微生物学报

Domains	Functions	Conserved motifs	Active sites	References
SAT	Choose acetyl-CoA as the starting unit and load it into KSvia ACP	G₁₂₉XC₁₃₁XG₁₃₃	Cys₁₃₁	[38]
KS	Extend polyketide intermediates by decarboxylation condensation	D₈₀PQXRXML₈₇, G₁₅₄P(G/S)₁₅₆, D₁₆₀TACSSS₁₆₆, G₂₂₃YCRGE₂₂₈, E₂₉₆AHGTGTXVGDP₃₀₇, G₃₂₉SVKGLXGHTE₃₃₉	Cys₁₆₃, His₂₉₈, His₃₃₇	[39]
AT	Choose malonyl-CoA as the extension unit and load it into ACP	G₈₄HSXG₈₈	Ser₈₆	[40]
PT	Catalyze C2–C7 regiospecific monocyclization	H₂₆X9P₃₆, D₂₀₉X3QX6N₂₂₀	His₂₆, Asp₂₀₉	[41]
ACP	Activate and shuttle substrates	G₂₇XDSL₃₁	Ser₃₀	[42-43]
CMeT	Add one or more methyl groups from S-adenosylmethionine to α-C of the acceptor substrate	I₂₁₁LEMGXGXGG₂₂₀, E₂₃₇YTXTDL(A/S)₂₄₄, M₂₆₁KFX3(D/N)IE₂₆₉, Q₂₈₀HX3AXNXVH₂₉₀, S₂₉₈TX6LR₃₀₇, D₃₀₉GFLXXLEM₃₁₇	Tyr₁₇₈, His₂₉₀, Glu₃₁₆	[15,44]
R	Catalyze the NAD(P)H-dependent reductive release	G₃ATGSLG₉, V₂₅VCXNR₃₀, V₁₄₂GYYPL₁₄₇, G₁₆₈YXXAK₁₇₃, F₁₉₁XPM₁₉₄, G₂₃₄XLSWXP₂₄₀	Tyr₁₆₉, Lys₁₇₃	[45-46]

Domains	Functions	Conserved motifs	Active sites	References
SAT	Choose acetyl-CoA as the starting unit and load it into KSvia ACP	G₁₂₉XC₁₃₁XG₁₃₃	Cys₁₃₁	[38]
KS	Extend polyketide intermediates by decarboxylation condensation	D₈₀PQXRXML₈₇, G₁₅₄P(G/S)₁₅₆, D₁₆₀TACSSS₁₆₆, G₂₂₃YCRGE₂₂₈, E₂₉₆AHGTGTXVGDP₃₀₇, G₃₂₉SVKGLXGHTE₃₃₉	Cys₁₆₃, His₂₉₈, His₃₃₇	[39]
AT	Choose malonyl-CoA as the extension unit and load it into ACP	G₈₄HSXG₈₈	Ser₈₆	[40]
PT	Catalyze C2–C7 regiospecific monocyclization	H₂₆X9P₃₆, D₂₀₉X3QX6N₂₂₀	His₂₆, Asp₂₀₉	[41]
ACP	Activate and shuttle substrates	G₂₇XDSL₃₁	Ser₃₀	[42-43]
CMeT	Add one or more methyl groups from S-adenosylmethionine to α-C of the acceptor substrate	I₂₁₁LEMGXGXGG₂₂₀, E₂₃₇YTXTDL(A/S)₂₄₄, M₂₆₁KFX3(D/N)IE₂₆₉, Q₂₈₀HX3AXNXVH₂₉₀, S₂₉₈TX6LR₃₀₇, D₃₀₉GFLXXLEM₃₁₇	Tyr₁₇₈, His₂₉₀, Glu₃₁₆	[15,44]
R	Catalyze the NAD(P)H-dependent reductive release	G₃ATGSLG₉, V₂₅VCXNR₃₀, V₁₄₂GYYPL₁₄₇, G₁₆₈YXXAK₁₇₃, F₁₉₁XPM₁₉₄, G₂₃₄XLSWXP₂₄₀	Tyr₁₆₉, Lys₁₇₃	[45-46]

Mr-PksPT/Mr-PksCT	Coverage (%)	Identity (%)	RMSD (Å)
SAT	99	41.90	0.811
KS	100	70.53	0.270
AT	100	54.31	0.513
PT	100	41.75	0.676
ACP₁/ACP	98	48.48	1.299
ACP₂/ACP	76	33.33	1.214
CMeT	96	51.77	0.725
R	100	59.18	0.450
PksPT/PksCT	98	50.23	12.426

Mr-PksPT/Mr-PksCT	Coverage (%)	Identity (%)	RMSD (Å)
SAT	99	41.90	0.811
KS	100	70.53	0.270
AT	100	54.31	0.513
PT	100	41.75	0.676
ACP₁/ACP	98	48.48	1.299
ACP₂/ACP	76	33.33	1.214
CMeT	96	51.77	0.725
R	100	59.18	0.450
PksPT/PksCT	98	50.23	12.426

Properties	PksPT		PksCT
ICs_total	99	84		68	117
ICs_charged/charged	3	7	5	8
ICs_charged/polar	11	7	9	8
ICs_charged/apolar	14	23	16	21
ICs_polar/polar	5	0	2	13
ICs_apolar/polar	29	12	18	36
ICs_apolar/apolar	37	35	18	31
NIS_apolar (%)	40.37	38.85	38.61	41.72
BA (kcal/mol)	−12.2	−10.0	−10.7	−12.2
K_D (mol/L)	1.2×10⁻⁹	4.9×10⁻⁸	1.4×10⁻⁸	1.2×10⁻⁹

Properties	PksPT		PksCT
ICs_total	99	84		68	117
ICs_charged/charged	3	7	5	8
ICs_charged/polar	11	7	9	8
ICs_charged/apolar	14	23	16	21
ICs_polar/polar	5	0	2	13
ICs_apolar/polar	29	12	18	36
ICs_apolar/apolar	37	35	18	31
NIS_apolar (%)	40.37	38.85	38.61	41.72
BA (kcal/mol)	−12.2	−10.0	−10.7	−12.2
K_D (mol/L)	1.2×10⁻⁹	4.9×10⁻⁸	1.4×10⁻⁸	1.2×10⁻⁹

基于AlphaFold 2和分子对接探讨非还原型聚酮合酶的碳甲基化程序

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廖世玉 ¹^,² , 刘庆培 ³ , 陈福生 ¹^,²^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(1): 143-160

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(1): 143-160

基于AlphaFold 2和分子对接探讨非还原型聚酮合酶的碳甲基化程序

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廖世玉¹^,², 刘庆培³, 陈福生¹^,²^,^*

作者信息

1 华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室, 湖北武汉 430070

2 华中农业大学食品科学与技术学院, 湖北武汉 430070

3 中南民族大学药学院, 湖北武汉 430070

C-methylation programming of non-reducing polyketide synthases: based on AlphaFold 2 and molecular docking

Shiyu LIAO¹^,², Qingpei LIU³, Fusheng CHEN¹^,²^,^*

Affiliations

1 National Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

2 College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

3 School of Pharmaceutical Sciences, South-Central Minzu University, Wuhan 430070, Hubei, China

出版时间: 2024-01-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230338

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摘要

收起

【目的】探讨非还原型聚酮合酶(non-reducing polyketide synthase, NR-Pks)的碳甲基化程序差异的原因。【方法】以红色红曲菌(Monascusruber) M7中红曲色素和桔霉素的NR-Pks为研究对象，采用生物信息学方法和AlphaFold 2软件，分析了这两种NR-Pks及其各结构域的序列和结构差异。再基于分子对接等技术，比较了它们的碳甲基转移酶结构域(C-methyltransferase domain, CMeT)分别与其他结构域及其中间产物的结合特征。【结果】两种NR-Pks各结构域的序列和结构相似性高，但其整体结构差异大，表明碳甲基化差异可能源于结构域互作差异。进一步分析发现，桔霉素Pks的CMeT比红曲色素Pks的更容易结合携带底物的酰基载体蛋白结构域(acyl carrier protein, ACP)，使其中间产物更容易受到CMeT催化。CMeT和β-酮酰基合成酶结构域(β-ketosynthase domain, KS)相比，与甲基受体底物的结合自由能更低。【结论】NR-Pks中的CMeT能通过与KS竞争，从而影响其产物的碳甲基化程度。研究结果为Pks的碳甲基化程序研究提供了新思路。

关键词

非还原型聚酮合酶 / 红曲菌 / 碳甲基转移酶 / AlphaFold 2 / 分子对接

Abstract

收起

[Objective] To explore the reasons for differences in the C-methylation programming of non-reducing polyketide synthases (NR-Pkss).[Methods] We used bioinformatics tools and AlphaFold 2 to compare the domain sequences and structures of the NR-Pkss involved in the synthesis ofMonascus pigment and citrinin inMonascus ruber M7, i.e., Mr-PksPT and Mr-PksCT. Furthermore, we employed molecular docking to compare the binding of C-methyltransferase domains (CMeTs) with other domains and the intermediates of the two NR-Pkss.[Results] The large differences of the overall structure and the high similarity of domain sequence and structure between the two NR-Pkss suggested that the differences of C-methylation programming between NR-Pkss may be resulted from domain interactions. The CMeT of Mr-PksCT was more likely to bind to the acyl carrier protein (ACP) carrying the substrate than that of Mr-PksPT, making the intermediate more easily catalyzed by CMeT. Moreover, CMeT had lower binding free energy to methyl receptor substrate than theβ-ketosynthase domain (KS).[Conclusion] The CMeTs of NR-Pkss can affect the C-methylation of the products by competing with KS. The findings provide a new idea for the study of C-methylation programming of Pkss.

Key words

non-reducing polyketide synthase / Monascus spp. / C-methyltransferase / AlphaFold 2 / molecular docking

引用本文

廖世玉, 刘庆培, 陈福生. 基于AlphaFold 2和分子对接探讨非还原型聚酮合酶的碳甲基化程序. 微生物学报, 2024 , 64 (1) : 143 -160 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230338

Shiyu LIAO, Qingpei LIU, Fusheng CHEN. C-methylation programming of non-reducing polyketide synthases: based on AlphaFold 2 and molecular docking[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (1) : 143 -160 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230338

正文

收起

真菌迭代Ⅰ型聚酮合酶(iterative type Ⅰ polyketide synthase, Pks)是包含多个结构域的复合酶^[1]。它以乙酰或/和丙二酰等为底物，通过重复利用其不同结构域，逐步延伸碳链长度，形成聚酮化合物(polyketide, Pk)^[2]。根据Pks结构域的不同，可分为非还原型Pks (non-reduced Pks, NR-Pks)、部分还原型Pks (partially reduced Pks)和高度还原型Pks (highly reduced Pks)^[3-4]。其中，NR-Pks的基本结构域通常包括起始单元酰基载体蛋白转酰酶(starter unit: acyl-carrier protein transacylase, SAT)、β-酮酰基合成酶(β-ketosynthase, KS)、酰基转移酶(acyl transferase, AT)、产物模板(product template, PT)和酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)^[3,5]。有些NR-Pks还包括碳甲基转移酶(C-methyltransferase, CMeT)，以及释放结构域——硫酯酶(thioesterase)、克莱森环化酶(Claisen cyclase)或者还原酶(reductase, R)^[6-7]。

红曲色素(Monascus pigments, MPs)和桔霉素(Citrinin, CIT)是由红曲菌(Monascus spp.)和青霉(Penicillium spp.)等丝状真菌产生的典型PK^[8-11]。合成MPs的Pks (Pks of MPs, PksPT)和CIT的Pks (Pks of CIT, PksCT)均属于NR-Pks，它们的结构域组成完全一致，且产生的第一个游离PK均为苯甲醛类(benzaldehyde, BA)化合物^[12-13]，但BA甲基化程度不同，PksPT产生的BA仅甲基化1次而PksCT的甲基化3次[PksPT和PksCT的结构域组成和产物结构等数据已提交到国家微生物科学数据中心(National Microbial Data Center, NMDC)，见NMDCX0000225中的图S1]^[10,14]。

天然产物的甲基化是其结构和功能等多样性形成的重要机理之一^[15]。根据甲基受体原子的不同，甲基化可分为氧甲基化、氮甲基化、碳甲基化和硫甲基化^[16]。PksPT和PksCT产生的BA的甲基化均发生在碳原子上，所以属于碳甲基化。关于Pks产物(指Pks产生的第一个游离产物，下同)的碳甲基化过程目前认为是发生在碳链的延长过程中，而不是发生在PK产物从Pks上释放之后^[17-18]。Storm等^[17]通过对PksCT结构域的解构和重组实验发现，PksCT产物BA的碳甲基化仅发生在碳链延伸过程中，且碳链延伸离不开正确的碳甲基化。随后，他们通过对来自紫色红曲菌(M.purpureus)的PksCT (Q65Z23)、短密青霉(Penicillium brevicompactum)的MpaC (F1DBA9)、黑曲霉(Aspergillus niger)的DtbA^[7]，以及构巢曲霉(A.nidulans)的PkeA (Q5AUX7)、AusA (Q5ATJ7)和PkbA (Q5AZ32)，共6种NR-Pks的CMeT结构域交换和体外酶学等实验发现，CMeT浓度高低可调控产物的碳甲基化程度，并发现产物甲基化程度可能与Pks中间产物碳链延伸过程中CMeT与KS结构域的动力学平衡(竞争性)相关^[18]。在洛伐他汀(lovastatin) Pks (一种高度还原型Pks)产物的甲基化研究中也发现，Pks产物的甲基化程度可能也与CMeT和酮基还原酶(ketoreductase, KR)之间竞争性相关^[19]。但是甲基化具体机理目前仍不清楚。

以上关于Pks产物甲基化的研究都是通过对CMeT的蛋白晶体结构分析等获得的。由于CMeT等蛋白晶体及其结构信息等的获得非常繁琐且困难，所以到目前为止(2023年4月底)在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中已公布的Pks的CMeT晶体结构信息仅为11个，其中来自丝状真菌的只有4个(见NMDCX0000225中的表S1)，这在很大程度上限制了关于Pks的CMeT在Pks产物甲基化过程中作用的深入研究。非常幸运的是，最近采用AlphaFold 2软件预测蛋白质的三维结构取得了长足进步，采用AlphaFold 2预测蛋白质结构的技术位也被列2021年“十大科学突破进展”之首^[20]。目前AlphaFold 2预测的蛋白质结构数据库(AlphaFold protein structure database, AlphaFold DB)已包含了超过2亿个蛋白质的预测结构^[21-22]。此外，分子对接(molecular docking)技术是研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合自由能的一种理论模拟方法，常用于计算机辅助药物设计领域^[23]。采用AlphaFold 2软件结合分子对接技术，可以很好地分析蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质的结合特征等^[24-27]。

尽管关于PksCT产物BA的碳甲基化程序(只有延伸碳链的特定位置才可以发生碳甲基化)已有相关的研究报道^[17]，但与PksCT同属于NR-Pks，结构域组成完全相同(图S1)，产物也为BA的PksPT的碳甲基化程序，以及PksCT和PksPT产物的甲基化差异等目前还未见相关研究报道。因此，本研究首先以生物信息学方法，对真菌中的PksPT和PksCT分别进行了聚类分析，并对PksPT和PksCT的结构域组成和氨基酸序列的保守性进行了比较，然后以AlphaFold 2预测和分析了红色红曲菌M7的PksPT和PksCT (Mr-PksPT和Mr-PksCT)及其各结构域的三维结构。在此基础上，以分子对接与自由能评估，比较了Mr-PksPT和Mr-PksCT在碳链延伸过程中的中间产物与CMeT和KS结构域等的结合效率，探讨了Mr-PksPT和Mr-PksCT产物的碳甲基化差异的形成机理，并提出了Mr-PksPT和Mr-PksCT产物BA的形成过程。

1 材料与方法

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Pks系统发育树的构建：采用MEGA 7.0软件^[28]，基于邻接法构建来自真菌且分别与Mr-PksPT和Mr-PksCT同源的PksPT和PksCT的系统发育树。建树的检验方法为步长检验，检验次数设定为1 000次。

Pks保守结构域的预测：利用InterPro 92.0^[29]对文中涉及的PksPT和PksCT进行保守结构域的预测。

结构域的多序列比对：采用Geneious 10.2.2软件^[30]对PksPT和PksCT中各结构域进行多序列比对。

蛋白质三维结构预测：利用AlphaFold 2^[21]对PksPT和PksCT及其各结构域进行蛋白质三维结构预测。

分子对接：采用Schrödinger 12.8软件中的Glide XP进行分子对接，再进一步通过Prime MM/GBSA进行结合自由能计算。

蛋白质对接：利用ZDOCK 3.0.2^[31]进行蛋白质对接，再进一步通过Prodigy^[32]对蛋白质复合物进行特性分析。

蛋白质三维结构可视化：Pymol 2.5.4 (https://pymol.org/#download)。

2 结果与分析

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2.1 PksPT和PksCT的比较分析

2.1.1 PksPT和PksCT的聚类分析

基于红色红曲菌M7中Mr-PksPT和Mr-PksCT的氨基酸序列，以BLASTp对NCBI数据库中截至2023年4月已发布的4 415株真菌基因组(包括16株已公布的红曲菌基因组)和本实验室已完成测序还未公布的5株红曲菌基因组(表S2，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)，进行同源性比对，分别发现了106条和73条Mr-PksPT与Mr-PksCT的同源序列(identity > 50%, coverage > 90%,E-value=0) (表S3和S4，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)。它们的系统发育树见图1。

由图1A可知，PksPT主要存在于红曲菌、篮状菌(Talaromece spp.)、炭团菌(Hypoxylon spp.)和球孢子菌(Coccidioides spp.)等真菌中。其系统发育树包括3个分支，第Ⅰ分支包含MPs主要生产菌株红曲菌、篮状菌和曲霉(Aspergillus spp.)^[9,12,33]；第Ⅱ分支和第Ⅲ分支主要包括球炭团菌、孢子菌和木霉菌(Trichoderma spp.)，与MPs主要生产菌株在生物分类学中关系较远^[12,34]。每个分支中又可进一步分为不同的亚分支。其中，21株红曲菌以100%的置信度聚集于Ⅰ₁亚分支，而谢瓦氏曲霉(A.chevalieri)一个菌株单独位于I₃亚分支。由图1B可知，PksCT主要存在于红曲菌、青霉菌和曲霉等真菌中。其系统发育树包括4个分支，第Ⅰ分支包括74条PksCT序列中的64条，红曲菌、青霉菌和曲霉等CIT的主要生产菌株均位于第Ⅰ分支中^[10,35-36]。第Ⅰ分支又可下分为不同亚分支。其中，13株红曲菌以95%的置信度聚集于Ⅰ₁亚分支，而其他8株红曲菌中不存在PksCT的同源基因(表S5，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)。第Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ分支包含的PksCT序列均较少，菌株主要为木霉菌、假裸囊菌(Pseudogymnoascus spp.)等真菌，与CIT主要生产菌株的亲缘关系较远。

上述聚类分析结果表明，不同红曲菌PksPT的起源(来源)可能相同，而红曲菌PksCT的起源可能存在差异。

2.1.2 红曲菌中PksPT和PksCT结构域和氨基酸序列的保守性分析

根据红曲菌的PksPT和PksCT (Ms-PksPT和Ms-PksCT)，分别与红色红曲菌M7中Mr-PksPT和Mr-PksCT序列相比较的覆盖度(coverage)、一致性(identity)和氨基酸数量(length)的异同，将21条Ms-PksPT和13条Ms-PksCT分别分为5类(Ms-PksPT 1−5)和5类(Ms-PksCT 1−5)，其中，Mr-PksPT和Mr-PksCT分别包含在Ms-PksPT1和Ms-PksCT1中(见NMDCX0000225中的表S6和S7)。各类Ms-PksPT和Ms-PksCT的结构域见图2。

由图2可知，Ms-PksPT和Ms-PksCT的结构域组成均为SAT-KS-AT-PT-(ACP)n-CMeT-R (Ms-PksPT中n=2，PksCT中n=1)。但在Ms-PksPT中，Ms-PksPT5缺少SAT结构域，理论上其不能合成MPs^[5]，值得进一步研究。另外，Ms-PksPT均含有2个串联ACP，串联ACP可能具有更高的MPs合成效率^[37]。对于Ms-PksCT，除Ms-PksCT2、Ms-PksCT3和Ms-PksCT5没有SAT结构域外，其他Ms-PksCT的结构域组成相同。

由表1可知，进一步对Ms-PksPT 1−5和Ms-PksCT 1−5中各结构域的氨基酸数量(表S8，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)、保守氨基酸序列(基序)和活性位点(图S2，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)进行比较。其中，只有Ms-PksCT3的释放结构域R的氨基酸数量偏小，其余所有的Ms-PksPT和Ms-PksCT各结构域之间的氨基酸数量差异不明显。此外，Ms-PksPT和Ms-PksCT中SAT结构域的保守氨基酸序列均为G₁₂₉XC₁₃₁XG₁₃₃，活性位点为半胱氨酸，氨基酸侧链为巯基；KS结构域的保守氨基酸序列均为motif Ⅰ−Ⅵ，活性位点为催化三联体Cys₁₆₃-His₂₉₈-His₃₃₇；AT结构域的保守氨基酸序列均为G₈₄HSXG₈₈，活性位点为丝氨酸，氨基酸侧链为羟基；PT结构域的保守氨基酸序列均为motif Ⅰ−Ⅱ，活性位点为His₂₆和Asp₂₀₉；ACP结构域的保守氨基酸序列均为G₂₇XDSL₃₁，是磷酸泛酰巯基乙胺的结合位点，活性位点是丝氨酸；CMeT结构域的保守氨基酸序列均为motif Ⅰ−Ⅵ，是S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的结合位点，活性位点为催化三联体Tyr₁₇₈-His₂₉₀-Glu₃₁₆；R结构域的保守氨基酸序列均为motif Ⅰ−Ⅵ，是NAD(P)H结合位点，活性位点为Tyr₁₆₉和Lys₁₇₃。

总之，Ms-PksPT和Ms-PksCT各结构域之间的保守氨基酸序列和活性位点相同。

2.1.3 Mr-PksPT和Mr-PksCT及其结构域的三维结构预测与相似性比较分析

蛋白质三维结构的相似性常采用均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)值来衡量，RMSD值越小则相似性越高。通常如果2个蛋白质结构之间的RMSD值小于2 Å，则可认为2个蛋白质的差异不明显，相似性好^[47]。采用AlphaFold 2软件分别对红色红曲菌M7的Mr-PksPT和Mr-PksCT及其结构域的三维结构进行预测(图S3，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)，并通过RMSD值对三维结构相似性进行了比较(表2)。

由表2可知，Mr-PksPT和Mr-PksCT中各结构域比较的RMSD值均小于2 Å，说明PksPT和PksCT中各结构域的三维结构差异不明显，但是Mr-PksPT和Mr-PksCT整体三维结构比较的RMSD值为12.426 Å，远远大于2 Å，表明Mr-PksPT和Mr-PksCT的三维结构之间差异明显。这也说明Mr-PksPT和Mr-PksCT三维结构之间的差异主要可能源于结构域之间的位置分布和相互作用等，而不是结构域本身的三维结构^[48]。这表明Mr-PksPT和Mr-PksCT产物的碳甲基化差异，可能与它们的CMeT和KS对ACP上中间产物(底物)的竞争力大小以及各结构域之间的互作相关。

2.2 基于结构域互作和分子对接等分析Mr-PksPT和Mr-PksCT的碳甲基化程序

2.2.1 基于结构域互作比较Mr-PksPT和Mr-PksCT的碳甲基化程序

蛋白质间的静电相互作用、互作界面的残基连接(inter-residue contacts, ICs)以及非互作表面(non-interacting surface, NIS)残基性质等均是影响蛋白质相互作用的主要因素^[49-51]，而蛋白质互作的强弱常用结合亲和力(binding affinity, BA)或者平衡解离常数(equilibrium dissociation constant, K_D)来描述^[32]。影响Mr-PksPT和Mr-PksCT产物甲基化程序的结构域(蛋白质)主要包括ACP、KS和CMeT^[18]，所以首先通过静电势能图，分析比较了Mr-PksPT和Mr-PksCT的ACP、KS和CMeT结构域的表面电荷差异，结果见图3。

由图3可知，Mr-PksCT的CMeT结构域的底物结合口袋入口表面(图3B)比Mr-PksPT的(图3A)带有更多正电荷，且Mr-PksCT的ACP结构域底物结合口袋的入口表面(图3B)比Mr-PksPT的(图3A)带有更多带负电荷，根据正负电荷相互吸引的原理，Mr-PksCT的CMeT与其ACP更容易结合。也就是说从ACP和CMeT结构域底物结合口袋入口处所带的电荷看，Mr-PksCT产物的甲基化比Mr-PksPT的具有更高的效率。但是，PksPT和PksCT的KS结构域底物结合口袋入口表面均带电性弱，所以基于静电相互作用的Mr-PksCT和Mr-PksPT的ACP与其对应的KS结构域的结合情况，还有待进一步研究。

进一步以蛋白质-蛋白质复合物的结合亲和力预测工具Prodigy^[32]，分别对Mr-PksPT和Mr-PksCT中KS-ACP和CMeT-ACP相互作用的ICs、NIS残基性质、BA与K_D等蛋白复合物的结合特性进行了分析(表3)。其中，ICs类型主要包括带电/带电、带电/极性、带电/非极性、极性/极性、非极性/极性和非极性/非极性连接等。

由表3可知，Mr-PksPT中KS-ACP互作比Mr-PksCT中互作的BA和K_D都更小，表明Mr-PksPT中KS-ACP互作时形成的蛋白质复合物更稳定，也就说明Mr-PksPT中ACP比Mr-PksCT中的更容易与其对应的KS发生相互作用。其原因包括Mr-PksPT中KS-ACP复合物的残基间连接数更多，以及非互作表面的非极性残基百分比更大。同理，Mr-PksCT中CMeT-ACP互作比Mr-PksCT中互作的BA和K_D都更小，表明Mr-PksCT中CMeT-ACP互作时形成的蛋白质复合物更稳定，也就说明Mr-PksCT中ACP比Mr-PksPT中的更容易与其对应的CMeT发生相互作用。其原因包括Mr-PksCT中CMeT-ACP复合物的残基间连接数更多，以及非互作表面的非极性残基百分比更大。其中，ACP与KS、CMeT互作的主要连接残基类型为非极性/非极性和极性/非极性连接，而Mr-PksPT中CMeT-ACP的极性/非极性连接较少，带电/非极性连接较多。此外，CMeT-ACP互作的确比KS-ACP互作有更多的带电残基参与，与图3中对KS底物结合口袋入口处表面电荷少故带电残基连接少的推测一致。

2.2.2 基于分子对接分析Mr-PksPT和Mr-PksCT的碳甲基化程序

分子对接是研究蛋白质-底物相互作用的有力工具^[52]。影响Mr-PksPT和Mr-PksCT产物碳甲基化程序的分子对接包括CMeT与甲基供体底物SAM的互作，以及CMeT与KS竞争性与Pks产物的互作^[18-19]。红色红曲菌M7中Mr-PksPT和Mr-PksCT的CMeT结构域的三维结构均可被分为N-端连接、N-端亚结构域和C-端亚结构域(图4)。C-端亚结构域有一个罗曼斯折叠，用于结合S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)，包括7个标准的β-折叠和分布于两侧的α-螺旋，属于Ⅰ类甲基转移酶^[15]。位于C-端亚结构域的核心插入部分构成底物连接口袋的底部。N-端亚结构域为一个未表征的螺旋折叠，像一个盖子覆盖在底物结合口袋上方，发挥底物选择作用^[17,53]。

将Mr-PksPT和Mr-PksCT的CMeTs结构域分别与甲基供体底物SAM进行分子对接。Mr-PksPT CMeT中的Asp₂₆₂对应Mr-PksCT CMeT中的Asn₂₆₀，与SAM的腺嘌呤基团形成氢键。Mr-PksPT CMeT中的Asp₂₃₇对应Mr-PksCT CMeT中的Asp₂₃₅，与SAM的核糖羟基部分形成氢键^[15]。Mr-PksPT CMeT中的Thr₂₁₆对应Mr-PksCT CMeT中的Thr₂₁₄，与SAM的甲硫氨酸中的氧原子和氮原子形成氢键且后者能形成更多(图5A、5B)。由于Mr-PksCT CMeT能与SAM形成更多的氢键，推测其更容易与SAM结合。

再进一步通过分子力学/广义波恩表面积(molecular mechanics/generalized Born surfacearea, MM/GBSA)自由能计算方法预测结合自由能^[54]，Mr-PksCT CMeT与SAM的结合自由能为−45.66 kcal/mol，小于PksPT CMeT与SAM的结合自由能−37.53 kcal/mol，与上述依据氢键数量推测Mr-PksCT CMeT更容易结合SAM的结论相符，也就说明其更容易将SAM上的甲基转移到聚酮化合物中间体的α-C上。此外，Mr-PksPT CMeT的底物空腔体积被预测为809.79 Å³，深度为24.01 Å，而Mr-PksCT CMeT的底物空腔体积为683.39 Å³，深度为21.95 Å^[55]，Mr-PksPT的CMeT有一个更大和更深的底物空腔，与能够催化比PksCT CMeT更长的聚酮链的事实一致。

进一步将Mr-PksPT和Mr-PksCT的CMeT和KS结构域分别与甲基受体底物即Pks中间产物进行分子对接，再通过MM/GBSA自由能计算方法预测结合自由能(图6)。

由图6B可知，Mr-PksCT的CMeT与第一轮延伸底物、第二轮延伸底物和第三轮底物的结合自由能分别为−40.74、−46.90、−49.77 kcal/mol，均小于Mr-PksCT的KS与对应底物的结合自由能。假设若底物与某一结构域的结合自由能更小，便会优先选择与其结合并发生反应，则根据假设所得的Mr-PksCT的碳甲基化程序如图6B所示，与Storm等^[17]提出的PksCT的碳甲基化程序一致，说明此假设较为合理。于是再将此假设用于分析Mr-PksPT的碳甲基化程序。由图6A可知，Mr-PksPT的CMeT与第四轮延伸后底物的结合自由能为−47.86 kcal/mol，小于Mr-PksPT的KS与对应底物的结合自由能，而与其余底物的结合自由能均大于Mr-PksPT的KS与对应底物的结合自由能，故推测Mr-PksCT的唯一一次碳甲基化发生在第四轮延伸后(图6A)，推测结果与已知的产物结构一致。

基于上述分析得到的碳甲基化程序，提出了PksPT和PksCT产生第一个游离产物的过程(图7)。SAT选择乙酰辅酶A作为起始单元，通过ACP转移乙酰基底物到KS。AT选择丙二酰辅酶A作为延伸单元，通过ACP转移丙二酰底物与KS上的乙酰基发生克莱森缩合反应以进行碳链延伸。之后，PksPT会在4轮延伸后进行碳甲基化修饰；而PksCT在前3轮延伸后均发生碳甲基化修饰。再分别进行一次延伸，PT环化，最后由R还原释放。

此外，由于Mr-PksPT和Mr-PksCT的CMeTs分别对特定底物有显著较小的结合自由能，推测CMeT能特异性识别底物，而PksPT和PksCT产物碳甲基化差异可能就是源于各自CMeT能特异性识别的底物存在差异^[19,56]。Mr-PksPT和Mr-PksCT KS与合成过程中所有酰基底物的结合自由能都始终稳定在较低水平，CMeT只有在识别特异性底物时才具有较小的结合自由能且比KS与该底物的结合自由能更小，以方便底物选择与CMeT结合并发生反应，进一步体现了CMeT与KS在产物合成过程中的竞争关系^[18-19]。

3 讨论与结论

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甲基化是天然产物中常见的现象，但其机理仍不清楚。本文以红色红曲菌M7基因组中结构域组成相同，产物均为BA但甲基化程度不同的2个NR-Pks——Mr-PksPT和Mr-PksCT为研究对象，通过AlphaFold 2预测Pks及其结构域的三维结构，并结合分子对接技术和结合自由能分析，表明Pks的CMeT结构域通过与KS结构域的竞争，从而影响Mr-PksPT和Mr-PksCT产物BA的甲基化程度。

基于Mr-PksPT和Mr-PksCT的聚类、结构域及其氨基酸序列保守性及其结构域的三维结构的相似性比较分析发现，尽管它们的聚类(图1)、结构域组成(图2)及其氨基酸序列保守性(表1)与结构域三维结构的相似性(表2)等非常相似，但是Mr-PksPT和Mr-PksCT三维结构的RMSD值为12.426 Å (表2)，远远大于2 Å，相似性很差，表明Mr-PksPT和Mr-PksCT产生BA的甲基化程度差异应该是由CMeT参与的结构域互作的差异决定的。随后，采用分子对接结合自由能分析表明，影响Mr-PksPT和Mr-PksCT产物BA甲基化程度的是由Pks的CMeT与KS结构域对Pks中间产物的竞争性决定的，并提出了Mr-PksPT和Mr-PksCT产生BA的形成过程(图7)。

目前，关于Pks的CMeT结构域的三维结构信息及其功能都是通过对CMeT结构域晶体的信息获得的，由于蛋白晶体及其结构信息的获得繁琐且困难，所以截至2023年1月底在PDB蛋白质数据库PDB中已公布的Pks的CMeT晶体结构信息仅为11个(表S1，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)。最近，采用AlphaFold 2软件预测蛋白质及其结构域的三维结构信息取得了长足进步，截至2022年12月采用AlphaFold 2已成功预测超过2亿个蛋白质三维结构^[21-22]，包括至少29 240个甲基转移酶结构域(methyltransferase, MT)的三维结构，其中许多通过AlphaFold 2预测的结构与实验结构的一致性好且常被用于科学研究(表S9，见国家微生物科学数据中心，编号NMDCX0000225)^[57-58]。本文在研究过程中，比较了通过蛋白质结晶获得的来自红曲菌PksCT的CMeT的三维结构(PDB ID: 5MPT)^[17]与采用AlphaFold 2预测的红曲菌PksCT的CMeT的三维结构结果(见NMDCX0000225中的图S4)，发现两者的RMSD值仅为0.391Å，远远小于2Å，表明二者的一致性好，这也表明本文采用AlphaFold 2预测的Pks及其结构域的结果是可靠的。

通过分析Mr-PksPT和Mr-PksCT的ACP、KS和CMeT结构域的表面电荷差异发现，这些结构域的表面电荷，特别是底物结合口袋入口表面电荷的差异(图3)影响着KS和CMeT对Pks中间产物的竞争性，从而决定着Pks产物BA的甲基化程度。为此，尝试这改变KS和CMeT结构域的底物结合口袋入口处的活性氨基酸组成，以调整表面电荷，从而有望产生不同甲基化程度的Pks产物。例如，Mr-PksCT的CMeT中主要参与底物结合口袋入口表面的带电连接的残基包括Lys₇₈、Lys₂₄₆、Arg₁₆₄，将这3个主要的正电荷残基全部突变为性质相似且不带电残基Gln。突变后的CMeT (CMeT_Q)理论上能由于口袋入口表面的正电荷减少，将减少与入口表面带负电荷的ACP相互作用的机会，从而改变C甲基化程度。于是，进一步对CMeT_Q进行分析，Mr-PksCT的CMeT_Q与CMeT三维结构的RMSD值为0.434，表明突变前后的三维结构相似。且MrPksCT中CMeT_Q-ACP互作的结合亲和力为−10.3 kcal/mol，与Mr-PksPT中CMeT-ACP互作的结合亲和力相似，说明该突变的确能降低Mr-PksCT中CMeT与KS竞争性与ACP互作的优势，以至于降低产物的甲基化效率，从而可能改变Mr-PksCT产物的甲基化程度。

综上所述，红色红曲菌M7中Mr-PksPT和Mr-PksCT产物BA的甲基化程度差异是由CMeT结构域与KS结构域的竞争造成的。并基于结合自由能分析，提出了Mr-PksPT和Mr-PksCT产物BA的合成过程。最后提出了通过改造Mr-PksCT的CMeT从而改变Mr-PksCT产物BA甲基化程度的建议。本研究结果希望能为Pks的碳甲基化研究提供新思路并为设计Pks产物的碳甲基化提供方向。

基金

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国家自然科学基金(31730068)
国家自然科学基金(31330059)

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文献

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2024年第64卷第1期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230338

接收时间：2023-05-13
首发时间：2026-03-18
出版时间：2024-01-04

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收稿日期：2023-05-13
录用日期：2023-08-28

基金

National Natural Science Foundation of China(31730068)

国家自然科学基金(31730068)

National Natural Science Foundation of China(31330059)

国家自然科学基金(31330059)

作者信息

1 华中农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室, 湖北武汉 430070

2 华中农业大学食品科学与技术学院, 湖北武汉 430070

3 中南民族大学药学院, 湖北武汉 430070

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Domains	Functions	Conserved motifs	Active sites	References
SAT	Choose acetyl-CoA as the starting unit and load it into KSvia ACP	G₁₂₉XC₁₃₁XG₁₃₃	Cys₁₃₁	[38]
KS	Extend polyketide intermediates by decarboxylation condensation	D₈₀PQXRXML₈₇, G₁₅₄P(G/S)₁₅₆, D₁₆₀TACSSS₁₆₆, G₂₂₃YCRGE₂₂₈, E₂₉₆AHGTGTXVGDP₃₀₇, G₃₂₉SVKGLXGHTE₃₃₉	Cys₁₆₃, His₂₉₈, His₃₃₇	[39]
AT	Choose malonyl-CoA as the extension unit and load it into ACP	G₈₄HSXG₈₈	Ser₈₆	[40]
PT	Catalyze C2–C7 regiospecific monocyclization	H₂₆X9P₃₆, D₂₀₉X3QX6N₂₂₀	His₂₆, Asp₂₀₉	[41]
ACP	Activate and shuttle substrates	G₂₇XDSL₃₁	Ser₃₀	[42-43]
CMeT	Add one or more methyl groups from S-adenosylmethionine to α-C of the acceptor substrate	I₂₁₁LEMGXGXGG₂₂₀, E₂₃₇YTXTDL(A/S)₂₄₄, M₂₆₁KFX3(D/N)IE₂₆₉, Q₂₈₀HX3AXNXVH₂₉₀, S₂₉₈TX6LR₃₀₇, D₃₀₉GFLXXLEM₃₁₇	Tyr₁₇₈, His₂₉₀, Glu₃₁₆	[15,44]
R	Catalyze the NAD(P)H-dependent reductive release	G₃ATGSLG₉, V₂₅VCXNR₃₀, V₁₄₂GYYPL₁₄₇, G₁₆₈YXXAK₁₇₃, F₁₉₁XPM₁₉₄, G₂₃₄XLSWXP₂₄₀	Tyr₁₆₉, Lys₁₇₃	[45-46]

Domains

Functions

Conserved motifs

Active sites

References

SAT

Choose acetyl-CoA as the starting unit and load it into KSvia ACP

G₁₂₉XC₁₃₁XG₁₃₃

Cys₁₃₁

[38]

Extend polyketide intermediates by decarboxylation condensation

D₈₀PQXRXML₈₇, G₁₅₄P(G/S)₁₅₆, D₁₆₀TACSSS₁₆₆, G₂₂₃YCRGE₂₂₈, E₂₉₆AHGTGTXVGDP₃₀₇, G₃₂₉SVKGLXGHTE₃₃₉

Cys₁₆₃, His₂₉₈, His₃₃₇

[39]

Choose malonyl-CoA as the extension unit and load it into ACP

G₈₄HSXG₈₈

Ser₈₆

[40]

Catalyze C2–C7 regiospecific monocyclization

H₂₆X9P₃₆, D₂₀₉X3QX6N₂₂₀

His₂₆, Asp₂₀₉

[41]

ACP

Activate and shuttle substrates

G₂₇XDSL₃₁

Ser₃₀

[42-43]

CMeT

Add one or more methyl groups from S-adenosylmethionine to α-C of the acceptor substrate

I₂₁₁LEMGXGXGG₂₂₀, E₂₃₇YTXTDL(A/S)₂₄₄, M₂₆₁KFX3(D/N)IE₂₆₉, Q₂₈₀HX3AXNXVH₂₉₀, S₂₉₈TX6LR₃₀₇, D₃₀₉GFLXXLEM₃₁₇

Tyr₁₇₈, His₂₉₀, Glu₃₁₆

[15,44]

Catalyze the NAD(P)H-dependent reductive release

G₃ATGSLG₉, V₂₅VCXNR₃₀, V₁₄₂GYYPL₁₄₇, G₁₆₈YXXAK₁₇₃, F₁₉₁XPM₁₉₄, G₂₃₄XLSWXP₂₄₀

Tyr₁₆₉, Lys₁₇₃

[45-46]

Mr-PksPT/Mr-PksCT	Coverage (%)	Identity (%)	RMSD (Å)
SAT	99	41.90	0.811
KS	100	70.53	0.270
AT	100	54.31	0.513
PT	100	41.75	0.676
ACP₁/ACP	98	48.48	1.299
ACP₂/ACP	76	33.33	1.214
CMeT	96	51.77	0.725
R	100	59.18	0.450
PksPT/PksCT	98	50.23	12.426

Mr-PksPT/Mr-PksCT

Coverage (%)

Identity (%)

RMSD (Å)

SAT

41.90

0.811

100

70.53

0.270

100

54.31

0.513

100

41.75

0.676

ACP₁/ACP

48.48

1.299

ACP₂/ACP

33.33

1.214

CMeT

51.77

0.725

100

59.18

0.450

PksPT/PksCT

50.23

12.426

Properties	PksPT		PksCT
ICs_total	99	84		68	117
ICs_charged/charged	3	7	5	8
ICs_charged/polar	11	7	9	8
ICs_charged/apolar	14	23	16	21
ICs_polar/polar	5	0	2	13
ICs_apolar/polar	29	12	18	36
ICs_apolar/apolar	37	35	18	31
NIS_apolar (%)	40.37	38.85	38.61	41.72
BA (kcal/mol)	−12.2	−10.0	−10.7	−12.2
K_D (mol/L)	1.2×10⁻⁹	4.9×10⁻⁸	1.4×10⁻⁸	1.2×10⁻⁹

Properties

PksPT

PksCT

KS-ACP

CMeT-ACP

KS-ACP

CMeT-ACP

ICs_total

117

ICs_charged/charged

ICs_charged/polar

ICs_charged/apolar

ICs_polar/polar

ICs_apolar/polar

ICs_apolar/apolar

NIS_apolar (%)

40.37

38.85

38.61

41.72

BA (kcal/mol)

−12.2

−10.0

−10.7

−12.2

K_D (mol/L)

1.2×10⁻⁹

4.9×10⁻⁸

1.4×10⁻⁸

1.2×10⁻⁹