微生物学报

Protein	Explanation	Reference
CusA	Actively absorbs metal ions from cytoplasm and periplasm, relying on methionine residues to bind and export silver ions	[14]
CusB	CusA and CusC are connected to participate in the efflux of silver ions	[15]
CusC	Expel the silver ions from the body	[16]
CusF	It can bind to silver ions in periplasm and transport to CusB	[17]
CusR	Phosphorylated CusR mediates transcription of the efflux protein CusCBA	[18]
CusS	It binds to silver ions in the periplasm and transmits signals to its cytoplasmic kinase domain	[19]

Protein	Explanation	Reference
CusA	Actively absorbs metal ions from cytoplasm and periplasm, relying on methionine residues to bind and export silver ions	[14]
CusB	CusA and CusC are connected to participate in the efflux of silver ions	[15]
CusC	Expel the silver ions from the body	[16]
CusF	It can bind to silver ions in periplasm and transport to CusB	[17]
CusR	Phosphorylated CusR mediates transcription of the efflux protein CusCBA	[18]
CusS	It binds to silver ions in the periplasm and transmits signals to its cytoplasmic kinase domain	[19]

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Sequence (bp)	Purpose
H1P1和H2P2分别是构建ΔcusS的同源臂上、下游引物；C1和C2是用来验证cusS成功敲出的上、下游引物，C1位于cusS上游基因，C2位于Kana基因；rrsA-F/R是内参；cusC-F/R、cusF-F/R、cusB-F/R、cusA-F/R和cusR-F/R是qPCR引物. 下划线表示同源臂序列 H1P1 and H2P2 were the upstream and downstream primers of the homologous arm for the construction of ΔcusS, respectively. C1 and C2 were the upstream and downstream primers to verify the successful knock-in ofcusS.rrsA-F/R is the internal control,cusC-F/R,cusF-F/R,cusB-F/R,cusA-F/R, andcusR-F/R are qPCR primers. The underlined bases are homologous arm sequences.
H1P1	CCGAAGCTAATTCAGACCGTGCGCGGCGTGGGTTACATGCTTGAGGTGCCGGTTGAGCGATTGTGTAGGCTGG	73	Confirmatory deletion
H2P2	GTGACAGCTTTTTACCATTAATAGGTATGACTATTGCGGCACGTTATTTTTACACTTAACGGCTGACATGGGAA	74	Confirmatory deletion
C1	ATGACCGCTAACGTTATCGCGA	22	Validation of deletion strain
C2	ACCGCTATCAGGACATAGCGTT	22	Validation of deletion strain
rrsA-F	CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA	22	Internal reference
rrsA-R	CCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCA	24	Internal reference
cusC-F	CAGTTCTCACTCAGCCAGAACG	22	qPCR
cusC-R	ATGCGCAAATCCCGATTATTCAC	23	qPCR
cusF-F	GCAAGTCGCAATGTTCAGTCT	21	qPCR
cusF-R	ATACCCTTTACCACGCCAGTG	21	qPCR
cusB-F	GATCTGGTGCCGAAATATGCCG	22	qPCR
cusB-R	CTGACATTCGCCGGGAAACT	20	qPCR
cusA-F	GCATAAACGGCTGGAAGAGTGG	22	qPCR
cusA-R	CGACAACGTGATAATCAGCAGACT	24	qPCR
cusR-F	GGTTGCCGATTTGATGGTCGA	21	qPCR
cusR-R	CCTGATGGCGAAGGAAGAACT	21	qPCR

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Sequence (bp)	Purpose
H1P1和H2P2分别是构建ΔcusS的同源臂上、下游引物；C1和C2是用来验证cusS成功敲出的上、下游引物，C1位于cusS上游基因，C2位于Kana基因；rrsA-F/R是内参；cusC-F/R、cusF-F/R、cusB-F/R、cusA-F/R和cusR-F/R是qPCR引物. 下划线表示同源臂序列 H1P1 and H2P2 were the upstream and downstream primers of the homologous arm for the construction of ΔcusS, respectively. C1 and C2 were the upstream and downstream primers to verify the successful knock-in ofcusS.rrsA-F/R is the internal control,cusC-F/R,cusF-F/R,cusB-F/R,cusA-F/R, andcusR-F/R are qPCR primers. The underlined bases are homologous arm sequences.
H1P1	CCGAAGCTAATTCAGACCGTGCGCGGCGTGGGTTACATGCTTGAGGTGCCGGTTGAGCGATTGTGTAGGCTGG	73	Confirmatory deletion
H2P2	GTGACAGCTTTTTACCATTAATAGGTATGACTATTGCGGCACGTTATTTTTACACTTAACGGCTGACATGGGAA	74	Confirmatory deletion
C1	ATGACCGCTAACGTTATCGCGA	22	Validation of deletion strain
C2	ACCGCTATCAGGACATAGCGTT	22	Validation of deletion strain
rrsA-F	CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA	22	Internal reference
rrsA-R	CCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCA	24	Internal reference
cusC-F	CAGTTCTCACTCAGCCAGAACG	22	qPCR
cusC-R	ATGCGCAAATCCCGATTATTCAC	23	qPCR
cusF-F	GCAAGTCGCAATGTTCAGTCT	21	qPCR
cusF-R	ATACCCTTTACCACGCCAGTG	21	qPCR
cusB-F	GATCTGGTGCCGAAATATGCCG	22	qPCR
cusB-R	CTGACATTCGCCGGGAAACT	20	qPCR
cusA-F	GCATAAACGGCTGGAAGAGTGG	22	qPCR
cusA-R	CGACAACGTGATAATCAGCAGACT	24	qPCR
cusR-F	GGTTGCCGATTTGATGGTCGA	21	qPCR
cusR-R	CCTGATGGCGAAGGAAGAACT	21	qPCR

大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

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安皓月 ¹^,²^,³^,^# , 谭超 ⁴^,^# , 沈舒楚 ¹^,²^,³ , 伍中宝 ¹^,²^,³ , 吴钰煌 ¹^,²^,³ , 邓凯红 ¹^,²^,³ , 邹黎黎 ¹^,²^,³ , 王君 ⁴^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(4): 1187-1202

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(4): 1187-1202

大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

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安皓月¹^,²^,³^,^#, 谭超⁴^,^#, 沈舒楚¹^,²^,³, 伍中宝¹^,²^,³, 吴钰煌¹^,²^,³, 邓凯红¹^,²^,³, 邹黎黎¹^,²^,³, 王君⁴^,^*

作者信息

1 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室, 湖北宜昌 443002

2 三峡大学感染与炎症损伤研究所, 湖北宜昌 443002

3 三峡大学基础医学院, 湖北宜昌 443002

4 三峡大学第一临床医学院, 湖北宜昌 443002

Bioinformatics of CusS inEscherichia coli in response to silver ion stress

Haoyue AN¹^,²^,³, Chao TAN⁴, Shuchu SHEN¹^,²^,³, Zhongbao WU¹^,²^,³, Yuhuang WU¹^,²^,³, Kaihong DENG¹^,²^,³, Lili ZOU¹^,²^,³, Jun WANG⁴^,^*

Affiliations

1 Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

2 Institute of Infection and Inflammation, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

3 College of Basic Medical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

4 The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

出版时间: 2024-04-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230675

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摘要

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【目的】解析大肠杆菌(Escherichia coli) K-12菌株同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶(sensor histidine kinase, CusS)蛋白在细菌应答金属银离子胁迫中的调控机制，为该菌的防治提供重要科学依据。【方法】利用ProtParam、ProtScale、Protein-Sol、TMHMM、SignalP、LocTree3、NetNGlyc-1.0、NetPhosBac-3.0、SOPMA、I-TASSERF、STRING和MEGA分别预测CusS的理化性质、亲水性、可溶性、跨膜域、信号肽、亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、蛋白互作的关系网络和蛋白在革兰阴性杆菌中的同源性。采用Red同源重组技术构建大肠杆菌ΔcusS，在不同培养基中连续监测ΔcusS的生长情况，观察该基因缺失后的细菌生长活性；通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)试验评价该缺失株对金属铜、银离子和临床常见抗生素的敏感性变化；运用RT-qPCR检测cusS缺失后其下游基因cusCFBA和cusR转录水平。【结果】CusS蛋白由480个氨基酸组成，相对分子质量为53 738.05，原子总数为7 624，等电点为6.02，具有稳定性，是一种亲水性、不溶性蛋白；含有跨膜域；不存在信号肽，定位于细胞内膜中；存在2个糖基化位点、24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点；二级结构中α-螺旋占比55.42%，β-折叠占比11.67%，β-转角占比3.75%，无规则卷曲占比29.17%；cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高；菌落PCR和一代测序验证ΔcusS构建成功；连续检测生长曲线表明cusS缺失并不影响细菌的生长代谢，但CusS蛋白为大肠杆菌抵御金属银胁迫的关键基因。【结论】cusS作为一个关键基因，它的缺失并不影响大肠杆菌的生长活性，但会显著降低细菌抵御银离子胁迫的应答能力。缺失cusS将使下游基因cusCFBA和cusR的mRNA表达水平显著下降。对CusS蛋白进行生物信息学分析及表型初探，为深入了解CusS在大肠杆菌应答银离子胁迫的调控机制奠定了基础。

关键词

大肠杆菌 / Red同源重组技术 / 银离子 / 金属外排系统 / 传感器组氨酸激酶(CusS) / 生物信息学分析

Abstract

收起

[Objective] To decipher the regulatory mechanism of a sensor histidine kinase (CusS) inEscherichia coli K-12 in response to silver ion stress and provide scientific evidence for the prevention and treatment of this bacterium. [Methods] ProtParam, ProtScale, Protein-Sol, TMHMM, SignalP, LocTree3, NetNGlyc-1.0, NetPhosBac-3.0, SOPMA, I-TASSERF, STRING, and MEGA were employed to predict the physicochemical properties, hydrophilicity, solubility, transmembrane domain, signal peptides, subcellular localization, glycosylation sites, phosphorylation sites, secondary structure, tertiary structure, protein-protein interaction network of CusS, and the homology of CusS in Gram-negative bacilli, respectively. After that, ΔcusS was constructed by the Red homologous recombination system, and the growth of ΔcusS in different media was monitored. In addition, we evaluated the sensitivity of ΔcusS to silver and copper ions and common antibiotics based on the minimum inhibitory concentration (MIC). RT-qPCR was employed to determine the transcription levels ofcusCFBA andcusR aftercusS deletion. [Results] CusS was composed of 480 amino acid residues, with the relative molecular weight of 53 738.05, the atom number of 7 624, and the isoelectric point of 6.02. It was a hydrophilic and insoluble protein containing transmembrane domain, and no signal peptide, located in the intracellular membrane. CusS had 2 glycosylation sites, 24 serine phosphorylation sites, 14 threonine phosphorylation sites, and 3 tyrosine phosphorylation sites. In the secondary structure, α-helixes, β-sheets, β-turns, and random coils accounted for 55.42%, 11.67%, 3.75%, and 29.17%, respectively. The genecusS was highly conserved inEscherichia andShigella. The colony PCR and first-generation sequencing confirmed the successful construction of ΔcusS. The deletion ofcusS had no influence on the growth or metabolism of the strain. However,cusS was the key gene forE.coli in response to the silver ion stress. [Conclusion] The deletion ofcusS did not affect the growth but attenuated the protective response ofE.coli to silver ion stress. Furthermore, the deletion ofcusS significantly down-regulated the mRNA levels of the downstream genescusCFBA andcusR. The bioinformatics analysis and phenotype characterization of CusS lays a foundation for unveiling the regulatory mechanism of CusS inE.coli in response to silver ion stress.

Key words

Escherichia coli / Red homologous recombination technology / silver ions / metal efflux system / sensor histidine kinase (CusS) / bioinformatics analysis

引用本文

安皓月, 谭超, 沈舒楚, 伍中宝, 吴钰煌, 邓凯红, 邹黎黎, 王君. 大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应. 微生物学报, 2024 , 64 (4) : 1187 -1202 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230675

Haoyue AN, Chao TAN, Shuchu SHEN, Zhongbao WU, Yuhuang WU, Kaihong DENG, Lili ZOU, Jun WANG. Bioinformatics of CusS inEscherichia coli in response to silver ion stress[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (4) : 1187 -1202 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230675

正文

收起

银是一种古老的抗菌物质，常被应用于烫伤患者的细菌感染^[1]、糖尿病引起的伤口溃疡^[2]、牙科治疗^[3]等相关医疗活动中。此外，银离子还被广泛运用于制作包括外科手术敷料在内的各种医用材料^[4-5]。一方面，银离子可通过抑制呼吸链^[6]，干扰细胞膜功能^[7]，诱导细菌凋亡样反应^[8]，产生活性氧和自由基诱导细胞毒性和氧化应激^[9]等发挥抗菌活性。另一方面，细菌也进化出内源性和外源性两种途径来抵御银离子的重金属毒性。内源性途径主要依赖于膜结合、细胞壁结构破坏和外排泵^[10]；外源性途径则包括外排泵蛋白和质粒等载体蛋白^[11]。值得注意的是，无论是内源性还是外源性机制，都主要涉及由一个转运蛋白、一个膜融合蛋白和一个外膜因子组成的细菌耐药结节细胞分化家族(resistance-nodulation-cell division, RND)外排泵^[12]，将各种有毒底物排出至细胞外环境。其中，在大肠杆菌中主要是通过内源性途径实现对银胁迫的抵御效应。

Randall等^[10]和Li等^[13]在大肠杆菌中发现了内源性抗银的机制，该机制与Cus外排系统和主要外膜蛋白(outer membrane protein, OMPs)的缺失(如OmpF或OmpC)有关。染色体编码的Cus系统由2个背靠背的操纵子组成，分别是调节操纵子cusRS和结构操纵子cusCFBA，在阅读框的顺序分别是cusS、cusR、cusC、cusF、cusB和cusA (其功能见表1和图1)。CusCFBA是一个独立的系统，由镶嵌在膜上的三元蛋白质复合体CusCBA和周质中金属伴侣CusF组成^[20]。其中CusCBA复合体包括转运蛋白CusA、周质蛋白CusB和外膜蛋白CusC^[21]，是目前已知的重金属特有的RND型外排转运体^[22]，对Ag⁺/Cu⁺均具有高度特异性。CusRS双组分系统是CusCFBA转运体正调节器，对cusCFBA外排泵编码基因的诱导至关重要。当Ag⁺/Cu⁺在周质中升高时，大肠杆菌为了适应这种环境，则会通过双组分系统CusRS上调cusCFBA基因的表达^[23]，将离子排出体外，维持机体内金属离子的稳态。CusS是同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶，由周质传感器结构域、α螺旋跨膜结构域和胞质激酶结构域组成，能够与周质中的Ag⁺/Cu⁺结合，并将信号传导至其细胞质激酶结构域^[24]。CusR是同源的胞质反应调节因子^[25]，是一种磷酸化反应调节器，CusR可被CusS以外的其他激酶传感器磷酸化^[26-27]，磷酸化的CusR介导外排蛋白CusCBA的转录^[28]。此外，CusR还具有与CusS相互作用的N端结构域和与DNA结合的C端结构域，从CusS向CusR的信号转导涉及以下分子活动：首先，CusS的周质传感器域与底物(Cu⁺/Ag⁺)结合，随后周质结构域二聚体化，变构信号通过跨膜结构域传递至胞质激酶结构域进行ATP水解，在His (H271)残基处发生顺式自磷酸化，活化的CusS将磷酰基转移到CusR的Asp (D51)残基上，然后与DNA结合以激活CusRS和cusCFBA基因的转录^{[23,25,29-30]}。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

大肠杆菌(Escherichia coli) K-12由三峡大学医学院感染与炎症研究损伤实验室保存，并进行全基因组测序。pKD4(Kan^r)、pKD46(Amp^r)均由三峡大学医学院感染与炎症研究损伤实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

AgNO₃，Sigma-Aldrich公司；甘油，武汉赛维尔生物科技有限公司；氨苄青霉素钠、硫酸卡那霉素、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin, OFL)、牛脑心浸液肉汤(beef brain heart infusion broth, BHI)、SOC培养基、胰酪大豆胨液体培养基TSB，生工生物工程(上海)股份有限公司；美罗培南(meropenem, MEM)、四环素(tetracycline, TET)，MCE公司；蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司；阿拉伯糖，上阿拉丁生化科技股份有限公司；琼脂糖，上海贝晶生物技术有限公司；核酸染料，武汉科瑞生物技术有限公司；TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase、PrimeScript^TM RT Master Mix，TaKaRa公司；TRIzol^TM Reagent，ThermoFisher Scientific公司；胶回收纯化，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇，西陇化工股份有限公司。电转仪器，Bio-Rad公司；全波长酶标仪，Thermo Scientific Multiskan Spectrum公司；台式高速离心机，Eppendorf公司；PCR，ABI公司。

1.2 生物信息学研究

利用ProtParam软件在线预测CusS的分子量、等电点、疏水性、脂溶性系数、消光系数和吸光度等基本理化性质；利用ProtScale软件在线预测CusS的亲水性；使用Protein-Sol软件在线预测CusS的可溶性；利用TMHMM软件预测CusS是否存在跨膜域；利用SignalP软件预测CusS是否存在信号肽；利用LocTree3软件预测CusS的亚细胞定位；使用NetNGlyc-1.0软件在线预测CusS的糖基化位点；利用NetPhosBac-3.0在线预测CusS的磷酸化位点；利用SOPMA软件在线预测CusS的二级结构；使用RCSC PDB软件构建CusS的三级结构模型；利用STRING数据库对CusS蛋白的调控作用关系网络进行分析。

1.3cusS缺失株构建

1.3.1 引物设计

根据NCBI数据库中大肠杆菌K-12的全基因组序列和pKD4序列，用Red同源重组方法构建大肠杆菌cusS缺失株^[31]。H1P1和H2P2引物由两部分组成，分别是cusS基因两端的同源臂序列和卡那霉素基因两端的序列。鉴定引物选取以cusS的上游基因为一部分，pKD4卡那抗性区域为另一部分，分别是C1和C2。引物序列如表2所示。

1.3.2 质粒提取以及目的片段获得

将pKD4和pKD46培养12 h，按照质粒小提试剂盒说明书提取，以pKD4为模板，采用TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase试剂盒，用引物H1P1和H2P2进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.25 μL，Buffer (20 mmol/L) 2.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2 μL，模板(500 ng) 1 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各1 μL，灭菌水17.25 μL。PCR反应条件：98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司胶回收纯化试剂盒说明书进行纯化，纯化后的产物用分光光度计检测浓度。

1.3.3 电转感受态制备

首先制备大肠杆菌的感受态。按照1:100转接至200 mL LB中，培养OD₆₀₀至0.5−0.7之间，4 ℃、5 500 r/min离心5 min，除去上清，使用预冷的丙三醇(10%)重悬菌体，混匀，4 ℃、5 500 r/min离心5 min除去上清，重复3次，最后使用1 mL预冷的丙三醇(10%)重悬菌体，以每管100 μL分装至无菌的EP管中，并保存于−80 ℃冰箱。

1.3.4 诱导同源重组酶的表达

取3 μL提取好的质粒pKD46加入即将融化的野生型大肠杆菌的感受态中，混合均匀，转移至预冷的电击杯，冰上放置3 min。电转，转移感受态至1 mL SOC培养基中，在37 ℃、220 r/min复苏2 h。取100 μL涂布至含氨苄抗性的LB固体培养基上，培养12 h，菌落PCR鉴定方法鉴定在氨苄抗性固体培养基生长的单克隆菌落。选取阳性菌落按照1:100转接至200 mL含有氨苄抗性的液体培养基中，培养OD₆₀₀至0.2−0.3，加入100 μg/mL的阿拉伯糖诱导至OD₆₀₀为0.6左右，该过程是诱导重组酶的表达。接着按照1.3.3步骤制备含有pKD46的感受态细胞。

1.3.5 同源重组以及阳性克隆鉴定

取2 μL纯化后的含有同源臂的抗性产物加入含有pKD46质粒的野生型感受态中，轻柔混匀，冰上静置5 min，使用Bio-Rad电转仪进行电转，在30 ℃、220 r/min条件下复苏2 h，取100 μL涂布至含卡那霉素抗性的固体培养基上，培养过夜。在生物安全柜挑取阳性克隆并用引物C1和C2进行菌落验证，将与预期大小相同的PCR扩增片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行一代测序。将测序正确的对应缺失株过夜培养，并对缺失株进行菌种保存。

1.3.6 ΔcusS的鉴定

在卡那霉素培养基上挑取阳性克隆，菌落PCR鉴定后，将与预期大小相同的PCR扩增片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行一代测序验证。将测序正确的菌株接种含有卡那霉素抗性的液体培养基中培养并进行菌种保存。

1.4 ΔcusS生长曲线测定

将对数生长期的细菌调至OD₆₀₀为0.4后，用含有卡那霉素的培养基1:1 000比例稀释，充分混匀，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、24 h监测细菌生长状态。

1.5 ΔcusS对AgNO₃/CuCl₂/OFL/MEM的敏感性

将对数生长期的细菌调至OD₆₀₀为0.4，用培养基按1:1 000的比例稀释，充分混匀后用不同浓度的AgNO₃/CuCl₂/OFL/MEM处理，混匀后接种于96孔板中，每孔200 μL，设置4个复孔。并将该96孔板置于37 ℃恒温培养箱，分别于0、2、4、8、16、24 h监测细菌生长状态。

1.6 ΔcusS对下游基因cusCFBA以及cusR转录水平的影响

1.6.1 RNA提取和cDNA提取

将DHB4和ΔcusS两株菌培养至对数生长期，离心后在沉淀中加入1 mL TRIzol，混匀，冰上放置5 min，加入200 μL氯仿，振荡15 s，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上层水相于新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入75%乙醇，静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入20 μL RNase-free H₂O水溶解沉淀，使用分光光度计检测纯度和浓度。使用反转录试剂PrimeScript^TM Master Mix进行反转录。将产物保存于−20 ℃。

1.6.2 荧光定量PCR

以16SrrsA为内参，采用TB Green Premix Ex Taq^TM Ⅱ TaKaRa荧光定量试剂盒检测DHB4和ΔcusS两株菌中cusC、cusF、cusB、cusA和cusR基因的表达量。反应体系(25 μL)：上、下游引物(0.4 μmol/L)各1 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，cDNA (100 ng) 2 μL，无酶水8.5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，40个循环。根据2^−ΔΔCt进行数据分析。

1.7 数据统计与分析

本实验数据统计采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析，两组数据间的比较采用t检验。

2 结果与分析

收起

2.1 基本理化性质分析

ProtParam软件分析显示CusS蛋白由480个氨基酸残基组成，分子式为C₂₄₀₅H₃₈₄₄N₆₅₈O₆₉₉S₁₈，相对分子质量为53 738.05，原子总数为7 624，等电点为6.02。亮氨酸(Leu)是含量最多的氨基酸，占比10.6%；甘氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)含量最低，占比0.4%。带负电荷残基数(天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu)为56，带正电荷残基数(精氨酸Arg和赖氨酸Lys)为47。脂溶性系数为103.98，亲水性平均值为0.012。在280 nm波长处，如果所有半胱氨酸残基对形成胱氨酸，则其消光系数为24 410，吸光度为0.457；如果所有半胱氨酸残基消失，则其消光系数为24 410，吸光度为0.454。CusS的不稳定系数为30.42，为稳定蛋白。

2.2 亲水性/疏水性和可溶性分析

利用ProtScale软件在线分析CusS的亲水性，亲、疏水性分别用负值、正值表示。结果显示第439位氨基酸亲水性最强，得分为−2.911；第200位氨基酸疏水性最强，得分为4.011 (图2A)。CusS的亲水性氨基酸总数多于疏水性氨基酸，为亲水性蛋白。通过Protein-Sol软件在线预测CusS的可溶性，CusS的溶解度为0.178，属于不溶性蛋白(图2B)。

2.3 跨膜域、信号肽和亚细胞定位分析

TMHMM软件预测显示CusS有跨膜域(图3A)，表明CusS是一条跨膜蛋白。SignalP软件显示其不存在信号肽(图3B)，因此推断CusS属于非分泌蛋白。LocTree3软件分析CusS的亚细胞定位，由图3C可见，CusS位于内膜中，亚细胞定位分数为100，精确度99%。基于上述预测结果表明，CusS为非分泌性蛋白，定位于细胞内膜中，在细胞内发挥作用。

2.4 CusS糖基化位点和磷酸化位点分析

利用NetNGlyc-1.0程序在线预测CusS的糖基化位点，结果表明，该蛋白含有糖基化位点2个(图4A)。这可能有助于CusS在感受到Ag⁺胁迫时，实现黏附、识别、信号转导等功能。

NetPhosBac-3.0程序在线预测CusS的磷酸化位点，结果显示其具有41个潜在的磷酸化位点(图4B)，包含24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点，3个酪氨酸磷酸化位点。其中，丝氨酸磷酸化位点位于第11、38、55、84、89、93、101、146、172、192、195、217、255、263、266、289、291、293、303、316、381、437、445和467位，苏氨酸磷酸化位点位于第24、68、75、97、111、224、391、396、403、417、462、466、472和477位，酪氨酸磷酸化位点位于第99、179、302位。CusS具有的多个磷酸化位点，使CusS容易被激活，这可能有助于其感受胞内Ag⁺。另一方面，多个磷酸化位点也能够协助CusS与CusR进行信息传递，激活CusR，提高处理Ag⁺的效率，保护胞内蛋白等结构免受伤害。

2.5 CusS二级和三级结构分析及与银离子结合位点预测

利用SOPMA软件在线预测CusS的二级结构，结果显示其具有α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)、β-转角(Tt)、无规则卷曲(Cc)，分别占比55.42%、11.67%、3.75%和29.17%。由SOPMA预测结果可知：CusS二级结构主要由螺旋和卷曲结构构成。

利用RCSB PDB软件在线构建CusS的三级结构模型，预测了CusS与银离子的结合位点(图5A、5B)。CusS对于金属底物可能具有一定的特异性。在CusS形成的3个二聚体中，每个二聚体有4个银离子结合位点(参与银离子结合的关键氨基酸残基：H42A/F43I/H176A/M133I/ M135I/H145A、pcusS-AIA-IIA等)，二聚体界面的两个对称结合位点由两个组氨酸和一个苯丙氨酸通过阳离子-π作用形成^[25]。CusS对银离子的高结合率，可能更有益于其高效运输底物，降低银离子等对细菌的毒性作用。

2.6cusS与其他基因的关系网络分析

通过STRING构建了cusS基因相互作用网络(图6)，基因之间有更多的关联，意味着它们之间的关联更紧密。发现CusS不仅与Cus其他成员组成CusCFBARS内源性外排系统，还与双组分系统BaeS、渗透调节相关的RnvZ-OmpR以及YedvW中的DNA结合转录激活因子BaeR，DNA结合转录双调节因子OmpR、YedW存在相互作用。此外，CusS与金属铜离子转运因子CueR和CueO相关联。CusS对于调控CusCFBA的表达及银离子的外排具有重要作用。

2.7cusS遗传进化关系分析

用MEGA软件构建系统进化树(图7)，结果展示了cusS在革兰阴性杆菌中的同源性。表明cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高。

2.8 ΔcusS的构建验证

为了验证cusS基因对大肠杆菌抵御银离子胁迫的重要性，利用Red同源重组构建ΔcusS菌株。在含有卡那霉素抗性的平板上共挑选10个阳性克隆进行菌落PCR验证。验证引物C1和C2在E.coli K-12无条带，在ΔcusS扩增出的目的条带是627 bp，其中第10泳道扩增出目的条带，将克隆10送一代测序，用软件Clustal Omega比对，显示cusS基因敲除菌株构建成功(图8)。

2.9cusS缺失不影响大肠杆菌正常生长

为了排除cusS基因是E.coli基础代谢所必需的，首先验证cusS基因的缺失是否影响E.coli K-12的生长活性。将E.coli K-12和ΔcusS菌株分别在常见培养基(LB、SOC、BHI和TSB)进行生长培养。结果如图9所示，E.coli K-12和ΔcusS菌株在不同培养基中的复制生长曲线无显著差异(P > 0.05)，表明cusS基因的缺失并不影响该细菌的生长活性。

2.10cusS缺失影响大肠杆菌抵御银和铜离子的能力

AgNO₃作用下，6 μg/mL的AgNO₃显著抑制WT的生长活性，4 μg/mL的AgNO₃抑制缺失株cusS的生长活性(P < 0.000 1)，CuCl₂作用下WT与缺失株cusS的生长活性无显著差异(图10)，表明cusS基因缺失对硝酸银的抗性明显减弱，由此说明CusS参与调控细菌对银离子的抗性。

2.11cusS缺失对抗生素OFL/MEM的敏感性测定

在OFL和MEM作用下，结果(图11)显示cusS缺失后细菌对OFL和MEM的敏感性不变，其最小抑菌浓度均为60 ng/mL。结合图10，表明cusS对银离子的感受性具有较高的特异性。

2.12cusS缺失对cusCFBA以及cusR转录水平影响

cusS的缺失能够明显下调cusCFBA和cusR mRNA的表达水平(图12)，表明cusS的缺失可能使CusR无法被磷酸化，继而CusR无法呈递信号给下游的CusCFBA，使得CusCFBA外排银离子的能力受损。

3 讨论与结论

收起

CusRS双组分系统对于细菌感知、响应和适应不断变化的环境十分重要。该双组分系统由控制跨包膜外排系统基因表达，参与感知外周质的金属阳离子^[32]，为细菌应对金属离子等的胁迫提供了识别感应与信号传导的基础。CusS是其中的关键蛋白，兼具感应环境信号和结合底物的双重作用。已有研究发现，cusS的突变可能促进CusS功能的获得，导致CusCFBA表达升高，增加银离子外排能力^[33]。因此，CusS的底物识别、信号传递与CusR被激活介导及CusCFBA表达，整个系统一系列蛋白之间的互作，是大肠杆菌抵御阳离子胁迫的重要保障。在这一过程中，CusS的底物识别以及信号传递是关键步骤，CusR的激活介导是实现这一过程的主要步骤，CusCFBA则是实现这一过程的主要蛋白^[34]。一系列蛋白之间的相互作用发挥着至关重要的作用，它们共同组成了一张完整的调控网络，从而确保了大肠杆菌能够抵御阳离子胁迫。由此认为，cusS上调是细菌应对周质银离子水平升高的重要手段之一。值得注意的是，因CusS在不同情况下的不同特殊表达，有必要进一步对其生物结构进行探索，以帮助研究者理解其细胞质结构域在活性与非活性状态下的不同构象^[23]，以及整个系统可能潜在的其他外排金属阳离子机制。随着CusS生物结构的深入探索，研究者们将更好地了解它的功能，并为研究它在不同情况下的特殊表达提供更多线索。

本文成功利用同源重组技术构建了大肠杆菌cusS单基因缺失株。结果显示，cusS的缺失显著提高了大肠杆菌K-12对银离子的敏感性。

CusS作为大肠杆菌应对银离子胁迫的重要外排泵，可通过调控下游基因cusCFBA及cusR的表达水平执行功能，因此认为CusS对于大肠杆菌响应银离子胁迫至关重要。CusS功能的缺失可降低CusR磷酸化水平，最终导致CusRS系统失灵，显著下调大肠杆菌抵御银离子胁迫的能力。本文进一步利用各种数据库和在线工具检索CusS蛋白的关键信息，如氨基酸组成、蛋白质结构、功能域等。以帮助我们了解CusS相关信息，便于设计下一步实验，用于深入阐述CusS蛋白在抵御银离子胁迫中的具体作用机制。根据上述实验与生物信息学分析，我们能够较好地了解CusS蛋白的结构、功能和作用机制，对深入研究Cus系统调控银离子的功能和机制提供帮助，并为解决细菌耐金属提供新靶点信息。

现如今，含银化合物产品被广泛应用于医疗、纺织品、环境净化等领域，大大地改善了人民的生活质量^[35]。病原菌中抗生素耐药性的增加正在危及抗生素的疗效，而越来越多的研究不仅证实含银化合物可有效对抗耐药菌，还有研究发现银离子可有效提高多种抗生素的治疗效率，使得含银化合物的使用越来越广泛^[36]。随着含银化合物的广泛使用，细菌则通过CusRS等重要双组分系统来调节对银离子的耐受能力^[23]。因此，深入了解银离子对病原微生物的影响及微生物双组份系统响应银离子胁迫的机制，对于设计更有效的具有选择性毒性的含银化合物，防止耐药性的发展至关重要。在未来，对于多药耐药病原体，应更谨慎地使用含银化合物或含银材料，以消除产生银耐受的可能性，并防止相关耐药基因的进一步传播。

基金

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湖北省自然科学基金(2022CFB544)

参考文献

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文献

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2024年第64卷第4期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230675

接收时间：2023-11-02
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-04-04

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收稿日期：2023-11-02
录用日期：2024-02-01

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Natural Science Foundation of Hubei Province(2022CFB544)

湖北省自然科学基金(2022CFB544)

作者信息

1 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室, 湖北宜昌 443002

2 三峡大学感染与炎症损伤研究所, 湖北宜昌 443002

3 三峡大学基础医学院, 湖北宜昌 443002

4 三峡大学第一临床医学院, 湖北宜昌 443002

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Protein	Explanation	Reference
CusA	Actively absorbs metal ions from cytoplasm and periplasm, relying on methionine residues to bind and export silver ions	[14]
CusB	CusA and CusC are connected to participate in the efflux of silver ions	[15]
CusC	Expel the silver ions from the body	[16]
CusF	It can bind to silver ions in periplasm and transport to CusB	[17]
CusR	Phosphorylated CusR mediates transcription of the efflux protein CusCBA	[18]
CusS	It binds to silver ions in the periplasm and transmits signals to its cytoplasmic kinase domain	[19]

Protein

Explanation

Reference

CusA

Actively absorbs metal ions from cytoplasm and periplasm, relying on methionine residues to bind and export silver ions

[14]

CusB

CusA and CusC are connected to participate in the efflux of silver ions

[15]

CusC

Expel the silver ions from the body

[16]

CusF

It can bind to silver ions in periplasm and transport to CusB

[17]

CusR

Phosphorylated CusR mediates transcription of the efflux protein CusCBA

[18]

CusS

It binds to silver ions in the periplasm and transmits signals to its cytoplasmic kinase domain

[19]

Primer name	Primer sequence (5′→3′)	Sequence (bp)	Purpose
H1P1和H2P2分别是构建ΔcusS的同源臂上、下游引物；C1和C2是用来验证cusS成功敲出的上、下游引物，C1位于cusS上游基因，C2位于Kana基因；rrsA-F/R是内参；cusC-F/R、cusF-F/R、cusB-F/R、cusA-F/R和cusR-F/R是qPCR引物. 下划线表示同源臂序列 H1P1 and H2P2 were the upstream and downstream primers of the homologous arm for the construction of ΔcusS, respectively. C1 and C2 were the upstream and downstream primers to verify the successful knock-in ofcusS.rrsA-F/R is the internal control,cusC-F/R,cusF-F/R,cusB-F/R,cusA-F/R, andcusR-F/R are qPCR primers. The underlined bases are homologous arm sequences.
H1P1	CCGAAGCTAATTCAGACCGTGCGCGGCGTGGGTTACATGCTTGAGGTGCCGGTTGAGCGATTGTGTAGGCTGG	73	Confirmatory deletion
H2P2	GTGACAGCTTTTTACCATTAATAGGTATGACTATTGCGGCACGTTATTTTTACACTTAACGGCTGACATGGGAA	74	Confirmatory deletion
C1	ATGACCGCTAACGTTATCGCGA	22	Validation of deletion strain
C2	ACCGCTATCAGGACATAGCGTT	22	Validation of deletion strain
rrsA-F	CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA	22	Internal reference
rrsA-R	CCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCA	24	Internal reference
cusC-F	CAGTTCTCACTCAGCCAGAACG	22	qPCR
cusC-R	ATGCGCAAATCCCGATTATTCAC	23	qPCR
cusF-F	GCAAGTCGCAATGTTCAGTCT	21	qPCR
cusF-R	ATACCCTTTACCACGCCAGTG	21	qPCR
cusB-F	GATCTGGTGCCGAAATATGCCG	22	qPCR
cusB-R	CTGACATTCGCCGGGAAACT	20	qPCR
cusA-F	GCATAAACGGCTGGAAGAGTGG	22	qPCR
cusA-R	CGACAACGTGATAATCAGCAGACT	24	qPCR
cusR-F	GGTTGCCGATTTGATGGTCGA	21	qPCR
cusR-R	CCTGATGGCGAAGGAAGAACT	21	qPCR

Primer name

Primer sequence (5′→3′)

Sequence (bp)

Purpose

H1P1和H2P2分别是构建ΔcusS的同源臂上、下游引物；C1和C2是用来验证cusS成功敲出的上、下游引物，C1位于cusS上游基因，C2位于Kana基因；rrsA-F/R是内参；cusC-F/R、cusF-F/R、cusB-F/R、cusA-F/R和cusR-F/R是qPCR引物. 下划线表示同源臂序列
H1P1 and H2P2 were the upstream and downstream primers of the homologous arm for the construction of ΔcusS, respectively. C1 and C2 were the upstream and downstream primers to verify the successful knock-in ofcusS.rrsA-F/R is the internal control,cusC-F/R,cusF-F/R,cusB-F/R,cusA-F/R, andcusR-F/R are qPCR primers. The underlined bases are homologous arm sequences.

H1P1

CCGAAGCTAATTCAGACCGTGCGCGGCGTGGGTTACATGCTTGAGGTGCCGGTTGAGCGATTGTGTAGGCTGG

Confirmatory deletion

H2P2

GTGACAGCTTTTTACCATTAATAGGTATGACTATTGCGGCACGTTATTTTTACACTTAACGGCTGACATGGGAA

Confirmatory deletion

ATGACCGCTAACGTTATCGCGA

Validation of deletion strain

ACCGCTATCAGGACATAGCGTT

Validation of deletion strain

rrsA-F

CTCTTGCCATCGGATGTGCCCA

Internal reference

rrsA-R

CCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCA

Internal reference

cusC-F

CAGTTCTCACTCAGCCAGAACG

qPCR

cusC-R

ATGCGCAAATCCCGATTATTCAC

qPCR

cusF-F

GCAAGTCGCAATGTTCAGTCT

qPCR

cusF-R

ATACCCTTTACCACGCCAGTG

qPCR

cusB-F

GATCTGGTGCCGAAATATGCCG

qPCR

cusB-R

CTGACATTCGCCGGGAAACT

qPCR

cusA-F

GCATAAACGGCTGGAAGAGTGG

qPCR

cusA-R

CGACAACGTGATAATCAGCAGACT

qPCR

cusR-F

GGTTGCCGATTTGATGGTCGA

qPCR

cusR-R

CCTGATGGCGAAGGAAGAACT

qPCR