微生物学报

Primers	Sequences (5′→3′)
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单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880在感染致病中的作用

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林柯辰 ¹ , 李豪杰 ¹ , 赵秀玲 ² , 周思 ¹ , 廖俊慧 ¹ , 王子念 ¹ , 金戈旋 ¹ , 朱富鑫 ¹ , 徐加利 ¹ , 孙静 ¹ , 宋厚辉 ¹ , 邓思敏 ¹^,^* , 程昌勇 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(3): 893-906

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(3): 893-906

单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880在感染致病中的作用

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林柯辰¹, 李豪杰¹, 赵秀玲², 周思¹, 廖俊慧¹, 王子念¹, 金戈旋¹, 朱富鑫¹, 徐加利¹, 孙静¹, 宋厚辉¹, 邓思敏¹^,^*, 程昌勇¹^,^*

作者信息

1 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室, 浙江杭州 311300

2 宁波检验检疫科学技术研究院宁波海关技术中心, 浙江宁波 315000

Role of LPXTG-anchored protein Lmo0880 inListeriamonocytogenes infection

Kechen LIN¹, Haojie LI¹, Xiuling ZHAO², Si ZHOU¹, Junhui LIAO¹, Zinian WANG¹, Gexuan JIN¹, Fuxin ZHU¹, Jiali XU¹, Jing SUN¹, Houhui SONG¹, Simin DENG¹^,^*, Changyong CHENG¹^,^*

Affiliations

1 Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics & Advanced Technology, Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management, China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, College of Animal Science and Technology & College of Veterinary Medicine, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

2 Technical Center of Ningbo Customs, Ningbo Academy of Quarantine & Inspection Science and Technology, Ningbo 315000, Zhejiang, China

出版时间: 2024-03-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230597

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摘要

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【目的】通过构建单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特菌) LPXTG蛋白Lmo0880的基因缺失菌株和回补菌株，探究Lmo0880在细菌生长、细胞感染和宿主感染等方面发挥的作用。【方法】利用同源重组原理构建lmo0880的基因缺失株及回补株，比较野生株、缺失株和回补株在生长能力、细胞黏附与侵袭和胞内增殖能力等方面的差异，从而鉴定Lmo0880在单增李斯特菌感染宿主中的作用。【结果】缺失lmo0880基因后，单增李斯特菌在生长能力上无明显变化；对细胞的黏附能力无显著差异，但对细胞侵袭能力、胞内增殖能力、小鼠致病力和小鼠组织定殖能力显著降低。【结论】本研究阐明了单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880在细胞侵袭、胞内增殖和组织定殖等方面发挥的重要作用。

关键词

单增李斯特菌 / LPXTG蛋白Lmo0880 / 宿主感染

Abstract

收起

[Objective] To generateListeriamonocytogenes strains withlmo0880 deleted and complemented strains, so as to investigate the roles of Lmo0880 in bacterial infection in a host. [Methods] Thelmo0880-deleted strain was generated by homologous recombination, and the complementary strain was constructed by introducing an integrative plasmid carryinglmo0880 into thelmo0880-deleted strain. The growth, adhesion, invasion, and intracellular proliferation were compared between thelmo0880-deleted strain, complementary strain, and the wild type. [Results] The deletion oflmo0880 did not significantly impact bacterial growth or adhesion. However, it led to notable decreases in cell invasion, proliferation, and colonization in the liver and spleen, ultimately diminishing the pathogenicity in mice. [Conclusion] The LPXTG-anchored protein Lmo0880 plays a crucial role in bacterial invasion, proliferation, and colonization in a host. These findings provide a solid foundation for deeply understanding the pathogen-host interaction duringL.monocytogenes infection.

Key words

Listeriamonocytogenes / LPXTG-anchored protein Lmo0880 / host infection

引用本文

林柯辰, 李豪杰, 赵秀玲, 周思, 廖俊慧, 王子念, 金戈旋, 朱富鑫, 徐加利, 孙静, 宋厚辉, 邓思敏, 程昌勇. 单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880在感染致病中的作用. 微生物学报, 2024 , 64 (3) : 893 -906 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230597

Kechen LIN, Haojie LI, Xiuling ZHAO, Si ZHOU, Junhui LIAO, Zinian WANG, Gexuan JIN, Fuxin ZHU, Jiali XU, Jing SUN, Houhui SONG, Simin DENG, Changyong CHENG. Role of LPXTG-anchored protein Lmo0880 inListeriamonocytogenes infection[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (3) : 893 -906 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230597

正文

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单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种食源性的胞内人兽共患病原菌，也是引起单增李斯特菌病的重要病原^[1]。当摄入受污染的食物后，单增李斯特菌会穿过肠道上皮屏障，通过淋巴和血液向肝脏和脾脏传播，甚至突破血脑屏障或孕妇的胎盘屏障，导致脑膜炎、脑膜脑炎、流产或新生儿败血症的发生，其引起的病死率高达20%−30%^[2]。在侵染宿主时，单增李斯特菌进入非吞噬细胞(如上皮细胞)后被内化到吞噬泡中，然后迅速诱导吞噬泡裂解从而进入到营养丰富的宿主胞质环境中，并在宿主细胞质内完成增殖，随后聚合肌动蛋白ActA形成“彗星尾”进而在细胞间传播^[3-4]。单增李斯特菌通过表达多种毒力因子实现该感染机制，例如：参与细胞黏附过程的自溶素Ami^[5]、肌动蛋白ActA^[6]、纤连蛋白结合蛋白FbpA^[7]和李斯特菌黏附蛋白Lap^[8]；参与细胞侵袭过程的内化素InlA^[9]、InlB^[9]、Vip^[10]和自溶素Auto^[11]；参与吞噬泡逃逸过程的李斯特菌溶血素LLO^[12]、磷酸酯酶PlcA和PlcB^[13-14]；参与细胞内运动和细胞间传播过程的ActA^[15-16]等。这些毒力因子大多是由细菌表面蛋白组成，可见表面蛋白在细菌感染过程中参与细胞黏附、细胞入侵和免疫逃逸等至关重要的环节。在李斯特菌属中，这些表面蛋白可分为三类：(1) 通过羧基末端LPXTG和NAKTN/NPKSS锚定基序与肽聚糖共价结合的表面蛋白，分别由分选酶A (sorting enzyme A, SrtA)和分选酶B (sorting enzyme B, SrtB)识别^[17-19]；(2) 通过羧基末端GW结构域、疏水尾蛋白和类P60 (P60-like)蛋白与肽聚糖非共价结合的表面蛋白；(3) 通过氨基末端区域连接到表面的脂蛋白^[20]。在单增李斯特菌EGD-e的全基因组中发现41个编码LPXTG蛋白的基因和2个编码NAKTN/NPKSS蛋白的基因^[20-21]，其中包括重要毒力因子InlA^[9,22]、Vip^[10]和LapB^[23]等。Doumith等^[24]和Hain等^[25]通过比较基因组学研究发现，约1/3的致病性李斯特菌携带的LPXTG蛋白无法在非致病性李斯特菌中被检索到。说明LPXTG蛋白可能和李斯特菌的致病力有关，然而目前许多LPXTG蛋白的生物学功能并未明确。

本研究前期通过生物信息学分析可知，Lmo0880是一个功能未知的表面蛋白，羧基端带有LPXTG锚定基序和与肽聚糖结合相关的LysM结构域，提示该蛋白可能与宿主感染过程有关。因此，本研究以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株，通过构建lmo0880的基因缺失菌株和回补菌株，并比较3种菌株在生长和对宿主致病力等方面的差异，为进一步解析Lmo0880在单增李斯特菌感染致病中的作用和机制奠定理论基础。

1 材料与方法

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1.1 菌株、质粒、细胞和培养条件

单增李斯特菌参考菌株EGD-e及本研究构建的基因缺失菌株Δlmo0880和回补菌株CΔlmo0880均由本实验室保存。所有单增李斯特菌菌株均培养于牛脑心浸出液肉汤培养基(brain heart infusion, BHI)中，除特殊说明外，以上菌株培养条件为37 ℃振荡或静置培养。

温敏型穿梭质粒pKSV7和整合型穿梭质粒pIMK2均为本实验室保存。

人肠上皮细胞Caco-2、小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠成纤维细胞L929均为本实验室保存。Caco-2细胞培养于添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养基中；RAW264.7细胞和L929细胞培养于添加10% FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)中，上述细胞均在含有5% CO₂、37 ℃的细胞恒温培养箱中静置培养。

1.2 主要试剂

BHI和LB培养基购自Oxoid公司；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胰酶(trypsin-EDTA, 0.25%)和FBS购自ThermoFisher Scientific公司；分子克隆用的KOD-plus-Neo PCR酶和DNA连接酶Ligation high ver. 2购自TOYOBO公司；限制性内切酶购自NEB公司；质粒快速提取试剂盒和PCR产物回收/纯化试剂盒购自上海惠凌生物技术有限公司。本研究所用化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物

本研究所涉及引物见表1。

1.4 Δlmo0880缺失菌株的构建和筛选

从NCBI GenBank数据库中获取单增李斯特菌EGD-e菌株(GenBank登录号：NC_003210.1)的基因组序列，用SnapGene设计引物lmo0880- up-F/R和lmo0880-down-F/R分别扩增lmo0880基因的上、下游同源臂，再通过重叠PCR获得用于同源重组的上下游同源臂融合片段。融合片段经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切后克隆至温敏型穿梭质粒pKSV7中，获得重组质粒pKSV7_lmo0880，将其命名为pSL2653。将重组质粒pSL2653电转至单增李斯特菌EGD-e感受态中，通过温度和Cm^r (10 μg/mL)抗性双重选择压力下进行同源重组克隆的筛选，随后用引物lmo0880-front-F/lmo0880-down-R对筛选出的重组克隆进行PCR和测序双重验证，最终获得缺失菌株Δlmo0880。

1.5 CΔlmo0880回补菌株的构建和筛选

通过BioCyc数据库查明lmo0880基因为单转录本。因此，用SnapeGene设计特异性引物CΔlmo0880-F/R，并以单增李斯特菌EGD-e为模板，PCR扩增lmo0880基因编码序列(coding sequence, CDS)编码区和上游启动子序列。随后将该序列用限制性内切酶Sac I和Sma I双酶切后克隆到pIMK2穿梭质粒上，经筛选后获得重组质粒pIMK2-lmo0880，命名为pSL2659。将重组质粒pSL2659电转至缺失菌株Δlmo0880感受态中，用含有Kana^r (50 μg/mL)抗性的LB固体培养基进行抗性筛选。随后对筛选出的疑似菌株进行菌落PCR和测序双重验证后，获得回补菌株CΔlmo0880。

1.6 生长曲线的绘制和菌落计数

分别挑取单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880单菌落，接种到5 mL BHI肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜。取过夜培养的菌液1:100转接至新鲜BHI培养基中，取200 μL稀释后的菌液加入到96孔板中，然后置于37 ℃恒温培养箱中静置培养，此时记为0 h，然后每隔1 h用多功能酶标仪SynergyTM H1测定波长600 nm处的吸光值(OD₆₀₀)。每个菌株设置3个重复。取上述过夜培养的菌液1:100转接至15 mL新鲜BHI培养基中，置于37 ℃、200 r/min培养4、5和6 h时，分别取100 μL菌液稀释涂板进行菌落计数。所有结果用GraphPad Prism 8.0进行数据处理。

1.7 细菌黏附与侵袭增殖试验

取1 mL过夜培养的单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880菌液1:100转接到新鲜培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6左右，然后用10 mmol/L PBS洗涤2次后用RPMI 1640细胞培养基倍比稀释菌液，最终以感染复数(multiplicity of infection, MOI)=10感染人肠上皮细胞Caco-2 (细胞密度约为2×10⁵个/mL)。黏附：37 ℃、5% CO₂感染30 min，用10 mmol/L PBS洗涤3次细胞，每孔加入预冷的胰酶裂解10 min，充分吹打混匀裂解细胞后进行稀释计数；侵袭：37 ℃、5% CO₂感染1.5 h后，加入含终浓度50 µg/mL庆大霉素的RPMI 1640细胞培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下培养30 min，利用庆大霉素杀死胞外细菌，随后裂解细胞并稀释涂板从而对胞内细菌进行计数，处理方法同上。所有结果用GraphPad Prism 8.0进行数据处理。

1.8 胞内增殖试验

单增李斯特菌作为一种侵袭性细菌病原体，能够在许多宿主细胞(包括巨噬细胞、肠上皮细胞和肝细胞)内增殖^[26]，且越来越多的研究表明巨噬细胞是控制单增李斯特菌感染的关键^[27]，因此本研究选择RAW264.7细胞进行胞内增殖试验。取1 mL过夜培养的单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880菌液1:100转接到新鲜培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6左右，然后用10 mmol/L PBS洗涤2次后用DMEM培养基倍比稀释菌液，最终以MOI=10感染小鼠巨噬细胞RAW264.7 (细胞密度约为2×10⁵个/mL)。在感染后30 min用添加50 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基37 ℃处理细胞30 min以杀灭胞外细菌。处理后用10 mmol/L PBS洗涤细胞3次，随后用添加5 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基(添加10% FBS)继续培养2、5和8 h，记为感染3、6和9 h。取上述不同处理时间的细胞进行细胞裂解后对胞内细菌进行胞内细菌计数。所有结果用GraphPad Prism 8.0进行数据处理。

1.9 细菌空斑试验

鉴于L929细胞形态为成纤维细胞样，贴壁生长，易于形成较致密的单层细胞，且该状态能维持较长时间，因此采用该细胞系进行细菌空斑试验。取1 mL过夜培养的单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880菌液1:100转接到新鲜BHI培养基中培养至OD₆₀₀为0.6左右，以MOI=0.2感染小鼠成纤维细胞L929 (细胞密度约为1×10⁶个/mL)。感染细胞置于37 ℃、5% CO₂条件下培养1 h，培养过程中每隔15 min水平晃动培养板1次，使细菌分布均匀；10 mmol/L PBS洗涤细胞3次，加入含终浓度50 µg/mL庆大霉素的DMEM细胞培养基，37 ℃、5% CO₂继续培养1 h杀灭胞外细菌；覆盖琼脂：10 mmol/L PBS洗涤细胞3次，加入3 mL含终浓度为0.7%的低熔点琼脂糖和10 µg/mL庆大霉素的无酚红DMEM (含10% FBS)细胞培养基，待琼脂凝固后，将6孔板倒置于37 ℃ (含5% CO₂)细胞培养箱中继续培养3 d直至出现空斑。固定与染色：每孔加入600 µL 40%甲醛溶液置于37 ℃培养箱固定2 h，倒扣掉琼脂，每孔加入600 µL 0.5%的结晶紫溶液染色10 min，随后用ddH₂O冲洗后测量空斑大小。所有结果用GraphPad Prism 8.0进行数据处理。

1.10 细菌存活和组织定殖试验

取1 mL过夜培养的单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880菌液用10 mmol/L PBS调整至OD₆₀₀为0.6左右(约1×10⁹ CFU/mL)，并连续2次10倍比稀释备用。将48只6周龄ICR小鼠(动物伦理编号：ZAFUAC2023035)平均分成6组，8只/组，每只ICR小鼠腹腔注射200 µL稀释后菌液(约1×10⁶ CFU/mL)，在小鼠感染后的24 h分离小鼠脾脏(spleen)和肝脏(liver)，加入10 mmol/L PBS后用均质仪匀浆并稀释点板计数。另取30只ICR小鼠，分成3组，10只/组，用同样的方法与剂量感染小鼠，感染后每隔12 h对各组小鼠进行存活统计，一共观察7 d，用GraphPad Prism 8.0软件对上述组织载菌量和小鼠存活的结果进行统计分析。

2 结果与分析

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2.1 单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880的生物信息学分析

LPXTG蛋白可被分选酶SrtA识别并与细菌肽聚糖共价结合，从而锚定到细胞壁上。通过MEME/MAST (http://meme-suite.org/tools/mast)在单增李斯特菌EGD-e中检索到LPXTG蛋白Lmo0880。通过NCBI的CD search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)结构域预测发现Lmo0880羧基端带有LPNTG锚定基序(433−437 aa)和与肽聚糖结合相关的LysM结构域(292−416 aa) (图1A)。通过Uniprot蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)预测Lmo0880是一个功能未知的细胞壁蛋白，在该数据库中链接的AlphaFoldDB三维结构预测中发现Lmo0880 (AlphaFoldDB登录号：Q8Y8L7)的LysM结构域具有高度保守的βααβ二级结构，其中2条β折叠链(353−359 aa和396−402 aa)形成反向平行的β片，然后2条α螺旋(366−373 aa和377−384 aa)折叠到β片的同侧(图1B)。

2.2 单增李斯特菌lmo0880基因缺失菌株和回补菌株的构建

以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板扩增出lmo0880的大小为500 bp的上、下游同源臂(图2A，泳道1和2)，并通过重叠PCR (overlap PCR)将上、下游同源臂融合成大小为1 000 bp的同源臂片段(图2A，泳道3)，然后将其克隆至pKSV7穿梭质粒中，通过菌落PCR (图2B，泳道1)和测序验证，表明成功获得构建lmo0880缺失的重组质粒pSL2653。同样以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板扩增出lmo0880的大小为1 798 bp的lmo0880及其上游启动子区的基因片段(图2B，泳道2)，并将其克隆至pIMK2穿梭质粒中，通过菌落PCR (图2B，泳道3)和测序验证，表明成功获得构建lmo0880回补的重组质粒pSL2659。

利用lmo0880的内外部引物lmo0880- outer-F/R与lmo0880-inner-F/R对EGD-e、筛选出的lmo0880基因缺失株和回补株进行PCR验证。如图2C所示，当用内部引物扩增时，EGD-e和CΔlmo0880在400 bp的位置出现目的条带，而Δlmo0880无明显条带；当用外部引物扩增时，Δlmo0880和CΔlmo0880在400 bp的位置出现目的条带，而野生株在1 800 bp的位置出现目的条带，表明lmo0880的基因缺失菌株和回补菌株构建成功。

2.3lmo0880基因的缺失不影响单增李斯特菌的生长

比较单增李斯特菌EGD-e、∆lmo0880和C∆lmo0880在37 ℃下的生长能力。如图3所示，在BHI肉汤培养基中EGD-e、∆lmo0880和C∆lmo0880在0−12 h的生长水平没有差异(图3A)。取对数中期4−6 h的菌液进行倍比稀释点板计数，结果发现，在4、5和6 h ∆lmo0880的菌数分别是EGD-e的1.72倍(0.01 <P < 0.05)、1.16倍(P > 0.05)和1.53倍(0.01 <P < 0.05)，但是EGD-e、∆lmo0880和C∆lmo0880的菌数CFU数量级相同(图3B)。综上结果表明单增李斯特lmo0880基因缺失后不影响单增李斯特菌的生长。

2.4lmo0880基因的缺失使单增李斯特菌在上皮细胞上的侵袭能力显著降低

通过体外感染人肠上皮细胞Caco-2，比较单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的黏附和侵袭能力的差异。在感染0.5 h时，EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的黏附率无显著差异；在感染1.5 h时，∆lmo0880的侵袭率与EGD-e和CΔlmo0880相比分别下降了19.94%和18.04% (图4A、4B)。表明lmo0880基因的缺失使得单增李斯特菌在人肠上皮细胞Caco-2上的侵袭能力显著下降。通过体外感染小鼠成纤维细胞L929模型，比较单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的胞间迁移能力的差异。EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的蚀斑大小均无显著差异(图4C)，可见lmo0880基因的缺失并不影响单增李斯特菌在小鼠成纤维细胞L929中的胞间迁移能力。综上结果表明，lmo0880基因的缺失不影响单增李斯特菌的细胞黏附和胞间迁移能力，但使其细胞侵袭能力显著降低。

2.5lmo0880基因的缺失使单增李斯特菌在巨噬细胞中的增殖能力显著降低

通过体外感染RAW264.7细胞，比较单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880在RAW264.7细胞中增殖能力的差异。在感染3 h时，EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的增殖率均无显著差异；在感染6 h和9 h时，EGD-e的增殖率分别是Δlmo0880的2.43倍和1.65倍，而EGD-e和CΔlmo0880的增殖率无显著差异(图5)。表明lmo0880基因的缺失使得单增李斯特菌在小鼠巨噬细胞RAW264.7中增殖能力显著下降。

2.6lmo0880基因的缺失降低了单增李斯特菌对小鼠的致病力

为了探究缺失lmo0880基因对单增李斯特菌致病力的影响，将30只ICR小鼠平均分成3组(10只/组)，分别腹腔注射感染1×10⁶ CFU/mL的单增李斯特菌EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880，然后每隔12 h观察小鼠的存活情况。在感染后60 h，EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880的存活率分别为20%、80%和40%，Δlmo0880在感染后84 h时存活率从70%降至40%，而EGD-e此时存活率为0 (图6A)。因此，lmo0880基因缺失使得小鼠感染单增李斯特菌后的存活能力显著升高，表明lmo0880基因的缺失降低了单增李斯特菌对小鼠的致病力。进一步通过小鼠组织载菌量试验探究缺失lmo0880基因后对单增李斯特菌在小鼠中的组织定殖能力的影响。用EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880分别感染小鼠，在感染24 h后对小鼠肝脏和脾脏进行细菌计数。结果表明，感染Δlmo0880的小鼠肝脏载菌量相较于感染EGD-e和CΔlmo0880的小鼠肝脏载菌量分别下降了8.65%和4.71%；感染Δlmo0880的小鼠脾脏载菌量相较于EGD-e和CΔlmo0880分别下降了9.12%和6.10%；而EGD-e和CΔlmo0880在肝脏和脾脏中的载菌量无显著差异(图6B)。这表明单增李斯特菌缺失lmo880基因后在小鼠脏器中的定殖能力显著降低。综上所述，lmo0880基因的缺失使单增李斯特菌对小鼠致病力显著减弱。

3 讨论与结论

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单增李斯特菌在老人、孕妇、新生儿和免疫力低下者中易感，感染后引起胃肠炎、致命性脑膜炎、流产或死胎等临床症状，是食源性疾病中病死率最高的致病菌之一，严重威胁公共卫生安全^[28-29]。单增李斯特菌通过表达多种毒力相关蛋白侵袭非吞噬细胞，抵抗巨噬细胞的胞内杀伤，介导胞内增殖和胞间传递，逃避体液免疫反应等来实现宿主感染^[20]。表面蛋白对于革兰阳性菌在环境中的存活和宿主感染都是至关重要的，而LPXTG蛋白是表面蛋白的重要组成部分。因此，本研究构建了功能未知的LPXTG蛋白Lmo0880的基因缺失菌株Δlmo0880和回补菌株CΔlmo0880，并比较了参考菌株EGD-e、Δlmo0880和CΔlmo0880在生长、细胞感染和小鼠感染等方面的差异，结果表明Lmo0880在单增李斯特菌的细胞侵袭、胞内增殖、组织定殖等过程发挥重要作用，最终影响感染小鼠的存活能力，这为解析单增李斯特菌介导宿主感染的机制奠定了重要的理论基础。

本研究通过细胞模型发现lmo0880基因缺失使单增李斯特菌在人肠道上皮细胞Caco-2上的侵袭能力(0.01 <P < 0.05)、小鼠巨噬细胞RAW264.7中增殖能力(0.01 <P < 0.05)和在小鼠组织器官中的定殖能力(0.01 <P < 0.05)均显著降低，最终使得Δlmo0880感染的小鼠存活率升高。该结果表明LPXTG锚定蛋白Lmo0880在单增李斯特菌的细胞侵袭、胞内增殖和组织定殖等感染过程中发挥重要作用。分选酶SrtA能够识别含有LPXTG基序的蛋白质并锚定在细胞壁上，与链球菌^[30]、葡萄球菌^[31-32]、肠球菌^[33]和李斯特菌^[20]等多种革兰阳性菌的毒力息息相关。srtA基因缺失导致单增李斯特菌的内化素的表达和定位在细菌表面的能力受损，感染宿主细胞的侵袭能力和对小鼠的致病力显著降低^[34-35]。InlA是第一个被鉴定的李斯特菌LPXTG蛋白，在跨越肠道和胎盘屏障中起着关键作用^[36-38]。另一个LPXTG蛋白Vip能够与宿主gp96相互作用，该机制是单增李斯特菌侵袭哺乳动物细胞和发挥毒力所必需的^[10]。LPXTG蛋白InlJ是单增李斯特菌在宿主体内感染时特异性表达的黏附素，也是该菌发挥完整毒力的必需因子^[39]。LPXTG表面蛋白LapB是一种黏附素，对于单增李斯特菌侵袭哺乳动物细胞和人工感染小鼠中的致病力具有重要意义^[23]。李斯特菌侵袭素LmiA (Lmo1413)通过促进细菌与宿主黏蛋白的相互作用，从而介导细菌的侵袭^[40]。因此LPXTG蛋白在单增李斯特菌宿主感染方面的作用和机制值得进一步探索。

通过氨基酸序列分析发现假定细胞壁蛋白Lmo0880含有LysM结构域和LPXTG锚定基序(图1)。LysM是一个高度保守的碳水化合物结合结构域，存在于动物、植物和微生物等几乎所有生物体中(除古生菌以外)，可特异性识别含有N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)残基的多糖，如细菌细胞壁上的肽聚糖。碳水化合物识别与许多重要的生物学过程有关，如细菌细胞壁降解^[41-42]、细菌和病毒与宿主相互作用^[43]、病原体免疫应答调节^[44-45]和信号转导^[46-47]等。原核生物中的多个蛋白质都含有高度保守的LysM结构域(1−12个不等)；多个LysMs通常呈间隔排列，并主要位于蛋白质的末端。LysM结构域也是肽聚糖水解酶中最常见的结构域^[48]，该结构域以非共价方式与细菌细胞壁的肽聚糖结合^[49-51]。在单增李斯特菌中，有6种蛋白携带1−4个LysMs结构域，包括MurA、P60、Lmo1941、Lmo0880、Lmo1303和Lmo2522^[21]。自溶素MurA和P60不仅有LysM结构域，还存在降解细胞壁的酶活性结构域，通过降解细菌细胞壁介导细胞生长、分裂和致病等重要过程^[52-54]；Lmo1941仅含有LysM结构域，目前发现与头孢菌素敏感性有关^[55]；其余3个含LysM结构域的蛋白功能未知。对Lmo0880结构分析发现其不存在酶活性结构域，并且与已知的细胞壁水解酶如MurA、P60、Ami、Auto和P45的序列相似性都较低，推测Lmo0880可能以非共价的方式结合到细胞壁上，但并不具有细胞壁降解活性，其LysM结构域可能也在Lmo0880参与单增李斯特菌的侵袭、胞内增殖和组织定殖等感染过程中起作用。

因此，本研究通过生物信息学分析、遗传操作技术、细胞模型和动物模型等手段探索了单增李斯特菌假定细胞壁蛋白Lmo0880的感染生物学特性，发现具有LysM肽聚糖识别结构域和LPXTG锚定基序的蛋白Lmo0880在单增李斯特菌感染的侵袭、胞内增殖和组织器官定殖等过程发挥重要作用。该研究为丰富携带LysM结构域和LPXTG锚定基序的蛋白群的功能注释和进一步解析Lmo0880介导细菌感染的机制奠定了重要基础；也对单增李斯特菌的防控有着重要意义。

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2024年第64卷第3期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230597

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20230597

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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