微生物学报

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Fragment size (bp)
下划线标记区域为基因ompD的同源臂区域，未标记下划线为质粒pKD13中Kan抗性扩增引物 The underlined area represents the homologous arm region of the geneompD, while the unlabeled area represents the Kan resistance amplification primer in plasmid pKD13.
P1	TAAGGATTATTAAAATGAAACTTAAGTTAGTGGCAGTGGC GATCCGTCGACCTGCAGTTC	1 377
P2	TGTTGTCGGTAGACACTTTAGCCGCTTTGGTGAAGTCGCT TGTGTAGGCTGGAGCTGCTT
P3	GGCGGGCCGATATTGATATT	725
P4	ATAGCCCAGTAGCTGACATTC
P5	TGAACTTATGCCACTCCGTC	365
P6	TGCACGGCATACTCCTTATG
P7	TGAACTTATGCCACACTCCGTC ATGTGAGCGAGTAACAACCC	561
P8
P9	AAGTTAGTGGCAGTGGCAGT	115
P10	GCTGAGCGTGAACTTTACCG

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Fragment size (bp)
下划线标记区域为基因ompD的同源臂区域，未标记下划线为质粒pKD13中Kan抗性扩增引物 The underlined area represents the homologous arm region of the geneompD, while the unlabeled area represents the Kan resistance amplification primer in plasmid pKD13.
P1	TAAGGATTATTAAAATGAAACTTAAGTTAGTGGCAGTGGC GATCCGTCGACCTGCAGTTC	1 377
P2	TGTTGTCGGTAGACACTTTAGCCGCTTTGGTGAAGTCGCT TGTGTAGGCTGGAGCTGCTT
P3	GGCGGGCCGATATTGATATT	725
P4	ATAGCCCAGTAGCTGACATTC
P5	TGAACTTATGCCACTCCGTC	365
P6	TGCACGGCATACTCCTTATG
P7	TGAACTTATGCCACACTCCGTC ATGTGAGCGAGTAACAACCC	561
P8
P9	AAGTTAGTGGCAGTGGCAGT	115
P10	GCTGAGCGTGAACTTTACCG

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

PDF下载

陈世雄 ¹^,² , 潘永 ³ , 令狐远凤 ¹^,² , 张家莉 ¹^,² , 杨婉 ¹^,² , 武绍碧 ¹^,² , 叶景芬 ¹^,² , 杨琦 ¹^,²^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(4): 1263-1273

收起

微生物学报 | 研究报告 2024, 64(4): 1263-1273

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

全屏

陈世雄¹^,², 潘永³, 令狐远凤¹^,², 张家莉¹^,², 杨婉¹^,², 武绍碧¹^,², 叶景芬¹^,², 杨琦¹^,²^,^*

作者信息

1 贵州大学动物科学学院, 贵州贵阳 550025

2 贵州大学动物疫病研究所, 贵州贵阳 550025

3 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所, 贵州贵阳 550025

Small RNA RybB and chaperone protein Hfq ofSalmonella Typhimurium regulate expression of porin OmpD

Shixiong CHEN¹^,², Yong PAN³, Yuanfeng LINGHU¹^,², Jiali ZHANG¹^,², Wan YANG¹^,², Shaobi WU¹^,², Jingfen YE¹^,², Qi YANG¹^,²^,^*

Affiliations

1 School of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China

2 Institute of Animal Diseases, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China

3 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550025, Guizhou, China

出版时间: 2024-04-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

文章导航

摘要

收起

【目的】探究小RNA (small RNA, sRNA) RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)为研究对象，将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株；在此基础上，利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株，以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株，以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type, WT)菌株相比，在lacZ报告菌株中，hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%，其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比，实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2∆ompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外，其余实验菌株均显著(P < 0.05)上调，其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显，为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节；Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建，阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系，探索了Hfq对ompD的调控关键区域，丰富了sRNA的调控理论。

关键词

鼠伤寒沙门菌 / λ-Red同源重组 / sRNA RybB / Hfq / ompD

Abstract

收起

[Objective] To investigate the role of the small RNA (sRNA) RybB and the chaperone protein Hfq in regulating the expression of porin OmpD inSalmonella. [Methods] In this study,Salmonella Typhimurium (STM) was used as the research object. The pCE40 plasmid carrying the reporter genelacZ encoding β-galactosidase was transferred into the single mutant lackingompD to obtain thelacZ reporter strain. On this basis, we employed P22 phage-mediated transduction to construct the double mutants lacking full-lengthrybB, full-lengthhfq, partial sequence ofhfq, or truncatedhfq sequence and the triple mutantlacking full-lengthrybB and full-lengthhfq. The regulatory effects of RybB and Hfq on the expression of OmpD were probed by β-galactosidase activity assay and RT-qPCR. [Results] We successfully constructed the double and the triple mutant. Compared with that in the wild type (WT), the OmpD activity was down-regulated by 2.16% in thelacZ reporter strain with truncated sequence (87 residues) ofhfq, and the β-galactosidase activity of OmpD increased in the rest strains. Compared with WT, except for STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq6, all the mutants showed up-regulated transcript level ofompD (P < 0.05), with the most significant up-regulation of 1.83-folds in the triple mutant. [Conclusion] The transcription and translation ofompD are mainly regulated by the negative feedback ofhfq and RybB. The distal end of Hfq plays a key role in the transcriptional repression ofompD. By construction of several mutants, this article illustrated the interactions of RybB and Hfq with OmpD and explored the key regions of Hfq in regulatingompD, which enriched the theory of sRNA regulation.

Key words

Salmonella Typhimurium / λ-Red homologous recombination / sRNA RybB / Hfq / ompD

引用本文

陈世雄, 潘永, 令狐远凤, 张家莉, 杨婉, 武绍碧, 叶景芬, 杨琦. 鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控. 微生物学报, 2024 , 64 (4) : 1263 -1273 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

Shixiong CHEN, Yong PAN, Yuanfeng LINGHU, Jiali ZHANG, Wan YANG, Shaobi WU, Jingfen YE, Qi YANG. Small RNA RybB and chaperone protein Hfq ofSalmonella Typhimurium regulate expression of porin OmpD[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (4) : 1263 -1273 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

正文

收起

沙门菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性菌，已知有超过2 400种不同的血清型^[1]，为全球范围内最常见的食源性致病菌之一，可引起广泛的胃肠道和全身性疾病^[2-3]。

鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)是通常用于研究非编码sRNA功能的病原体之一^[4]。sRNA在细菌中广泛存在，其作用在任何生物体中都不容忽视^[5]。STM中许多非编码sRNA都是在静止阶段积累的，在这个阶段会上调许多应激反应调节因子，如sRNA SdsR、sRNA MicC、伴侣蛋白Hfq等^[6]。STM在调节过程中，部分sRNA的调节需要结合伴侣蛋白Hfq，Hfq使用端面结合sRNA形成的复合物具有保护sRNA降解、促使sRNA与靶标RNA结合、提高sRNA靶向特异性等功能^[7-8]。

STM中孔蛋白以同源或异源三聚体的形式存在，可形成水通道，允许小分子量(< 600 Da)的亲水分子被动转运^[9]；细菌能通过孔蛋白形成的通道摄取细胞外营养物质以及排出细胞内废物和有毒物质，维持细胞外环境中周质的等渗性，孔蛋白也可作为一种保护系统抵御外来有害大分子^[10]。OmpD是经典孔蛋白家族的成员，也是STM外膜中最丰富的蛋白质^[11]。OmpD具有免疫原性，且在STM感染宿主的过程中，该蛋白表达有利于其在宿主内克服诸多不利条件，使其能成功感染宿主^[12]。RybB是一种西格玛因子(σ^E)依赖性sRNA，可调节大肠杆菌和沙门氏菌中主要孔蛋白的合成^[13]。OmpD作为RybB和Hfq联合调控的靶标，在国内研究较少。lacZ基因主要编码β-半乳糖苷酶，作为一种广泛使用的报告基因可用于研究沙门氏菌和其他病原体在不同条件下的启动子活性，也可在细菌、出芽酵母、果蝇、小鼠等的研究中作报告基因^[14-15]。

本研究通过同源重组技术构建了STMompD单基因缺失株与lacZ基因融合的lacZ报告菌株，将本课题组保存的Hfq远端面核心氨基酸第25位氨基酸残基酪氨酸突变为丙氨酸的菌株hfqY25A [STM LT2hfq (TAT73−75 >GCG)::tet]、Hfq近端面核心氨基酸第56位氨基酸残基赖氨酸突变为丙氨酸的菌株hfqK56A [STM LT2hfq (AAG166−168 >GCG)::tet]、Hfq蛋白C端分别截短至65、72和87个氨基酸的菌株：hfq65 [STM LT2hfqΔ(196−306)::tet]、hfq72 [STM LT2hfqΔ (217−306)::tet]、hfq87 [STM LT2hfqΔ(262−306)::tet]以及hfq基因完全缺失株(STM LT2Δhfq::tet)，通过P22噬菌体分别与lacZ报告菌株进行双缺失；再将rybB和hfq基因缺失菌株与lacZ报告菌株分别进行双缺失、三缺失，以探究rybB、hfq基因对沙门氏菌ompD基因转录和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

鼠伤寒沙门菌野生型菌株STM LT2 (WT)、pKD13质粒(含有卡那霉素抗性片段)、pCE40质粒(含有lacZ基因片段)、STM 12488株(携带质粒pCP20)、STM 7455株(携带质粒pKD46)、P22噬菌体，均由法国国家科学研究中心(National Centre for Scientific Research, CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠；邻硝基苯β-半乳吡喃糖苷(o-nitrobenzene β-galactopyranoside, ONPG)购自北京索莱宝科技有限公司；鼠伤寒沙门菌hfq基因完全缺失株菌株MA10675 (STM LT2Δhfq::tet)、hfqY25A [STM LT2hfq (TAT73−75 >GCG)::tet]、hfqK56A [STM LT2hfq (AAG166−168 >GCG)::tet]、hfq65 [STM LT2hfqΔ(196−306)::tet]、hfq72 [STM LT2hfqΔ(217−306)::tet]、hfq87 [STM LT2hfqΔ(262−306)::tet]、rybB基因缺失株(基因型：STM LT2ΔrybB::cat)均由本实验室构建保存。

1.1.2 主要试剂

GreenTaq Mix、琼脂糖、DNA回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GeneJET质粒小提试剂盒、l-阿拉伯糖、R6950 Bacterial RNA Kit和HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂盒购自贵州卓一生物科技有限公司。

实验室配制Z缓冲液(Z buffer)：Na₂HPO₄·7H₂O 16.1 g，NaH₂PO₄·H₂O 5.5 g，KCl 0.75 g，MgSO₄·7H₂O 0.246 g，β-巯基乙醇2.7 mL，ddH₂O定容至1 L，pH调至7.0，过滤除菌。

1.2 基因缺失株的构建

1.2.1 引物设计

以NCBI公布的鼠伤寒沙门菌LT2的全基因组序列(序列号为：NC_003197.2)为参考序列，设计基因ompD的打靶片段引物及特异性验证引物。打靶片段引物序列如表1所示；引物均送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 打靶片段的制备

用GeneJET质粒小提试剂盒提取pKD13质粒，以质粒pKD13为模板，P1、P2为引物进行Touchdown PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：pKD13模板(10 mg/L) 8 μL，P1、P2引物(1×10⁻⁵ mol/L)各2 μL，ddH₂O 13 μL，GreenTaq Mix 25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环5次；95 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环5次；95 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环15次；72 ℃ 8 min；取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物纯化后进行下一步操作。

1.2.3ompD基因缺失株的构建

感受态细胞的制备：挑取STM 7455菌株单菌落接种于5 mL LB中，37 ℃、170 r/min振荡培养过夜，次日1:100复接于70 mL LB中，加入52 μL 20%的阿拉伯糖，30 ℃振荡培养至对数早期(OD₆₀₀为0.2−0.3)，用10%甘油洗涤4次后重悬于200 μL的甘油中，每管分装50 μL并置于冰上备用。

一次重组菌株的构建：将纯化后PCR产物按1:10的比例与感受态细胞混合后，2.5 kV电压进行电转化，37 ℃孵育1 h，取200 μL涂布于卡那霉素抗性平板，37 ℃过夜培养，次日挑取阳性转化子，利用引物P3、P4进行鉴定。构建成功的基因命名为：STM LT2∆ompA::kn。

二次重组菌株的构建：取1 μL pCP20质粒与50 μL STM LT2∆ompA::kn感受态细胞混合后，2.5 kV电压进行电转化，去除STM LT2∆ompA::kn中的卡那抗性基因，30 ℃、170 r/min振荡培养1 h后涂布于氨苄青霉素抗性平板，30 ℃、170 r/min培养过夜后挑取单个菌落以P5、P6进行验证，PCR产物送至生工生物(上海)股份有限公司进行测序鉴定。最终获得STM LT2∆ompD。

1.3lacZ报告菌株的构建

利用λ-Red同源重组技术，将STM LT2∆ompD菌株接种于5 mL LB中，37 ℃、170 r/min振荡培养过夜，按1.2.3方法制备感受态细胞，取1 μL质粒pCE40与其混合后，2.5 kV电压进行电转化，37 ℃、170 r/min振荡培养1 h后涂布于卡那霉素抗性平板，37 ℃培养过夜。次日挑取单个菌落作为模板，以引物P7、P8进行PCR验证，并将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。最终获得lacZ报告菌株STM LT2∆ompD::lacZ。

1.4 缺失lacZ报告菌株中rybB和hfq基因的实验菌株构建

将MA10675 (STM LT2hfq::tet)、hfqY25A [STM LT2hfq (TAT73−75 >GCG)::tet]、hfqK56A [STM LT2hfq (AAG166−168 >GCG)::tet]、hfq65 [STM LT2hfqΔ(196−306)::tet]、hfq72 [STM LT2hfqΔ(217−306)::tet]、hfq87 [STM LT2hfqΔ (262−306)::tet]和rybB基因缺失株为供体菌，STM LT2∆ompD::lacZ为受体菌，取P22噬菌体肉汤与菌株STM LT2∆ompD::lacZ混合培养过夜，次日12 000 r/min离心3 min，取离心后上清液，加入50 μL氯仿振荡，4 ℃静置1 h后备用。取供体菌100 μL与受体菌50 μL混匀，在37 ℃、170 r/min振荡培养1 h后取30 μL涂布于卡那霉素抗性平板，37 ℃培养过夜，次日挑取单个菌落进行PCR验证。

1.5 实验菌株中OmpD蛋白表达水平的影响

将所有实验菌株培养至OD₆₀₀为0.4−0.7，取菌液100 μL与900 μL Z buffer混匀，加入20 μL甲苯后水浴2 h，再加入200 μL ONPG (4 mg/mL)，记录起始时间t₁，待溶液变黄，立即加入500 μL Na₂CO₃终止液，记录终止时间t₂，最后10 000 r/min离心5 min，取上清液测OD₄₂₀，记录数值后计算β-半乳糖苷酶活性。计算公式如下^[16]：β-半乳糖苷酶活性=1 000×OD₄₂₀/[(t₂−t₁)×0.1×OD₆₀₀]。

1.6 实时荧光定量PCR检测实验菌株中ompD基因转录水平

将所有实验菌株过夜培养，根据R6950 Bacterial RNA Kit提取菌株总RNA，以相应的菌株RNA作为模板反转录成cDNA，反转录得到的cDNA作为模板，引物为P9、P10，进行RT-qPCR试验，每个样品设置3个重复，以16S rRNA基因作为内参，结果采用C_q值法^[17] (Q_r=2^−ΔΔCt)计算。

1.7 数据统计和分析

试验数据使用软件GraphPad Prism 7作图，比较各组间的变化与差异，并采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way analysis of varianceone-way, ANOVA)和邓肯氏法(Duncan’s)多重比较，结果采用(平均值±标准差)表示。P < 0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

收起

2.1lacZ报告菌株构建结果

以质粒pKD13为模板扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，缺失株的目的条带大小为1 377 bp (图1A)。

对两次重组结果分别进行PCR鉴定，两次重组菌株均出现与预期大小相符目的条带(图1B、1C)。结果显示，两次重组菌株目的条带大小分别为725 bp和365 bp。

将转入质粒pCE40作为模板进行PCR扩增，条带与预期相符(图1D)。结果显示目的条带大小为561 bp，lacZ报告菌株成功构建。

2.2 实验菌株构建结果

利用P22噬菌体转导技术构建双缺失及三缺失的实验菌株，PCR鉴定结果显示，rybB基因和hfq基因缺失菌株与STM LT2∆ompD::lacZ的实验菌株成功构建：STM LT2ΔompDΔrybB::cat (图2A)、STM LT2∆ompD::lacZ∆rybB::cat∆hfq::tet (图2B)，将lacZ报告菌株STM LT2∆ompD::lacZ和hfq全基因缺失、hfq基因定点缺失、hfq基因截短缺失的菌株进行转导，构建实验菌株：STM LT2∆ompD::lacZΔhfq::tet、STM LT2∆ompD::lacZΔhfqK56A、STM LT2∆ompD::lacZΔhfq65、STM LT2∆ompD::lacZΔhfq72、STM LT2∆ompD::lacZΔhfq87和STM LT2∆ompD::lacZΔhfqY25A，PCR扩增后条带均与预期相符(图3)，实验菌株成功构建。

2.3 实验菌株中OmpD蛋白表达水平

在实验株构建成功的基础上进行β-半乳糖苷酶活性分析实验，探知hfq基因全缺失、hfq基因定点缺失、hfq基因截短缺失和rybB基因缺失对OmpD蛋白水平表达的影响，并使用软件GraphPad Prism 7进行作图和数据分析。结果显示：与WT菌株相比，所有实验菌株的OmpD的β-半乳糖苷酶活性除STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq87外均有所升高，STM LT2∆ompD::lacZ∆hfqY25A、STM LT2∆ompD::lacZ∆hfqK56A、STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq65、STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq72、STM LT2∆ompD::lacZ ∆hfq、STM LT2∆ompD::lacZ∆rybB和STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq∆rybB依次上升1.76、1.29、1.13、1.04、1.79、1.88和2.06倍(图4)，以上实验菌株中所缺失基因对OmpD蛋白都具有负反馈调节作用，其中STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq∆rybB上调最明显；与WT菌株相比，STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq87中OmpD蛋白下调了2.16%。

2.4 实验菌株中ompD基因转录水平

使用荧光定量PCR检测实验菌株中ompD基因转录水平的影响，并使用软件GraphPad Prism 7进行作图和数据分析。结果显示(图5)，与WT相比，实验菌株ompD基因转录水平除STM LT2∆ompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外，其余菌株均显著(P < 0.05)上调，所有实验菌株中ompD基因转录水平上调趋势依次为1.67、1.06、1.01、1.10、1.12、1.68、1.77和1.83倍，其中STM LT2∆ompD::lacZ∆hfq∆rybB实验菌株中ompD基因转录水平上调最明显。结果表明，Hfq和sRNA RybB对ompD基因转录水平具有负反馈调节作用。

3 讨论与结论

收起

革兰氏阴性菌的外膜含有密集的孔蛋白，外膜结合的β-桶状蛋白有助于运输盐、糖、营养物质、多肽、氨基酸和维生素等^[18]。许多细菌通过孔蛋白来改变其外膜通透性，以产生对抗生素、抗菌肽等耐药性^[19-20]。大多数肠杆菌科都需要丰富的外膜孔蛋白OmpA、OmpC、OmpD和OmpF来产生抗生素耐药性，例如在鼠伤寒沙门氏菌中，OmpA、OmpC、OmpD和OmpF这4种孔蛋白在对两种广谱β-内酰胺类抗生素头孢他啶和美罗培南等产生耐药性方面有着重要作用^[18-21]；Chowdhury等^[18]研究表明，敲除ompA基因后，增加了外膜通透性并促进抗生素的进入，使抗生素对其更具杀伤性。所以对孔蛋白的研究有助于了解细菌耐药性，对开发抗菌药物有重要意义。

细菌包膜应激反应是由包膜损伤或包膜蛋白过度合成、错误折叠不断积累时触发的，由σ^E介导，激活σ^E途径会导致主要omp mRNA的快速下调，防止未组装的包膜蛋白大量聚积，并在需要包膜重塑的条件下释放易位和折叠装置^[23]。在沙门菌中，σ^E控制的非编码sRNA RybB是维持包膜稳态的主要调节因子之一^[13]。如图4、图5所示，缺失sRNA RybB的菌株表现出对OmpD蛋白活性及ompD基因的转录表达的明显上调，呈现负反馈调节趋势。RNA伴侣蛋白Hfq在细菌生理学中作用众多，sRNA RybB可以与伴侣蛋白Hfq近端面、远端面及侧面3个位置分别结合成复合物，从而对靶标mRNA进行调节^[22]；Hfq突变远端面的菌株相对于Hfq突变近端面和3株Hfq C端截短突变的菌株，ompD基因的转录量及蛋白表达量增长幅度明显，显示Hfq对ompD基因的调节主要集中在远端面上，说明Hfq的远端面对ompD基因的转录抑制中起关键作用。推测Hfq远端面的突变，可能导致Hfq与RybB的结合障碍，使两者不能形成相应的复合物，降低sRNA RybB对ompD基因的抑制；也可能是影响了Hfq蛋白与ompD基因上的某段序列的直接结合，从而不能催化sRNA RybB对ompD基因的转录降解作用。

Hfq蛋白有多个面可与RNA结合，且能同时结合多个RNA；Hfq蛋白的C端本质上是无序的、灵活的，该结构特点有助于Hfq与RNA底物的相互作用^[24]。研究证实hfq mRNA转录后的表达受Hfq反馈调节，Hfq蛋白同时与hfq mRNA 5′-UTR-55−50的富U以及−20至+4包含核糖体结合位点的序列结合，抑制hfq mRNA的翻译^[25]。在潘永^[26]研究中，对Hfq蛋白的C端进行截短后均导致Hfq蛋白水平上调。结合本试验，对Hfq蛋白的非结构化C端突变后，Hfq蛋白水平上调，应该加强其对ompD基因转录和蛋白的抑制作用，然而在本实验中ompD基因转录和蛋白表达并未表现出明显的抑制作用，甚至表现出轻微的促进作用。据此推测，hfq基因进行突变和截短处理后，可能改变了Hfq蛋白分子构象，破坏了ompD基因与Hfq六聚体以远端面为主要结合面的关键作用位点，导致对Hfq蛋白C端进行截短处理后，ompD基因转录和蛋白表达并未表现出明显变化，具体调控机制则需进行更为深入的研究确证。

试验通过β-半乳糖苷酶活性试验、RT-qPCR试验检测实验菌株中ompD基因转录水平和蛋白表达水平的变化。缺失hfq基因和rybB基因均使ompD基因转录和蛋白表达水平上调，显示Hfq和sRNA RybB对ompD基因具有负调控作用；hfq定点突变和截短缺失对ompD基因转录和蛋白表达水平产生不同程度的影响，表明ompD基因在Hfq的结合位置主要集中在远端面，Hfq的近端面和非结构C端对ompD基因也有一定调节作用，但并非主要调节。目前沙门氏菌中被鉴定出许多具有调节作用的sRNA，一些sRNA在对mRNA调节过程中都有Hfq蛋白参与，三者间相互作用方式不尽相同，值得进行更深入研究和探索。

基金

收起

国家自然科学基金(32260884)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

MEYER T, STRATMANN-SELKE J, MEENS J, SCHIRRMANN T, GERLACH GF, FRANK R, DÜBEL S, STRUTZBERG-MINDER K, HUST M.Isolation of scFv fragments specific to OmpD ofSalmonella Typhimurium[J].Veterinary Microbiology,2011,147(1/2):162-169.

[2]

AGRAWAL S, KULABHUSAN PK, JOSHI M, BODAS D, PAKNIKAR KM.A high affinity phage-displayed peptide as a recognition probe for the detection ofSalmonella Typhimurium[J].Journal of Biotechnology,2016,231:40-45.

https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.05.027

[3]

JUNG B, PARK S, KIM E, YOON H, HAHN TW.Salmonella Typhimurium lackingphoBR as a live vaccine candidate against poultry infection[J].Veterinary Microbiology,2022,266:109342.

https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2022.109342

[4]

VOGEL J.A rough guide to the non-coding RNA world ofSalmonella[J].Molecular Microbiology,2009,71(1):1-11.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06505.x

[5]

ADKAR-PURUSHOTHAMA CR, IYER PS, SANO T, PERREAULT JP.sRNA profiler: a user-focused interface for small RNA mapping and profiling[J].Cells,2021,10(7):1771.

https://doi.org/10.3390/cells10071771

[6]

FRÖHLICH KS, PAPENFORT K, BERGER AA, VOGEL J.A conserved RpoS-dependent small RNA controls the synthesis of major porin OmpD[J].Nucleic Acids Research,2012,40(8):3623-3640.

https://doi.org/10.1093/nar/gkr1156

[7]

SAUER E, SCHMIDT S, WEICHENRIEDER O.Small RNA binding to the lateral surface of Hfq hexamers and structural rearrangements upon mRNA target recognition[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109(24):9396-9401.

[8]

WROBLEWSKA Z, OLEJNICZAK M.Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence ofompD mRNA and in rearranging its structure[J].RNA,2016,22(7):979-994.

https://doi.org/10.1261/rna.055251.115

[9]

NIKAIDO H.Multidrug efflux pumps of Gram-negative bacteria[J].Journal of Bacteriology,1996,178(20):5853-5859.

https://doi.org/10.1128/jb.178.20.5853-5859.1996

[10]

VALERO-PACHECO N, BLIGHT J, ALDAPA-VEGA G, KEMLO P, PÉREZ-TOLEDO M, WONG-BAEZA I, KURIOKA A, PEREZ-SHIBAYAMA C, GIL-CRUZ C, SÁNCHEZ-TORRES LE, PASTELIN-PALACIOS R, ISIBASI A, REYES-SANDOVAL A, KLENERMAN P, LÓPEZ-MACÍAS C.Conservation of the OmpC porin among typhoidal and non-typhoidalSalmonella serovars[J].Frontiers in Immunology,2020,10:2966.

https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02966

[11]

CALDERÓN IL, MORALES E, CARO NJ, CHAHÚAN CA, COLLAO B, GIL F, VILLARREAL JM, IPINZA F, MORA GC, SAAVEDRA CP.Response regulatorArcA ofSalmonella enterica serovar Typhimurium downregulates expression of OmpD, a porin facilitating uptake of hydrogen peroxide[J].Research in Microbiology,2011,162(2):214-222.

https://doi.org/10.1016/j.resmic.2010.11.001

[12]

IPINZA F, COLLAO B, MONSALVA D, BUSTAMANTE VH, LURASCHI R, ALEGRÍA-ARCOS M, ALMONACID DE, AGUAYO D, CALDERÓN IL, GIL F, SANTIVIAGO CA, MORALES EH, CALVA E, SAAVEDRA CP.Participation of theSalmonella OmpD porin in the infection of RAW_264.7 macrophages and BALB/c mice[J].PLoS One,2014,9(10):e111062.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111062

[13]

BALBONTÍN R, FIORINI F, FIGUEROA-BOSSI N, CASADESÚS J, BOSSI L.Recognition of heptameric seed sequence underlies multi-target regulation by RybB small RNA inSalmonella enterica[J].Molecular Microbiology,2010,78(2):380-394.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07342.x

[14]

AVIV G, GAL-MOR O.lacZ reporter system as a tool to study virulence gene regulation in bacterial pathogens[J].Methods in Molecular Biology,2018,1734:39-45.

[15]

KLIMOVA N, CHU SW, TURCOTTE B.AlacZ reporter with high activity in the human fungal pathogenCandida albicans[J].FEMS Yeast Research,2021,21(2):foab013.

https://doi.org/10.1093/femsyr/foab013

[16]

宋洁, 侯兵兵, 叶江, 吴海珍, 张惠展.大肠杆菌Small RNA EsrE的转录调控[J].微生物学通报,2020,47(5):1430-1440. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSWT202305032.htm

SONG J, HOU BB, YE J, WU HZ, ZHANG HZ.Transcriptional regulation of small RNAEsrE inEscherichia coli[J].Microbiology China,2020,47(5):1430-1440 (in Chinese). https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSWT202305032.htm

[17]

TAYLOR SC, NADEAU K, ABBASI M, LACHANCE C, NGUYEN M, FENRICH J.The ultimate qPCR experiment: producing publication quality, reproducible data the first time[J].Trends in Biotechnology,2019,37(7):761-774.

https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.12.002

[18]

CHOWDHURY AR, MUKHERJEE D, SINGH AK, CHAKRAVORTTY D.Loss of outer membrane protein A (OmpA) impairs the survival ofSalmonella Typhimurium by inducing membrane damage in the presence of ceftazidime and meropenem[J].The Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2022,77(12):3376-3389.

https://doi.org/10.1093/jac/dkac327

[19]

NIKAIDO H.Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR,2003,67(4):593-656.

https://doi.org/10.1128/MMBR.67.4.593-656.2003

[20]

PILONIETA MC, ERICKSON KD, ERNST RK, DETWEILER CS.A protein important for antimicrobial peptide resistance, YdeI/OmdA, is in the periplasm and interacts with OmpD/NmpC[J].Journal of Bacteriology,2009,191(23):7243-7252.

https://doi.org/10.1128/JB.00688-09

[21]

HU WS, CHEN HW, ZHANG RY, HUANG CY, SHEN CF.The expression levels of outer membrane proteins STM1530 and OmpD, which are influenced by the CpxAR and BaeSR two-component systems, play important roles in the ceftriaxone resistance ofSalmonella enterica serovar Typhimurium[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2011,55(8):3829-3837.

https://doi.org/10.1128/AAC.00216-11

[22]

SITTKA A, PFEIFFER V, TEDIN K, VOGEL J.The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence ofSalmonella Typhimurium[J].Molecular Microbiology,2007,63(1):193-217.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2006.05489.x

[23]

PAPENFORT K, PFEIFFER V, MIKA F, LUCCHINI S, HINTON JCD, VOGEL J.SigmaE-dependent small RNAs ofSalmonella respond to membrane stress by accelerating globalomp mRNA decay[J].Molecular Microbiology,2006,62(6):1674-1688.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2006.05524.x

[24]

BEICH-FRANDSEN M, VECEREK B, KONAREV PV, SJÖBLOM B, KLOIBER K, HÄMMERLE H, RAJKOWITSCH L, MILES AJ, KONTAXIS G, WALLACE BA, SVERGUN DI, KONRAT R, BLÄSI U, DJINOVIC-CARUGO K.Structural insights into the dynamics and function of the C-terminus of theE.coli RNA chaperone Hfq[J].Nucleic Acids Research,2011,39(11):4900-4915.

https://doi.org/10.1093/nar/gkq1346

[25]

MORITA T, AIBA H.Mechanism and physiological significance of autoregulation of theEscherichia coli hfq gene[J].RNA,2019,25(2):264-276.

https://doi.org/10.1261/rna.068106.118

[26]

潘永. 沙门菌中伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB及其靶基因oppA的调控机理分析[D]. 贵阳: 贵州大学硕士学位论文, 2021.

PAN Y. Analysis of the regulatory mechanism of the chaperone protein Hfq with the small RNA GcvB and its target geneoppA inSalmonella[D]. Guiyang: Master's Thesis of Guizhou University, 2021 (in Chinese).

2024年第64卷第4期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

接收时间：2023-11-14
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-04-04

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2023-11-14
录用日期：2024-01-29

基金

National Natural Science Foundation of China(32260884)

国家自然科学基金(32260884)

作者信息

1 贵州大学动物科学学院, 贵州贵阳 550025

2 贵州大学动物疫病研究所, 贵州贵阳 550025

3 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所, 贵州贵阳 550025

通讯作者:

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT