微生物学报

Type	Efflux pumps	Genes	Substrates	Other functions	Regulatory genes	References
^a: Conclusions from unpublished data in our lab.
ABC	CadA	lmo1100 (cadA3)	Cd²⁺	/	CadC	[17,23-26]
AnrAB	lmo2114,lmo2115	Nisin, bacitracin, gallidermin, ampicillin, cefotaxime, and some other β-lactam antibiotics	/	VirR	[30]
VirAB	lmo1746,lmo1747	Cephalosporins, kanamycin, tetracycline, nisin, EtBr, BC, etc.	Maintain the actin tail formation, promote biofilm formation, involved in bacterial adhesion	VirSR	[16,18,32-34]
	VgaL	lmo0919	Lincosamides, streptogramin A compounds	/	/	[35-38]
MFS	MdrL	lmo1409	Macrolides, cefotaxime, heavy metals, QACs	/	LadR	[15,40-46]
Lde	lmo2741	Fluoroquinolones, EtBr, dye acridine orange	/	/	[47-50]
MdrT	lmo2588	Cholic acid	Control the magnitude of a host cytosolic surveillance pathway, leading to the production of several cytokines, including type I IFN	BrtA	[19,53-56]
MdrM	lmo1617	MarR
MATE	FepA	lmo2087	Fluoroquinolones, QACs, EtBr, etc.	Promote flagella formation and expression of virulence proteins^a	FepR	[62-65,73]
SMR	QacH, BcrABC, and EmrE					[69]
EmrC	Plasmid-borne	QACs	/	TetR	[14,70-71]
SugE1/SugE2	lmo0853,lmo0854	QACs	/	SugR	[72-73]

Type	Efflux pumps	Genes	Substrates	Other functions	Regulatory genes	References
^a: Conclusions from unpublished data in our lab.
ABC	CadA	lmo1100 (cadA3)	Cd²⁺	/	CadC	[17,23-26]
AnrAB	lmo2114,lmo2115	Nisin, bacitracin, gallidermin, ampicillin, cefotaxime, and some other β-lactam antibiotics	/	VirR	[30]
VirAB	lmo1746,lmo1747	Cephalosporins, kanamycin, tetracycline, nisin, EtBr, BC, etc.	Maintain the actin tail formation, promote biofilm formation, involved in bacterial adhesion	VirSR	[16,18,32-34]
	VgaL	lmo0919	Lincosamides, streptogramin A compounds	/	/	[35-38]
MFS	MdrL	lmo1409	Macrolides, cefotaxime, heavy metals, QACs	/	LadR	[15,40-46]
Lde	lmo2741	Fluoroquinolones, EtBr, dye acridine orange	/	/	[47-50]
MdrT	lmo2588	Cholic acid	Control the magnitude of a host cytosolic surveillance pathway, leading to the production of several cytokines, including type I IFN	BrtA	[19,53-56]
MdrM	lmo1617	MarR
MATE	FepA	lmo2087	Fluoroquinolones, QACs, EtBr, etc.	Promote flagella formation and expression of virulence proteins^a	FepR	[62-65,73]
SMR	QacH, BcrABC, and EmrE					[69]
EmrC	Plasmid-borne	QACs	/	TetR	[14,70-71]
SugE1/SugE2	lmo0853,lmo0854	QACs	/	SugR	[72-73]

单增李斯特菌耐药外排泵研究进展

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夏菁 , 罗亚如 , 宋厚辉 , 程昌勇 ^*

微生物学报 | 综述 2024,64(5): 1331-1347

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微生物学报 | 综述 2024, 64(5): 1331-1347

单增李斯特菌耐药外排泵研究进展

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夏菁, 罗亚如, 宋厚辉, 程昌勇^*

作者信息

浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室, 浙江杭州 311300

Advances in efflux pump-mediated multidrug resistance ofListeria monocytogenes

Jing XIA, Yaru LUO, Houhui SONG, Changyong CHENG^*

Affiliations

Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics & Advanced Technology, Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management, China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, College of Animal Science and Technology & College of Veterinary Medicine, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

出版时间: 2024-05-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230631

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摘要

收起

单增李斯特菌是一种重要的人兽共患食源性胞内致病菌，广泛存在于自然环境中且易污染动物性食品，人及动物感染后可引起严重的李斯特菌病，死亡率高达30%。单增李斯特菌通常对多种药物敏感，然而，因不合理使用抗菌药或消毒剂形成的选择压力导致李斯特菌多重耐药情况的报道日渐增多。外排泵蛋白是细菌中一类重要的蛋白，可参与机体多种生物学过程，包括影响细菌对抗生素敏感性、促进有毒化合物泵出、影响细菌毒力等。本文综述了近年来关于单增李斯特菌耐药外排泵的功能及调控机制的研究进展，为深入理解李斯特菌耐药等环境适应机制及有效控制该病原污染传播和筛选抗感染药物新靶点提供理论基础。

关键词

单增李斯特菌 / 外排泵 / 多重耐药 / 毒力

Abstract

收起

Listeria monocytogenes, a major zoonotic food-borne intracellular pathogen, is ubiquitous in the natural environment and easily contaminates animal-derived food products. The consumption of the contaminated food can cause severe listeriosis in both humans and animals, with the mortality rate reaching up to 30%. The antimicrobial therapy is the only feasible approach for treatingL.monocytogenes infection sinceL.monocytogenes is susceptible to multiple antimicrobials. However, the reports of multidrug-resistant strains are increasing due to the selective pressure exerted by the irrational use of antimicrobials or disinfectants. The antimicrobial resistance mechanisms ofL.monocytogenes are complex. Efflux pump proteins are crucial in bacteria and participate in various biological processes. Specifically, they can influence bacterial sensitivity to antibiotics, facilitate the efflux of toxic compounds, and affect bacterial virulence. Over the last two decades, scholars have conducted research on the efflux pumps-mediated resistance ofL.monocytogenes, identifying several efflux pump proteins associated with the efflux of antibiotics or toxic compounds. Additionally, some efflux pumps are involved in the virulence expression process ofL.monocytogenes. This paper reviews the research advances in the functions and regulatory mechanisms of efflux pumps in multidrug-resistantL.monocytogenes. It provides a theoretical foundation for probing into the environmental adaption mechanisms ofL.monocytogenes, curbing the spread of this pathogen, and identifying new drug targets for combating infections.

Key words

Listeria monocytogenes / efflux pump / multidrug resistance / virulence

引用本文

夏菁, 罗亚如, 宋厚辉, 程昌勇. 单增李斯特菌耐药外排泵研究进展. 微生物学报, 2024 , 64 (5) : 1331 -1347 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230631

Jing XIA, Yaru LUO, Houhui SONG, Changyong CHENG. Advances in efflux pump-mediated multidrug resistance ofListeria monocytogenes[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (5) : 1331 -1347 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230631

正文

收起

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一种重要的人兽共患食源性胞内致病菌，其广泛分布于自然界中，具有很强的环境适应能力(如抗氧化应激能力、能在4−45 ℃范围内存活、耐高渗环境、抗酸应激能力等)^[1]。Lm能在多种食品(如肉及肉制品、乳制品、蔬菜、水果、鱼等)及加工环境中存活，人及动物摄入被Lm污染的食品后，可导致严重的侵袭性感染，称为李斯特菌病^[2-3]。细菌首先穿过肠道屏障，进入血液循环，然后在肝和脾等靶器官进行增殖扩散，可穿过血脑屏障和胎盘屏障，进而引发败血症、脑膜炎和流产等严重疾病^[4]。Lm主要感染老年人、孕妇和免疫力低下的人群，是致死率最高的食源性致病菌之一(可高达20%−30%)，被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)列为“零容忍”食源性病原菌^[5-6]。过去20年，在欧美等国家已报道了多起食源性李斯特菌病的暴发事件，绝大多数的李斯特菌感染是由食用被Lm污染的即食食品引起的^[7-8]。近年来对我国不同省市Lm污染情况调查发现，在不同食品加工过程中都存在Lm污染^[9-10]。目前，有效抗菌药物治疗是针对Lm感染唯一可行的办法，Lm通常对多种药物敏感，但由于过度使用抗菌药而施加的选择压力，耐药包括多重耐药(multidrug resistance, MDR) Lm的报道在逐渐增多^[11-13]。

根据已有报道，Lm的耐药机制比较复杂，包括可移动元件介导的耐药基因转移、药物作用靶点的改变、药物的外排作用、钝化酶或灭活酶的产生、生物被膜等多种机制^[11,14-16]。其中，外排泵蛋白作为细菌中一类重要的蛋白，可参与机体多种活动。作为Lm产生MDR的机制之一，外排泵不仅可介导Lm对多种抗菌药或有毒化合物的外排，如抗生素、重金属、消毒剂、染料等其他抗菌化合物^[15,17-18]，同时还参与调控宿主先天免疫过程^[19]。近20年来，国内外许多学者已经开展Lm耐药外排泵的相关研究，发现了多个与抗生素或有毒化合物泵出相关的外排蛋白，同时，一些外排泵还参与了Lm毒力表达过程。本文主要对Lm耐药外排泵的研究进展进行综述，并结合本实验室相关研究，进行讨论。

1 单增李斯特菌耐药外排泵的结构分类

收起

根据底物转移的特性、作用机制和能量来源，Lm外排泵可以分为两大类，即：初级活性转运蛋白和次级活性转运蛋白。初级活性转运蛋白利用腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)水解释放的化学能作为动力，包含ATP依赖转运蛋白(ATP-binding cassette, ABC)家族；次级活性转运蛋白利用H⁺或Na⁺穿过内膜的电化学势作为驱动力，包括易化因子超家族(major facilitator superfamily, MFS)、多药和有毒化合物排出(multidrug and toxic-compound extrusion, MATE)家族以及小多重耐药(small multidrug resistance, SMR)家族^[20]。另外3种在其他细菌中报道的耐药外排泵类型，耐药结节分化(resistance nodulation cell division, RND)家族、变形杆菌抗菌化合物外排(proteobacterial antimicrobial compound efflux, PACE)家族和药物/代谢物外排(drug/metabolic efflux, DME)家族蛋白在Lm中尚未见报道。下面将对Lm中不同种类外排泵的报道进行综述与讨论。

2 单增李斯特菌不同结构耐药外排泵的功能及调控机制

收起

2.1 ABC家族外排泵

ABC家族外排泵是利用ATP水解的能量将药物逆着其浓度梯度排出细胞的初级活性转运蛋白，是所有旁系同源蛋白家族中最大的家族，包含ABC转运蛋白，也包括不参与转运但是参与DNA修复、基因表达调节等过程的ABC型ATP酶^[21]。在乳酸乳球菌中发现的MDR转运蛋白LmrA是革兰阳性菌中最早发现的ABC家族外排泵，LmrA不仅帮助乳酸乳球菌转运柔红霉素和溴化乙锭(ethidium bromide, EtBr)，还可以提高乳酸乳球菌在高盐环境下的存活^[22]。Lm中已经报道的ABC家族外排泵主要有CadAC、AnrAB、VirAB和VgaL (图1)。

2.1.1 CadAC

CadAC是Lm中报道的第一个外排泵，它的发现源于对Lm镉耐受的研究。在最初的研究中，Lebrun等^[23]证明Lm对镉的耐受是质粒介导的，对关键因素进一步探索发现，位于Tn5422转座子上的CadAC操纵子是介导镉耐受的关键基因^[17]。之后由于cadA不同基因亚型的发现，该cadA被命名为cadA1。根据发现时间的先后，另外3个cadA分别被命名为cadA2、cadA3和cadA4^[24-26]。1998−1999年，美国暴发了与热狗污染有关的李斯特菌感染事件，Nelson等^[24]对引起此次疫情的分离株进行基因组测序，发现菌株内质粒pLM80 (约80 kb)携带CadA，因序列与cadA1不同，被命名为cadA2，同时该质粒还携带介导苯扎氯铵(benzalkonium chloride, BC)耐受的基因。Mullapudi等^[25]通过对Lm菌株EGD-e的基因组分析发现，其也携带镉耐受基因，因序列存在差异，因此被命名为cadA3。1983年，美国曼彻斯特暴发李斯特菌病，通过实验室细菌培养，分离出Lm菌株，命名为Scott A^[26]。Briers等^[26]对Scott A的基因组分析后，根据序列相似度将其携带的镉耐受基因命名为cadA4，但并未对CadA4的功能进行验证。为了对CadA4的功能进行解析，Parsons等^[27]进行了一系列实验。他们发现镉暴露可以诱导cadA4表达；在大蜡螟模型中的毒力评估表明，cadA4正常表达会减弱细菌毒力；生物被膜实验表明cadA4失活会降低细菌生物被膜的形成，证明CadA4确实参与细菌抵抗镉应激，同时还与细菌毒力表达和生物被膜形成相关^[27]。

根据报道，Lm中的CadA介导Cd²⁺外排，CadC是负调控蛋白，这和金黄色葡萄球菌中的CadAC作用方式一致^[28]。CadC除了调控CadA之外，还被证明可能是广泛的毒力基因表达抑制基因。Pombinho等^[29]发现CadC在Lm感染后期会高度表达，下调在胃肠道中生存所需的基因来促进Lm毒力，进而促进细菌感染。

2.1.2 AnrAB

在对Lm菌株EGD-e序列分析时，Collins等^[30]发现AnrB (由lmo2115编码)可以介导Lm对乳酸链球菌素(nisin)的天然耐药；anrB缺失后，Lm对杆菌肽敏感性升高最显著(8倍)，对抗菌肽gallidermin敏感性升高4倍，同时对氨苄西林、青霉素G、头孢呋辛、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素敏感性显著升高，证明AnrB是介导MDR的外排泵。

AnrAB位于同一个操纵子中，AnrB是介导MDR的外排泵，AnrA (由lmo2114编码)则是相应的ATP结合蛋白，其上游的假定启动子包含一个与VirR介导的调控相关的保守回文序列，因此被认为很可能受VirR调控^[30]。VirR是双组份调控系统(two-component system, TCS) VirSR中的响应调控蛋白，是Lm中重要的毒力调控因子，研究表明，VirR的缺失严重降低了菌株在细胞和小鼠中的毒力与侵袭性^[31]。目前，AnrAB介导MDR的确切机制尚不清楚。

2.1.3 VirAB

菌株LM-49是通过转座子突变筛选出的生物被膜强表达菌株，Zhu等^[32]通过对其序列进行分析，发现一个假定的ABC型转运蛋白可以负调控Lm生物被膜的形成，该转运蛋白之后被命名为VirAB，在EGD-e中分别由lmo1746和lmo1747编码。与野生株相比，virAB缺失株形成生物被膜的能力下降，对头孢菌素类抗生素、nisin和EtBr的敏感性增加；当培养基中分别添加亚致死浓度的BC、卡那霉素和四环素时，缺失株均表现出不同程度的生长缺陷^[33]。通过对调控机制的进一步研究，Grubaugh等^[34]发现VirAB表达也受VirSR的调控。已知VirAB和AnrAB均受VirSR调控，VirAB与细菌对nisin的耐药相关，但却与杆菌肽耐药无关，表明VirR对杆菌肽耐药的调控机制不依赖于VirAB，更可能依赖于AnrAB^[34]。另外，virAB缺失株和virR缺失株在体外噬斑形成和体内毒力方面也表现出相似的缺陷，肌动蛋白尾巴会变短，表明这些缺失株的毒力降低都是基于肌动蛋白的运动性移动和传播的能力降低，证明VirAB与VirR在同一通路中发挥作用，调控细菌毒力和耐药所需基因的表达^[34]。同时，VirAB和VirS都与黏附相关，但与群集运动无关；VirAB和VirS对细菌生物被膜的形成都至关重要，它们可以作为一个整体在生物被膜的形成中发挥作用^[16]。

因此，TCS VirSR和两个ABC型外排泵VirAB、AnrAB组成了复杂的TCS/ABC转运系统(VirAB-VirSR-AnrAB)，成为了独特的耐药模式。Jiang等^[18]通过对VirAB-VirSR-AnrAB系统研究发现，它们不仅介导对nisin、杆菌肽的耐药，同时还介导菌株对头孢菌素类抗生素、EtBr和BC耐药或耐受。在该系统中，两种ABC转运蛋白VirAB和AnrAB在头孢噻肟耐药中发挥着不同的作用，前者仅负责抗生素感知，作为VirSR信号传导的感应器，而后者则有助于抗生素的运输^[18]。另外，VirAB可以促进菌株对卡那霉素和四环素的耐药，证明VirAB确实是MDR外排泵^[18]。

2.1.4 VgaL

Chesneau等^[35]对细菌基因组序列分析表明，Lm中Lmo0919与葡萄球菌Vga蛋白存在亲缘关系；将Lmo0919异源表达于葡萄球菌中，发现其可以介导对林克酰胺类抗生素和链阳霉素A化合物的耐药，因此认为该基因可以介导抗生素耐药。Lmo0919随后被Crowe-Mcauliffe等^[36]命名为vgaL。为了解VgaL介导的耐药表型，Dar等^[37]在Lm中缺失VgaL，发现菌株对林可霉素敏感性升高了4倍，而没有影响对其他抗生素的敏感性；证明vgaL编码的蛋白具有林可霉素特异耐药性。

Dar等^[37]进一步对vgaL的5′UTR调控序列进行解析，发现该基因可能具有双茎、终止子/反终止子结构。即使在林可霉素存在的情况下，从反终止子中缺失8个核苷酸也使调节子处于组成性“关闭”状态，使细菌对抗生素变为敏感；相反，从反-反终止子中缺失8个核苷酸会释放反终止子，使其干扰终止子结构，这样在没有抗生素的情况下也会导致本构性通读(即“开放”状态)，并导致细菌对林可霉素的耐药性增加^[37]。这表明，vgaL介导的林可霉素依赖性激活是由该基因5'UTR中终止子/反终止子结构的结构性相互作用介导的^[37]。除了VgaL，Lm中还报道了另一林可霉素耐药蛋白HflXr (由lmo0762编码)，Duval等^[38]通过对HflXr功能研究表明，VgaL在Lm对林可霉素的固有耐药中起主要作用，而HflXr可以部分恢复VgaL的缺失，因此在林可霉素存在情况下，VgaL和HflXr很可能起协同作用。

2.2 MFS外排泵

MFS外排泵是最大的次级转运蛋白家族，存在于从细菌、植物到哺乳动物的所有门中。基于保守基序比对的生物信息学分析表明，MFS转运蛋白可以分为两组，分别含有12个或14个跨膜螺旋或片段(transmembrane helices or segments, TMS)。该家族中包含多种转运蛋白，如金黄色葡萄球菌中的NorA和QacA，不同菌株之间同源性通常不高。综合已有报道，MFS外排泵通常受TetR型、MarR型或MerR型转录抑制因子的调控^[39]。Lm中已经报道的MFS外排泵主要有MdrL、Lde、MdrT和MdrM (图2)。

2.2.1 MdrL

MdrL是Lm中报道的第一个MDR外排泵。MdrL位于Lm染色体上(由lmo1409编码)，Mata等^[15]发现当该基因缺失后，菌株不能外排EtBr，对大环内酯类抗生素、头孢噻肟和部分重金属离子(Zn²⁺、Co²⁺和Cr²⁺)的最小抑制浓度均明显降低。随着研究的深入，研究人员发现MdrL的底物范围不止于此。Mereghetti等^[40]调查97株不同来源的Lm对季铵盐类消毒剂(quaternary ammonium compounds, QACs)耐受的结果表明，约7%的Lm对BC的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值较高，可能和MdrL的过度表达有关，提示MdrL与菌株对BC等QACs的耐受也相关。以上研究的MdrL都是由染色体编码的，而Romanova等^[41]发现MdrL也可以由质粒携带，同样介导对QACs的耐受。Huillet等^[42]证明PadR型的调控因子LadR (由lmo1408编码)可以负调控MdrL，且MdrL不受全局调控因子PrfA的调控。

徐雅梦等^[43-44]及Jiang等^[45]进一步证明MdrL外排泵介导Lm对BC的耐受，但与之前的报道不同，mdrL的缺失对头孢噻肟耐药性和EtBr外排无影响；且证明Lm的调控子LadR通过与mdrL基因启动子区域特异性结合实现对外排泵MdrL的负调控。由于BC在食品工业中广泛使用，MdrL有利于Lm在食品加工环境中生存，这引发对消毒剂耐受Lm在食品加工环境中持留的担忧。Yu等^[46]将Lm暴露于逐渐增加的BC浓度下，不仅导致菌株对BC的耐受，还导致对其他几种具有不同作用原理的抗菌剂的适应，包括头孢噻肟、环丙沙星和EtBr，这表明BC消毒剂具有选择抗生素耐药性的能力；反复暴露于BC后，大多数菌株对酸、碱、渗透压、乙醇和氧化应激的敏感性都增加了。进一步研究发现菌株对BC的高耐受与MdrL相关，但是对头孢噻肟等的交叉耐药却与MdrL不相关，提示有其他的耐药机制存在；证明Lm持续暴露于BC压力，不仅可以增强MdrL的表达，同时很可能也诱导了其他耐药外排泵的表达^[46]。

2.2.2 Lde

Godreuil等^[47]对488株法国人源Lm进行耐药情况检测时发现，有5株Lm对氟喹诺酮类抗生素耐药；进一步研究证明，外排泵Lde (由lmo2741编码)介导该表型。研究团队同时发现，Lde除了介导对氟喹诺酮类抗生素耐药外，还可以增加菌株对EtBr和染料吖啶橙的耐受^[47]。对国内Lm分离株的研究也证明了Lde过表达是介导菌株对氟喹诺酮类抗生素耐药的机制之一；Jiang等^[48]对18株零售食品源Lm (其中15株对环丙沙星耐药，另外3株敏感)的研究表明，Lde过度表达与Lm对环丙沙星的耐药密切相关，对于一些其他细菌中常见的喹诺酮类抗生素耐药基因均未检测到^[49]。除了在菌株水平，Lismond等^[50]还发现，当Lm感染J774巨噬细胞时，Lde可以和真核外排泵合作，共同降低细胞内环丙沙星的浓度，以减弱环丙沙星对细胞内细菌靶标的活性。

同时，Rakic-Martinez等^[51]的研究证明Lm在环丙沙星中的持续暴露会产生和消毒剂诱导一样的耐药增强现象。他们发现在环丙沙星(2 μg/mL)和BC (10 μg/mL)存在条件下诱导菌株，Lm不仅会产生对上述两种化合物的耐药，同时对庆大霉素、EtBr、化疗药物四苯基氯化磷(tetraphenylphosphonium chloride, TPP)的MIC值都有所升高^[51]。尤其在BC诱导株中，lde的表达升高了5倍，而其他MFS型外排泵的表达并未发生变化，因此推测MIC值的升高与外排泵如Lde的过表达密切相关^[51]。然而，Jiang等^[52]对暴露于浓度逐渐增加的环丙沙星筛选出的耐药Lm菌株进行分析发现，环丙沙星诱导菌株对EtBr产生交叉耐药，未出现对BC交叉耐药的菌株；在环丙沙星诱导菌株中，lde的表达水平升高，证明外排泵Lde在Lm对环丙沙星和EtBr (而不是BC)的耐药过程中起重要作用。同时，作者还证明，Lde不受SOS反应(SOS response)的中央调节子LexA的调控^[52]。Lde具体的调控机制尚未见报道。

2.2.3 MdrT和MdrM

通过转座子突变文库的筛选，Crimmins等^[19]发现，在Lm感染宿主过程中，MFS型外排泵MdrT (由lmo2588编码)和MdrM (由lmo1617编码)可以激活宿主先天免疫的胞质监测途径，引起IFN-β的释放，促进Lm的感染。MdrT和MdrM分别受其上游调控因子tetR (后被Quillin等^[53]命名为brtA)和marR负调控；当调控因子缺失，MdrT和MdrM过度表达，会引起IFN-β的大量产生。MdrL外排泵的负调控因子LadR也可以调控mdrM的表达，但弱于MarR的作用^[19]。为研究MdrT和MdrM在Lm感染过程中可以激活宿主先天免疫的胞质监测途径的机制，Woodward等^[54]采用反相高效液相色谱对各MDR菌株的活性样品进行分离和分析发现，MdrT和MdrM过度表达的Lm菌株培养上清液中存在高水平的c-di-AMP，且Lm上清液诱导IFN-β的活性与c-di-AMP浓度呈线性相关，证明Lm在细胞内感染过程中，MdrT和MdrM等转运蛋白有利于c-di-AMP的输出，进而激活宿主先天免疫的胞质监测途径，引起IFN-β的释放。除了MdrT和MdrM外，MdrM的同源蛋白MdrA和MdrC (4个外排泵组成MdrMTAC)共同参与对Ⅰ型干扰素的诱导释放，MdrMTAC在细胞内生长过程中转录上调，并促进宿主细胞对I型干扰素的反应，证明MdrT和MdrM与细菌毒力表达密切相关^[55]。当MdrMTAC缺失后，菌株不能产生和释放肽聚糖，Lm对亚致死浓度的万古霉素转为敏感，而c-di-AMP深度参与了这一表型的产生，这些结果表明MdrMTAC介导c-di-AMP的分泌，调节肽聚糖合成，进而帮助细菌响应细胞壁应激^[55]。

除了促进宿主先天免疫反应外，MdrM和MdrT还可以影响Lm在感染过程中遇到的富含胆汁的脏器中的存活，如肝脏、脾脏和胆囊。Quillin等^[53]发现MdrM和MdrT可以被胆汁成分胆酸强力和特异性诱导表达，这种诱导是由BrtA介导的；当在胆酸存在的情况下，BrtA失去了与mdrT启动子结合和抑制的能力，但目前尚不清楚这是因为胆酸直接与BtrA蛋白结合还是由于其清洁剂性能干扰了BtrA的结构导致的。MdrT可以外排胆酸，证明胆酸是外排泵MdrT的底物；mdrT缺失株在体外暴露于胆酸或胆汁时，以及在体内感染小鼠的胆囊和肝脏定殖能力都显著减弱^[53]。Schwartz等^[56]也发现，转录调节因子BrtA的功能缺失，会解除MdrT表达的抑制，引起IFN-β的过度激活，增强Lm的毒力，但是菌株在多种小鼠感染模型中的定殖反而显著减弱，这表明分泌c-di-AMP的外排泵MdrT不受调控的表达，以一种未知的机制显著限制了Lm在体内的毒力，提示MdrT精准调控对于Lm感染的重要性。

2.3 MATE家族外排泵

MATE家族外排泵在20多年前才首次被发现，最初被认为属于MFS，然而通过系统分析以及进一步研究发现，MATE家族与MFS在基因序列以及蛋白结构上都存在差异，MATE家族有一个保守的折叠结构，包含12个跨膜螺旋(TM)，排列成两束6个螺旋^[57]。MATE家族外排泵利用Na⁺跨膜或H⁺跨膜引起的电化学势作为驱动力，在革兰阴性菌中报道较多，包括NorM、YdhE、VmrA、VcmA、AbeM、PmpM^[58-59]等。在革兰阳性菌中MATE成员也有不少报道，如金黄色葡萄球菌中的MepA^[60]、艰难梭菌的CdeA^[61]等。Lm中目前报道的耐药MATE家族外排泵只有一个：FepA (图3)。

Guérin等^[62]对两株分别对诺氟沙星和环丙沙星敏感(菌株BM4715)和高度耐药(菌株BM4716)的Lm菌株进行基因组分析发现，一个TetR型转录调控因子FepR (由lmo2088编码)发生突变，导致其下游的MATE型外排泵FepA (由lmo2087编码)高水平表达，证明FepA的过度表达是Lm对氟喹诺酮类抗生素产生高水平耐药的原因，FepA受到FepR的负调控。除了介导氟喹诺酮类抗生素耐药，FepR的突变也被证明与QACs的耐受相关。Bland等^[63]在研究食品加工环境源Lm对商业消毒剂和抗生素之间交叉耐药性的现状时发现，fepR突变在低水平适应QACs后的抗生素敏感性降低中发挥了作用。

FepR突变与QACs耐受的相关性在更系统的序列研究中得到了证明。Douarre等^[64]对消毒剂适应株和亲本菌株进行比较基因组学研究，核心基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析在94%的适应菌株中发现了转录调节因子fepR的各种突变，而其他基因的突变频率较低；通过计算机预测和蛋白质同源性建模来评估突变对蛋白质结构和功能的影响，发现75%的错义突变位于蛋白质的HTH结构域，即位于DNA相互作用位点内，这些突变会降低调控因子的活性，导致负责环丙沙星抗性增强的外排泵即FepA的过度表达。提示反复暴露于亚抑制性消毒剂浓度可诱导Lm对这些化合物的耐受性增加，同时可诱导Lm对抗生素的交叉耐药，两者都增加了Lm在食品生产环境中的持久存活能力和食品污染的风险。Bolten等^[65]也指出，在低剂量BC诱导下，多数Lm菌株的fepR基因会发生突变，导致菌株对BC耐受浓度升高；但是并没有显著提高这些耐受菌株在食品加工环境推荐使用的消毒剂浓度中的存活能力。这些结果表明，在食品加工环境使用推荐浓度的BC进行消毒时，无论菌株是否耐受低水平的BC，推荐浓度的BC对于Lm或其他李斯特属的细菌杀灭作用是相似的，提示我们不必对BC耐受Lm菌株过于担心，但持续监测仍然是必需的^[65]。

本实验室在Lm菌株EGD-e的研究中发现，当FepA缺失后，菌株对头孢噻肟、消毒剂(QACs，如苯扎溴铵、BC)及染料(EtBr、吖啶橙等)的敏感性升高，但未发现对氟喹诺酮类抗生素的敏感性发生变化。值得注意的是，FepA可以通过影响多个鞭毛相关基因转录影响鞭毛合成，导致Lm运动性降低；进一步分析发现，缺失FepA后，Lm多个毒力蛋白表达水平下降，使得菌株在细胞内感染和小鼠模型中毒力均下降(数据未发表)。证明FepA除了介导抗生素和有毒化合物的外排，还可以促进单增李斯特菌鞭毛形成和参与细菌感染过程。

2.4 SMR家族外排泵

SMR家族外排泵是已知的结构最小的次级转运蛋白，大小约为100−140个氨基酸，是包含4个跨膜α螺旋结构域的小蛋白^[66]。SMR蛋白转运动力来自电化学质子泵的能量，革兰阳性菌中SMR蛋白经典底物包括防腐剂、QACs、染料以及四环素类、氟喹诺酮类等抗生素^[66-68]。大肠埃希菌中的EmrE是SMR家族外排泵的典型代表，可以提高大肠埃希菌对多种QACs、四环素、EtBr等的耐受^[68]；革兰阳性菌金黄色葡萄球菌中的Smr主要介导对QACs、EtBr等染料的耐受^[67]。目前，Lm中报道的SMR家族外排泵有BcrABC、EmrE、EmrC、QacH、Sug1/Sug2等，几乎都与消毒剂，特别是QACs的耐受相关。姜晓冰等^[69]曾对Lm对季铵盐类消毒剂的耐药机制进行过综述，该综述已对QacH、BcrABC和EmrE进行详细介绍，此处不再赘述，仅介绍EmrC和SugE1/SugE2 (图3)。

2.4.1 EmrC

Kremer等^[14]在对96株引起成人脑膜炎的Lm菌株基因组分析时发现了一个新质粒pLMST6，该质粒携带BC耐受基因emrC，降低了菌株对食品加工业中使用的消毒剂的敏感性；与emrC阴性的Lm菌株相比，emrC阳性的Lm菌株可以在较高水平的BC浓度下生长，并且对阿莫西林和庆大霉素的MIC值升高。这些结果表明，食品加工环境中消毒剂的不当使用会对Lm菌株产生筛选，可能会导致疾病风险的增加^[14]。Kropac等^[70]进一步对携带emrC基因的质粒pLMST6的流行情况调查发现，1.6% (7/436)不同来源的Lm携带pLMST6，pLMST6仅增加Lm对QACs的耐受性，对非季铵盐类消毒剂以及氨苄西林、四环素和庆大霉素等抗生素的敏感性没有影响；携带该质粒的菌株毒力也有所提高。同时，结果还提示emrC很可能受一个TetR型的转录因子的调控，但具体调控机制并未证明^[70]。相较于其他介导QACs耐药或耐受的基因，如qacH，ermC的流行率相对较低。Chmielowska等^[71]在对287株鱼、鱼产品和食品加工厂源Lm进行药物敏感性和耐药基因分析发现，40%菌株对BC耐受，其中83%的BC耐受菌株携带qacH，有12株Lm携带编码EmrC的pLMST6-like质粒pLIS3；另外，56%菌株对镉耐受，共检测到3种不同的镉外排泵基因(cadA1、cadA2和cadA4)，其中以cadA1流行率最高，88%镉耐受Lm携带cadA1。

2.4.2 SugE1/SugE2

Jiang等^[72]发现操纵子lmo0852/lmo0853/lmo0854 (相应命名为sugR/sugE1/sugE2)可以促进Lm菌株EGD-e对QACs的耐受。SugE1和SugE2是两个SMR型外排泵，SugR是TetR型转录调控因子。SugE1和SugE2均可以介导菌株对QACs的耐受，表明两者功能重合；在BC存在条件下，任一个sugE的缺失会导致另一个sugE基因的转录水平显著升高^[72]。此外，SugR通过结合操纵子启动子区域负调控sugE基因的转录^[72]。

除了BC，溴化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)也是常用的QACs之一。Schulz等^[73]在研究中发现Lm对不同QACs的适应机制也不尽相同：一方面，所有对BC耐受的诱导菌株都只携带fepR基因的突变，与前述报道一致，fepR编码TetR型转录调节因子，其启动子区域的突变导致外排泵FepA的过度表达；另一方面，CTAB耐受却与sugR基因的突变有关，该基因调控外排泵SugE1和SugE2的表达，表明Lm对BC和CTAB耐受的诱导机制是不同的，但是FepA和SugE1/2至少可以部分相互补偿。值得注意的是，缺乏FepA或SugE1/2的李斯特菌株仍然可以获得对BC和CTAB的耐受性；基因组分析揭示，其他外排系统的过度表达可以弥补被删除的外排系统，即使在没有这两种外排系统的情况下，也可以分离出耐受菌株，这些菌株都携带了二酰基甘油激酶编码基因lmo1753 (dgkB)的突变。DgkB将二酰基甘油转化为磷脂酸，随后再用于合成磷脂，这表明膜组成的改变可能是第3种适应机制^[73]。证明在对QACs的耐受中，Lm中多个以QACs为底物的外排泵可以起到协同作用，当其中一个或两个外排泵受到抑制时，其他同底物外排泵的表达会增强，以帮助细菌提高外排QACs的能力，但具体补偿机制尚不清楚。

单增李斯特菌目前已报道的4种耐药外排泵功能及调控机制总结在图4和表1。

3 单增李斯特菌不同结构耐药外排泵存在协同作用

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在对共同底物的转运中，Lm中不同结构的外排泵很可能起协同作用，比如QACs。Lm多个外排泵均以QACs为底物，包括ABC外排泵VirAB、MFS型外排泵MdrL、MATE型外排泵FepA和多个SMR型外排泵等，它们在介导Lm对QACs的耐受中起到协同作用，这已在其他报道和前述内容中进行叙述^[69,73]。除了QACs作为多个外排泵共同底物存在协同效应外，对其他一些底物，如头孢菌素类抗生素等，Lm不同外排泵也存在协同转运作用。

Lm通常对多种抗菌药敏感，但它们对某些抗菌药具有固有或天然的耐药性，其中就包括头孢菌素类抗生素^[74]。由于头孢菌素是治疗不明原因败血症最常用的抗生素，对头孢菌素的固有耐药显著降低了感染的治愈率^[75]。Lm对头孢菌素的固有耐药机制比较复杂，包括青霉素结合蛋白突变、TCS系统(如CesRK、LisRK)和其他因子调控，当然也包括前述以头孢菌素为底物的外排泵，如MdrL、AnrAB、VirAB和FepA等^{[15,18,30,75-77]}。它们共同介导了Lm对头孢菌素类抗生素如头孢噻肟的固有耐药。

关于Lm不同结构耐药外排泵协同作用的机制还有待更多研究。

4 结语

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由于不合理使用抗菌药或消毒剂而施加的选择压力，耐药包括MDR Lm的报道在不断增多。不同耐药外排泵是导致Lm产生MDR的重要原因之一，多数外排泵参与抗生素、消毒剂等杀菌剂、重金属等的排出，少数外排泵还参与了细菌在宿主内的感染过程。也就是说，外排泵蛋白在Lm对抗外界压力、介导毒力方面都可能发挥作用，外排泵对于Lm的生存十分重要。加强对Lm耐药情况的监控，研究外排泵的功能及调控，有助于进一步了解Lm特性，帮助控制食源性Lm感染，也为找到新的抗李斯特菌药物靶点提供更多理论基础。

基金

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浙江省自然科学基金(LQ22C180001)
国家自然科学基金(32172849)
国家自然科学基金(31972648)
浙江农林大学人才启动项目(2019FR041)

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文献

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2024年第64卷第5期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230631

接收时间：2023-10-14
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-05-04

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收稿日期：2023-10-14
录用日期：2024-02-29

基金

Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LQ22C180001)

浙江省自然科学基金(LQ22C180001)

National Natural Science Foundation of China(32172849)

国家自然科学基金(32172849)

National Natural Science Foundation of China(31972648)

国家自然科学基金(31972648)

Talent Launching Project of Zhejiang A&F University(2019FR041)

浙江农林大学人才启动项目(2019FR041)

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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