微生物学报

Substrates (10 mg/mL)	Typical structures	Specific activities (U/mg)
: Glucose;: Mannose;: Galactose;: Xylose;: Glucuronic acid; Me-O: Methyl. Data represent the mean±SD (n=4); NA: Not active.
Barley β-glucan		443.55±24.48
Icelandic moss lichenan		65.56±5.98
Konjac gum		122.37±2.85
Tamarind xyloglucan		159.16±7.73
Carboxyl methyl cellulose		NA
Laminaria digitata laminarin		NA
Ivory nut mannan		NA
Beechwood xylan		NA

Substrates (10 mg/mL)	Typical structures	Specific activities (U/mg)
: Glucose;: Mannose;: Galactose;: Xylose;: Glucuronic acid; Me-O: Methyl. Data represent the mean±SD (n=4); NA: Not active.
Barley β-glucan		443.55±24.48
Icelandic moss lichenan		65.56±5.98
Konjac gum		122.37±2.85
Tamarind xyloglucan		159.16±7.73
Carboxyl methyl cellulose		NA
Laminaria digitata laminarin		NA
Ivory nut mannan		NA
Beechwood xylan		NA

湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

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徐晓锋 ¹^,²^,³ , 韩俊彦 ¹^,²^,³ , 丁钰杰 ¹ , 廖静 ¹ , 高德英 ² , 张骥 ³ , 王佳堃 ² , 尹尚军 ¹ , 王谦 ²^,^* , 徐洁皓 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(3): 755-766

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(3): 755-766

湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

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徐晓锋¹^,²^,³, 韩俊彦¹^,²^,³, 丁钰杰¹, 廖静¹, 高德英², 张骥³, 王佳堃², 尹尚军¹, 王谦²^,^*, 徐洁皓¹^,^*

作者信息

1 浙江万里学院生物与环境学院, 浙江宁波 315100

2 浙江大学动物科学学院奶业科学研究所, 浙江杭州 310058

3 杭州云心质力生物科技有限公司, 浙江杭州 310018

Heterologous expression and characterization of a GH9 glucanase geneIDSGLUC9-25 from rumen microbiota in Hu sheep

Xiaofeng XU¹^,²^,³, Junyan HAN¹^,²^,³, Yujie DING¹, Jing LIAO¹, Deying GAO², Ji ZHANG³, Jiakun WANG², Shangjun YIN¹, Qian WANG²^,^*, Jiehao XU¹^,^*

Affiliations

1 College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, Zhejiang, China

2 Institute of Dairy Science, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

3 Start Bioservices Co., Ltd., Hangzhou 310018, Zhejiang, China

出版时间: 2024-03-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230503

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摘要

收起

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分，本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因，用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因，在大肠杆菌中进行异源表达，对重组蛋白进行诱导表达和纯化，研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸，包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域；重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa，最适反应温度和pH分别为40 ℃和6.0，在30–50 ℃下活性较高，在pH 4.0–8.0范围内能够保持较高的稳定性，经pH 4.0–8.0缓冲液处理1 h后残余活性均大于90%；底物谱分析表明，rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖，比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73) U/mg；利用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物发现，rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%)，催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25 (EC 3.2.1.4)，能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖，为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。

关键词

湖羊 / 消化道微生物 / 葡聚糖酶 / IDSGLUC9-25 / 纤维寡糖

Abstract

收起

[Objective] Glucanases serve as one of the main components in feed additives. This study identified and characterized a novel GH9 glucanase gene derived from rumen microbiota in herbivores, aiming to provide a reference for the research and development of feed enzymes. [Methods] We obtained theIDSGLUC9-25 gene from the rumen fluid cDNA of Hu sheep and heterologously expressed it inEscherichia coli. The recombinant protein was induced for expression by isopropyl β-d-thiogalactopyranoside, purified, and then subjected to functional characterization. [Results] IDSGLUC9-25 encoded a protein consisting of 527 amino acid residues, which included a CelD_N domain and a GH9 family catalytic domain. The recombinant rIDSGLUC9-25 protein exhibited a molecular weight of approximately 62.7 kDa and the highest enzymatic activity at 40 ℃ and pH 6.0. The enzyme displayed robust catalytic activity within the temperature range of 30–50 ℃. After preincubation at pH 4.0–8.0 for 1 h, rIDSGLUC9-25 retained the relative activity over 90%. The substrate spectrum analysis revealed that rIDSGLUC9-25 exhibited specific activities against barley β-glucan, moss lichenan, konjac gum, and xyloglucan, with the activities of (443.55±24.48), (65.56±5.98), (122.37±2.85), and (159.16±7.73) U/mg, respectively. The hydrolysis assay showed that rIDSGLUC9-25 primarily catalyzed the hydrolysis of β-glucan into cellotriose (representing 64.19%±1.19% of total reducing sugars) and cellotetraose (representing 26.24%±0.12% of total reducing sugars). Additionally, the enzyme predominantly generated cellotriose from the hydrolysis of lichenan (representing 78.46%±0.89% of total reducing sugars). [Conclusion] This study characterizes IDSGLUC9-25, an endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) derived fromTreponema sp. The enzyme exhibited robust activity in the conversion of polysaccharides into cellotriose and cellotetraose, establishing a foundation for the development of feed enzymes and functional oligosaccharides preparation.

Key words

Hu sheep / gastrointestinal microbiota / glucanase / IDSGLUC9-25 / cellooligosaccharides

引用本文

徐晓锋, 韩俊彦, 丁钰杰, 廖静, 高德英, 张骥, 王佳堃, 尹尚军, 王谦, 徐洁皓. 湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征. 微生物学报, 2024 , 64 (3) : 755 -766 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230503

Xiaofeng XU, Junyan HAN, Yujie DING, Jing LIAO, Deying GAO, Ji ZHANG, Jiakun WANG, Shangjun YIN, Qian WANG, Jiehao XU. Heterologous expression and characterization of a GH9 glucanase geneIDSGLUC9-25 from rumen microbiota in Hu sheep[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (3) : 755 -766 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230503

正文

收起

纤维素、半纤维素等非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSPs)是谷物饲料中重要的抗营养因子。其中β-葡聚糖是半纤维素的主要成分之一。饲粮中β-葡聚糖溶解后会变得黏稠，形成网状结构，使得消化道中的营养素被这种结构所“捕获”，从而减少了其与消化酶之间的接触，影响动物对饲料的消化吸收^[1]。分析其化学成分可知，β-葡聚糖是由β-d-葡萄糖残基通过β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的线性多糖。饲料中添加β-葡聚糖酶等碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)能有效消除NSPs的抗营养作用；同时，反应生成的纤维寡糖能促进乳酸菌、双歧杆菌等益生菌增殖，益生菌发酵后能释放大量短链脂肪酸降低肠道内pH值，从而抑制致病菌生长，维持机体肠道微生态稳定^[2]。

β-葡聚糖酶是指一类能够裂解葡聚糖的β-1,3、β-1,4或β-1,6糖苷键产生纤维寡糖和葡萄糖的糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)^[3]，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，主要分布在GH5、GH8、GH9、GH16和GH55等家族^[4]。根据底物类型和水解方式差异^[5]，内切葡聚糖酶可进一步分为内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4)、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶[endo-β-1,3(4)-glucanase, EC 3.2.1.6]、内切-β-1,3-葡聚糖酶(endo-β-1,3-glucanase, EC 3.2.1.39)、内切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶/地衣多糖酶(endo-β-1,3-1,4-glucanase/lichenase, EC 3.2.1.73)和木葡聚糖酶(xyloglucanase, EC 3.2.1.151)等。

牛、羊、骆驼等反刍动物的消化道被认为含有丰富的CAZymes^[6-7]。然而由于瘤胃环境严格厌氧且存在多种消化液等复杂条件，其中绝大多数瘤胃微生物仍难以纯培养。随着深度测序和多组学技术的快速发展，基于目标CAZymes的基因序列来筛选获得新型酶制剂已取得较大进展^[8-10]。本课题组前期采用宏基因组学、宏转录组学等多组学分析技术获取了大量来自湖羊瘤胃微生物的CAZymes基因序列，其中238万多个单基因(unigenes)中2.65%为糖苷水解酶，与纤维素降解相关的功能基因主要分布于GH3、GH5和GH9家族^[11]。目前，有关湖羊消化道微生物来源的葡聚糖酶已开展一系列功能表征，其中大部分为GH5家族葡聚糖酶^[12-13]。不同于GH5家族的“保留型(retaining)”催化机制，GH9家族葡聚糖酶采用“反转型(inverting)”方式催化多聚糖底物^[14]，表征GH9家族功能基因有望获得性质优良的葡聚糖酶。因此，本研究从湖羊瘤胃微生物中克隆获得一个GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25，并在大肠杆菌中进行异源表达，研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。

1 材料与方法

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1.1 材料

湖羊瘤胃微生物总cDNA^[11]、表达质粒pET-28a(+)、大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)，均为本实验室保存；多糖和纤维寡糖购自Megazyme公司；SuperPfx DNA聚合酶购自康为世纪生物科技(北京)有限公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白Marker、6×His Tagged Ni-NTA agarose、卡那霉素(kanamycin, Kan)和异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ClonExpress^® Ⅱ One step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 重组菌株构建

利用IDSGLUC9-25基因特异性引物对(下划线为表达载体同源臂序列) F (5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCA-TGAAAGAGTCAGAAATTTT-3′)和R(5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCTTAC-GCGCGCAAGCAGAT-3′)，用SuperPfx DNA聚合酶以湖羊瘤胃微生物总cDNA为模板进行扩增。PCR产物纯化与经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的pET-28a(+)混合后，使用ClonExpress^® Ⅱ One step Cloning Kit进行同源重组，热激转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含50 μg/mL Kan的LB平板，37 ℃培养16–20 h^[12-13]。使用T7引物进行菌落PCR扩增，验证完成后提取阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 序列分析

利用Expasy Compute pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白等电点与理论分子量，利用SignalP-6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)和InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)预测蛋白信号肽和功能结构域，利用SWISS-MODEL对蛋白质三级结构进行同源建模(https://swissmodel.expasy.org/interactive)，利用MEGA 7.0工具进行系统进化树构建。

1.4 重组大肠杆菌的诱导表达与纯化

重组工程菌BL21(DE3)/pET28a/IDSGLUC9-25以1%的接种量加至500 mL LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养OD₆₀₀达到0.6–1.0，加入250 μL 1 mol/L IPTG并置于16 ℃、100 r/min诱导16 h。4 ℃、5 000×g离心10 min以收集菌体，用50 mL 1×PBS缓冲液重悬洗涤菌体后以相同条件再次收集菌体，弃去上清。菌体中加入50 mL无菌1×PBS缓冲液(其中含有1 mL Triton X-100)充分重悬，使用超声破碎仪(苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)以15%功率，在运行1.5 s/暂停6 s条件下破碎15 min获得粗酶液。

将亲和Ni-NTA agarose填料以1:50 (体积比)与上述粗酶液混合，加入1 mL 1 mol/L咪唑，置于冰上并以100 r/min振荡孵育1 h。孵育完成后将粗酶液缓慢倒入亲和层析柱中并使用磷酸缓冲液(分别含20、50、250 mmol/L咪唑)梯度洗脱目标蛋白，并使用10 kDa Millipore Amicon^® Ultra超滤柱去除目标蛋白中的残余咪唑并浓缩蛋白以获得纯化蛋白。纯化蛋白用于SDS-PAGE和底物催化分析。

1.5 酶学性质分析

采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)法测定葡聚糖酶活性^[15]。采用Bradford法测定蛋白浓度^[16]。1个酶活力单位(U)定义为每分钟(min)产生1 μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶蛋白量。分别配制10 mg/mL的大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、罗望子木葡聚糖、魔芋胶、羧甲基纤维素钠、海带多糖、象牙果甘露聚糖和桦木木聚糖底物，取20 μL酶液(约0.4 μg蛋白)与50 μL上述底物混合，在最适条件下反应15 min后测定还原糖生成量。以灭活的酶进行底物催化反应作为对照组，试验组和对照组分别设置4个重复(n=4)。

1.5.1 最适温度

将20 μL (约1 μg蛋白，下同)酶液与50 μL 0.5%葡聚糖底物充分混合，分别在20–80 ℃下反应15 min，反应结束后加入70 μL DNS溶液于95 ℃下孵育10 min，待冷却至室温后使用酶标仪测定OD₅₄₀。在对照组加入20 μL失活酶液，其余条件保持一致，设置4组平行试验。以最高活性时的温度作为100%，计算不同温度下的相对活性。

1.5.2 最适pH

将20 μL酶液与50 μL分别配制在pH 2.2–10.0缓冲液(柠檬酸/磷酸缓冲液pH 2.2–8.0；Tris-HCl缓冲液pH 8.0–9.0；碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液pH 9.0–10.0)的0.5%葡聚糖底物充分混合，在最适温度下反应15 min测定催化活性。以最高活性时的pH作为100%计算不同pH下的相对活性。

1.5.3 热稳定性

将酶液在分别置于30、40、50 ℃下各保温5、10、15、20、30和60 min后，将20 μL酶液与50 μL最适pH 0.5%葡聚糖底物充分混合后，在最适温度下反应15 min，测定催化活性。以未经热处理的酶活性为100%，计算各温度下的残余活性。

1.5.4 pH稳定性

将酶液以1:1的比例与pH值为2.2–10.0缓冲液混合，冰上放置60 min后，将20 μL酶液与50 μL最适pH 0.5%葡聚糖底物充分混合后，在最适温度下反应15 min，测定催化活性。以未经pH缓冲液处理的酶活性为100%，计算各pH下的残余活性。

1.6 水解产物测定

以大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖为底物，在5 mL底物中分别加入2 mL酶液(含有16.8 μg蛋白)。反应在37 ℃下进行，分别在0、5、10、20、30 min和1、3、6、12、24、48 h间隔取样600 μL于离心管中，95 ℃处理15 min终止反应。4 ℃、10 000×g离心取上清液用于底物水解分析，设置3组平行试验。

采用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)初步分析IDSGLUC9-25水解产物，取0.7 μL反应产物与0.5 mg/mL标准品混合物[葡萄糖(G1)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)、纤维五糖(G5)及纤维六糖(G6)]点于玻璃薄层板(glass TLC plate, Merck)上，反应产物重复上样12次，标准品混合物重复上样6次。流动相为正丁醇: 乙酸: 水(5:2:3，体积比)，充分展开后取出，置于通风橱待其完全干燥后均匀喷上显色液(硫酸: 乙醇=5:95，体积比)，待其干燥后105 ℃显色10 min，拍照记录。

进一步采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物。利用Asahipak NH2P-50 4E色谱柱(Shodex公司)和LC-1200高效液相色谱仪(Agilent公司)，流动相为65%乙腈，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，采用RID-20A示差折光检测器分析底物水解样品。

2 结果与分析

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2.1 基因克隆与序列分析

从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增得到一个葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25 (GenBank登录号：MT832759.1)，测序结果与目标序列一致。其开放阅读框长度为1 584 bp，编码527个氨基酸(amino acid, aa)，理论分子量为58.2 kDa。序列分析显示，IDSGLUC9-25包含一个CelD_N结构域(1−86 aa)和一个GH9家族催化结构域(96−523 aa)，未发现信号肽序列。同源建模显示，IDSGLUC9-25的催化结构域呈现(α/α)₆桶状结构(图1)，属于GH9家族的典型特征^[17]。序列比对表明，IDSGLUC9-25与来自密螺旋体属(Treponema sp.) GH9蛋白(GenBank登录号：MBQ1795108.1)序列相似度最高(81.63%)，推测IDSGLUC9-25可能来自密螺旋体属细菌。系统发育进化树表明(图2)，IDSGLUC9-25被归入GH9家族，与GH5家族葡聚糖酶稍远，IDSGLUC9-25与MBQ1795108.1、ABB51609.1和ACY24809.1等GH9家族蛋白聚成一簇，相似性分别为81.63%、41.37%和41.23%。其中，MBQ1795108.1的功能未被报道，ABB51609.1和ACY24809.1均为内切β-1,4-葡聚糖酶^[18-19]，提示IDSGLUC9-25的活性可能与这2个酶相似。

2.2 重组蛋白表达与活性底物谱分析

SDS-PAGE结果显示，工程菌BL21/pET28a/IDSGLUC9-25表达的粗蛋白经亲和层析分析，获得了分子量约为62.7 kDa的rIDSGLUC9-25重组蛋白(图3)，这与其理论分子量(约58.2 kDa)和表达载体序列总和(约4.5 kDa)相一致。活性底物谱分析显示，rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和罗望子木葡聚糖，其中对大麦β-葡聚糖的催化活性最高，达(443.55±24.48) U/mg (表1)。然而，该蛋白对羧甲基纤维素钠、海带多糖、象牙果甘露聚糖和桦木木聚糖底物无催化活性。由此可见，rIDSGLUC9-25对主链为Glcβ1→3Glc和Glc1β→4Glc大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、木葡聚糖和魔芋胶具有较高的催化活性，但对Glcβ1→3Glc结构的海带多糖没有活性。此外，rIDSGLUC9-25对Manβ1→4Man或Xylβ1→4Xyl组成的甘露聚糖或木聚糖也没有降解作用，提示rIDSGLUC9-25是一种特异性催化多聚糖主链的Glcβ1→4Glc糖苷键的糖苷水解酶，即葡聚糖酶。

2.3 rIDSGLUC9-25的酶学性质分析

酶学性质分析显示，rIDSGLUC9-25的最适反应温度为40 ℃，在30–50 ℃范围内具有较高的催化活性(>70%)，但当温度升高至60 ℃时，其催化活性迅速丧失(图4A)。热稳定性分析显示，rIDSGLUC9-25在40 ℃以下较为稳定，40 ℃处理1 h后，剩余62.58%±1.10%的残余活性，然而在50 ℃下处理10 min后酶活完全消失(图4B)。rIDSGLUC9-25的最适反应pH为6.0，在pH 5.0–6.0范围内催化活性较高(>80%) (图4C)。pH稳定性结果显示，rIDSGLUC9-25在pH 4.0–8.0范围内能够保持较高的稳定性，处理1 h后残余活性均能保持在90%以上(图4D)。以上结果表明，rIDSGLUC9-25是一种弱酸性中温酶。

2.4 rIDSGLUC9-25水解产物分析

TLC结果表明，反应初期rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖生成聚合度较高的水解产物，反应1 h后产物中检测到少量纤维三糖(G3)和纤维四糖(G4)；随着反应继续进行，rIDSGLUC9-25进一步催化聚合度较高的寡糖生成小分子产物，且产物中G3和G4大量累积(图5A)。rIDSGLUC9-25水解苔藓地衣多糖的过程与大麦葡聚糖相类似，区别在于反应终产物主要为G3 (图5B)。以木葡聚糖和魔芋胶为底物时，rIDSGLUC9-25处理30 min后几乎检测不到降解产物；反应1–48 h后，高聚合度寡糖含量持续积累，反应终产物主要为聚合度≥6的寡糖(图5C、5D)。

进一步利用HPLC分析底物水解产物得知，rIDSGLUC9-25快速从葡聚糖中释放G3和G4，同时生成微量纤维五糖(G5)、纤维二糖(G2)和葡萄糖(G)；催化24 h后达到反应平衡点，G3和G4的产量分别为(8.72±0.08) mmol/L和(3.57± 0.03) mmol/L，占总还原糖的64.19%±1.19%和26.24%±0.12% (图6A、6B)。rIDSGLUC9-25催化地衣多糖主要生成G3，同时生成微量的G4、G2和G；其中，G3在反应24 h后达到平衡值，含量为(3.50±0.14) mmol/L，占总还原糖的78.46%±0.89%，然而G4在反应3 h后即达到平衡，含量为(0.50±0.09) mmol/L，占总还原糖的15.50%±0.67%，之后直至反应结束其在体系中的含量趋于稳定(图6C、6D)。

3 讨论与结论

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葡聚糖酶能够高效水解葡聚糖类NSPs，在饲料、食品和纺织工业等领域具有重要应用价值。葡聚糖酶广泛存在各种微生物中，目前已从芽孢杆菌属细菌分离出较多编码β-葡聚糖酶基因，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)等^[20-24]。牛、羊等草食动物采食植物性饲料生产优质的肉与奶制品，主要得益于其消化道微生物具有高效的纤维降解与转化能力。基于多组学分析和筛选技术的快速发展，研究人员从牛^[25-26]、羊^[14-15]等反刍动物消化道微生物中挖掘得到多个GH5葡聚糖酶。本研究从湖羊瘤胃微生物中筛选获得一个葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25，该蛋白序列与来自密螺旋体属(Treponema sp.) GH9蛋白(WP_074929933.1)序列相似度最高，亲缘关系较近(图2)，推测IDSGLUC9-25可能来自密螺旋体属细菌。密螺旋体属是一个涉及木质纤维素降解的菌属^[27]，但目前尚未有密螺旋体属来源的内切葡聚糖酶的相关报道。本研究为密螺旋体属来源葡聚糖酶的性质研究提供参考。

重组葡聚糖酶rIDSGLUC9-25在中温(30–50 ℃)、弱酸性(pH 5.0–6.0)条件下催化活性较高(图4)。另有报道显示，多个消化道来源的CAZymes均表现出在中温、弱酸性中发挥高效催化作用，例如Cel-1^[25]、Cel5A-h38、Cel5A-h49^[12]、CMC-1^[26]、IDSGLUC5-26及IDSGLUC5-37^[13]等葡聚糖酶和ORF6^[28]、XYN-LXY^[29]等木聚糖酶。这可能是微生物及其活性酶与反刍动物消化道的温度(38–41 ℃)和pH (pH 5.0–7.5)环境相适应的结果。然而，工业生产中某些特定工艺对目标酶蛋白的热稳定性有较高要求，例如饲料制粒环节要求酶分子能耐受80–110 ℃热处理，保持较高残余催化活性。因此，后续研究需要进一步采用定点突变^[30]、定向进化^[31]或分子环化^[32]等酶工程手段提升rIDSGLUC9-25的热稳定性。

本研究使用的葡聚糖底物主链为纤维三糖(Glcβ1→3Glcβ1→4Glcβ1→4Glcβ1→3Glc)或纤维四糖(Glcβ1→3Glcβ1→4Glcβ1→4Glcβ1→4Glcβ1→ 3Glc)经Glcβ1→3Glc连接而成，而地衣多糖主链为纤维三糖经Glcβ1→3Glc连接而成。rIDSGLUC9-25水解这2个底物的产物主要生成G3和G4 (图5、图6)，这与Cel5A-h38^[12]和IDSGLUC5-37^[13]的产物特征相一致，高度符合内切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)的水解模式。然而，本研究中的rIDSGLUC9-25却对主链为Glcβ1→4Glc或Manβ1→4Man连接的木葡聚糖和魔芋胶表现出较高催化作用(表1，图5)，提示rIDSGLUC9-25仍属于典型的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)。多数研究表明，内切葡聚糖酶水解底物生成聚合度为2−5的纤维寡糖^{[12-13,33-34]}，这些纤维寡糖能有效促进双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)等益生菌增殖^[35-36]。本研究中的rIDSGLUC9-25能水解葡聚糖和地衣多糖生成G3，分别占总还原糖的64.19%±1.19%和78.46%±0.89%，显著高于Cel5A-h49^[12]、IDSGLUC5-37^[13]等已报道的葡聚糖酶。同时，反应生成的G3持续稳定存在于反应体系中，有利于对其开展进一步的分离纯化。

综上所述，本研究从湖羊密螺旋体属细菌中获得了一个新型葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25并在大肠杆菌中进行异源表达。重组蛋白rIDSGLU9-25的最适反应温度和pH分别为40 ℃和pH 6.0，在pH 4.0–8.0内较为稳定。该酶能高效催化大麦β-葡聚糖生成纤维三糖和纤维四糖，催化地衣多糖生成纤维三糖，同时能催化木葡聚糖和魔芋胶生成聚合度较高的纤维寡糖，是一种内切β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，可用于研发饲用酶制剂和功能性寡糖制备。

基金

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浙江省研发攻关计划(2022C02043)
浙江省“生物工程”一流学科自设课题(ZS2023008)

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2024年第64卷第3期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230503

接收时间：2023-07-31
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-03-04

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收稿日期：2023-07-31
录用日期：2023-10-13

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Research and Development Research Program of Zhejiang Province(2022C02043)

浙江省研发攻关计划(2022C02043)

Zhejiang Provincial Top Discipline of Biological Engineering(ZS2023008)

浙江省“生物工程”一流学科自设课题(ZS2023008)

作者信息

1 浙江万里学院生物与环境学院, 浙江宁波 315100

2 浙江大学动物科学学院奶业科学研究所, 浙江杭州 310058

3 杭州云心质力生物科技有限公司, 浙江杭州 310018

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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