil field	2.4	2.7	/	/	29.2	/	5.4	1.4	/	6.6	/	1.3	43.5
Background	3.8	1.2	/	/	34.0	/	49.9	1.6	/	4.8	/	0.1	0.1
7	Gas field	2.6	1.0	/	/	39.2	/	45.3	1.2	/	4.3	/	2.4	0.1
Background	1.5	1.0	/	/	19.9	/	46.5	1.7	/	2.9	/	23.7	0.2

Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.173	0.127	0.127	0.265
NO_X⁻-N	−0.240	0.033*	−0.211	0.062
NH₄⁺-N	−0.336	0.002**	−0.388	0.000**
pH	−0.221	0.050	−0.295	0.008*
Particles (<2 μm)	0.069	0.543	0.194	0.086
Particles (2−5 μm)	0.244	0.030*	0.269	0.017*
Particles (5−10 μm)	0.189	0.095	0.165	0.147
Particles (10−50 μm)	0.062	0.585	0.044	0.697
Particles (50−100 μm)	−0.311	0.005**	−0.426	0.000**
Particles (100−500 μm)	−0.042	0.715	−0.117	0.305
Particles (500−1 000 μm)	0.042	0.714	0.019	0.868
Total N	0.094	0.408	0.271	0.016*
P	0.102	0.370	0.113	0.320
SO₄²⁻	−0.504	0.000**	−0.301	0.023*
Cl⁻	−0.464	0.000**	−0.364	0.005**
Al	0.117	0.303	0.161	0.157
Fe	0.153	0.179	0.221	0.050
K	0.073	0.522	0.081	0.477
Ca	−0.233	0.038*	0.010	0.931
Na	−0.077	0.500	−0.093	0.414
Mg	−0.097	0.393	−0.015	0.897
Mn	0.152	0.181	0.140	0.218
Zn	0.186	0.101	0.245	0.030*
Cu	0.094	0.408	0.064	0.577

Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.173	0.127	0.127	0.265
NO_X⁻-N	−0.240	0.033*	−0.211	0.062
NH₄⁺-N	−0.336	0.002**	−0.388	0.000**
pH	−0.221	0.050	−0.295	0.008*
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Mn	0.152	0.181	0.140	0.218
Zn	0.186	0.101	0.245	0.030*
Cu	0.094	0.408	0.064	0.577

Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.005	0.965	0.134	0.239
NO_X⁻-N	−0.137	0.230	−0.173	0.128
NH₄⁺-N	0.050	0.661	−0.104	0.364
pH	0.061	0.590	−0.178	0.117
Particles (<2 μm)	−0.328	0.003**	−0.201	0.076
Particles (2−5 μm)	−0.237	0.035*	−0.074	0.517
Particles (5−10 μm)	−0.139	0.222	−0.083	0.468
Particles (10−50 μm)	−0.111	0.331	−0.043	0.704
Particles (50−100 μm)	0.120	0.294	−0.132	0.246
Particles (100−500 μm)	0.320	0.004**	0.108	0.345
Particles (500−1 000 μm)	0.258	0.022*	0.224	0.048*
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P	−0.493	0.000**	−0.585	0.000**
SO₄²⁻	−0.199	0.138	0.023	0.864
Cl⁻	−0.205	0.126	−0.260	0.051
Al	−0.145	0.281	−0.026	0.845
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Mn	−0.383	0.003**	−0.375	0.004**
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Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.005	0.965	0.134	0.239
NO_X⁻-N	−0.137	0.230	−0.173	0.128
NH₄⁺-N	0.050	0.661	−0.104	0.364
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Factors	RDA1	RDA2	r²	P	Explained variable (%)
BHC：六氯环己烷；DDT：双对氯苯基三氯乙烷. ：在0.05水平上显著相关；：在0.01水平上显著相关. /：未检测 BHC: Benzenehexachloride; DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethane. : Significantly correlated at the 0.05 level; **: Highly significantly correlated at the 0.01 level. /: No detection.
Moisture	−0.203	0.979	0.505	0.001**	13.07
NO_X⁻-N	0.998	0.058	0.007	0.909	/
NH₄⁺-N	0.369	0.930	0.008	0.902	/
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Particles (<2 μm)	0.965	−0.261	0.311	0.007**	2.77
Particles (2−5 μm)	0.952	−0.307	0.199	0.053	/
Particles (5−10 μm)	0.486	0.874	0.044	0.516	/
Particles (10−50 μm)	−0.762	0.648	0.110	0.195	/
Particles (50−100 μm)	−1.000	−0.005	0.005	0.960	/
Particles (100−500 μm)	−0.934	−0.356	0.057	0.461	/
Particles (500−1 000 μm)	−0.909	−0.417	0.126	0.130	/
TN	0.967	−0.254	0.368	0.001**	2.82
P	0.998	−0.061	0.113	0.194	/
Al	−0.506	−0.863	0.077	0.295	/
Ca	0.191	0.982	0.475	0.002**	1.14
Cu	0.041	0.999	0.020	0.741	/
Fe	−0.857	0.516	0.007	0.907	/
K	0.178	−0.984	0.095	0.251	/
Mg	−0.534	0.845	0.176	0.054	/
Mn	0.971	−0.240	0.027	0.655	/
Na	−0.943	0.332	0.064	0.395	/
Zn	0.409	−0.912	0.080	0.311	/
SO4²⁻	0.644	0.765	0.011	0.846	/
Cl⁻	0.894	−0.448	0.022	0.781	/
BHC	1.000	0.029	0.245	0.014*	1.25
DDT	0.228	−0.974	0.009	0.937	/

Factors	RDA1	RDA2	r²	P	Explained variable (%)
BHC：六氯环己烷；DDT：双对氯苯基三氯乙烷. ：在0.05水平上显著相关；：在0.01水平上显著相关. /：未检测 BHC: Benzenehexachloride; DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethane. : Significantly correlated at the 0.05 level; **: Highly significantly correlated at the 0.01 level. /: No detection.
Moisture	−0.203	0.979	0.505	0.001**	13.07
NO_X⁻-N	0.998	0.058	0.007	0.909	/
NH₄⁺-N	0.369	0.930	0.008	0.902	/
pH	0.397	0.918	0.628	0.001**	4.77
Particles (<2 μm)	0.965	−0.261	0.311	0.007**	2.77
Particles (2−5 μm)	0.952	−0.307	0.199	0.053	/
Particles (5−10 μm)	0.486	0.874	0.044	0.516	/
Particles (10−50 μm)	−0.762	0.648	0.110	0.195	/
Particles (50−100 μm)	−1.000	−0.005	0.005	0.960	/
Particles (100−500 μm)	−0.934	−0.356	0.057	0.461	/
Particles (500−1 000 μm)	−0.909	−0.417	0.126	0.130	/
TN	0.967	−0.254	0.368	0.001**	2.82
P	0.998	−0.061	0.113	0.194	/
Al	−0.506	−0.863	0.077	0.295	/
Ca	0.191	0.982	0.475	0.002**	1.14
Cu	0.041	0.999	0.020	0.741	/
Fe	−0.857	0.516	0.007	0.907	/
K	0.178	−0.984	0.095	0.251	/
Mg	−0.534	0.845	0.176	0.054	/
Mn	0.971	−0.240	0.027	0.655	/
Na	−0.943	0.332	0.064	0.395	/
Zn	0.409	−0.912	0.080	0.311	/
SO4²⁻	0.644	0.765	0.011	0.846	/
Cl⁻	0.894	−0.448	0.022	0.781	/
BHC	1.000	0.029	0.245	0.014*	1.25
DDT	0.228	−0.974	0.009	0.937	/

典型油气藏区域环境因素差异对甲烷氧化菌丰度与群落结构分布的影响

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许科伟 ¹^,^* , 刘海峰 ² , 顾磊 ¹ , 郑旭莹 ¹ , 贾仲君 ³ , 陈晟 ²^,^*

微生物学报 | 地质微生物应用 2024,64(6): 1992-2007

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微生物学报 | 地质微生物应用 2024, 64(6): 1992-2007

典型油气藏区域环境因素差异对甲烷氧化菌丰度与群落结构分布的影响

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许科伟¹^,^*, 刘海峰², 顾磊¹, 郑旭莹¹, 贾仲君³, 陈晟²^,^*

作者信息

1 中国石化石油勘探开发研究院无锡石油地质研究所, 江苏无锡 214126

2 江南大学生物工程学院, 江苏无锡 214122

3 中国科学院南京土壤研究所, 江苏南京 210008

Effects of environmental factors on the abundance and distribution of methane-oxidizing bacteria in typical oil and gas reservoirs

Kewei XU¹^,^*, Haifeng LIU², Lei GU¹, Xuying ZHENG¹, Zhongjun JIA³, Sheng CHEN²^,^*

Affiliations

1 Wuxi Research Institute of Petroleum Geology, Sinopec Petroleum Exploration and Production Research Institute, Wuxi 214126, Jiangsu, China

2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

3 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, Jiangsu, China

出版时间: 2024-06-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230800

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摘要

收起

【目的】甲烷氧化菌(methane-oxidizing bacteria, MOB)是油气微生物勘探中重要的指标微生物，其丰度与群落结构分布受到地理位置和多种环境因素的影响。本研究以采集的7个典型油气藏区域的土壤样品为研究对象，探究油气藏区域环境因素差异对甲烷氧化菌丰度与群落结构分布的影响。【方法】对采集自7个典型油气藏区域土壤样品进行pmoA基因实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)、细菌16S rRNA基因测序和甲烷氧化菌功能基因pmoA测序，结合环境因子，比较甲烷氧化菌丰度差异，分析环境因子对甲烷氧化菌分布的影响。【结果】土壤样品的理化性质测定发现江汉盆地样品的含水量最高，约22.8%，硝态氮平均含量最高位于玉北油田，达到31.96 μg/g干重土壤，春光油田出现最高的SO₄²⁻ (6 425.0 mg/g干重土壤)及Cl⁻ (1 617.0 mg/g干重土壤)浓度。qPCR分析发现pmoA基因丰度仅为土壤样本总细菌丰度的0.77%，表明甲烷氧化菌绝对数量较少。16S rRNA基因测序发现type Ⅰ型甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基嗜热菌属(Methylocaldum)、甲基球菌属(Methylococcus)与type Ⅱ型的甲基胞囊菌属(Methylocystis) 4种主要的甲烷氧化菌，甲烷氧化菌中的优势菌属的相对丰度极低，最高仅为0.124%。甲烷氧化菌功能基因pmoA测序发现type Ⅱ型的甲基胞囊菌属、甲基弯曲菌属(Methylosinus)为主要优势pmoA基因型。环境因子与甲烷氧化菌丰度相关性分析表明甲烷氧化菌绝对丰度与铵态氮、pH、颗粒大小、硫酸根和氯离子显著相关，而环境因子与甲烷氧化菌的相对丰度的相关性分析仅发现与颗粒大小、总氮、总磷、金属离子(Al、Fe、K、Ca、Mg、Mn、Zn和Cu)显著相关。甲烷氧化菌pmoA功能基因组成判别相关分析(discriminant correlation analysis, DCA)表明含水量(土壤湿度)、pH值、<2 μm的土壤颗粒、总氮及钙离子对甲烷氧化菌pmoA功能基因组成影响具有显著性。【结论】本研究通过对来自7个典型油气藏区域的土壤样品的甲烷氧化菌的绝对丰度与相对丰度进行分析，发现基于不同的测量方法，甲烷氧化菌的丰度存在较大差异，16S rRNA基因测序无法较为全面地反映土壤样本中优势甲烷氧化菌的群落结构，不同地理位置的甲烷氧化菌指示群落存在差异，在全国尺度下油气区及背景点均无特有的甲烷氧化菌指示群落。对环境因子与甲烷氧化菌相关性分析发现，基于不同的甲烷氧化菌丰度指标，环境因子的显著影响具有较大差别。

关键词

微生物勘探 / 高通量测序 / 分子诊断 / 甲烷氧化菌 / 环境因子

Abstract

收起

[Objective] Methane-oxidizing bacteria (MOB) are crucial indicators in the microbial exploration of oil and gas reservoirs, while their diversity and distribution are influenced by geographical location and environmental factors. This study aims to explore the effects of environmental variations on the abundance and distribution of MOB in the soil samples collected from seven representative areas in typical oil and gas reservoirs. [Methods] Soil samples were subjected to real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) forpmoA and sequencing of bacterial 16S rRNA gene andpmoA. The abundance of MOB was compared among different samples, on the basis of which the impacts of environmental factors on the distribution of MOB were analyzed. [Results] The highest water content (approximately 22.8%) was detected in the samples from the Jianghan Basin. The average content of nitrate nitrogen was highest in the Yubei oil field, reaching approximately 31.96 μg/g. The Chunguang oil field showcased the highest concentrations of SO₄²⁻ (6 425.0 mg/g) and Cl⁻ (1 617.0 mg/g). The qPCR results revealed that thepmoA in MOB accounted for only 0.77% of that in total soil bacteria, indicating the low absolute abundance of MOB in the soil. The 16S rRNA gene sequencing identified three type Ⅰ MOB genera (Methylosarcina,Methylocaldum, andMethylococcus) and one type Ⅱ MOB genera (Methylocystis). However, the dominant genera in the MOB had extremely low relative abundance, with the maximum of 0.124%. Sequencing ofpmoA revealed thatMethylocystis andMethylosinus, two genera of type Ⅱ MOB, were dominant. The absolute abundance of MOB showed significant correlations with ammonium nitrogen, pH, particle size, SO₄²⁻, and Cl⁻. The relative abundance of MOB had significant correlations only with particle size, total nitrogen, total phosphorus, and metal ions (Al, Fe, K, Ca, Mg, Mn, Zn, and Cu). The discriminant correlation analysis (DCA) indicated that soil moisture, pH, soil particles<2 μm, total nitrogen, and Ca²⁺ significantly influenced the composition of the functional genepmoA in MOB. [Conclusion] This study analyzed the absolute and relative abundance of MOB in soil samples from seven typical oil and gas reservoirs. The MOB abundance showed significant differences depending on the measurement method used. The 16S rRNA gene sequencing fails to comprehensively reflect the community structure of MOB in the soil samples. Different geographical locations showed variations in MOB communities, and no specific indicator communities were detected for oil and gas reservoirs or background sites on a national scale. The correlation analysis between environmental factors and MOB revealed that the environmental factors had different effects on the absolute and relative abundance of MOB.

Key words

microbial exploration / high-throughput sequencing / molecular diagnostics / methane-oxidizing bacteria / environmental factors

引用本文

许科伟, 刘海峰, 顾磊, 郑旭莹, 贾仲君, 陈晟. 典型油气藏区域环境因素差异对甲烷氧化菌丰度与群落结构分布的影响. 微生物学报, 2024 , 64 (6) : 1992 -2007 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230800

Kewei XU, Haifeng LIU, Lei GU, Xuying ZHENG, Zhongjun JIA, Sheng CHEN. Effects of environmental factors on the abundance and distribution of methane-oxidizing bacteria in typical oil and gas reservoirs[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (6) : 1992 -2007 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230800

正文

收起

油气微生物勘探通过检测在油藏上方表层土壤中形成的以轻烃为养料的高度专属性微生物异常，进行油气勘探，因其成本低、周期短、效率高等优点受到广泛的关注。在地下油气藏压力的驱动下，甲烷、乙烷、丙烷和丁烷等低分子量碳氢化合物可以垂直穿透储层中的断层和裂缝，向上迁移到近地表土壤，并被当地的碳氢化合物氧化微生物利用^[1]。因此，这些细菌的异常富集是由长期和连续的轻烃泄露引起的，可作为油气勘探指标微生物。在碳氢化合物氧化微生物中，主要利用CH₄的甲烷氧化菌(methane-oxidizing bacteria, MOB)被确定为最重要的指标微生物，因为油气藏中90%以上的轻质碳氢化合物是CH₄^[2]。截至目前，甲烷氧化细菌可分为：(1) γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)甲烷氧化细菌(type Ⅰ型)，包含Methylococcacea科(type Ⅰa/Ib)和Methylotermaceae科(type Ⅰc)；(2) α变形菌纲(Alphaproteobacteria)甲烷氧化细菌(type Ⅱ型)，包含甲基胞囊菌科(Methylocystaceae) (type Ⅱa)和拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae) (type Ⅱb)；(3) 疣微菌门(Verrucomicrobia)甲烷氧化细菌，均属于Methylacidophyliceae科；(4) NC10门甲烷氧化细菌，均来自于Candidatus Methylomirabilis属，代表菌Candidatus Methylomirabilis oxyfera和Candidatus Methylomirabilis sinica^[3]。

大部分甲烷氧化菌都含有编码甲烷单加氧酶的pmoA基因，目前被认为是最有用的功能性和系统发育性甲烷菌标记之一，并已被广泛用于探索环境样品中的甲烷菌丰度^[4-5]。近10年来，提出了基于实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)的微生物异常分析，并通过比较从气田、油田和非油气区块以及不同油气区域采集的土壤中pmoA基因的丰度，成功地反映了潜在油气藏的存在^[6-8]。

甲烷氧化菌在不同生态系统中的丰度也受到地理位置和各种环境因素的影响，如甲烷和氧气浓度、营养物质可用性、pH、温度、盐度、水分含量和植物覆盖^[9]。因此，具有不同地理位置和显著异质性的油气田可能包括不同的微生物群落结构。例如，I型甲烷氧化菌在适应不同的环境条件(低温和高温、低pH和高pH、高盐、低氧)方面表现出很大的灵活性，而培养的II型甲烷氧化杆菌则多样化较弱^[10-13]。

为进一步探究油气藏区域环境因素差异对甲烷氧化菌丰度与群落结构分布的影响，本研究采集的7个典型油气藏区域的土壤样品，拟从以下几个方面进行研究：(1) 确定油气藏区域土壤的理化性质；(2) 基于qPCR技术对土壤样本中甲烷氧化菌的丰度进行精确定量，基于16S rRNA基因测序确定油气藏区域中甲烷氧化菌的相对丰度；(3) 基于pmoA测序确定油气藏区域中MOB丰度；(4) 确定环境因素对甲烷氧化菌群落结构的影响。研究结果以期为油气藏区域环境因素如何影响甲烷氧化菌群落结构提供了全面的信息，并为微生物勘探油气提供了极具潜力的基础。

1 材料与方法

收起

1.1 土壤样品采集

本研究通过现场实际的钻井情况进行取样，选取其中产油气井位置作为明确的油气藏土壤样品，而干井位置采集为背景区样品。根据五点采样法，选取钻井点周围4个距离相等的点，提取5个样本点土样混合作为一个样本。采集的典型油气点及背景区点样品来自普光气田(35个，106°03′E，30°80′N)、春光油田(26个，86°08′E，44°32′N)、玉北油田(4个，82°30′E，39°14′N)、江汉盆地油气田(6个，112°54′E，29°43′N)、镇泾油田(3个，105°86′E，34°06′N)、河南油田(2个，112°45′E，36°71′N)和鄂尔多斯气田(3个，106°39′E，37°83′N)等7个区域，共计79个。采集土壤表层80 cm深度样品，尽量避免草根、石块对样品的影响。每个样品采集100 g土样装袋密封，采样结束后运回实验室−20 ℃保存。

1.2 理化指标检测

样本中土壤含水量测定：将铝盒105 ℃烘干2 h后称重，精确称取土壤5 g，加入铝盒中105 ℃烘干6 h，烘干土样放入干燥器冷却20 min后立即称重。含水量=(土样湿重−土样干重)/土样湿重。

土壤pH值的测定：取5 g过2 mm筛的土壤，按1:2.5的比例加入去离子水，振荡混匀后，用精密pH计测定上清的pH值。

土壤溶解态氮盐测定：称取新鲜土壤4 g置于50 mL离心管中，加入20 mL 2 mol/L的KCl浸提液，150 r/min振荡30 min后静置0.5 h，滤纸过滤上清至50 mL离心管，流动分析仪测定滤液中的NH₄⁺、NO₃⁻。

土壤SO₄²⁻、Cl⁻测定：称取5 g土壤105 ℃烘干至恒重后，研磨破碎，过100目筛，取10 g加入无CO₂超纯水50 mL，振荡3 min，4 000 r/min离心5 min后上清液用滤纸过滤，滤液8 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜后由ICS-900离子色谱仪(Dionex公司)测定SO₄²⁻、Cl⁻浓度。

利用电感耦合等离子体发射光谱仪(赛默飞世尔科技公司)测定样品中的金属元素(Al、Ca、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na和Zn)含量，利用原子荧光光谱仪(北京海光仪器有限公司)测定样品中的总磷含量。

土壤颗粒大小测定通过2 mm筛的土样经去除有机质、可溶性盐和石膏等前处理后，加入分散剂充分分散，过0.063 mm洗筛；筛上的土样经烘干后，逐级过0.600 mm和0.212 mm土壤筛，并分别称重。筛下悬浊液定容至500 mL后，利用吸液管法逐级测定各级颗粒含量。

1.3 实时荧光定量PCR

甲烷氧化菌pmoA基因qPCR的标准曲线制作：根据pEASY-T3 Cloning Kit说明书，制备pmoA基因的重组质粒，以10倍梯度稀释含有pmoA基因的重组质粒，作为标准样品。然后对标样和未知土壤样品DNA进行pmoA基因定量分析。引物对为A189f (5′-GGNGACTGGGACT TCTGG-3′)和mb661r (5′-CCGGMGCAACGTC YTTACC-3′)。qPCR的反应体系(20 μL)：DNA模板1 μL，SYBR PremixEx Taq^TM (Perfect Real Time公司) 10 μL，正、反引物(10 μmol/L)各0.25 μL，灭菌双蒸水8.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；80 ℃ 5 s读取荧光值。采用实时荧光定量仪(Bio-Rad公司)测定土壤样品中的pmoA基因数量，结果以copies/g新鲜土表示。按公式(1)计算。

(1)

式中，N₁为土壤样品pmoA基因数量(copies/g)；N为定量PCR仪器中读取的拷贝数量(copies/µL)；V为土壤DNA溶解体积(µL)；D为稀释倍数；m为土壤样品鲜重(g)。

微生物16S rRNA基因的qPCR方法与pmoA类似，所用引物对为515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。扩增反应体系同pmoA基因的qPCR扩增。扩增条件：95 ℃预热3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环；80 ℃ 5 s读取荧光值。

1.4 微生物总DNA提取及高通量测序

称取1 g土壤样品，采用TIANamp Bacteria DNA Kit [天根生化科技(北京)有限公司]提取土壤微生物总DNA，并测定浓度和质量检测。DNA样品基于Illumina HiSeq 2500高通量测序平台进行16S rRNA基因测序，扩增引物对为515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板1.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，无菌水22.5 μL，PremixTaq^TM (TaKaRaTaq^TM version 2.0) 25 μL。PCR反应条件：94 ℃预热3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共30次循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物进行胶回收和定量后进行MiSeq高通量测序。随后采用相同方法对功能基因pmoA进行测序。其扩增引物、反应体系参照甲烷氧化菌pmoA基因qPCR，扩增条件参照qPCR程序，循环次数为32次，最后72 ℃延伸5 min。基于优化序列进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类分析和物种分类学注释，统计每个样品注释到各分类水平上的序列数目，明确各分类水平的整体注释情况。基于OTU聚类结果进行物种群落结构分析^[14-17]。

2 结果与分析

收起

2.1 原位土壤样品的理化性质

2.1.1 土壤含水量、pH值的测定

七个采样区样品的平均含水量差异显著，其中江汉盆地样品的含水量最高，约22.8%，而玉北油田样品的含水量仅为3.6%。pH测定结果显示普光气田样品的pH接近中性(6.8)，其他区域的样品均属于弱碱性土壤(表1)。

2.1.2 氮盐的测定

氮盐是土壤微生物生长所需的重要营养成分，分为硝态氮、铵态氮和总氮。氮源在不同采样区域的平均含量均表现出较大的变异范围，特别是硝态氮。硝态氮平均含量最高位于玉北油田，达到31.96 μg/g干重土壤，鄂尔多斯气田的硝态氮含量仅为0.96 μg/g干重土壤。铵态氮和总氮的含量差异范围远小于硝态氮，最高值与最低值差距在2−3倍之间(表1)。

2.1.3 土壤颗粒组成

土壤颗粒组成是土壤的一种十分稳定的自然属性，其大小决定于成土的母质类型。土壤质地与土壤的通气、营养盐维持和水分的保持关系密切，对土壤微生物生长具有重要的影响。结果显示不同区域的样品颗粒组成具有较大差异性(表1)，其中普光气田、春光油田和江汉盆地油气田样品的颗粒以<50 μm为主，而镇泾油田样品颗粒集中在10−50 μm，占42.4%。河南油田样品颗粒大小多在50 μm以下，超50 μm的颗粒仅占4.2%。玉北油田样品以大颗粒为主，直径100 μm以上的颗粒占比为29.4%。

2.1.4 P、SO₄²⁻、Cl⁻及金属元素含量测定

P、SO₄²⁻及Cl⁻的平均浓度最高值均出现在春光油田样品中，特别是SO₄²⁻ (6 425.0 mg/g干重土壤)及Cl⁻ (1 617.0 mg/g干重土壤)的含量远高于其他采样区域(表1)。所有样品中Al含量最高(56.6−77.2 mg/g干重土壤)，依次为Fe (19.8−43.6 mg/g干重土壤)，K (16.3−22.6 mg/g干重土壤)。普光气田的样品与所有样品金属元素平均含量排序基本一致，但Ca的平均含量仅有7.7 mg/g干重土壤。然而，春光油田样品的Ca含量远高于其他区域，达57.7 mg/g干重土壤，并且Mg的含量也比其他样品高，这可能是由于不同区域的土壤样品成土母质的差异导致的。所有样品中Mn、Zn、Cu的含量约比其他金属元素的含量低2−3个数量级。

2.2 土壤样品pmoA基因与16S rRNA基因的qPCR分析

采用qPCR技术对所有7个典型的油气藏区域及背景区土壤样本(79个)中的总细菌及甲烷氧化菌的丰度进行精确定量。结果发现春光油田样品及背景区样品16S rRNA基因的平均丰度为2.53×10⁹ copies/g，而pmoA基因平均丰度为1.46×10⁷ copies/g (图1)；而河南油田、江汉盆地油气田、鄂尔多斯气田、普光油田及镇泾油田区域样品中16S rRNA基因、pmoA基因的平均丰度相差不大，16S rRNA基因平均丰度范围为7.88×10⁹−1.11×10¹⁰ copies/g，而pmoA基因平均丰度在7.61×10⁷−1.19×10⁸ copies/g；玉北油田区域16S rRNA基因、pmoA基因平均丰度最低，与河南油田相差约2个数量级，平均丰度分别为4.27×10⁸ copies/g，1.19×10⁶ copies/g。所有区域样本中的pmoA基因与16S rRNA基因绝对数量相差两个数量级以上，pmoA基因平均占土壤样本中总细菌的0.77%，土壤中检测到的甲烷氧化菌绝对数量较少，这一结果与目前被广泛接受的轻烃微渗策略吻合，即油气藏资源形成的长期地质历史过程中，甲烷氧化菌并未成为微生物群落的优势种群。

此外，还对这些样本进行了16S rRNA基因的高通量测序，通过与16S rRNA基因分类数据库进行比对，获得这些序列的微生物种类信息，选择其中的甲烷氧化菌分析其相对丰度和群落结构。在所有样品中共检测出11种类型的甲烷氧化菌，分别是type Ⅰ型的甲基杆状菌属(Methylobacter)、甲基嗜热菌属(Methylocaldum)、甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基驱体菌属(Methylosoma)和甲基单胞菌属(Methylomonas)；type Ⅱ型的甲基胞囊菌属(Methylocystis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基胞菌属(Methylocella)和甲基荚膜菌属(Methylocapsa)。其中普光气田样品中的甲烷氧化菌主要类型为甲基八叠球菌属，甲基胞囊菌属(图2)；春光油田样本中的甲烷氧化菌主要为甲基胞囊菌属；玉北盆地油田样品中主要含有两类甲烷氧化菌，分别是甲基嗜热菌属和甲基球菌属；甲基嗜热菌属是江汉油气田样本中的主要甲烷氧化菌类型；镇泾油田、河南油田及鄂尔多斯气田样本中的主要甲烷氧化菌类型均以甲基胞囊菌属为主，优势甲烷氧化菌平均相对丰度极低，最高仅为0.124%，其占比小于由pmoA基因qPCR技术得到的甲烷氧化菌的绝对丰度。

2.3 土壤样品的功能基因pmoA测序

本研究还采用与pmoA基因qPCR方法相同的引物对所有样品进行扩增，在79个样品中仅有38个获得了足量的PCR产物用于后续的MiSeq高通量测序，平均每个样品获得了1.8万条高质量pmoA序列，用于和已知的功能基因分类数据库进行比对。如表2所示，普光气田点样品主要以Methylocystis、稻田簇-2 (rice paddy cluster-2, RPC-2)及稻田簇(rice paddy clusters, RPCs)为优势种，平均占比分别为41.5%、29.7%和15.5%。Methylosarcina和高地土壤簇γ (upland soil cluster-γ, USC-γ)为次优势种，占比分别为4.8%和2.1%。其中，RPC-2基因型属于首次在稻田土壤中发现并命名的生态型，然而，目前尚未获得属于该生态型的纯培养菌株。RPCs是另一种最初发现于稻田中的生态型，属于type Ⅰ b型甲烷氧化菌，与Methylocaldum亲缘关系较近。普光背景点样品的甲烷氧化菌组成非常单一，以USC-γ为唯一优势类群，占比超85.0%。其他pmoA基因型占比均在5.0%以下。春光油田点样品以Methylocystis为唯一的优势种，占比达到84.9%。其余pmoA基因型占比均在5.0%以下。背景点样品以Methylosinus为第一优势种，Methylocystis为次优势种，占比分别为52.9%与16.1%。玉北油田背景点样品以Methylocystis为优势种，高地土壤团簇-α (upland soil cluster-alpha, USC-α)为次优势种，占比超25.0%。玉北油田点样品以Methylosinus为第一优势种，约占47.2%，而在背景点该种类占比仅为0.8%，次优势种Methylocystis占比(29.7%)明显小于背景区样本。江汉盆地油田的背景点和油田点样品甲烷氧化菌优势种完全不同，背景点样品中以Methylobacter为绝对优势种(74.6%)，而在油田点样品中Methylobacter可以忽略不计，其优势种为Methylosinus (42.6%)及USC-γ (37.3%)。气田点及背景点样品第一优势种相同，均为RPCs，但两者的次优势种差别很大，分别为Methylocystis和未培养的甲烷营养生物系统发育簇(uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs, LWs)。镇泾油田点样品中USC-γ和Methylosinus为优势种，平均占比分别为53.8%和28.5%。在背景点USC-γ和Methylosinus同样属于优势种，各自占比超20.0%。此外，甲烷氧化菌JR3占比为30.9%，是镇泾油田背景点另一个优势种。河南油田点与背景点样品中的甲烷氧化菌组成差别显著，第一优势种分别为JR2 (43.5%)和USC-γ (49.9%)，但相同之处是都含有约30.0%的Methylosinus。鄂尔多斯气田的情况正好相反，气田点和背景点样品的第一优势种均为USC-γ，不同的是次优势种：分别为Methylosinus (39.2%)和甲烷氧化菌JR3 (23.7%)。采用非度量多维排列(non-metric multidimensional permutations, NMDS)对甲烷氧化菌群落结构分异性进行分析，结果如图3所示。气田点和气田区域背景点互相交错，未完全分开；油田点和油田区域背景点情况类似。

2.4 地表环境因子与油气指示微生物相关性分析

2.4.1 环境因子与甲烷氧化菌丰度相关性分析

本研究采用Pearson和Spearman相关性分析法测定含水量、硝态氮、铵态氮、pH值及颗粒组成等环境因子对甲烷氧化菌丰度的影响。如表3所示，含水量和甲烷氧化菌丰度无相关性。两种分析法均表明铵态氮与甲烷氧化菌丰度呈显著负相关关系，而硝态氮与甲烷氧化菌丰度无相关性。pH对甲烷氧化菌丰度具有一定的负相关性，但显著性系数因方法不同而有所差异。颗粒大小对甲烷氧化菌丰度的影响显著不同，相关性最强的为50−100 μm颗粒，呈现显著负相关关系(P<0.01)，其次为2−5 μm颗粒，呈显著正相关性(P<0.05)，其他粒径的颗粒含量和甲烷氧化菌的丰度无相关关系。磷对甲烷氧化菌丰度无影响，而硫酸根和氯离子与甲烷氧化菌丰度呈显著负相关。多数金属离子与甲烷氧化菌丰度未显示出直接相关性。钙、锌及总氮对甲烷氧化菌丰度的影响尚不能确定，两种方法的分析结果差别较大，需要进一步研究。

2.4.2 环境因子与甲烷氧化菌的相对数量的相关性分析

基于16S rRNA基因测序结果可计算甲烷氧化菌在总微生物中的相对含量，在一定程度上表示特定环境下甲烷氧化菌在总细菌中的相对优势度。结果如表4所示，含水量，氮盐及pH均未表现出与甲烷氧化菌相对数量的相关性，5 μm以下的颗粒和甲烷氧化菌相对数量呈负相关，但这种关系的显著性因Pearson和Spearman分析方法的不同而有所差异。100 μm以上的颗粒与甲烷氧化菌相对数量呈正相关，特别是500 μm以上的颗粒，具有显著性(P<0.05)。总氮和总磷与甲烷氧化菌相对数量呈负相关，总磷影响具有显著性(P<0.01)。硫酸根和氯离子尚未显著影响甲烷氧化菌相对数量。所有检测的金属离子(除Na)外都和甲烷氧化菌相对数量呈负相关，其中Mg、Mn、Zn及Cu相关性显著。

2.4.3 环境因子与甲烷氧化菌pmoA功能基因组成相关性分析

本研究对甲烷氧化菌pmoA功能基因组成进行判别相关分析(discriminant correlation analysis, DCA)，坐标轴长度最大值为3.32，单峰模型的冗余分析(redundancy analysis, RDA)与蒙特卡罗置换检验联用分析环境因子对pmoA功能基因组成分布解释具有显著性。结果如表5所示，对甲烷氧化菌pmoA功能基因组成影响具有显著性的为含水量(即土壤湿度)、pH值、<2 μm的土壤颗粒、总氮及钙离子。选择上述6种环境因子进行RDA排序分析(图4)，甲烷氧化菌群落的总变化量为2 713，环境因子的总解释量为1 399，占51.6%。随后进一步针对各个因子进行偏分析，即固定其他因子，测定单个因子的解释量，其中含水量的解释量最大占13.07%，说明样品含水量对甲烷氧化菌的组成影响最大，其次为pH占4.77%，总氮及<2 μm的土壤颗粒解释量都在2.80%左右，钙的单独解释量在1.20%左右。

3 讨论

收起

本研究基于qPCR技术、16S rRNA基因测序技术评估典型油气藏区域样品中甲烷氧化菌的绝对和相对丰度，同时通过pmoA功能基因测序揭示了甲烷氧化菌的优势群落结构特征。研究结果表明，甲烷氧化菌的绝对丰度远高于优势甲烷氧化菌的相对丰度，基于16S rRNA基因测序技术与pmoA功能基因测序技术鉴定得到的优势甲烷氧化菌有所不同。这可能是由于一些未知的16S rRNA基因序列没有已知甲烷氧化菌种作为比对参考而无法确定其分类地位，而基于qPCR技术检测到的pmoA基因序列即使没有相似的已知甲烷氧化菌pmoA序列作为参考，仍能够确定其为某种未知的甲烷氧化菌种类^[18]。这表明基于16S rRNA基因测序技术得到的甲烷氧化菌的群落结构可能不够准确。同时在7个典型油气藏区域的土壤样本中发现了一些广泛存在的甲烷氧化菌属，如Methylocystis属、USC-γ。Ricke等和Pratscher等研究也发现了甲烷氧化细菌Methylocystis属在旱地土壤和森林土壤中广泛存在^[19-20]。这可能是由于Methylocystis属甲烷氧化细菌的颗粒性甲烷单加氧酶(particle methane monooxygenase, pMMO)对甲烷的亲和力范围极广^[21]。USC-γ是一种广泛分布于旱地土壤且未获得纯培养菌株的pmoA基因型，被认为与大气中的低浓度甲烷的氧化紧密相关^[22]。此外，利用pmoA功能基因测序在7个典型油气藏区域样本中得到的优势甲烷菌群落结构存在较大差异，不同的油气藏区域样本中具有独特的甲烷氧化菌群落结构，并且发现河南油田、江汉盆地油气田等多处区域油气点和背景点pmoA基因组成具有显著差别，这表明，除了油气存在与否这一因素，其他环境地理因素也在很大程度上影响了甲烷氧化菌的组成及分布。为了研究在全国尺度下油气区与背景区甲烷优势群落的差异特征，本研究分别选取了7个典型油气藏区域样本的油气点样本与背景点样本，基于NMDS分析识别其中的差异。NMDS分析结果显示，气田点和气田区域背景点互相交错，未完全分开；油田点和油田区域背景点情况类似。基于pmoA功能基因测序得到的7个典型油气藏区域样本中的油气区与背景区具有不同的优势甲烷群落，因此我们认为在全国的尺度下，油气区和油气区背景点样品中甲烷氧化菌群落结构并无显著差异，即油气区及背景点均无特有甲烷氧化菌指示群落。

为了解释环境因素对典型油气藏区域样本甲烷氧化菌群落的影响，本研究基于Pearson和Spearman相关性分析法研究环境因素和甲烷氧化菌的绝对和相对丰度之间的相关关系。研究结果显示，基于不同的甲烷氧化菌丰度指标(绝对和相对丰度)，环境因子具有不同的显著影响。土壤样本中的总氮、总磷与甲烷氧化菌的相对丰度呈显著负相关关系，与甲烷氧化菌的绝对丰度未呈现相关关系。这可能是由于一些不能通过16S rRNA基因序列测序及分析技术鉴定出来的甲烷氧化菌受环境中氮、磷浓度的正调控，如Rigler等的研究证实氨氮的添加可能会通过改变土壤碳氮比从而促进甲烷氧化细菌的生长^[23]，Bodelier等通过对稻田土壤施加尿素和磷酸铵也观察到了甲烷氧化细菌丰度和活性的提升^[24]。此外，发现土壤样本中氨态氮和硝态氮与甲烷氧化细菌的相对丰度无相关关系，而氨态氮与甲烷氧化细菌的绝对丰度呈现负相关关系，这可能是由于pmoA功能基因测序检测到受氨态浓度负调控的优势甲烷氧化菌属。正如Walkiewicz等研究发现，氨氮对好氧甲烷氧化细菌的影响还与土壤类型有关，在砂土和壤土中，结果完全相反^[25]。土壤颗粒大小对甲烷氧化菌的绝对和相对丰度产生显著不同的影响。在与甲烷氧化菌的绝对丰度相关性的分析中，50−100 μm颗粒与其显示出显著的负相关关系，2−5 μm颗粒呈现显著的正相关性。然而，在与甲烷氧化菌的相对丰度相关性的分析中， >100 μm特别是 >500 μm的颗粒与甲烷氧化菌的绝对丰度呈现出正相关性。我们推测造成这种现象差异的原因可能是由于不同土壤颗粒的大小能够影响土壤中甲烷氧化菌吸收氧气的速率，而pmoA功能基因测序识别出了一些反硝化型厌氧甲烷菌属，这些菌属与好氧甲烷氧化菌属受到氧气调控的作用截然相反^[26]。同时，为了进一步地探究环境因素与单个样本中的甲烷氧化菌群落结构的关系，基于甲烷氧化菌pmoA功能基因组成进行判别相关分析。研究结果显示出了含水量(即土壤湿度)、pH值、<2 μm的土壤颗粒、总氮及钙离子对甲烷氧化菌pmoA功能基因组成具有显著性影响。这与国际上研究甲烷氧化菌分布的主流观点非常一致^[27-29]。

4 结论

收起

本研究通过qPCR技术、16S rRNA基因测序技术测定了来自7个典型油气藏区域样本中甲烷氧化菌属的绝对丰度与相对丰度，发现基于不同的测量方法，甲烷氧化菌的丰度存在较大差异，基于16S rRNA基因测序无法较为全面地反映土壤样本中优势甲烷氧化菌的群落结构。同时，通过pmoA功能基因测序揭示土壤样本中甲烷氧化菌群落结构，发现一些目前广泛存在的甲烷氧化菌属，如Methylocystis属、USC-γ等，不同的油气藏区域样本中具有独特的甲烷氧化菌群落结构，基于NMDS分析得到的结果，我们更加确信了这一点，即在全国的尺度下，油气区和油气区背景点样品中甲烷氧化菌群落结构并无显著差异，即油气区及背景点均无特有甲烷氧化菌指示群落。最后，本研究分析了环境因素与甲烷氧化菌绝对丰度、相对丰度以及pmoA功能基因组成之间的相关关系，发现基于不同的甲烷氧化菌丰度指标，环境因子具有不同的显著影响，含水量(即土壤湿度)、pH值、<2 μm的土壤颗粒、总氮及钙离子对甲烷氧化菌pmoA功能基因组成具有显著性影响，符合甲烷氧化菌分布研究的主流观点。

基金

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国家自然科学基金(41202241)
中石化科技部项目(P22010)

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2024年第64卷第6期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230800

接收时间：2023-12-27
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-06-04

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收稿日期：2023-12-27
录用日期：2024-02-26

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National Natural Science Foundation of China(41202241)

国家自然科学基金(41202241)

Research Project of Sinopec Science and Technology Department(P22010)

中石化科技部项目(P22010)

作者信息

1 中国石化石油勘探开发研究院无锡石油地质研究所, 江苏无锡 214126

2 江南大学生物工程学院, 江苏无锡 214122

3 中国科学院南京土壤研究所, 江苏南京 210008

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Region	Number of samples	Water content (%)	pH	Nitrogen salt dry weight of soil(μg/g)		Percentage of soil particle size (%)	Total phosphorus, sulfate ions, and chloride ions dry weight of soil (μg/g)		Metal element dry weight of soil (mg/g)
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. /: No detection.
1	35	10.8	6.8	5.97	3.87	720	22.6	14.9	11.8	26.9	9.9	13.9	377.1	49.9	29.1	77.2	36.9	21.3	7.7	11.0	10.2	0.677	0.094	0.020
2	26	11.5	8.0	17.55	5.97	480	24.5	13.1	11.5	26.8	14.2	9.9	561.3	6 425.0	1 617.0	66.8	32.7	22.6	57.7	16.7	19.8	0.673	0.083	0.024
3	4	3.6	8.7	31.96	5.48	/	6.8	3.6	4.3	19.6	36.3	29.4	404.0	54.7	30.2	77.1	43.6	21.5	25.3	9.5	14.6	0.812	0.102	0.031
4	6	22.8	8.2	2.28	4.01	740	20.3	14.9	16.6	33.3	6.4	8.5	384.0	136.2	21.6	66.6	33.5	20.4	32.5	13.0	12.2	0.623	0.072	0.018
5	3	17.2	8.2	9.67	4.21	670	23.1	12.3	12.0	42.4	9.7	0.5	126.0	64.1	18.3	72.5	35.7	16.3	12.6	10.0	9.2	0.596	0.063	0.019
6	2	21.1	7.7	5.99	5.46	470	21.9	19.2	18.2	36.5	4.1	0.1	135.0	134.2	28.9	56.6	19.8	17.7	28.7	18.1	6.9	0.355	0.035	0.004
7	3	7.1	8.9	0.96	4.23	220	9.0	4.0	2.9	8.8	24.7	50.6	/	/	/	73.9	35.9	21.1	19.2	12.1	11.9	0.668	0.088	0.021

Region

Number of samples

Water content (%)

Nitrogen salt dry weight of soil(μg/g)

Percentage of soil particle size (%)

Total phosphorus, sulfate ions, and chloride ions dry weight of soil (μg/g)

Metal element dry weight of soil (mg/g)

NO_X⁻-N

NH₄⁺-N

Total N

2−5

5−10

10−50(μm)

50−100

100−500

SO₄²⁻

Cl⁻

10.8

6.8

5.97

3.87

720

22.6

14.9

11.8

26.9

9.9

13.9

377.1

49.9

29.1

77.2

36.9

21.3

7.7

11.0

10.2

0.677

0.094

0.020

11.5

8.0

17.55

5.97

480

24.5

13.1

11.5

26.8

14.2

9.9

561.3

6 425.0

1 617.0

66.8

32.7

22.6

57.7

16.7

19.8

0.673

0.083

0.024

3.6

8.7

31.96

5.48

6.8

3.6

4.3

19.6

36.3

29.4

404.0

54.7

30.2

77.1

43.6

21.5

25.3

9.5

14.6

0.812

0.102

0.031

22.8

8.2

2.28

4.01

740

20.3

14.9

16.6

33.3

6.4

8.5

384.0

136.2

21.6

66.6

33.5

20.4

32.5

13.0

12.2

0.623

0.072

0.018

17.2

8.2

9.67

4.21

670

23.1

12.3

12.0

42.4

9.7

0.5

126.0

64.1

18.3

72.5

35.7

16.3

12.6

10.0

9.2

0.596

0.063

0.019

21.1

7.7

5.99

5.46

470

21.9

19.2

18.2

36.5

4.1

0.1

135.0

134.2

28.9

56.6

19.8

17.7

28.7

18.1

6.9

0.355

0.035

0.004

7.1

8.9

0.96

4.23

220

9.0

4.0

2.9

8.8

24.7

50.6

73.9

35.9

21.1

19.2

12.1

11.9

0.668

0.088

0.021

Sampling area	Mcystis	Msarcina	Mbacter	Mcaldum	Msinus	RPC-2	USC-γ	RPCs	USC-α	JRC-3	LWs	JR3	JR2
Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. Mcystis:Methylocystis; Msarcina:Methylosarcina; Mbacter:Methylobacter; Mcaldum:Methylocaldum; Msinus:Methylosinus; RPC-2: Rice paddy cluster-2; USC-γ: Upland soil cluster-γ; RPCs: Rice paddy clusters; USC-α: Upland soil cluster-alpha; JRC-3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; LWs: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR2: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs. /: No detection.
1	Gas field	41.5	4.8	0.5	0.2	/	29.7	2.1	15.5	1.6	/	/	/	/
Background	2.5	0.9	0.1	0.1	/	2.1	88.2	0.4	3.2	/	/	/	/
2	Oil field	84.9	2.5	/	/	1.6	3.3	/	3.0	0.1	0.0	/	/	/
Background	16.1	3.7	/	1.9	52.9	1.4	/	5.3	0.6	11.2	/	/	/
3	Oil field	29.7	4.5	/	0.9	47.2	1.6	/	2.4	0.6	6.4	/	/	/
Background	44.2	9.0	/	/	0.8	1.8	/	7.5	25.7	0.2	/	/	/
4	Oil field	1.3	/	0.1	2.9	42.6	0.2	37.3	1.5	/	/	0.0	/	/
Background of oil field	2.3	/	74.6	4.2	3.3	1.5	3.1	5.3	/	/	0.4	/	/
Gas field	14.5	/	2.9	3.4	7.9	9.6	1.3	46.5	/	/	1.3	/	/
Background of gas field	1.5	/	15.3	0.3	0.2	15.0	0.8	39.2	/	/	20.3	/	/
5	Oil field	2.0	1.4	/	/	28.5	/	53.8	1.3	/	6.1	/	3.2	0.1
Background	1.6	0.7	/	/	23.1	/	36.4	0.9	/	3.4	/	30.9	0.1
6	Oil field	2.4	2.7	/	/	29.2	/	5.4	1.4	/	6.6	/	1.3	43.5
Background	3.8	1.2	/	/	34.0	/	49.9	1.6	/	4.8	/	0.1	0.1
7	Gas field	2.6	1.0	/	/	39.2	/	45.3	1.2	/	4.3	/	2.4	0.1
Background	1.5	1.0	/	/	19.9	/	46.5	1.7	/	2.9	/	23.7	0.2

Sampling area

Mcystis

Msarcina

Mbacter

Mcaldum

Msinus

RPC-2

USC-γ

RPCs

USC-α

JRC-3

LWs

JR3

JR2

Region 1: Puguang oil field; Region 2: Chunguang oil field; Region 3: Yubei oil field; Region 4: Jiangnan basin oil and gas field; Region 5: Zhenjing oil field; Region 6: Henan oil field; Region 7: Ordos gas field. Mcystis:Methylocystis; Msarcina:Methylosarcina; Mbacter:Methylobacter; Mcaldum:Methylocaldum; Msinus:Methylosinus; RPC-2: Rice paddy cluster-2; USC-γ: Upland soil cluster-γ; RPCs: Rice paddy clusters; USC-α: Upland soil cluster-alpha; JRC-3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; LWs: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR3: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs; JR2: Uncultured phylogenetic clusters of methanotrophs. /: No detection.

Gas field

41.5

4.8

0.5

0.2

29.7

2.1

15.5

1.6

Background

2.5

0.9

0.1

2.1

88.2

0.4

3.2

Oil field

84.9

2.5

1.6

3.3

3.0

0.1

0.0

Background

16.1

3.7

1.9

52.9

1.4

5.3

0.6

11.2

Oil field

29.7

4.5

0.9

47.2

1.6

2.4

0.6

6.4

Background

44.2

9.0

0.8

1.8

7.5

25.7

0.2

Oil field

1.3

0.1

2.9

42.6

0.2

37.3

1.5

0.0

Background of oil field

2.3

74.6

4.2

3.3

1.5

3.1

5.3

0.4

Gas field

14.5

2.9

3.4

7.9

9.6

1.3

46.5

1.3

Background of gas field

1.5

15.3

0.3

0.2

15.0

0.8

39.2

20.3

Oil field

2.0

1.4

28.5

53.8

1.3

6.1

3.2

0.1

Background

1.6

0.7

23.1

36.4

0.9

3.4

30.9

0.1

Oil field

2.4

2.7

29.2

5.4

1.4

6.6

1.3

43.5

Background

3.8

1.2

34.0

49.9

1.6

4.8

0.1

Gas field

2.6

1.0

39.2

45.3

1.2

4.3

2.4

0.1

Background

1.5

1.0

19.9

46.5

1.7

2.9

23.7

0.2

Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.173	0.127	0.127	0.265
NO_X⁻-N	−0.240	0.033*	−0.211	0.062
NH₄⁺-N	−0.336	0.002**	−0.388	0.000**
pH	−0.221	0.050	−0.295	0.008*
Particles (<2 μm)	0.069	0.543	0.194	0.086
Particles (2−5 μm)	0.244	0.030*	0.269	0.017*
Particles (5−10 μm)	0.189	0.095	0.165	0.147
Particles (10−50 μm)	0.062	0.585	0.044	0.697
Particles (50−100 μm)	−0.311	0.005**	−0.426	0.000**
Particles (100−500 μm)	−0.042	0.715	−0.117	0.305
Particles (500−1 000 μm)	0.042	0.714	0.019	0.868
Total N	0.094	0.408	0.271	0.016*
P	0.102	0.370	0.113	0.320
SO₄²⁻	−0.504	0.000**	−0.301	0.023*
Cl⁻	−0.464	0.000**	−0.364	0.005**
Al	0.117	0.303	0.161	0.157
Fe	0.153	0.179	0.221	0.050
K	0.073	0.522	0.081	0.477
Ca	−0.233	0.038*	0.010	0.931
Na	−0.077	0.500	−0.093	0.414
Mg	−0.097	0.393	−0.015	0.897
Mn	0.152	0.181	0.140	0.218
Zn	0.186	0.101	0.245	0.030*
Cu	0.094	0.408	0.064	0.577

Physicochemical parameters

Pearson correlation coefficient

Significance

Spearman correlation coefficient

Significance

*：在0.05水平(双侧)上显著相关；**：在0.01水平(双侧)上显著相关
*: Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).

Water content

0.173

0.127

0.265

NO_X⁻-N

−0.240

0.033*

−0.211

0.062

NH₄⁺-N

−0.336

0.002**

−0.388

0.000**

−0.221

0.050

−0.295

0.008*

Particles (<2 μm)

0.069

0.543

0.194

0.086

Particles (2−5 μm)

0.244

0.030*

0.269

0.017*

Particles (5−10 μm)

0.189

0.095

0.165

0.147

Particles (10−50 μm)

0.062

0.585

0.044

0.697

Particles (50−100 μm)

−0.311

0.005**

−0.426

0.000**

Particles (100−500 μm)

−0.042

0.715

−0.117

0.305

Particles (500−1 000 μm)

0.042

0.714

0.019

0.868

Total N

0.094

0.408

0.271

0.016*

0.102

0.370

0.113

0.320

SO₄²⁻

−0.504

0.000**

−0.301

0.023*

Cl⁻

−0.464

0.000**

−0.364

0.005**

0.117

0.303

0.161

0.157

0.153

0.179

0.221

0.050

0.073

0.522

0.081

0.477

−0.233

0.038*

0.010

0.931

−0.077

0.500

−0.093

0.414

−0.097

0.393

−0.015

0.897

0.152

0.181

0.140

0.218

0.186

0.101

0.245

0.030*

0.094

0.408

0.064

0.577

Physicochemical parameters	Pearson correlation coefficient	Significance	Spearman correlation coefficient	Significance
：在0.05水平(双侧)上显著相关；：在0.01水平(双侧)上显著相关 : Significantly correlated at the 0.05 level (two-tailed); **: Highly significantly correlated at the 0.01 level (two-tailed).
Water content	0.005	0.965	0.134	0.239
NO_X⁻-N	−0.137	0.230	−0.173	0.128
NH₄⁺-N	0.050	0.661	−0.104	0.364
pH	0.061	0.590	−0.178	0.117
Particles (<2 μm)	−0.328	0.003**	−0.201	0.076
Particles (2−5 μm)	−0.237	0.035*	−0.074	0.517
Particles (5−10 μm)	−0.139	0.222	−0.083	0.468
Particles (10−50 μm)	−0.111	0.331	−0.043	0.704
Particles (50−100 μm)	0.120	0.294	−0.132	0.246
Particles (100−500 μm)	0.320	0.004**	0.108	0.345
Particles (500−1 000 μm)	0.258	0.022*	0.224	0.048*
Total N	−0.282	0.034*	−0.245	0.066
P	−0.493	0.000**	−0.585	0.000**
SO₄²⁻	−0.199	0.138	0.023	0.864
Cl⁻	−0.205	0.126	−0.260	0.051
Al	−0.145	0.281	−0.026	0.845
Fe	−0.306	0.021*	−0.216	0.106
K	−0.260	0.051	−0.255	0.056
Ca	−0.072	0.593	−0.115	0.394
Na	0.168	0.213	0.040	0.766
Mg	−0.313	0.018*	−0.320	0.015*
Mn	−0.383	0.003**	−0.375	0.004**
Zn	−0.484	0.000**	−0.410	0.002**
Cu	−0.352	0.007**	−0.458	0.000**

Physicochemical parameters

Pearson correlation coefficient

Significance

Spearman correlation coefficient

Significance

Water content

0.005

0.965

0.134

0.239

NO_X⁻-N

−0.137

0.230

−0.173

0.128

NH₄⁺-N

0.050

0.661

−0.104

0.364

0.061

0.590

−0.178

0.117

Particles (<2 μm)

−0.328

0.003**

−0.201

0.076

Particles (2−5 μm)

−0.237

0.035*

−0.074

0.517

Particles (5−10 μm)

−0.139

0.222

−0.083

0.468

Particles (10−50 μm)

−0.111

0.331

−0.043

0.704

Particles (50−100 μm)

0.120

0.294

−0.132

0.246

Particles (100−500 μm)

0.320

0.004**

0.108

0.345

Particles (500−1 000 μm)

0.258

0.022*

0.224

0.048*

Total N

−0.282

0.034*

−0.245

0.066

−0.493

0.000**

−0.585

0.000**

SO₄²⁻

−0.199

0.138

0.023

0.864

Cl⁻

−0.205

0.126

−0.260

0.051

−0.145

0.281

−0.026

0.845

−0.306

0.021*

−0.216

0.106

−0.260

0.051

−0.255

0.056

−0.072

0.593

−0.115

0.394

0.168

0.213

0.040

0.766

−0.313

0.018*

−0.320

0.015*

−0.383

0.003**

−0.375

0.004**

−0.484

0.000**

−0.410

0.002**

−0.352

0.007**

−0.458

0.000**

Factors	RDA1	RDA2	r²	P	Explained variable (%)
BHC：六氯环己烷；DDT：双对氯苯基三氯乙烷. ：在0.05水平上显著相关；：在0.01水平上显著相关. /：未检测 BHC: Benzenehexachloride; DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethane. : Significantly correlated at the 0.05 level; **: Highly significantly correlated at the 0.01 level. /: No detection.
Moisture	−0.203	0.979	0.505	0.001**	13.07
NO_X⁻-N	0.998	0.058	0.007	0.909	/
NH₄⁺-N	0.369	0.930	0.008	0.902	/
pH	0.397	0.918	0.628	0.001**	4.77
Particles (<2 μm)	0.965	−0.261	0.311	0.007**	2.77
Particles (2−5 μm)	0.952	−0.307	0.199	0.053	/
Particles (5−10 μm)	0.486	0.874	0.044	0.516	/
Particles (10−50 μm)	−0.762	0.648	0.110	0.195	/
Particles (50−100 μm)	−1.000	−0.005	0.005	0.960	/
Particles (100−500 μm)	−0.934	−0.356	0.057	0.461	/
Particles (500−1 000 μm)	−0.909	−0.417	0.126	0.130	/
TN	0.967	−0.254	0.368	0.001**	2.82
P	0.998	−0.061	0.113	0.194	/
Al	−0.506	−0.863	0.077	0.295	/
Ca	0.191	0.982	0.475	0.002**	1.14
Cu	0.041	0.999	0.020	0.741	/
Fe	−0.857	0.516	0.007	0.907	/
K	0.178	−0.984	0.095	0.251	/
Mg	−0.534	0.845	0.176	0.054	/
Mn	0.971	−0.240	0.027	0.655	/
Na	−0.943	0.332	0.064	0.395	/
Zn	0.409	−0.912	0.080	0.311	/
SO4²⁻	0.644	0.765	0.011	0.846	/
Cl⁻	0.894	−0.448	0.022	0.781	/
BHC	1.000	0.029	0.245	0.014*	1.25
DDT	0.228	−0.974	0.009	0.937	/

Factors

RDA1

RDA2

r²

Explained variable (%)

BHC：六氯环己烷；DDT：双对氯苯基三氯乙烷. *：在0.05水平上显著相关；**：在0.01水平上显著相关. /：未检测
BHC: Benzenehexachloride; DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethane. *: Significantly correlated at the 0.05 level; **: Highly significantly correlated at the 0.01 level. /: No detection.

Moisture

−0.203

0.979

0.505

0.001**

13.07

NO_X⁻-N

0.998

0.058

0.007

0.909

NH₄⁺-N

0.369

0.930

0.008

0.902

0.397

0.918

0.628

0.001**

4.77

Particles (<2 μm)

0.965

−0.261

0.311

0.007**

2.77

Particles (2−5 μm)

0.952

−0.307

0.199

0.053

Particles (5−10 μm)

0.486

0.874

0.044

0.516

Particles (10−50 μm)

−0.762

0.648

0.110

0.195

Particles (50−100 μm)

−1.000

−0.005

0.005

0.960

Particles (100−500 μm)

−0.934

−0.356

0.057

0.461

Particles (500−1 000 μm)

−0.909

−0.417

0.126

0.130

0.967

−0.254

0.368

0.001**

2.82

0.998

−0.061

0.113

0.194

−0.506

−0.863

0.077

0.295

0.191

0.982

0.475

0.002**

1.14

0.041

0.999

0.020

0.741

−0.857

0.516

0.007

0.907

0.178

−0.984

0.095

0.251

−0.534

0.845

0.176

0.054

0.971

−0.240

0.027

0.655

−0.943

0.332

0.064

0.395

0.409

−0.912

0.080

0.311

SO4²⁻

0.644

0.765

0.011

0.846

Cl⁻

0.894

−0.448

0.022

0.781

BHC

1.000

0.029

0.245

0.014*

1.25

DDT

0.228

−0.974

0.009

0.937