微生物学报

Sample name	Number of OTU	Chao1 index	ACE index	Shannon index
pH 5.0	256	310.67	284.29	3.82
pH 7.0	253	273.71	273.82	4.00
pH 9.0	183	199.53	208.30	0.97

Sample name	Number of OTU	Chao1 index	ACE index	Shannon index
pH 5.0	256	310.67	284.29	3.82
pH 7.0	253	273.71	273.82	4.00
pH 9.0	183	199.53	208.30	0.97

不同pH值条件下硫酸盐还原菌组成及硫酸盐还原机制分析

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庞安冉 , 张晓丹 , 刘淼 , 刘洪艳 ^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(4): 1081-1094

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(4): 1081-1094

不同pH值条件下硫酸盐还原菌组成及硫酸盐还原机制分析

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庞安冉, 张晓丹, 刘淼, 刘洪艳^*

作者信息

天津科技大学海洋与环境学院, 天津 300457

Dominant sulfate-reducing bacteria at different pH and mechanism of sulfate reduction

Anran PANG, Xiaodan ZHANG, Miao LIU, Hongyan LIU^*

Affiliations

College of Marine and Environmental Sciences, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

出版时间: 2024-04-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230585

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摘要

收起

【目的】从海洋沉积物中富集获得硫酸盐还原菌群，改变pH值进行培养，分析pH值对硫酸盐还原性质的影响，明确菌群组成和进行硫酸盐还原功能基因预测，探究硫酸盐还原机制。【方法】分析硫酸盐还原菌群在不同pH值条件下的硫酸盐还原率，在此基础上，利用高通量测序技术和PICRUSt软件分析硫酸盐还原菌群优势菌组成及硫酸盐还原相关基因相对丰度。【结果】硫酸盐还原菌群在不同pH值培养条件下的生长和硫酸盐还原率出现显著变化(P＜0.01)，在pH 5.0时达到峰值，分别为0.34±0.01和96.52%±0.44%。高通量测序数据显示，pH 5.0时菌群丰富度和多样性最高，优势菌属为假单胞菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)，相对丰度较高的基因为同化性硫酸盐还原相关基因。【结论】硫酸盐还原菌富集生长的最适pH 5.0，在此条件下的高硫酸盐还原率由同化性硫酸盐还原途径主导，为揭示硫酸盐还原机制提供了实验支持，并拓宽了硫酸盐还原菌实践应用方面的种质资源。

关键词

硫酸盐还原菌 / pH值 / 硫酸盐还原率 / 菌群组成 / 同化性硫酸盐还原

Abstract

收起

[Objective] To analyze the influence of pH on sulfate-reducing properties of sulfate-reducing bacteria enriched from marine sediments, identify the bacterial community composition, predict the key genes of sulfate reduction, and explore the mechanism of sulfate reduction. [Methods] The sulfate reduction rates of sulfate-reducing bacteria at different pH conditions were determined. On this basis, high-throughput sequencing and PICRUSt were employed to analyze the dominant sulfate-reducing bacteria and the relative abundance of sulfate-reducing genes. [Results] The biomass (OD₆₀₀) and sulfate reduction rate of sulfate-reducing bacteria varied significantly under different pH conditions (P＜0.01) and reached their peak values (0.34±0.01 and 96.52%±0.44%, respectively) at pH 5.0. According to the high-throughput sequencing data, the abundance and diversity of bacteria were the highest at pH 5.0. The dominant bacteria werePseudomonas andBacillus, and the assimilatory sulfate reduction-related genes had higher abundance. [Conclusion] Sulfate-reducing bacteria are suitable to be enriched and cultured at pH 5.0. Under this condition, the high sulfate reduction rate is attributed to the assimilatory sulfate reduction pathway. The findings provide experimental support for revealing sulfate reduction mechanism and broaden the germplasm resources of sulfate-reducing bacteria for application.

Key words

sulfate-reducing bacteria / pH value / sulfate reduction rate / bacterial community composition / assimilatory sulfate reduction

引用本文

庞安冉, 张晓丹, 刘淼, 刘洪艳. 不同pH值条件下硫酸盐还原菌组成及硫酸盐还原机制分析. 微生物学报, 2024 , 64 (4) : 1081 -1094 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230585

Anran PANG, Xiaodan ZHANG, Miao LIU, Hongyan LIU. Dominant sulfate-reducing bacteria at different pH and mechanism of sulfate reduction[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (4) : 1081 -1094 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230585

正文

收起

硫酸盐还原是硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)将硫酸盐(SO₄²⁻)还原为亚硫酸盐(SO₃²⁻)、硫氧化物(S₂O₃²⁻)直至硫化物(S²⁻)的过程。SRB广泛存在于海水、油井和油气运输管道等厌氧环境内，能够附着于金属表面，利用金属作为电子受体进行生长代谢，从而对钢铁等金属产生腐蚀。Lan等从铺管土壤中分离到一株脱硫弧菌(Desulfovibrio sp.) Hqm3菌株，采用电化学法和扫描电镜等测试技术研究了腐蚀对镁合金的影响，发现在SRB的影响下，镁合金在滩涂环境中被腐蚀的速率高达1.31 mm/年^[1]。Zhai等采用电化学测试方法研究了不锈钢浸泡在SRB溶液中的腐蚀行为，结果表明不锈钢在含SRB溶液中的失重率增长了13倍^[2]。自然界中70%的微生物腐蚀都是SRB造成^[3]。

虽然SRB进行硫酸盐还原会对金属造成腐蚀，但其产生的硫化物因具有一定的还原性，能够与重金属离子反应，生成金属硫化物沉淀，从而有效地去除重金属污染。Mothe等采用海藻酸钠固定化的SRB可去除95%的重金属^[4]。Joo等在Fe²⁺的促进作用下，利用脱硫弧菌去除了海洋环境中的Cd、Ni和Cr等重金属离子，发现其能够将Cd、Ni几乎全部去除，且对Cr也有74.2%的去除率^[5]。Hwang等比较了SRB与矿区土样原生菌对酸性矿井水中重金属的去除效果，发现脱硫弧菌将完全去除重金属的时间缩短了1 500%^[6]。由此可见，SRB可利用细胞外的重金属为电子受体，实现有毒金属污染物的转化，在重金属污染的处理方面有一定的应用前景。

为进一步研究SRB，研究者从地下水、废水污泥、沉积物等低氧、厌氧环境中分离出了多种种属不同的SRB。陈秀云等于矿山污染水中分离出菌株YQ-1，属于梭菌科瘤胃解蛋白质菌属^[7]；杨丽平等在高浓度硫酸盐废水污泥中分离得到菌株SR 3，属于肠杆菌科柠檬酸杆属^[8]；Takahashi等^[9]和Pérez-Bernal等^[10]在微咸湖沉积物和火山口湖沉积物中分离出2株SRB，分别属于脱硫弧菌科的假脱硫弧菌属和脱硫弧菌属。由此可见，SRB并不是一个分类学意义上的名词，目前已经发现了超过60属220种的SRB^[11]，具备硫酸盐还原能力的微生物都可称之为SRB。付坤等将煤化工厌氧污泥菌群富集、分离筛选出7株SRB后发现，不同菌属的SRB的硫酸盐还原性质存在差异，其中柠檬酸杆菌属和丁酸杆菌属的SRB表现了高于其他菌株10%−20%还原能力^[12]。因此，持续研究SRB种属与硫酸盐还原性质的关系，对于拓展硫酸盐还原优势菌株的种质资源有一定的意义。

除SRB种属性质不同产生的影响外，SRB的硫酸盐还原性质同样会受到温度、碳源等多种因素的影响。陈旭等研究发现随着温度增加SRB活性增强，超过40 ℃的临界值后会影响SRB的正常生命活动^[13]。Zhao等利用硫酸盐还原率作为指标评估微生物对不同碳源的亲和性，研究发现丙酸盐在用作碳源时表现出最高的硫酸盐还原效率，其次是乳酸>乙醇>甲酸盐>d-山梨醇^[14]。pH值同样会影响SRB的硫酸盐还原性质^[15]，Kushkevych等发现脱硫弧菌Vib-7的生长及硫酸盐还原能力在pH 4.0和pH 9.0条件下产生了不同程度的抑制，且酸性条件的抑制更加明显^[16]。Suyasa等从沉积物中筛选出3株SRB，在pH 3.0时能够存活，pH 4.0−7.0时生长旺盛^[17]。由此可见，不同pH条件对SRB硫酸盐还原性质的影响存在差异^[18-19]，对于硫酸盐还原机制的研究比较有限，需进一步探索。

本文以分离自渤海海洋沉积物中的SRB富集菌群为研究对象，通过测定不同pH值下混合菌群的生长情况和硫酸盐还原率，并结合高通量测序数据分析SRB种属特征，探究pH值对SRB种属变化对于硫酸盐还原性质的影响，并通过菌群相对丰度的变化对硫酸盐还原机制进行探索。

1 材料与方法

收起

1.1 培养条件

基本培养基(g/L)：乳酸钠3.5，MgSO₄∙7H₂O 2.0，NH₄Cl 1.0，Na₂SO₄ 0.5，CaCl₂∙7H₂O 0.1，酵母浸汁1.0，121 ℃灭菌20 min。1.5 g FeSO₄∙7H₂O和0.5 g抗坏血酸预先制成无菌溶液单独加入上述培养基中。

菌培养条件：菌株按3%接种，厌氧螺口管装满培养基。pH 6.0±0.5，培养温度35 ℃。

1.2 富集与培养

以海洋沉积物作为本研究的菌源，使用基本培养基作为硫酸盐还原菌的富集培养基。准确称取10 g沉积物于烧杯中，于80 ℃热休克10 min，然后将其接种于含100 mL新鲜培养基的血清瓶中，盖好瓶塞，充氮气10 min，放置于35 ℃、150 r/min振荡培养。4 d后，测定细胞密度OD₆₀₀和硫酸盐浓度，分析其硫酸盐还原能力。重复富集培养3次。最后以细胞密度的高低及硫酸盐还原能力的大小作为富集硫酸盐还原菌群的指标。

1.3 pH对硫酸盐还原的影响

在以硫酸盐为电子受体的硫酸盐还原培养体系中，分析pH对混合菌群生长和硫酸盐还原性质的影响。SRB富集混合菌群接种于含SO₄²⁻的基本培养基中，预先调整培养液pH值分别至4.0、5.0、7.0、9.0、10.0。培养至对数期，测定菌群细胞生长数据OD₆₀₀及硫酸盐还原率，分析硫酸盐还原能力，每组实验重复3次。

1.4 菌群组成分析

准确吸取1 mL菌液于1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心5 min，留沉淀，弃上清，重复上述操作3次(菌体量为覆盖1.5 mL离心管底部为佳)。再加入500 μL TE缓冲液使其混匀，并于12 000 r/min离心5 min，留沉淀，弃上清，重复此步骤两次。采用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，具体步骤详见试剂盒说明书。确认DNA提取量及纯度满足要求后，使用细菌通用引物对，27F (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′)进PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：27F引物(10 μmol/L) 1 μL，1492R引物(10 μmol/L) 1 μL，6×Phusion MasterMix 8 μL，DNA模板1 μL，ddH₂O 39 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

使用ThermoFisher Scientific公司的Ion Plus Fragment Library Kit建库试剂盒进行文库的构建。文库经Qubit定量检测合格后，基于Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。测序得到的原始数据(raw reads)进行质控、过滤、去嵌合体，得到有效数据(clean reads)^[20]。采用UPARSE软件(UPARSE v7.0.1001)将有效序列按照相似性为97%的阈值进行可操作性分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，采用Mothur方法将OTU代表序列与SSUrRNA数据库进行比对(设定阈值为0.8−1.0)^[21]，从而得到样品的OTUs和分类谱系在门、纲、目、科和属水平上的基本分析结果。测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 测定方法

利用分光光度计测定菌液在波长600 nm处的吸光值，以此来表示菌液细胞密度。采用pH计测定pH值。细菌硫酸盐还原能力通过测定培养液中SO₄²⁻浓度的变化计算。使用硫酸钡比浊法测定SO₄²⁻浓度，菌液12 000 r/min离心5 min后取上清液0.4 mL，加入4 mL硫酸盐测定液和0.6 mL的重蒸水，最后加入3 mL BaCl₂溶液，定容至10 mL漩涡40 s，迅速转移至比色皿测定420 nm反应液吸收度，根据标准曲线计算SO₄²⁻浓度。利用PICRUSt生物软件信息包，基于Greengene数据库中OTU的tree、OTU上的基因信息构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱，根据16S rRNA基因测序数据进行基于KEGG数据库的功能预测。

2 结果与分析

收起

2.1 pH对SRB菌群生长的影响

不同pH值下SRB菌群的生长和硫酸盐还原率见图1。在设定的pH值范围内，菌群的生长指标OD₆₀₀和硫酸盐还原率存在差异，随着pH值的增加，菌群的生长和硫酸盐还原率呈现出先上升后下降的趋势。pH值为4.0时，硫酸盐还原菌群的生长指标OD₆₀₀和硫酸盐还原率均处于较低水平，表明菌群在较低pH值环境下难以利用硫酸盐作为电子受体进行生长。pH值为5.0时，细菌数量出现峰值，OD₆₀₀相较pH 4.0增长8.97倍，达到0.34±0.01，硫酸盐还原率表现出极显著增加(P＜0.001)，由11.24%±1.64%上升至96.52%±0.44%；SRB菌群在pH 7.0、pH 9.0和pH 10.0条件下的OD₆₀₀及硫酸盐还原率均显著减少(P＜0.01)，细胞生长指标OD₆₀₀比pH 5.0时分别降低27.73%、49.26%和90.86%，硫酸盐还原率分别降低31.54%、74.91%和83.82%，且硫酸盐还原率呈现与细菌生长相似的变化趋势。由此可见，实验所用SRB菌群的pH值耐受范围为5.0−9.0，在pH 5.0时，SRB菌群不仅生长指标OD₆₀₀最高，而且表现出了最佳的硫酸盐还原效率，为SRB菌群的最适pH值。

不同pH值条件下SRB菌群的生长与硫酸盐还原率存在一定相关性。如图2所示，对不同pH值下菌群的生长指标OD₆₀₀和硫酸盐还原率分别进行Boltzmann模型拟合、线性拟合和ExpDec2模型拟合分析，通过对拟合系数R²进行对比(图2)，Boltzmann模型的精确度>ExpDec2模型>线性模型。由此可见，菌群生长对硫酸盐还原率的影响符合S型曲线方程而非正相关，生长指标OD₆₀₀较低时硫酸盐还原率增长平缓，而生长指标OD₆₀₀较高时会抑制硫酸盐还原过程，这可能是由于细胞密度较低时，硫酸盐并不作为主要的电子受体参与菌体生长，而当细胞密度较高时，培养液中的硫酸盐被大部分消耗，硫酸盐还原受到限制。

2.2 SRB菌群硫酸盐还原性质

SRB菌群生长指标OD₆₀₀、硫酸盐还原率和pH值变化量情况见图3。在以硫酸盐为电子受体的培养体系中，培养的第2天，SRB菌群开始进入对数期，SRB菌群生长指标OD₆₀₀为0.06±0.01，硫酸盐还原率为10.93%±5.62%；此时培养液pH值出现小幅增长。进入对数期后，硫酸盐还原率随细胞生长逐步增加，培养液pH值在第4天出现显著增长(P＜0.001)，由5.0增长至6.89±0.11，培养至第5天，SRB菌群生长已处于稳定期，SRB菌群生长指标OD₆₀₀达到0.34±0.02，硫酸盐还原率显著增长至96.52%± 0.44% (P＜0.001)，pH值已经增长至7.67±0.05，培养至第6天，菌群生长、硫酸盐还原率和pH值变化量都出现一定程度的下降，菌群生长进入衰减期。

探究SRB菌群的生长与硫酸盐还原率和pH值变化量的相关性有助于分析pH值对SRB菌群生长和硫酸盐还原率的影响。如图4所示，SRB菌群的生长指标OD₆₀₀与硫酸盐还原率和pH值变化量的相关性同样符合Boltzmann模型。随着菌群生长，pH值相较于硫酸盐还原率更早实现快速增长，而pH值达到稳定后硫酸盐还原率快速增长。这可能是由于细胞密度较低时细胞维持生命活动消耗大量质子，使培养液中质子含量快速下降影响菌群的硫酸盐还原过程，SRB逐渐消耗质子，pH值就会随之增加，而当pH值趋于稳定后，硫酸盐还原率因为OD₆₀₀的增长而进入快速生长阶段。

2.3 pH值SRB菌群组成的影响

2.3.1 α多样性分析

实验选取pH 5.0、pH 7.0和pH 9.0这3种条件，探究SRB菌群在酸性、中性和碱性条件下的菌群组成变化。不同pH值条件下SRB菌群的物种数量(OTU)、香农多样性(Shannon)、丰富度(Chao1)和均匀度(ACE)指数见表1。pH为5.0时，SRB菌群的OTU、Shannon、Chao1及ACE指数均为较高水平。其中OTU、Chao1指数及ACE指数为最高；pH 7.0和pH 9.0条件下，SRB菌群的上述3类指标有所下降。Shannon指数在pH 5.0和pH 7.0条件下无明显差异但显著高于pH 9.0。

2.3.2 门水平组成分析

使用UniFrac算术平均的非加权分析法(non-weighted analysis of arithmetic mean, UPGMA)来分析不同pH值条件下SRB菌群组成的差异。如图5所示，99.00%以上的reads被聚类为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)、热孢菌门(Thermotogae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、互养菌门(Synergistetes)、阴沟单胞菌门(Cloacimonetes)、纤细菌门(Gracilibacteria)、蓝藻门(Cyanobcteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。门水平上的系统发育相对分析显示，随着pH的变化，SRB菌群中优势门不同。当pH值为5.0时，SRB菌群中厚壁菌门丰度最高(62.25%)，其次为变形菌门(32.88%)，覆盖SRB菌群中95.13%的物种；当pH值为7.0时，变形菌门的丰度显著升高至84.09% (P＜0.01)，同时厚壁菌门丰度显著降低为7.44% (P＜0.01)；当pH值为9.0时，变形菌门的丰度进一步增加(90.91%)。由此可见，变形菌门和厚壁菌门为SRB菌群的优势门类。随着pH值的增大，变形菌门的丰度逐渐增加，厚壁菌门的丰度下降，SRB菌群组成在门水平上产生了显著变化。

2.3.3 属水平组成分析

基于进化图中的属级丰度分布进一步分析SRB菌群的前15个优势属的特征。如图6所示，在pH值为5.0时，SRB菌群主要由厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus, 49.57%)和变形菌门的假单胞菌属(Pseudomonas, 24.77%)组成。pH值增加为7.0时，假单胞菌属丰度显著增加至70.83% (P＜0.05)；pH增加至9.0，变形菌门的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)表现极显著增长，数量达到SRB菌群总量的90.12% (P＜0.01)。由此可见，不同pH值培养条件下，SRB菌群在属水平上发生显著变化，pH 5.0时优势菌属为芽孢杆菌属和假单胞菌属。

2.4 硫酸盐还原相关基因预测

探究不同pH值条件下硫酸盐还原过程相关基因的相对丰度有助于分析硫酸盐还原机制。如图7所示，根据生成产物的不同可将硫酸盐还原过程分为同化性硫酸盐还原(assimilatory sulfate reduction, ASR)和异化性硫酸盐还原(dissimilatory sulfate reduction, DSR)。胞外硫酸盐(SO₄²⁻)在硫酸盐转运系统底物结合蛋白的介导下进入胞内，DSR途径中，SO₄²⁻在硫酸腺苷转移酶的作用下生成腺嘌呤磷酰硫酸盐(adenosine 5′-phosphosulfate, APS)，生成的APS被还原为H₂S排出胞外；而ASR途径中APS首先被活化为3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate, PAPS)，PAPS被还原为硫化物并与丝氨酸合成半胱氨酸。

根据16S rRNA基因测序数据，利用PICRUSt软件对硫酸盐还原相关基因进行筛选，SRB菌群内硫酸盐还原相关基因稳定表达。筛选出ASR相关基因(cysPUMA、sat、cysND、cysC、cysJI、cysH、cysE和cysK)和DSR相关基因(cysPUMA、sat、aprAB和dsrAB)。SRB菌群不同pH值条件下ASR和DSR基因的相对丰度如图8所示。不同pH值条件下ASR基因和DSR基因相对丰度存在差异。pH值为5.0和7.0时，ASR基因相对丰度显著高于异化型还原基因相对丰度(P＜0.01)；pH值为9.0时，DSR基因的相对丰度高于ASR基因。由此可见，在酸性或中性条件下，SRB菌群主要由ASR主导还原硫酸盐，而在碱性条件下，SRB菌群主要由DSR主导还原硫酸盐。

为进一步探究不同pH值条件下SRB菌群硫酸盐还原基因相对丰度变化的原因，将硫酸盐还原相关基因丰度与优势菌属(Bacillus、Pseudomonas)丰度进行相关性分析。如图9所示，根据相关系数，优势菌属丰度与大部分ASR相关基因(cysPUMA、sat、cysND、cysJI、cysH、cysE和cysK)丰度呈正相关，而与DSR相关基因(sat、aprAB和dsrAB)丰度呈负相关。这说明pH值为5.0的条件下，Bacillus、Pseudomonas的富集是ASR途径较为活跃的原因。

3 讨论

收起

将菌群置于不同pH值的培养条件下，从细胞生长指标OD₆₀₀和硫酸盐还原率可以看出，菌群的生长和硫酸盐还原性受到pH值不同程度的影响。相关研究表明，在低pH值条件下，天然嗜酸或驯化群体能有效去除硫酸盐^[22-23]。Panova等^[15]于金矿开采的微生物群落中分离出一株脱硫孢子菌属SRB，将其在pH 4.0−7.0条件下进行培养，结果表明在pH 5.5培养条件下生长和硫酸盐还原率达到最高。Frolov等^[24]研究pH值对菌株SRB菌株生长的影响，随着pH值的增加，菌株的生长呈现先增长后下降的趋势，pH 4.5是菌株的最适pH值。张艳梅等^[25]采用低pH冲击实验探究混合菌群在酸胁迫条件下的脱硫性能，随着pH值的降低，6种菌株按照一定比例形成的混合菌群在生长和硫酸盐还原率等方面均优于各单菌体系，当pH值降至4.5时，混合菌群能够达到90%的硫酸盐还原率，而单个菌株的硫酸盐还原受到抑制甚至无法生长。在本研究中，菌群在pH 5.0的培养条件下生长和硫酸盐还原率达到最高，表明沉积物中的菌群经过硫酸盐还原体系的富集培养后具备一定的耐酸性。

Tran等^[26]检测pH 5.0、pH 6.0和pH 7.4培养条件下SRB的硫酸盐还原率，SRB在pH 5.0和pH 6.0时保持着较高的硫酸盐还原率，而在pH 7.4时，硫酸盐还原率最大值是其他培养条件下的一半。在菌群耐受范围之内，硫酸盐还原速率受环境的质子浓度的影响。根据硫酸盐还原途径，SO₄²⁻首先消耗ATP被激活为APS，反应见公式(1)。

(1)

生成的APS在APS还原酶的作用下继续转化成SO₃²⁻和AMP，反应见公式(2)。

(2)

SO₃²⁻中硫原子拥有自由电子对，失去6个电子被还原为S²⁻，反应见公式(3)。

(3)

由此可见，硫酸盐还原是一个消耗质子的过程^[27]，较低的pH值或较高的质子浓度下，硫酸盐还原速率较高，消耗培养液中的质子使pH值上升。实验采用Postgate改良硫酸盐还原培养体系，加入抗坏血酸抗氧化剂防止培养液中SO₃²⁻被氧化影响反应结果的判断。抗坏血酸属于已糖醛基酸，解离常数pK1为4.17，在酸性条件下稳定而遇碱中和分解。张慧等^[28]探究不同pH值对抗坏血酸稳定性的影响，抗坏血酸在pH 3.0时溶液中含量最高，随着pH值的增加，抗坏血酸的含量逐渐降低，表明抗坏血酸在pH 3.0稳定性最高。由此可见，在pH 5.0的硫酸盐还原体系的培养下，抗坏血酸保持稳定性促进了硫酸盐还原的正向进行。因此，在pH值低的情况下，将更有利于硫酸盐还原过程的进行。但SRB菌群对于pH值存在耐受范围。Tran等^[26]将含有SRB物种的富营养人工海水培养基在37 ℃、pH值为4.0−7.4的条件下进行培养，发现pH为4.0时细菌由于环境pH过低生长极缓，且硫产量几乎为零。本实验中，pH 4.0的培养条件下，菌群生长和硫酸盐还原都受到抑制。这表明，pH值过低会使部分细菌受到冲击而无法正常地利用硫酸盐作为电子供体进行生长代谢。

本实验中，对SRB菌群在pH 5.0、pH 7.0和pH 9.0下的菌群组成变化进行分析，根据高通量测序数据显示，pH 5.0培养条件下的SRB菌群物种数量最多，并呈现较高的丰富度和多样性。SRB菌群在pH 5.0的培养条件下优势菌属为厚壁菌门芽孢杆菌属和变形菌门假单胞菌属。相关研究表明，两类菌属具有硫酸盐还原能力和酸性环境的适应性。Akinpelu等^[29]利用以芽孢杆菌为主的微生物群落处理硫酸盐含量较高的酸性矿山废水，在pH 5.6培养条件下的生物反应器中硫酸盐还原率达到85%，实验结果表明，芽孢杆菌对于极端酸性pH环境具有足够的适应性。Nguyen等^[30]从酸性硫酸盐土壤中分离出VNW02、TLS06、VNW64和VNS89四株沼泽红假单胞菌，在pH 4.5和pH 5.0的培养条件下能够以硫酸盐作为电子受体保持硫酸盐的还原性质，且能还原Al³⁺、Fe²⁺等重金属。

硫酸盐还原途径根据生成产物的不同，一般可分为DSR和ASR还原两种^[31]。DSR以硫酸盐为电子受体，将硫酸根还原为H₂S气体；ASR以硫酸盐为电子受体，生成亚硫酸盐后与胞内色氨酸结合形成半胱氨酸并固定在蛋白质中，相较于异化还原途径减少了H₂S有毒气体的排出^[3]。许多研究发现，ASR在不同环境下往往是较为活跃的硫酸盐还原途径^[32-33]。Li等^[34]对不同pH值条件下油藏中微生物的硫酸盐还原相关基因进行预测后发现，cys基因即ASR途径基因丰度较高，ASR相关基因在所有pH值培养条件下均可表达，而DSR相关基因在酸性条件下表达量较低。Li等^[35]发现，在低硫酸盐环境下，DSR占优势，随着硫酸盐的增加，在高硫酸盐环境下，ASR最终取代DSR成为主要的硫酸盐还原途径。本研究中，对硫酸盐还原有关基因进行预测注释，结果表明在pH 5.0的培养条件下，ASR基因丰度高于DSR基因，SRB菌群在pH 5.0条件下的高硫酸盐还原效率的形成是由ASR途径所主导。ASR最终产物半胱氨酸为抗氧化剂谷胱甘肽的前体，谷胱甘肽对于维持细菌中的氧化还原稳态是至关重要的^[36]，同时酸性条件更有利于保持谷胱甘肽的稳定性^[37]，这可能是SRB菌群在pH 5.0培养条件下ASR途径突出和生长量最高的原因，在pH 5.0的培养条件下，SRB菌群主要进行ASR生成谷胱甘肽前体物质半胱氨酸维持氧化还原稳态，并为菌群的生长提供良好条件。

在硫酸盐还原培养体系中，SRB菌群能够在pH 5.0条件下保持较高的生长量和硫酸盐还原率，这为利用硫酸盐还原解决如酸性矿山废水等重金属污染问题提供了新型解决方案。实验所用SRB菌群在酸性条件下以ASR为主要硫酸盐还原途径，在保持高硫酸盐还原效率的同时能够减少H₂S的排出，扩宽了环境友好型环境微生物的种质资源，经过驯化后具有一定的环境微生物生物制剂的应用前景。

4 结论

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SRB菌群分离自海洋沉积物，在硫酸盐还原培养体系中，菌群能够以硫酸盐为电子受体进行硫酸盐还原。SRB菌群在不同pH值培养条件下生长和硫酸盐还原率呈现先增长后下降的趋势，pH 5.0时生长和硫酸盐还原率均极显著增长(P＜0.001)并达到峰值，分别为0.34±0.01和96.52%±0.44%。菌群生长和硫酸盐还原率、pH值变化量之间符合Boltzmann模型，pH值先于硫酸盐还原率实现快速增长。根据高通量测序数据分析，菌群在pH 5.0培养条件下的丰富度和多样性最高，优势菌属为厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus)和变形菌门的假单胞菌属(Pseudomonas)。利用PICRUSt软件对硫酸盐还原相关基因进行预测，不同pH值培养条件下，SRB菌群硫酸盐还原相关基因的相对丰度有所差别。pH 5.0时ASR相关基因的活跃表达是硫酸盐还原率最高的重要原因。研究结果可拓宽SRB种质资源，为SRB在微生物环境治理方面的应用提供实验支持，进一步推动微生物硫酸盐还原机制研究进程。

基金

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国家自然科学基金(41606157)

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2024年第64卷第4期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230585

接收时间：2023-09-14
首发时间：2026-03-19
出版时间：2024-04-04

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收稿日期：2023-09-14
录用日期：2023-12-21

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National Natural Science Foundation of China(41606157)

国家自然科学基金(41606157)

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天津科技大学海洋与环境学院, 天津 300457

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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