微生物学报

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Gene ID	Length (bp)	Description	Amino acid	Methionine content^a (%)	Up-regulation fold change^b
^a: Methionine content=the number of methionine/the number of amino acids×100%, and the number in parentheses represents the number of methionine residues in the protein.^b: Up-regulation=the transcription level of the gene in the root nodules ofAstragalus sinicus inoculated withMesorhizobium huakuii 7653R for 28 days/the transcription level of the gene inM.huakuii 7653R under the autogenous conditions.
MCHK_RS31355	534	Peroxidase	177	2.82 (5)	96.52
MCHK_RS23945	660	Peroxidase	219	2.28 (5)	15.55
MCHK_RS30180	480	Decarboxylase	159	3.14 (5)	6.06
MCHK_RS16105	1 281	Catalase	426	1.17 (5)	3.35
MCHK_RS08640	468	Peroxidase	155	1.93 (3)	3.09
MCHK_RS19040	669	Peroxidase	222	3.60 (8)	1.14

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MCHK_RS14825	447	Response regulator	148	4.05 (6)	18.86
MCHK_RS27745	540	RNA polymerase factor	179	2.78 (5)	13.48
MCHK_RS24415	864	RNA polymerase factor	287	4.18 (12)	11.42
MCHK_RS12835	825	AraC family transcription regulatory factor	274	1.82 (5)	6.31
MCHK_RS31475	444	Lrp/AsnC family transcription regulatory factor	147	2.72 (4)	6.10
MCHK_RS07270	951	GNAT family N-acetyltransferases	316	0.60 (2)	5.60

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根瘤菌中甲硫氨酸亚砜还原酶底物蛋白的筛选与相互作用验证

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韦曼丽 , 姚演兰 , 闭寒思 , 郭荣兴 , 何宝源 , 李岚 , 易弋 , 黄翠姬 , 佀再勇 ^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(3): 780-794

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(3): 780-794

根瘤菌中甲硫氨酸亚砜还原酶底物蛋白的筛选与相互作用验证

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韦曼丽, 姚演兰, 闭寒思, 郭荣兴, 何宝源, 李岚, 易弋, 黄翠姬, 佀再勇^*

作者信息

广西科技大学生物与化学工程学院, 广西柳州 545006

Screening and verification of substrate proteins of methionine sulfoxide reductase in rhizobia

Manli WEI, Yanlan YAO, Hansi BI, Rongxing GUO, Baoyuan HE, Lan LI, Yi YI, Cuiji HUANG, Zaiyong SI^*

Affiliations

School of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545006, Guangxi, China

出版时间: 2024-03-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230511

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摘要

收起

根瘤菌在侵染豆科植物过程中会受到活性氧的氧化胁迫，含甲硫氨酸的蛋白质易被氧化成甲硫氨酸亚砜导致蛋白结构和功能改变，甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductases, Msrs)能将甲硫氨酸亚砜还原成甲硫氨酸，恢复蛋白的结构和功能。前期在华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R基因组中发现有4个Msrs和抗氧化压力密切相关，但其作用机制仍不清楚。【目的】通过筛选4个Msrs的相互作用底物，为阐明4个Msrs在M.huakuii 7653R中的作用机制提供证据。【方法】按照甲硫氨酸含量由高到低统计M.huakuii 7653R中所有蛋白的分布情况；利用蛋白互作网站预测获得4个Msrs的候选互作底物，将预测互作底物进行功能注释基因本体(gene ontology, GO)分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)代谢通路分析；通过细菌双杂交初步验证它们之间的相互作用。【结果】甲硫氨酸含量百分数分布基本呈正态分布形式，位于中间百分数的蛋白最多，位于两边的蛋白较少；筛选获得有6个抗氧化酶和6个转录调控因子是4个Msrs的候选互作底物；细菌双杂交显示，有2个抗氧化酶和5个转录调控因子确实和4个Msrs存在不同程度的相互作用。【结论】为阐明Msrs在根瘤菌M.huakuii 7653R中抵抗氧化压力的作用机制提供了证据，为揭示根瘤菌抵抗活性氧提供了新的思路和方向。

关键词

活性氧 / 甲硫氨酸亚砜还原酶 / 根瘤菌 / 氧化胁迫 / 细菌双杂交 / 互作底物

Abstract

收起

Rhizobia would encounter oxidative stress of reactive oxygen species (ROS) in the process of infecting leguminous plants. Methionine-containing proteins are easy to be oxidized to methionine sulfoxide, leading to changes in protein structure and function. Methionine sulfoxide reductases (Msrs) can reduce methionine sulfoxide to methionine, restoring protein structure and function. We have identified four Msrs in the genome ofMesorhizobium huakuii 7653R that are involved in oxidative stress response, while the mechanism remains unclear. [Objective] To identify the substrates of four Msrs and elucidate the roles of the four Msrs inM.huakuii 7653R. [Methods] According to the methionine content, we determined the distribution of all the proteins inM.huakuii 7653R. Then, we used the online protein interaction prediction tools to predict the substrates of the four Msrs, and performed gene ontology (GO) functional annotation and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment for the predicted substrates. Finally, we verified the interaction between them by using the bacterial two-hybrid system. [Results] The methionine content followed the normal distribution, with most proteins in the middle and few proteins on both sides. Six antioxidant enzymes and six transcription factors were selected as the candidate substrates of the four Msrs. Finally, the bacterial two hybrid results showed that two antioxidant enzymes and five transcription factors can interact with the four Msrs to different degrees. [Conclusion] We provided the proof in illustrating the role of Msrs in the oxidative stress response toM.huakuii 7653R and provided a new idea for the research on the mechanism of rhizobia in response to ROS.

Key words

reactive oxygen species / methionine sulfoxide reductase / rhizobia / oxidative stress / bacterial two-hybrid system / interacting substrates

引用本文

韦曼丽, 姚演兰, 闭寒思, 郭荣兴, 何宝源, 李岚, 易弋, 黄翠姬, 佀再勇. 根瘤菌中甲硫氨酸亚砜还原酶底物蛋白的筛选与相互作用验证. 微生物学报, 2024 , 64 (3) : 780 -794 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230511

Manli WEI, Yanlan YAO, Hansi BI, Rongxing GUO, Baoyuan HE, Lan LI, Yi YI, Cuiji HUANG, Zaiyong SI. Screening and verification of substrate proteins of methionine sulfoxide reductase in rhizobia[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (3) : 780 -794 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230511

正文

收起

生物固氮指在固氮酶的催化作用下，将空气中的氮气还原为能被代谢利用的氨态氮(NH₃)形式的过程。生物固氮包括自生固氮体系、豆科植物与根瘤菌互利共生的固氮体系和固氮螺菌属与禾本科植物形成的联合固氮体系。其中豆科植物与根瘤菌形成的共生固氮体系是生物固氮的重要组成部分。在根瘤菌-豆科植物共生体系建立的过程中，活性氧能作为抗菌剂抵抗根瘤菌入侵，又能作为根瘤器官发育的起始的信号分子^[1]。活性氧能调节许多发育过程，例如细胞的增殖和分化、细胞程序性死亡、种子发芽、向地性、根毛生长、花粉管发育和衰老等^[2]。同时活性氧也能引起生物大分子的氧化破坏，例如脂质、蛋白质和核酸的氧化导致结构、功能活性发生改变^[3]。在根瘤菌侵染豆科植物根毛细胞的早期，豆科植物会产生大量的活性氧来抵抗根瘤菌的入侵，特别是含硫氨基酸甲硫氨酸特别容易受到活性氧的氧化，甲硫氨酸氧化后生成S-型甲硫氨酸亚砜和R-型甲硫氨酸亚砜，能分别被A型甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase A, MsrA)和B型甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase B, MsrB)还原成甲硫氨酸从而恢复底物蛋白的活性^[4]。

细菌为了抵抗氧化压力，经过长期进化出一系列的抗氧化装置来抵抗氧化压力^[5-7]。其中甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase, Msrs)就是其中的一种。甲硫氨酸亚砜还原酶广泛存在于细菌、酵母、哺乳动物和植物中。植物中具有多拷贝数的msrs，并且它们有不同的组织表达特征和不同亚细胞定位特征，植物与细菌和动物相比甲硫氨酸亚砜还原酶会有多种功能，比如在应对生物和非生物胁迫和对植物器官发育起到重要作用^[8]。查找文献发现，在细菌中甲硫氨酸亚砜还原酶通过改变细菌的黏附性、生物膜形成以及运动性、存活能力、抗氧化性和毒力来影响病原菌的感染能力^[8]。在绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中msrA和msrB突变后对次氯酸钠和双氧水变得更为敏感，毒力有所下降^[9]。msrA参与到大肠杆菌和戈登氏链球菌生物膜的形成，并且大肠杆菌的msrA在生物膜合成时受到诱导表达^[10-11]。植物病原菌菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中的msrA缺失后，在平板上的运动性减弱^[12]。血液链球菌(Streptococcus sanguis)中msrA突变后，不能黏附血小板或者不能让血小板聚集^[13]。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中msrA突变后在巨噬细胞中的存活能力显著降低^[14]。虽然甲硫氨酸亚砜还原酶在病原菌侵染宿主过程中有重要功能，但其具体的作用机制仍不清楚。

为阐明甲硫氨酸亚砜还原酶的作用机制，筛选其作用底物是一种有效的方法。目前筛选作用底物的方法有预测法、亲和层析法、细菌(酵母)双杂交筛选法和在甲硫氨酸亚砜还原酶基因上调或者下调的物种中寻找变化的基因。蛋白中甲硫氨酸含量越高，越有可能成为其底物^[15-16]，另外可以通过蛋白互作网站进行底物蛋白的筛选(http://sbi.imim.es/iLoopsServer/index. php/init.html)。在拟南芥中通过亲和层析的方法鉴定出24个与AtMsrB1相互作用的蛋白，这些蛋白参与光合作用、转录、氧化压力以及氨基酸和糖的代谢^[17]。由于蛋白质中MetO含量的变化，引起这些蛋白稳定性改变，所以与Msrs互作的蛋白会在msrs上调或者下调的株系中表现出不同的丰度^[18]。

华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R是陈华癸院士早期分离的一种根瘤菌，与紫云英(Astragalus sinicus)有着专一的共生关系，能形成不定型瘤^[19]。紫云英是豆科黄芪属，二年生草本植物，俗名草子、红花草，是我国稻田最主要的冬季绿肥作物。实验室早期发现根瘤菌M.huakuii 7653R基因组中有4个甲硫氨酸亚砜还原酶基因MCHK_3347、MCHK_5276、MCHK_5689和MCHK_5902，分别编码MsrA1、MsrB1、MsrA2和MsrB2，这4个基因与抵抗氧化压力密切相关。为阐明4个甲硫氨酸亚砜还原酶的作用机制，首先通过蛋白互作网站分别得到它们的候选底物，然后通过GO功能分析和KEGG代谢通路分析获得可能互作的抗氧化酶和转录因子，根据实验室M.huakuii 7653R接种紫云英的转录组数据，筛选得到6个抗氧化酶基因和6个转录因子基因，并通过细菌双杂交技术进行了验证。本研究结果有助于阐明甲硫氨酸亚砜还原酶在共生过程中抵抗氧化压力的作用机制，为进一步揭示根瘤菌抵抗活性氧的机制提供新的思路。

1 材料与方法

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1.1 材料

根瘤菌Mesorhizobium huakuii 7653R、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、E.coli XL1-Blue (pBT-msrA1/mrsB1/msrA2/msrB2)报告菌株，实验室保存。质粒pMD-19T、pTRG等，购自TaKaRa公司；基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，胶回收试剂盒购自OMEGA公司，限制性内切酶购自SibEnzyme公司。

TY培养基、LB培养基、细菌双杂交非选择性培养基NSSM和选择性培养基DSSM参考文献[20]配制。

1.2 预测网站筛选Msrs的底物蛋白

将M.huakuii 7653R中的6 325个蛋白在蛋白互作预测网站(http://sbi.imim.es/iLoopsServer/index.php/init.html)进行预测，筛选出根瘤菌中与MsrA1、MsrA2、MsrB1和MsrB2可能互作的所有蛋白。将可能互作的底物蛋白在韦恩图在线制作网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获得Msrs底物蛋白预测结果的韦恩图。

1.3 底物蛋白GO分析和KEGG代谢通路分析

底物蛋白GO分析和KEGG代谢通路分析在上海美吉生物云(http://cloud.majorbio.com)上进行。分别和GO数据库^[21]、KEGG数据库^[22]进行BLAST (E_value < 1e⁻⁵)比对，从而获得底物蛋白序列的功能注释信息。

1.4 引物设计

将基因序列从NCBI下载后，用引物设计软件Primer 5设计引物，并加上合适的限制性酶切位点，送至南京金斯瑞生物有限公司合成引物，本研究所用引物见表1。

1.5 PCR产物扩增及测序

扩增采用40 μL体系：10×缓冲液4 μL，ddH₂O 13.9 μL，模板2 μL，dNTPs Mixture 2 μL，酶0.2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL。PCR反应体系：95 5 min；95 30 s，58 90 s，72 90 s，30个循环；72 5 min，25 ℃ 10 min。回收电泳检测产物大小，将产物与载体pMD19-T连接并转化E.coli DH5α，送武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序。

1.6 重组质粒的构建及酶切验证

将测序正确的基因片段用限制性内切酶切下并回收，与相同限制性内切酶酶切后线性化的载体pTRG在T4连接酶作用下进行酶连，转化E.coli DH5α，经PCR验证正确后，提取重组质粒。

重组质粒按相应的限制性内切酶酶切质粒(酶切体系：质粒20 μL，10×SS Buffer 4 μL，RNase A 1 μL，ddH₂O 13 μL，2种限制性内切酶各1 μL)，37 ℃酶切过夜。电泳观察结果。酶连：酶切后pTRG质粒和目的基因片段配酶连体系(10 μL：目的基因4.5 μL，pTRG载体2.5 μL，10×buffer 2 μL，T4连接酶1 μL)，16 ℃酶连过夜。采用钙转化法转化大肠杆菌感受态，并筛选转化子，用pTRG引物PCR验证。筛选验证正确的转化子接入液体LB中(培养基加链霉素)，37 ℃摇床培养过夜，菌体保存备用。

1.7 细菌双杂交实验

按文献方法配制细菌双杂交培养基^[20]，将验证正确的转化菌株和正、负对照的转化菌株接入5 mL LB液体培养基中，37摇床培养过夜；取1 mL菌液，5 000 r/min离心3 min，弃上清加1 mL无菌水清洗2次后加入1 mL无菌水重悬，重悬后的菌液梯度稀释为10⁻¹–10⁻⁵；吸取5 μL制备好的点样菌液，分别在非选择性平板NSSM和选择性平板DSSM中对应网格位置轻轻打出菌液；点样完后的平板用正置避光放置，平板上的菌液干后倒置放于37培养箱中避光培养16–48 h后观察结果。

1.8 分子生物学相关操作

细菌总DNA提取、PCR扩增检测及回收、质粒的提取和酶切、酶连和转化等相关分子生物学操作参考《精编分子生物学实验指南，第五版》。

2 结果与分析

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2.1 统计M.huakuii 7653R中所有蛋白含甲硫氨酸个数百分含量

根据文献报道，蛋白质中含有甲硫氨酸含量越高或者富含甲硫氨酸的结构域，越有可能是甲硫氨酸亚砜还原酶的底物^[23]，因此将M.huakuii 7653R中所有蛋白按照所含甲硫氨酸氨基酸个数的百分含量排序。M.huakuii 7653R中有6 325个含甲硫氨酸的蛋白，按照甲硫氨酸含量的百分比进行从高到低排序，并统计不同区间甲硫氨酸含量的蛋白个数，根据统计结果作图(图1)，结果显示甲硫氨酸含量落在区间2.0%−2.5%的蛋白个数最多，甲硫氨酸含量落在区间 > 10%的蛋白个数最少；甲硫氨酸含量在区间1.5%−3.5%的蛋白占M.huakuii 7653R总蛋白个数的65.09%；整体结果显示甲硫氨酸含量百分数分布基本呈正态分布形式，位于中间百分数的蛋白最多，位于两边的蛋白较少。

2.2 预测M.huakuii 7653R中4个Msrs底物蛋白

按照1.2的预测方法，将M.huakuii 7653R中的蛋白分别与4个Msrs在蛋白互作网站进行预测[结果见国家微生物科学数据中心NMDC (http://nmdc.cn)，编号：NMDCX0000231]，并做Msrs底物蛋白预测结果的韦恩图(图2)，结果显示与4个Msrs互作的蛋白共有2 620个，其中与MsrA1互作的蛋白有1 530个，与MsrB1互作的蛋白有2 039个，与MsrA2互作的蛋白有2 276个，与MsrB2互作的蛋白有2 205个；有1 059个蛋白都与4个Msrs存在相互作用；有897个蛋白与3个Msrs存在相互作用；有459个蛋白与2个Msrs存在相互作用；有205个蛋白与1个Msr存在相互作用；有7、56、63和79个蛋白分别只和MsrA1、MsrB1、MsrA1和MsrB2存在相互作用。结果表明，预测的互作底物和不同Msrs的相互作用存在差异。

2.3 预测蛋白的GO分析和KEGG分析

将得到的底物蛋白进行功能GO聚类分析和KEGG代谢通路分析，功能GO聚类分析结果表明，这些蛋白主要集中在生物过程、细胞组成和分子功能三大部分，其中分子功能主要聚集在催化活性、结合能力、转录调节活性、转运活性以及抗氧化活性，这暗示了甲硫氨酸亚砜还原酶可能通过改变这些酶的活性来影响生命活动(图3)。互作蛋白KEGG代谢通路分析结果显示，最多的是氨基酸代谢、碳代谢、膜转运和细胞群落原核生物，结果表明和Msrs互作的底物蛋白参与到各种各样的代谢通路(图4)。

2.4 候选底物抗氧化酶与转录因子的筛选

通过GO功能分析得到166个转录因子和14个抗氧化酶是根瘤菌中4个Msrs的候选底物，实验室前期分析了根瘤菌M.huakuii 7653R在自生条件和接种紫云英后共生条件下，根瘤菌中基因的转录组数据。共生条件相比于自生条件下，将这些根瘤菌基因上调表达倍数较高的转录因子和抗氧化酶作为候选基因。将上调前6位的基因作为研究对象。候选抗氧化酶基因和转录因子的编号、长度、类型、氨基酸个数、甲硫氨酸含量与上调倍数见表2和表3。

2.5 抗氧化酶与转录因子基因的扩增和重组载体的构建

提取M.huakuii 7653R基因组，用Primer 5设计抗氧化酶和转录因子的引物进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示抗氧化酶基因都扩增出了和预测大小一致的条带；转录因子基因有1个没有扩增出来，可能原因是基因结构复杂，设计的引物多次优化后仍没有扩增到目的条带(图5A、5B)。将扩增出的基因进行回收，连接到pMD-19T载体上，然后测序正确后[测序结果见国家微生物科学数据中心NMDC (http://nmdc.cn)，编号：NMDCX0000231]经过双酶切、回收酶连到载体pTRG上，转化大肠杆菌DH5α，经PCR验证后提取质粒进行双酶切验证，结果显示从重组质粒中双酶切得到了大小正确的抗氧化酶基因和转录因子基因(图5C、5D)。

2.6 细菌双杂交验证甲硫氨酸亚砜还原酶与底物蛋白的互作

提取验证后的重组质粒，分别转化到含有诱饵质粒pBT-msrA1/mrsB1/msrA2/msrB2的报告菌株E.coli XL1-Blue中，经过菌落PCR验证，将同时含有诱饵和猎物重组质粒的报告菌株保存于甘油管备用。将菌活化后分别点板到NSSM平板和DSSM平板，其中NSSM平板为非选择性平板，含有pTRG质粒和含有pBT质粒的菌株可以生长，DSSM为选择性平板，只有存在相互作用才在上面生长。甲硫氨酸亚砜还原酶和抗氧化酶相互作用点板结果如图6所示。结果表明1个过氧化物酶(GenBank ID:MCHK_RS31335)和过氧化氢酶(GenBank ID:MCHK_RS16105)与4个甲硫氨酸亚砜还原酶互作，而其他4个均不互作；甲硫氨酸亚砜还原酶和转录因子相互作用点板结果如图7所示，结果显示5个转录因子和4个甲硫氨酸亚砜还原酶存在不同程度的相互作用。

3 讨论与结论

收起

本研究综合蛋白互作网站和功能注释GO分析和KEGG代谢通路分析，然后参考中慢生根瘤菌-紫云英共生的转录组数据，筛选得到与中慢生根瘤菌M.huakuii 7653R中甲硫氨酸亚砜还原酶相互作用的6个抗氧化酶基因和6个转录调控因子基因，最后经过细菌双杂交技术验证得到1个过氧化物酶(GenBank ID:MCHK_RS31335)和1个过氧化氢酶(GenBank ID:MCHK_RS16105)与甲硫氨酸亚砜还原酶存在相互作用；2个RNA转录酶因子(GenBank ID:MCHK_RS27745,MCHK_RS24415)、1个AraC家族转录调节因子(GenBank ID:MCHK_RS12835)、1个Lrp/AsnC家族转录调控因子(GenBank ID:MCHK_RS31475)和1个GNAT家族N-乙酰转移酶(GenBank ID:MCHK_RS07270)与甲硫氨酸亚砜还原酶存在相互作用。实验结果表明蛋白互作网站得到的互作底物蛋白要结合其他方法进一步验证。

蛋白质中的甲硫氨酸残基是最容易被氧化的氨基酸之一，作为蛋白内源的抗氧化剂，并且处于蛋白表面的甲硫氨酸残基更容易受到活性氧的氧化，处于活性部位附近的甲硫氨酸残基不易被氧化^[24-25]。文献报道蛋白质中甲硫氨酸含量越高，该蛋白越有可能是甲硫氨酸亚砜还原酶的底物^[15-16]，将M.huakuii 7653R中所有的蛋白质按照甲硫氨酸残基含量百分数进行了排序(图1)，结果显示基本按正态分布排列。从6个抗氧化酶中的甲硫氨酸残基含量来看，脱羧酶(Gene ID：MCHK_RS30180，甲硫氨酸残基含量3.14%)和一类过氧化物酶(GenBank ID：MCHK_RS19040，甲硫氨酸残基含量3.60%)中的甲硫氨酸残基含量显著高于其他几个抗氧化酶，但是并不和甲硫氨酸亚砜还原酶有互作(表2和图6)。6个转录调控因子中的甲硫氨酸残基含量越高的并没有和甲硫氨酸亚砜还原酶相互作用越强(表3和图7)。这说明并不是甲硫氨酸含量越高，越和甲硫氨酸亚砜还原酶相互作用，也不是含量越高互作就越强。M.huakuii 7653R中含有2个A型甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrA1和MsrA2)与2个B型甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrB1和MsrB2)，它们的互作底物蛋白并不是都同时和这4个甲硫氨酸亚砜还原酶相互作用而是1−4个不等，但是与4个Msrs都互作的蛋白最多(图2B)。有些底物蛋白只和其中一个MsrA或MsrB互作，而与另一个不互作(图6和图7)，这可能和底物蛋白中甲硫氨酸亚砜残基位点的结构有关。

活性氧在结瘤和固氮过程中起重要作用，过氧化氢有利于侵染线正常延伸^[1]。结果表明M.huakuii 7653R中1个过氧化物酶(GenBank ID:MCHK_RS31355)和1个过氧化氢酶(GenBank ID:MCHK_RS16105)都和Msrs有不同程度的相互作用(图6)。超氧化物酶和过氧化物酶的缺失或者超表达都会影响到共生固氮的表型。苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中超表达katB减少侵染线内部过氧化氢的含量，结果导致结瘤延迟和畸形的侵染线^[26]。Mesorhizobium loti中sodA突变后在百脉根上表现结瘤缺陷，katE突变后固氮酶活性下降了50%^[1,27]。在S.meliloti中katA/katC双基因突变后固氮酶活显著下降并且早衰^[5]。这表明在M.huakuii 7653R中，甲硫氨酸亚砜还原酶能通过与抗氧化酶互作来影响共生固氮的过程。

扩增出的5个转录因子和4个Msrs都有不同程度的相互作用(图7)。其中RNA聚合酶因子(GenBank ID:MCHK_RS27745,MCHK_RS24415)的甲硫氨酸含量都比另外3个高，但是与4个Msrs的相互作用并不比其他强。大肠杆菌中的MsrA/B能修饰氧化的重组酶RecA，在DNA修饰中发挥功能^[28]，因此M.huakuii 7653R中的Msrs可能通过和RNA聚合酶因子的互作来调节转录过程，但这需要更进一步地证明。AraC家族转录因子主要和细菌毒力、生物被膜形成、耐药性和新陈代谢相关^[29-30]，在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中，AraC家族转录因子可以直接调控毒力基因ctxAB和tcpA的转录^[31]。Lrp/AsnC家族转录调控因子既能正调控氨基酸生物合成、菌毛生物合成和氨同化的操纵子，也可以负调控参与氨基酸分解代谢和肽转运^[32]。GNAT家族N-乙酰转移酶，参与调控细胞内代谢过程和信号通路。在S.meliloti中转录因子LsrB能和MsrA/B相互作用，并能通过激活基因lrp3-lpsCDE的表达来调节脂多糖的合成，也可以直接激活合成谷胱甘肽所需基因gshA表达，同时控制氧化还原感受器OxyR的表达，OxyR又可以调节katA的表达，但是OxyR对共生固氮不是必需的^[23-34]。在大肠杆菌中MsrA能和信号识别颗粒蛋白Ffh相互作用，Ffh中的甲硫氨酸氧化后不能与4.5S RNA相互作用^[16]。M.huakuii 7653R中的Msrs可能通过与AraC家族转录因子、Lrp/AsnC家族转录调控因子和GNAT家族N-乙酰转移酶互作调控下游的生命活动。

本研究通过蛋白互作网站预测得到M.huakuii 7653R中4个甲硫氨酸亚砜还原酶的互作底物，并对底物蛋白进行功能注释GO分析，筛选出2个抗氧化酶和5个转录调控因子与4个Msrs相互作用。为阐明Msrs抵抗氧化压力的作用机制提供了方向，但它们之间具体的相互作用的机制需要进一步研究。

基金

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广西自然科学基金(2023GXNSFAA026398)
广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2022KY0347)
广西大学生创新创业训练计划(S202110594128)
广西科技大学博士基金(校科博20Z33)

参考文献

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文献

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2024年第64卷第3期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230511

接收时间：2023-08-05
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出版时间：2024-03-04

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收稿日期：2023-08-05
录用日期：2023-09-15

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广西自然科学基金(2023GXNSFAA026398)

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广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2022KY0347)

Guangxi University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program Funding Project(S202110594128)

广西大学生创新创业训练计划(S202110594128)

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广西科技大学生物与化学工程学院, 广西柳州 545006

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Restriction enzyme
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MCHK_RS12835-F	CGGGATCCATGCGTCCACAATTTGCTT	BamH I
MCHK_RS12835-R	GGAATTCTCAAGGATTGAGGCGTCG	EcoR I
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MCHK_RS08640-R

CCGCTCGAGTCAAAGCGCGCGAACGG

Xho I

MCHK_RS19040-F

CGGGATCCATGTCTCTTCGTATCGCCGAC

BamH I

MCHK_RS19040-R

CGGAATTCTCAGGCGTTGCTGTGAGG

EcoR I

MCHK_RS30180-F

CGGGATCCATGCTCAAGTCAAAACTGAATGTCA

BamH I

MCHK_RS30180-R

CGGAATTCTCACTGCGACTTCGCCTTG

EcoR I

MCHK_RS31355-F

CGGGATCCATGACCGGTCAAAAGAAGGTTC

BamH I

MCHK_RS31355-R

CCGCTCGAGTCATGCTGCGTCCTTCAATG

Xho I

MCHK_RS16105-F

CGGAATTCATGACGACAGGACGAGGCA

EcoR I

MCHK_RS16105-R

CCGCTCGAGTCAGTTCGCTGGGCCCG

Xho I

pTRG-F

TGGCTGAACAACTGGAAGCT

pTRG-R

ATTCGTCGCCCGCCATAA

pBT-F

TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC

pBT-R

GGGTAGCCAGCAGCATCC

Gene ID	Length (bp)	Description	Amino acid	Methionine content^a (%)	Up-regulation fold change^b
^a: Methionine content=the number of methionine/the number of amino acids×100%, and the number in parentheses represents the number of methionine residues in the protein.^b: Up-regulation=the transcription level of the gene in the root nodules ofAstragalus sinicus inoculated withMesorhizobium huakuii 7653R for 28 days/the transcription level of the gene inM.huakuii 7653R under the autogenous conditions.
MCHK_RS31355	534	Peroxidase	177	2.82 (5)	96.52
MCHK_RS23945	660	Peroxidase	219	2.28 (5)	15.55
MCHK_RS30180	480	Decarboxylase	159	3.14 (5)	6.06
MCHK_RS16105	1 281	Catalase	426	1.17 (5)	3.35
MCHK_RS08640	468	Peroxidase	155	1.93 (3)	3.09
MCHK_RS19040	669	Peroxidase	222	3.60 (8)	1.14

Gene ID

Length (bp)

Description

Amino acid

Methionine content^a (%)

Up-regulation fold change^b

^a: Methionine content=the number of methionine/the number of amino acids×100%, and the number in parentheses represents the number of methionine residues in the protein.^b: Up-regulation=the transcription level of the gene in the root nodules ofAstragalus sinicus inoculated withMesorhizobium huakuii 7653R for 28 days/the transcription level of the gene inM.huakuii 7653R under the autogenous conditions.

MCHK_RS31355

534

Peroxidase

177

2.82 (5)

96.52

MCHK_RS23945

660

Peroxidase

219

2.28 (5)

15.55

MCHK_RS30180

480

Decarboxylase

159

3.14 (5)

6.06

MCHK_RS16105

1 281

Catalase

426

1.17 (5)

3.35

MCHK_RS08640

468

Peroxidase

155

1.93 (3)

3.09

MCHK_RS19040

669

Peroxidase

222

3.60 (8)

1.14

Gene ID	Length (bp)	Description	Amino acid	Methionine content^a (%)	Up-regulation fold change^b
^a: Methionine content=the number of methionine/the number of amino acids×100%, and the number in parentheses represents the number of methionine residues in the protein.^b: Up-regulation=the transcription level of the gene in the root nodules ofAstragalus sinicus inoculated withMesorhizobium huakuii 7653R for 28 days/the transcription level of the gene inM.huakuii 7653R under the autogenous conditions.
MCHK_RS14825	447	Response regulator	148	4.05 (6)	18.86
MCHK_RS27745	540	RNA polymerase factor	179	2.78 (5)	13.48
MCHK_RS24415	864	RNA polymerase factor	287	4.18 (12)	11.42
MCHK_RS12835	825	AraC family transcription regulatory factor	274	1.82 (5)	6.31
MCHK_RS31475	444	Lrp/AsnC family transcription regulatory factor	147	2.72 (4)	6.10
MCHK_RS07270	951	GNAT family N-acetyltransferases	316	0.60 (2)	5.60

Gene ID

Length (bp)

Description

Amino acid

Methionine content^a (%)

Up-regulation fold change^b

MCHK_RS14825

447

Response regulator

148

4.05 (6)

18.86

MCHK_RS27745

540

RNA polymerase factor

179

2.78 (5)

13.48

MCHK_RS24415

864

RNA polymerase factor

287

4.18 (12)

11.42

MCHK_RS12835

825

AraC family transcription regulatory factor

274

1.82 (5)

6.31

MCHK_RS31475

444

Lrp/AsnC family transcription regulatory factor

147

2.72 (4)

6.10

MCHK_RS07270

951

GNAT family N-acetyltransferases

316

0.60 (2)

5.60