微生物学报

Experimental No.	Phanerochaete chrysosporium	Coriolus versicolor	Lentinus sajor-caju	Pleurotus ostreatus	Pb²⁺ removal rate (%)
1	0.250	0.250	0.250	0.250	29.37±0.15
2	0.125	0.625	0.125	0.125	35.83±0.67
3	0.125	0.125	0.625	0.125	32.89±0.89
4	0.125	0.125	0.125	0.625	27.10±0.21
5	0.625	0.125	0.125	0.125	21.92±0.37
6	1.000	0.000	0.000	0.000	36.12±0.09
7	0.000	1.000	0.000	0.000	39.23±0.17
8	0.000	0.000	1.000	0.000	37.29±0.23
9	0.000	0.000	0.000	1.000	28.39±0.81
10	0.500	0.500	0.000	0.000	32.26±0.34
11	0.500	0.000	0.500	0.000	34.33±0.14
12	0.500	0.000	0.000	0.500	18.81±0.26
13	0.000	0.500	0.500	0.000	48.23±0.31
14	0.000	0.500	0.000	0.500	33.94±0.42
15	0.000	0.000	0.500	0.500	30.21±0.10

Experimental No.	Phanerochaete chrysosporium	Coriolus versicolor	Lentinus sajor-caju	Pleurotus ostreatus	Pb²⁺ removal rate (%)
1	0.250	0.250	0.250	0.250	29.37±0.15
2	0.125	0.625	0.125	0.125	35.83±0.67
3	0.125	0.125	0.625	0.125	32.89±0.89
4	0.125	0.125	0.125	0.625	27.10±0.21
5	0.625	0.125	0.125	0.125	21.92±0.37
6	1.000	0.000	0.000	0.000	36.12±0.09
7	0.000	1.000	0.000	0.000	39.23±0.17
8	0.000	0.000	1.000	0.000	37.29±0.23
9	0.000	0.000	0.000	1.000	28.39±0.81
10	0.500	0.500	0.000	0.000	32.26±0.34
11	0.500	0.000	0.500	0.000	34.33±0.14
12	0.500	0.000	0.000	0.500	18.81±0.26
13	0.000	0.500	0.500	0.000	48.23±0.31
14	0.000	0.500	0.000	0.500	33.94±0.42
15	0.000	0.000	0.500	0.500	30.21±0.10

Volume ratios	Removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
1:3	13.19±0.66d	16.33±0.48c	21.50±0.35b	26.71±0.33c	30.80±0.32c	35.34±0.32c	36.11±0.36c	37.20±0.43c
1:2	11.52±0.96c	17.63±0.58c	25.10±0.24a	29.89±0.53b	33.41±0.28b	36.00±0.38c	38.16±0.74b	38.54±0.09b
1:1	23.14±0.04a	24.92±0.72a	25.32±0.44a	31.60±0.20a	38.17±0.08a	41.51±0.88a	43.42±0.94a	46.80±0.22a
2:1	17.38±0.66b	19.17±0.98b	22.27±0.55b	27.00±0.58c	31.92±0.78c	37.81±0.18b	38.91±0.44b	39.20±0.58b
3:1	6.33±0.24e	9.51±0.32d	12.71±0.21c	16.77±0.61d	21.31±0.82d	27.54±0.12d	30.79±0.76d	31.34±0.29d

Volume ratios	Removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
1:3	13.19±0.66d	16.33±0.48c	21.50±0.35b	26.71±0.33c	30.80±0.32c	35.34±0.32c	36.11±0.36c	37.20±0.43c
1:2	11.52±0.96c	17.63±0.58c	25.10±0.24a	29.89±0.53b	33.41±0.28b	36.00±0.38c	38.16±0.74b	38.54±0.09b
1:1	23.14±0.04a	24.92±0.72a	25.32±0.44a	31.60±0.20a	38.17±0.08a	41.51±0.88a	43.42±0.94a	46.80±0.22a
2:1	17.38±0.66b	19.17±0.98b	22.27±0.55b	27.00±0.58c	31.92±0.78c	37.81±0.18b	38.91±0.44b	39.20±0.58b
3:1	6.33±0.24e	9.51±0.32d	12.71±0.21c	16.77±0.61d	21.31±0.82d	27.54±0.12d	30.79±0.76d	31.34±0.29d

Experimental No./Factors	SA mass concentration (g/L)	Biochar mass concentration (g/L)	White rot fungus spore volume (×10⁶ CFU/mL)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
k₁ means Pb²⁺ removal rate of SA at different factor levels;k₂ means Pb²⁺ removal rate of white-rot fungus at different factor levels;k₃ means Pb²⁺ removal rate of biochar at different factor levels.R means measures of variation byk₁,k₂ andk₃. The larger theR, the more effect of a change of that factor on the indicator for that experiment, means the more important the factor is; Conversely, the smaller theR, the less important the factor. Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05). /: No data (except “/” in parentheses).
1	15.0	10.0	1.5	86.65±0.16b
2	15.0	15.0	2.0	90.42±0.35a
3	15.0	20.0	2.5	83.07±0.01c
4	20.0	10.0	2.5	90.54±0.56a
5	20.0	15.0	2.0	90.63±0.74a
6	20.0	20.0	1.5	89.59±0.21b
7	25.0	10.0	2.5	84.21±1.47c
8	25.0	15.0	1.5	86.99±0.83b
9	25.0	20.0	2.0	87.29±0.82a
k₁/%	80.34	86.39	85.66	/
k₂/%	85.34	88.14	89.98	/
k₃/%	79.16	84.73	86.61	/
R/%	6.18	3.41	4.32	/

Experimental No./Factors	SA mass concentration (g/L)	Biochar mass concentration (g/L)	White rot fungus spore volume (×10⁶ CFU/mL)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
k₁ means Pb²⁺ removal rate of SA at different factor levels;k₂ means Pb²⁺ removal rate of white-rot fungus at different factor levels;k₃ means Pb²⁺ removal rate of biochar at different factor levels.R means measures of variation byk₁,k₂ andk₃. The larger theR, the more effect of a change of that factor on the indicator for that experiment, means the more important the factor is; Conversely, the smaller theR, the less important the factor. Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05). /: No data (except “/” in parentheses).
1	15.0	10.0	1.5	86.65±0.16b
2	15.0	15.0	2.0	90.42±0.35a
3	15.0	20.0	2.5	83.07±0.01c
4	20.0	10.0	2.5	90.54±0.56a
5	20.0	15.0	2.0	90.63±0.74a
6	20.0	20.0	1.5	89.59±0.21b
7	25.0	10.0	2.5	84.21±1.47c
8	25.0	15.0	1.5	86.99±0.83b
9	25.0	20.0	2.0	87.29±0.82a
k₁/%	80.34	86.39	85.66	/
k₂/%	85.34	88.14	89.98	/
k₃/%	79.16	84.73	86.61	/
R/%	6.18	3.41	4.32	/

Projects	Specific treatments	Mechanical strengths (mN)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
Crosslinking time	0.5 h	1 531±47.49e	90.45±1.77b
1 h	1 944±64.40d	93.32±0.55a
2 h	2 024±44.92c	89.85±1.59b
3 h	2 103±85.02b	75.55±1.62c
4 h	2 388±41.54a	73.33±2.15d
Storage methods	Freezing	2 054±64.23d	80.67±0.51c
0.2 mol/L NaH₂PO₄ in saturated boric acid	2 411±45.41b	83.54±1.03b
Humid and refrigeration	2 326±06.43c	84.34±1.27b
Refrigeration in 5 mg/L Pb²⁺ wastewater	2 513±56.65a	91.44±1.35a
SiO₂ and zeolite addition	Without SiO₂ and modified zeolite	2 294±31.46c	71.50±2.96c
No SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 321±36.32b	84.65±1.79b
10 g SiO₂ added, no modified zeolite	2 362±42.68a	85.65±0.47b
10 g SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 376±12.54a	92.12±1.68a

Projects	Specific treatments	Mechanical strengths (mN)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
Crosslinking time	0.5 h	1 531±47.49e	90.45±1.77b
1 h	1 944±64.40d	93.32±0.55a
2 h	2 024±44.92c	89.85±1.59b
3 h	2 103±85.02b	75.55±1.62c
4 h	2 388±41.54a	73.33±2.15d
Storage methods	Freezing	2 054±64.23d	80.67±0.51c
0.2 mol/L NaH₂PO₄ in saturated boric acid	2 411±45.41b	83.54±1.03b
Humid and refrigeration	2 326±06.43c	84.34±1.27b
Refrigeration in 5 mg/L Pb²⁺ wastewater	2 513±56.65a	91.44±1.35a
SiO₂ and zeolite addition	Without SiO₂ and modified zeolite	2 294±31.46c	71.50±2.96c
No SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 321±36.32b	84.65±1.79b
10 g SiO₂ added, no modified zeolite	2 362±42.68a	85.65±0.47b
10 g SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 376±12.54a	92.12±1.68a

Indicators	Results
Load capacity (CFU/mL)	(5.48±0.02)×10⁶
True density (g/L)	1.376±0.013
Bulk density (g/L)	0.782±0.001
Water content multiplication (%)	52.40±2.46
Water content (%)	1.10±0.04
Specific surface area (m²/g)	332.89±4.23
Diameter(cm)	0.413±0.028
Broken ratio (%)	39.71±1.24
Transmissibility (%)	79.44±3.09

Indicators	Results
Load capacity (CFU/mL)	(5.48±0.02)×10⁶
True density (g/L)	1.376±0.013
Bulk density (g/L)	0.782±0.001
Water content multiplication (%)	52.40±2.46
Water content (%)	1.10±0.04
Specific surface area (m²/g)	332.89±4.23
Diameter(cm)	0.413±0.028
Broken ratio (%)	39.71±1.24
Transmissibility (%)	79.44±3.09

Item	C (%)	H (%)	N (%)	O (%)	H/C	O/C	(N+O)/C
BC means native biochar; MB-SA means biochar containing sodium alginate; MB-Bas means biochar containing saturated boric acid solution; MB-SiO₂ means biochar containing SiO₂.
BC	68.21	3.22	1.24	17.91	0.047	0.26	0.28
MB-SA	56.44	3.12	0.64	14.21	0.055	0.25	0.26
MB-Bas	45.58	2.18	0.77	9.45	0.049	0.21	0.22
MB-SiO₂	43.20	2.25	0.79	11.76	0.052	0.27	0.29

Item	C (%)	H (%)	N (%)	O (%)	H/C	O/C	(N+O)/C
BC means native biochar; MB-SA means biochar containing sodium alginate; MB-Bas means biochar containing saturated boric acid solution; MB-SiO₂ means biochar containing SiO₂.
BC	68.21	3.22	1.24	17.91	0.047	0.26	0.28
MB-SA	56.44	3.12	0.64	14.21	0.055	0.25	0.26
MB-Bas	45.58	2.18	0.77	9.45	0.049	0.21	0.22
MB-SiO₂	43.20	2.25	0.79	11.76	0.052	0.27	0.29

Experimental No.	Before biosorption (cm⁻¹)	After biosorption (cm⁻¹)	Types of functional groups
Number 1−9 indicates the characteristic absorption peaks of different functional group; − means not observed.
1	3 735	−	−NH₂
2	3 412	3 401	−OH
3	2 938	−	−CH₂
4	2 360	2 356	−PH
5	2 325	2 319	−PH
6	1 644	1 641	−C=O
7	1 376	−	−CH₃
8	1 104	1 102	−C–O
9	616	−	Metal−O

Experimental No.	Before biosorption (cm⁻¹)	After biosorption (cm⁻¹)	Types of functional groups
Number 1−9 indicates the characteristic absorption peaks of different functional group; − means not observed.
1	3 735	−	−NH₂
2	3 412	3 401	−OH
3	2 938	−	−CH₂
4	2 360	2 356	−PH
5	2 325	2 319	−PH
6	1 644	1 641	−C=O
7	1 376	−	−CH₃
8	1 104	1 102	−C–O
9	616	−	Metal−O

混合白腐真菌的固定化及其在治理铅污染废水中的应用

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毛轩雯 , 李逸雯 , 姜小羽 , 王颜和 , 吴楠 , 蒋云杰 , 刘粤 , 游薇 , 王婷舒 , 肖茵翠 , 方芳 , 刘鹏 ^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(1): 283-302

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(1): 283-302

混合白腐真菌的固定化及其在治理铅污染废水中的应用

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毛轩雯, 李逸雯, 姜小羽, 王颜和, 吴楠, 蒋云杰, 刘粤, 游薇, 王婷舒, 肖茵翠, 方芳, 刘鹏^*

作者信息

浙江师范大学生命科学学院植物学实验室, 浙江金华 321004

Immobilization of mixed white rot fungi and it application in the treatment of lead-contaminated wastewater

Xuanwen MAO, Yiwen LI, Xiaoyu JIANG, Yanhe WANG, Nan WU, Yunjie JIANG, Yue LIU, Wei YOU, Tingshu WANG, Yincui XIAO, Fang FANG, Peng LIU^*

Affiliations

Botany Laboratory, College of Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China

出版时间: 2024-01-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230427

文章导航

摘要

收起

【目的】为缓解重金属废水污染对全球食品安全和人类健康的威胁，降低铅(plumbum, Pb)在土壤及动植物体内的积累，借助固定化技术提高菌株的重金属去除效率。【方法】以白腐真菌(white rot fungi)为实验材料，通过混菌兼容性及铅离子(Pb²⁺)去除能力筛选出吸附效果好且兼容性优的复合菌种，探究最优混菌类型及其比例，优化菌球最佳固定化助剂配方，在此基础上深入探究菌球在实际应用中的最优吸附条件。【结果】黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、云芝(Coriolus versicolor)、凤尾菇(Lentinus sajor-caju)和平菇(Pleurotus ostreatus) 4种菌株兼容效果佳，可进行后续实验；其中云芝和凤尾菇以体积1:1混合后对Pb²⁺去除效果显著优于各单菌作用；固定化条件优化实验中，20.0 g/L海藻酸钠、15.0 g/L生物炭和2.0×10⁶个/mL白腐真菌组成混菌体系，辅以二氧化硅及沸石制得的固定化菌球在96 h Pb²⁺去除率为90.63%，且制得的固定化菌球机械强度高，耐受机械剪切力强；环境条件优化实验中，固定化菌球投加量为8.35 g/L、pH 5.64时，96 h Pb²⁺去除率可达97.45%；本固定化菌球吸附-解吸-再吸附后可重复利用7次并保持高效Pb²⁺去除能力。【结论】固定化白腐真菌混合菌株相较传统的单菌处理方式能够显著提高微生物利用率及含铅废水处理效率，在适宜的条件下短时间内可极大程度吸附废水中的Pb²⁺，减轻重金属污染物造成的环境生态威胁，因此将固定化白腐真菌混合菌株应用于重金属废水修复领域对推进环境保护事业具有重要意义。

关键词

铅污染 / 白腐真菌 / 混菌固定化 / 胞外聚合物组分变化

Abstract

收起

[Objective] To mitigate the threat of heavy metal pollution in wastewater to global food safety and human health, reduce the accumulation of lead (Pb) in soil, plants, and animals, and improve the removal rate of heavy metals by immobilizing microbial strains.[Methods] We carried out mixed strain test to select the white rot fungal strains with strong Pb²⁺ removal effects and excellent compatibility and explored the optimal strains and ratio for combination. Furthermore, we optimized the formula of the fungal strain composite and explored the optimal adsorption conditions of the composite in application.[Results] Phanerochaete chrysosporium,Coriolus versicolor,Lentinus sajor-caju, andPleurotus ostreatus with good compatibility were selected for subsequent experiments.C.versicolor mixed withL.sajor-caju at a volume ratio of 1:1 outperformed the single strains in removing Pb²⁺. The fungal strain composite composed of 20.0 g/L sodium alginate, 15.0 g/L biochar, 2.0×10⁶ CFU/mL white rot fungi, silica, and zeolite showed the Pb²⁺ removal rate of 90.63% within 96 h. Moreover, this composite had higher mechanical strength and strong resistance to mechanical shear. At the addition amount of 8.35 g/L and pH 5.64, the composite demonstrated the Pb²⁺ removal rate of 97.45% within 96 h. Moreover, this composite can be reused 7 times after adsorption-desorption-readsorption and maintained high Pb²⁺ removal capacity.[Conclusion] The immobilized white rot fungal strain composite can significantly improve the microbial utilization rate and wastewater treatment efficiency compared with single strains. It can greatly adsorb Pb²⁺ in wastewater under appropriate conditions within a short time and reduce the environmental threat caused by heavy metal pollutants. Therefore, the promotion of environmental protection greatly benefits from the use of immobilized mixed white rot fungal strains in the treatment of heavy metal-contaminated wastewater.

Key words

lead pollution / white rot fungi / immobilization of mixed fungi / component variations of extracellular polymeric substances

引用本文

毛轩雯, 李逸雯, 姜小羽, 王颜和, 吴楠, 蒋云杰, 刘粤, 游薇, 王婷舒, 肖茵翠, 方芳, 刘鹏. 混合白腐真菌的固定化及其在治理铅污染废水中的应用. 微生物学报, 2024 , 64 (1) : 283 -302 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230427

Xuanwen MAO, Yiwen LI, Xiaoyu JIANG, Yanhe WANG, Nan WU, Yunjie JIANG, Yue LIU, Wei YOU, Tingshu WANG, Yincui XIAO, Fang FANG, Peng LIU. Immobilization of mixed white rot fungi and it application in the treatment of lead-contaminated wastewater[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (1) : 283 -302 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230427

正文

收起

随着化工工业的持续发展，全国范围内的废水排放量逐年增加，其中，铅(plumbum, Pb)污染情况尤为严重^[1]。废水中的铅多以离子化合物状态存在，铅离子(Pb²⁺)被土壤吸收后不仅会加重土壤的酸化程度，而且经食物链传递后进入人体，会产生腹泻、贫血等症状^[2]，此外由于生物无法代谢Pb²⁺，使其成为永久性重金属污染^[3]。目前，主要利用物理吸附技术、离子交换技术和微生物修复技术等进行含铅废水的处理^[4]。其中物化修复技术具有操作简便、设备要求低等优点，但易产生二次污染，且难以处理痕量重金属废水。而微生物修复法因其具有经济性突出、处理效果佳及环境友好程度高等优势^[5]，在重金属废水治理中具有较大应用前景。

白腐真菌(white rot fungi)是一类可以降解和利用植物木质素，引起木质腐烂的白色丝状真菌集合体^[6]。研究发现，白腐真菌具有独特的重金属吸附能力，其主要吸附方式是通过产生胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)^[7]，利用其中携带的特殊官能团(羧基、磷酰基、硫酸酯基、氨基和酰胺基等)上电负性较大的原子与重金属离子在细胞表面形成络合物或螯合物，而使废水中的重金属被吸附^[8]。因此，国内外现多利用白腐真菌与重金属的互作形式进行有机污水的治理，但目前应用或研究的白腐真菌以单一菌株为主，较少涉及多种白腐真菌复合处理废水的效果探究。此外，在利用游离微生物处理废水的过程中，常采取振荡、搅拌等措施以提高营养物质及氧气的传质效率，但此过程中易产生机械剪切力，致使微生物胞外酶失活和反应体系关闭，从而影响其吸附性能^[9]，结合固定化载体能够有效提高菌体的稳定性和重复利用性。

固定化是利用特定的技术手段将游离微生物固定于载体限定的空间区域，被认为是目前制备稳定高效的生物反应器的最有效的手段之一^[10]。将真菌固定在复合载体上可以形成稳定的吸附剂，具有一定的抗冲击负荷能力，避免了真菌的流失和不稳定性带来的问题。同时，固定化技术还能够提高吸附剂的机械强度和耐受性，在有效保证菌体自然生长和运作的同时，调控生物量在反应体系中的合理分布，能够适应复杂的应用条件^[11]。目前固定化方法以吸附法、交联法、包埋法为主，其中包埋法因其条件温和、密度高、稳定性好和增殖速度较快，是固定化的首选方法^[12]。包埋法的固定效果主要由载体决定，现有研究表明，生物炭可通过其多孔性固定较多的微生物，对其分泌的EPS具有聚合作用，从而充分发挥基质中微生物的吸附能力^[13]。海藻酸钠(sodium alginate, SA)则凭借其高传质性、强抗分解性的优势，进一步提升菌球机械强度，显著提高菌的存活率，同时其表面携带基团对保持微生物的长时净水效果具有帮助^[14]，综合两者优势可最大程度发挥固定化效果。张晓晓^[15]发现固定化技术虽然可减少外界环境对白腐真菌形态的影响，但在一定程度上会减小菌种净水的有效面积，从而影响其处理效果。因此，为同时保持固定化菌球的活性与稳定性，需要进一步探究SA、生物炭的质量浓度与白腐真菌孢子量的最佳比例，以及从多因素水平探寻制备固定化菌球最佳环境条件。基于以上背景，本研究选取白腐真菌中重金属吸附能力较强的黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、云芝(Coriolus versicolor)、凤尾菇(Lentinus sajor-caju)和平菇(Pleurotus ostreatus)作为目标菌株，以Pb²⁺去除率为最终指标，探究最优净水混菌类型及其比例，并优化固定化菌球最佳固定化配方，致力于提高微生物的利用率以及含铅废水处理效率，以期为重金属废水的治理及微生物资源化利用提供技术保障。

1 材料与方法

收起

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌株

凤尾菇(Lentinus sajor-caju) (50112)和云芝(Coriolus versicolor) (14001)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) (CCTCC AF 96007)和平菇(Pleurotus ostreatus) (CCTCC HF 2008087)购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。

1.1.2 主要试剂

菌种活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth, PDB)培养基购自北京索莱宝科技有限公司；聚乙烯醇、SA、NaH₂PO₄饱和硼酸溶液及其他生化试剂均为分析纯或生化试剂，Pb(NO₃)₂为优级纯，均购自国药集团。

1.2 仪器和设备

UV3000紫外可见分光光度计购自上海精科实业有限公司；JIDI-17D微量高速离心机购自广州吉迪仪器有限公司；有机元素分析仪购自大昌洋行(上海)有限公司；电镜扫描结果来自上海国检浦东检测技术有限公司。

1.3 菌液的制备

用无菌吸管吸取0.3−0.4 mL的PDA液体培养基，滴入含有Phanerochaete chrysosporium、Coriolus versicolor、Lentinus sajor-caju和Pleurotus ostreatus的4个菌种管内培养12 h (150 r/min, 30 ℃)，以5.00%的接种量接种于PDB培养基继续培养(160 r/min, 35 ℃)。

单一菌株菌液：用分光光度计在600 nm下测定菌液的OD值，待OD₆₀₀为0.5后取菌液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，取下层沉淀稀释于10 mL无菌水中，即为待试菌液。

混合菌株菌液：将待试菌株浅层静置培养7 d，基于前期实验结果，按最佳混菌比例取一定体积的白腐真菌单一菌株菌液，形成混合菌株悬液，后续操作同上。

1.4 重金属铅污染模拟废水的配制及Pb²⁺浓度测定

准确称取1.598 5 g优级纯Pb(NO₃)₂于烧杯中，加5.00% (体积分数) HNO₃溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即制得1 000 mg/L的Pb²⁺标准储备溶液，贮存于棕色容量瓶中4 ℃下避光保存^[10]。

Pb²⁺浓度测定：取1 000 mg/L Pb²⁺储备液，用硝酸溶液(取1 mL分析纯硝酸沿壁缓慢加入499 mL超纯水中)稀释为5 mg/L，调pH值为6，即得待试Pb²⁺模拟废水。将上述菌球分别置于装有100 mL模拟废水的三角锥形瓶中，并置于37 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中，于第0、12、24、36、48、72、96、120、144 h取2 mL的模拟废水，置于离心机中离心10 min，取上清液并通过分光光度计测定448 nm下的OD值，根据标准曲线计算出Pb²⁺浓度。

Pb²⁺的去除率采用公式(1)计算。

(1)

式中，W为Pb²⁺去除率，%；C₀为Pb²⁺初始浓度，mg/L；C为Pb²⁺最终浓度，mg/L。

1.5 单菌生长及单一菌株对重金属Pb²⁺吸附能力测定

取保存的不同白腐真菌菌液接种至灭菌且含5 mg/L Pb²⁺的PDB平板上^[16]，置于28 ℃、150 r/min的培养箱中避光培养120 h。于第0、12、24、48、72、96、120小时通过观察菌落面积测定菌株生长情况。

将4株菌以菌悬液的形式分别接入Pb²⁺模拟废水中(取5 mg/L Pb²⁺模拟废水100 mL，置于250 mL锥形瓶中)，每瓶接种2 mL菌悬液，接种后置于35 ℃、自然pH下浅层静置处理120 h，并测定Pb²⁺去除率(同上)。

1.6 混菌兼容性实验及最佳混菌比例筛选

混菌兼容实验：取保存的4种白腐真菌菌液逐个接种至含5 mg/L Pb²⁺的PDB平板上，各菌之间间隔3 cm。在平板中滴加0.5 mol/L的2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，28 ℃、150 r/min避光培养120 h，于第0、12、24、48、72、96、120小时用十字交叉法^[17]测量菌丝生长圈直径得出菌种兼容情况。

混合菌株筛选：以上述可兼容菌株间的混合比例为自变量，取2 mL不同菌种混合后的菌悬液，分别接入5 mg/L Pb²⁺模拟废水中，置于35 ℃、自然pH下浅层静置处理96 h，测定Pb²⁺去除率(同上)。以Pb²⁺去除率为实验指标，探究具有最佳吸附Pb²⁺能力的复合菌株。

最佳混菌比例筛选：基于混合菌株筛选结果，选取吸附Pb²⁺能力强的复合菌株，设置混菌比例(菌株体积比)，并将混合菌株接种至5 mg/L Pb²⁺模拟废水中，于第0、12、24、36、48、60、72、84、96小时测定Pb²⁺去除率，测定方法同上。

1.7 固定化小球的制备

参考文献[18]的方法，稍作修改。准确称取SA和生物炭于80 ℃溶于100 mL无菌水，115 ℃灭菌15 min，冷却至室温，保存备用。将白腐真菌悬液(OD₆₀₀=5.0)和SA-生物炭溶液以相对应的比例混合，用直径为4 mm的无菌制球器吸取混合液，在距液面10 cm高度处，将混合物匀速逐滴滴入CaCl₂溶液中(滴加过程在磁力搅拌器上完成)，形成凝胶珠，固化30 min，无菌去离子水洗去凝胶珠表面的CaCl₂，4 ℃冰箱储存备用。

1.8 固定化小球的物理性能测定、元素分析及电镜观察

采用平板计数法、浸液法、亚甲基蓝染料法^[19]测定固定化小球载菌量、真密度、堆积密度和比表面积性质等表观参数。

机械强度测定：制作并沥干后取出大小形状相近的5粒，置于天平上用载玻片慢慢按压固定化菌球，观察菌球变形直至不能恢复为止，读出此时最大质量M_i，根据公式(2)测量菌球平均机械强度。

(2)

元素分析：参考文献[20]的方法，利用元素分析仪测定固定化菌球C、H、O、N元素含量并在电镜下观察菌球表面形态。

1.9 固定化菌球制作配方及其条件的选择

制作成分的选择：采用正交实验，配制海藻酸钠浓度分别为15.0、20.0和25.0 g/L，生物炭浓度为10.0、15.0和20.0 g/L，白腐真菌孢子量为1.5×10⁶、2.0×10⁶和2.5×10⁶个/mL的固定化白腐真菌小球，共27组。分别测定其Pb²⁺去除率以探究制作固定化菌球各组分的最佳使用量。

制作条件的选择：利用SA与生物炭固定化白腐真菌，基于预实验的基础上设定交联时间(0.5、1、2、3和4 h)、保存方法(冷冻保存、NaH₂PO₄饱和硼酸溶液保存、湿体冷藏环境保存、5 mg/L模拟Pb²⁺污染废水中冷藏保存)，并添加二氧化硅(SiO₂)和改性沸石。对不同固定化处理的菌球机械强度与Pb²⁺去除率进行测定，方法同上。

1.10 响应面优化固定化菌球最佳环境条件

基于上述实验设计测得的最佳固定化条件，共设计三因素三水平15组试验。自变量包括固定化菌球投加量(a：1.0、2.5、4.0、8.0、12.0、16.0 g/L)、初始废水中Pb²⁺浓度(b：0、25、50、75、100 mg/L)、环境pH (c：3、4、5、6、7) 3个因素。使用0.1 mol/L HNO₃和0.1 mol/L NaOH调节模拟废水的不同pH值，以96 h Pb²⁺去除率为响应值，进行响应面分析实验^[21]，从而探究菌球发挥最佳吸附效果时的环境条件。Pb²⁺去除率测定方法同上。

1.11 固定化菌球的EPS产量及吸附性能

基于上述实验结果，设置Pb²⁺浓度梯度为0、25、50、75、100 mg/L，探究不同程度Pb²⁺污染废水对固定化菌球的EPS产量与吸附性能的影响。利用蒽酮比色法^[22]、Lowry法^[23]测定固定化菌球中多糖与蛋白质质量；EPS产量与多糖、蛋白质质量之间的转换关系根据以下公式(3)得到；单位EPS吸附性能与Pb²⁺去除率、菌球EPS总产量的转换关系根据以下公式(4) 得到。

(3)

(4)

式中，P为固定化菌球的EPS产量(product, mg/g)，P_t为固定化菌球的总EPS产量(total product, mg/g)；m₁为固定化菌球中多糖与蛋白质质量之和(mass, mg)，m₂为固定化菌球的干重(mass, g)；q代表每单位质量EPS的Pb²⁺去除率(%)；R_t代表废水中的总Pb²⁺去除率(total removal rate, %)。

1.12 傅里叶变换红外光谱分析

为确定固定化菌球吸附Pb²⁺的主要官能团种类，利用傅里叶变换红外光谱仪定性分析菌球吸附反应前后官能团的变化。取20 mg烘干的固定化菌球于研钵中，加入2 g溴化钾(KBr)，研磨后转移至模具中压制为均匀的锭片，在样品室中于相同条件下用傅里叶变换红外光谱仪测定红外光谱^[24]，光谱范围为400−4 000 cm⁻¹。

1.13 游离化白腐真菌及固定化菌球重复使用性实验

使用直径1 cm的无菌打孔器制作5片菌饼，放入盛有50 mg/L Pb²⁺模拟废水的250 mL锥形瓶中，于35 ℃自然pH下浅层静置96 h后测定Pb²⁺浓度。吸附完成后，将吸附后的白腐真菌滤出，反复冲洗直至冲洗完全，后将其加入到盛有50 mL 500 mg/L HNO₃的锥形瓶中，于35 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱内解吸2 h^[25]，测定解吸液中的Pb²⁺。

测定固定化菌球96 h Pb²⁺吸附量(同上)。待吸附完成后，取出并擦干固定化菌球，加入到盛有50 mL 500 mg/L HNO₃的锥形瓶中，于35 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱内解吸2 h^[26]，测定解吸液中的Pb²⁺浓度，之后用超纯水清洗上述小球若干次，再转移到含有100 mL 50 mg/L Pb²⁺的溶液中进行吸附。重复进行10次，比较多次吸附-解吸-再吸附后固定化菌球对Pb²⁺去除效果。

1.14 数据处理

所有数据采用Excel 2022进行统计整理，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Ducan法进行多重比较(α=0.05)，Design-Expert 8.0软件设计响应面优化实验，Omnic 9.0分析红外光谱图。Origin 2021软件进行作图，所有数据以平均值±标准误差表示。每个指标测定均设定3次平行。

2 结果与分析

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2.1 菌株筛选

2.1.1 单菌Pb²⁺吸附能力即Pb²⁺去除率测定

如图1所示，4种菌对Pb²⁺的吸附过程均出现较快的吸附过程，随后吸附效率相对持平。在相同时间内黄孢原毛平革菌对Pb²⁺的吸附作用最强，在96 h可达到36.52% (图1A)，凤尾菇对Pb²⁺的吸附速率最快，在36 h即可达到峰值并维持在相对稳定状态(图1B)。结合不同浓度、不同时间条件下的预实验，推测在高浓度、长时间的吸附过程中，菌体表面吸附的Pb²⁺易出现解吸现象，且解吸率与种类、时间、浓度等因素有关。

2.1.2 混菌兼容性实验

通过共同培养4种白腐真菌探究各菌种之间的兼容性，由图2可见4种菌均未出现明显的抑制作用，即未出现透明的抑菌圈，说明4种菌株之间混合长势良好，满足混菌发酵的条件。此外，从生长状况来看，4种菌株生长态势相当，均能正常生长且对营养物质消耗多，生长速度较快。

2.1.3 筛选吸附Pb²⁺的最佳混合菌株

结果表明(表1)，混菌对Pb²⁺去除率要明显高于单菌对Pb²⁺的去除率。当黄孢原毛平革菌、平菇在混菌体系中体积占比越大，混菌对Pb²⁺ 去除率越低；云芝、凤尾菇体积占比提高，Pb²⁺去除率先升高后降低，其中当云芝与凤尾菇体积比为1:1时，Pb²⁺去除率最高，为48.23%。由此可见，黄孢原毛平革菌与平菇在吸附Pb²⁺存在拮抗作用，凤尾菇和云芝的协同作用较强，对Pb²⁺去除率的促进效果显著，可选为后续实验的混菌菌种。

2.1.4 筛选混合菌株的最佳体积比例

基于上述结果，进一步探究并验证云芝与凤尾菇促进Pb²⁺去除率的最优体积比例，设置混菌体积比例(云芝: 凤尾菇)为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1，结果如表2所示。在混菌体积比例为1:1条件下，各时间点废水中的Pb²⁺去除率均高于其余组别，其中96 h时模拟废水中Pb²⁺的去除率可达到46.80%，相较于同时间段其余混菌组平均增长10.25%，可见该比例有利于发挥净化效果。

综上，吸附Pb²⁺的最优混菌菌种为云芝与凤尾菇，最佳比例为云芝: 凤尾菇为1:1 (体积比)。

2.2 固定化菌球的制备

2.2.1 固定化配方中主要成分浓度的确定

为考察SA、生物炭、包埋菌量3种成分对固定化菌球吸附Pb²⁺效果的影响，明确固定化菌球的最佳制备条件，选取Pb²⁺去除率作为目标值进行正交试验。对比各因素所对应的R值(表3)，3种因素对固定化混菌小球性能的作用按其影响大小排序为：SA质量浓度 > 白腐真菌孢子量 > 生物炭质量浓度。由表3可知，随着SA质量浓度的升高，成球效果及Pb²⁺的去除率均有所上升，但当SA质量浓度超过20.0 g/L，使用过程中易发生尾部断裂现象。此外，当生物炭浓度超过15.0 g/L后，狭小的内部空间对菌球的Pb²⁺去除率有所抑制，同时较大的投入菌量会使白腐真菌生长密度过高，也会导致吸附效果的下降。

综上，固定化最佳配方中主要成分浓度为：SA质量浓度20.0 g/L、生物炭质量浓度15.0 g/L、白腐真菌孢子量2.0×10⁶个/mL，在此基础上制得的固定化菌球在96 h Pb²⁺去除率高达90.63%，显著优于未经固定的混菌，证明该固定化条件能够有效促进菌球的Pb²⁺吸附能力。

2.2.2 固定化配方次要成分及制作条件的选择

固定化配方次要成分与制作条件对固定化菌球机械强度和Pb²⁺去除率具有显著影响(表4)。结果显示，若交联时间过短，会导致小球机械强度差，易破碎；若交联时间过长，会导致包埋菌的活力降低。其次，选择0.2 mol/L NaH₂PO₄的饱和硼酸溶液作为交联剂可使制备的载体更易成型，在强化菌球机械强度的同时，进一步提升了其传质性能。此外，在交联过程中加入SiO₂和改性沸石，可明显提高菌球机械强度和Pb²⁺去除率。

在上述条件下，5 mg/L Pb²⁺模拟废水冷藏、交联时间1 h时，固定化菌球吸附Pb²⁺性能，Pb²⁺去除率达93.32%，且具有极高稳定性，在实际应用中此固定化菌球在持续作用96 h后，仍保持菌球性状与工作效率的稳定。以上证明，本固定化菌球的制作配方可进一步提高菌球稳定性，加强Pb²⁺去除效果。

2.2.3 固定化菌球表观测定及其电镜扫描与元素分析

由表5可知，基于上述固定化配方制作的固定化菌球各项物理指标测试均表现优异，弹性、成球性较好，机械强度高，既能承载足量白腐真菌，又拥有优良的亲水性与传质性。由图3A可见小球成球性良好、弹性强，形态均匀且无粘连、拖尾现象，粒径约3−4 mm。将固定化菌球置于扫描电镜下，可见固定化菌球外被SA凝膜，内部SA与混菌菌丝相互交织，生物炭紧密结合其中(图3B)。由此证明，3种因子共同发挥效用，使得固定化菌球性能达到最优。

采用元素分析仪对固定化菌球的生物炭进行元素分析，包括原生生物炭(biochar, BC)、含海藻酸钠的生物炭(biochar-sodium alginate, MB-SA)、含饱和硼酸溶液的生物炭(biochar-saturated boric acid, MB-Bas)、含二氧化硅的生物炭(biochar-SiO₂, MB-SiO₂)，相关元素组成变化见表6。与BC相比，MB-SA、MB-Bas、MB-SiO₂的C，N含量、H/C、O/C与(N+O)/C等参数均有不同程度的降低，代表处理后的菌球生物炭极性降低，稳定性升高。综上所述，添加SA、饱和硼酸及SiO₂均有利于提高生物炭的稳定性，进一步证明了本固定化菌球最佳制作配方的可行性。

2.3 固定化对白腐真菌重金属吸附能力的影响

2.3.1 Pb²⁺胁迫下固定化菌球的EPS产量

低浓度Pb²⁺会促进白腐真菌产生EPS (图4)，各组EPS产量在胁迫初期迅速上升，并于96 h时达到峰值后开始有所下降，其中50 mg/L Pb²⁺处理时EPS产量达到峰值后维持稳定且该组各时间段EPS产量均明显高于其他浓度胁迫组别；而100 mg/L Pb²⁺条件下，EPS产量显著低于对照组(0 mg/L Pb²⁺)。由此可得，Pb²⁺在胁迫初期会促进EPS的分泌，随着胁迫时间延长，Pb²⁺对EPS产量具有一定的抑制，而50 mg/L Pb²⁺对固定化菌球分泌EPS具有持续正向促进作用。

2.3.2 Pb²⁺胁迫下单位质量EPS的吸附性能

如图5所示，各处理组单位质量EPS的Pb²⁺去除率随处理时间的延长呈现先增后降的趋势，前期增长速率较慢，72 h时EPS的吸附性能显著增强，并于120 h达到峰值。25 mg/L Pb²⁺处理组和50 mg/L Pb²⁺处理组的Pb²⁺去除率在各时间段均显著高于其他处理组，其中50 mg/L Pb²⁺胁迫最有利于提高Pb²⁺去除率。而75 mg/L Pb²⁺和100 mg/L Pb²⁺则会抑制单位EPS对Pb²⁺的吸附能力。由此表明，适宜浓度的Pb²⁺胁迫能够更好地发挥白腐真菌对Pb²⁺的吸附能力，减少废水中的Pb²⁺含量，从而提高含铅污水处理的效率。

2.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

通过傅里叶变换红外光谱(图6)分析鉴定吸附重金属铅离子前后的固定化混菌表面的官能团变化。由表7可知，官能团区3 412 cm⁻¹ (No. 2)附近为强极性基团−OH伸缩振动峰，多来自羧酸、醇类、酚类等物质^[27]，可为重金属离子进行离子交换提供H⁺，1 644 cm⁻¹ (No. 6)处归属于酰胺的−C=O不对称伸缩振动吸收峰，1 104 cm⁻¹ (No. 8)左右为醇类、糖类或羧酸类−C−O伸缩振动吸收峰。吸附Pb²⁺后，本固定化菌球−OH的聚合度降低，−C=O的伸缩振动峰从1 644 cm⁻¹移动到1 641 cm⁻¹，醇类、糖类或羧酸类−C−O伸缩振动吸收峰移动到1 102 cm⁻¹处，表明在固定化菌球吸附重金属Pb²⁺的过程中在其表面的羟基、酰胺基、羧基等官能团起了重要的作用。

2.4 响应面优化固定化菌球吸附条件及优化条件验证

2.4.1 响应面优化固定化环境条件

以自变量为固定化菌球投加量(a)、Pb²⁺初始浓度(b)和环境pH (c)，响应值为96 h时Pb²⁺去除率进行响应面优化实验。由图7可知，在3种影响固定化菌球吸附Pb²⁺因素中，除图7A、7D呈现圆形外其余各图均呈现明显的椭圆形，曲率半径较大，表明Pb²⁺受菌球投加量和环境pH影响较大。此外，随着菌球投加量和pH的增加，Pb²⁺去除率呈先升高后降低的趋势，结果表现为固定化菌球投加量8.35 g/L，Pb²⁺初始浓度41.36 mg/L，pH 5.64条件下96 h Pb²⁺去除率最大，为98.77% (图7D−7F)。

2.4.2 最优条件下固定化菌球吸附Pb²⁺能力验证

将上述实验所得的最优混菌(云芝、凤尾菇)以1:1 (体积比)混合，通过最佳固定化配方(SA质量浓度20.0 g/L、生物炭质量浓度15.0 g/L、白腐真菌孢子量2.0×10⁶个/mL和交联剂为0.2 mol/L NaH₂PO₄的饱和硼酸溶液)在最适制备条件(5 mg/L Pb²⁺模拟废水冷藏、交联时间1 h、交联过程加入SiO₂和改性沸石)下制作固定化菌球。设置环境条件为固定化菌球投加量8.35 g/L、Pb²⁺初始浓度41.36 mg/L、pH 5.64下进行Pb²⁺去除实验，测定不同时间下的Pb²⁺去除率，以验证优化条件在实际应用中的可行性。结果如图8所示，可知，随着处理时间的延长，废水中的Pb²⁺去除率迅速升高，于96 h达到最佳处理效果(Pb²⁺去除率为97.45%)后趋于稳定，即固定化白腐真菌混菌小球的Pb²⁺吸附效果随时间上升且具备高效处理含Pb²⁺废水能力。

2.4.3 固定化与游离化菌球的重复利用对比

为考察固定化菌球的实际应用效果，进行解吸-再利用实验。将游离的白腐真菌投入到Pb²⁺废水中进行吸附并解吸，结果如图9A所示，未固定化的白腐真菌在初次解吸再次投放后，其Pb²⁺吸附量显著下降，且Pb²⁺解吸量显著低于未解吸的组别，仅为1.25 mg/L。此外，游离白腐真菌解吸出的Pb²⁺量与吸附Pb²⁺量的差值显著，在第三次解吸再利用时达到峰值，表明游离白腐真菌体内残留较多Pb²⁺。而固定化菌球在经过多次吸附-解吸处理后，仍保持高效的Pb²⁺去除能力，由图9B可知，在前7次重复投放-吸附-解吸中，本固定化菌球Pb²⁺去除能力无显著变化，7次之后，Pb²⁺去除量下降8.34%，解吸量下降11.78%，表明当解吸次数达到阈值后，固定化菌球Pb²⁺吸附能力有所下降。综上可知，固定化相较于游离化白腐真菌不仅具有更强的Pb²⁺耐受能力，还能多次解吸重复利用，可见本固定化菌球在实际应用过程中较游离化白腐真菌更具有优势，应用前景良好。

3 讨论

收起

本实验首先对不同白腐真菌的单菌Pb²⁺去除率进行测定，结果显示各菌均具有一定的Pb²⁺去除能力，后续对菌种兼容性进行探究，在共培养过程中发现4种菌株之间混合长势良好，满足混菌发酵条件。以这4种白腐真菌进行混合，各组混菌对Pb²⁺去除率明显高于单菌，其中混菌中含有黄孢原毛平革菌与平菇时吸附Pb²⁺效果不佳，而含有云芝、凤尾菇的吸附效果显著优于其余组别，由此可见不同的菌种不仅存在协同作用，还具有拮抗作用，推测云芝、凤尾菇在吸附Pb²⁺具有协同效应。混菌最佳比例实验中，云芝与凤尾菇体积比为1:1时，Pb²⁺去除率最高，为46.80%，显著优于其他比例组，可见该比例有利于发挥净化效果。本实验与施巧琴等^[28]的重金属富集实验结果一致，施巧琴等^[28]发现凤尾菇相对于香菇(Lentinus edodes)、金针菇(Flammulina velutiper)及木耳(Auricularia auricula)具有更强的重金属富集效果。此外，葛飞等^[29]用云芝和香菇联合作用可高效降解偶氮染料，此结果也与本实验相吻合。

固定化技术可将游离菌株制作成具有催化活性但不溶于水的固相菌株，从而提高菌株稳定性，进而保证其正常的生理活性^[14]。SA作为最常用、有效的固定剂之一，其优势在于对微生物的本身影响较小，回收率高，能够满足实际应用中的需要^[30]。2020年彭海渊^[31]利用聚乙烯醇与SA作为固定化载体对菌株固定化，固定化菌球具有丰富的孔隙结构，介孔结构丰富，有利于对重金属的吸附。本文得出了与之相似的结论，在SA质量浓度20.0 g/L、生物炭质量浓度15.0 g/L、白腐真菌孢子量2.0×10⁶个/mL条件下制作的固定化菌球于96 h Pb²⁺去除率可达90.63%，优于传统固定化条件下的单菌吸附与未经固定的混合菌株吸附效果，证明该条件能够有效促进菌球的Pb²⁺去除能力，即本固定化配方可显著提高微生物对于重金属成分的吸附能力。基于此，可推知本固定化菌球中的白腐真菌可通过菌球内部的孔隙将分泌的EPS传递到菌球的表面，此时分泌的EPS在固定化菌球外结合Pb²⁺，并将Pb²⁺吸附于固定化菌球之上。与此同时，由于SA与生物炭在菌体表面形成的多孔性载体和凝胶结构阻拦Pb²⁺的进入，加之生物炭较强的疏水性，进一步排斥溶液中的Pb²⁺，因此内部的白腐真菌并不会直接受到Pb²⁺的损害，从而白腐真菌可持续分泌EPS，以抵御Pb²⁺胁迫。此外，当Pb²⁺扩散入固定化菌体时，需要克服重重阻碍，因而相对于游离的白腐真菌存在时间滞后性，相对游离白腐真菌EPS的产量更大，结合Pb²⁺能力更强。在此基础上，创新性探究了固定化菌球的其他固定化助剂对菌球Pb²⁺去除率的影响，当交联时间固定为4 h时，于固定剂中加入SiO₂、沸石可使菌球在持续作用96 h后，仍保持稳定的菌球性状与工作效率，Pb²⁺去除率达93.32%，此结果与吴亚杰等^[32]得出SiO₂和人造沸石可提升固定化凝胶球的性能的结论相一致。

对固定化菌球的理化性质进行测定，固定化菌球的传质性与机械强度均显著上升，表明经固定化后的菌株在高效传递营养物质与氧气的同时，可抵抗机械剪切力^[33]。该结果与茆云汉等^[34]固定化微生物时，加入饱和硼酸可提高固定化微生物颗粒的机械稳定性和生物活性的结论一致。电镜下观察固定化菌球，可见SA与菌丝相互交织，生物炭紧密结合其中，即本固定化菌球中生物炭主要起骨架作用，并可利用多孔性载体将菌体包裹，该结构与陈弘钊等^[35]观察的结果相似。通过对固定化菌球中生物炭的元素分析发现，与原生生物炭相比，加入SA、饱和硼酸溶液、SiO₂，生物炭的C，N含量均下降，这是由于饱和硼酸与SiO₂的相对浓度增加所致。而MB-SA、MB-Bas、MB-SiO₂的H/C原子比、H和C的含量均略低于BC，表明3者的碳芳香程度增加，这可能是导致生物炭稳定性增强的主要原因。此外，生物炭极性可用O/C和(N+O)/C原子比等参数来表示，与BC相比，MB-SA、MB-Bas、MB-SiO₂的O/C比值、(N+O)/C均明显降低，说明它们内部的含氧官能基团成分较少、极性小、疏水性强，造成生物炭表面的低亲水性，排斥溶于水中的Pb²⁺，使其更难接触到菌体，从而使固定化菌球的稳定性得到提升。综上可知，生物炭表面孔隙结构使得小分子底物和产物能够自由进出，并利于微生物附着进行生长和繁殖。而SA与菌丝相互交织，最终于菌球表面形成SA凝胶包被，能够将菌丝分泌的EPS聚集成球型，微生物不会扩散到周围介质中的同时，Pb²⁺难以进入菌球内，相较于游离白腐真菌有更强的Pb²⁺吸附能力。

以固定化菌球的EPS产量与单位EPS的吸附性能为指标，验证不同Pb²⁺胁迫环境下固定化菌球对废水中Pb²⁺吸附的性能，结果显示，50 mg/L Pb²⁺胁迫条件最有利于混合菌株EPS的合成与运输，并不影响其对Pb²⁺的吸附性能，与此同时在其他浓度胁迫下均能表现出良好的净水效能。表明Pb²⁺会促进白腐真菌分泌EPS，这是由于白腐真菌与Pb²⁺之间存在相互作用，Pb²⁺在对白腐真菌产生伤害的同时，白腐真菌本身也对Pb²⁺进行抵御^[7]。为明确固定化菌球产生EPS吸附Pb²⁺的具体官能团，通过傅里叶变换红外光谱分析鉴定吸附重金属铅离子前后的固定化混菌表面的官能团变化。红外光谱下固定化菌球在吸附Pb²⁺后，强极性基团−OH的聚合度降低，−C=O的伸缩振动峰从1 644 cm⁻¹移动到1 641 cm⁻¹，−C−O吸收峰移动到1 102 cm⁻¹处，暗示羧基官能团与Pb²⁺可能发生配位反应，而后−OH对Pb²⁺起束缚作用^[36]，进而促使废水中Pb²⁺含量下降，与此同时由于Pb²⁺被吸附在菌球上导致酰胺基团被分解破坏^[37]，此结论与固定化菌球在处理含铅废水后期EPS产量与单位EPS的吸附性能下降相呼应。为达到更好的净水效果，本团队通过响应面优化法探索固定化菌球投加量、Pb²⁺初始浓度和环境pH这三项环境指标对固定化菌球去除废水中Pb²⁺的影响，结果显示在固定化菌球投加量8.35 g/L，Pb²⁺初始浓度41.36 mg/L，pH 5.64条件下固定化达到最佳效果，表明弱酸性且中等胁迫的环境更有利于固定化菌球发挥作用。在验证实验中，本固定化菌球的Pb²⁺去除率于96 h达97.45%，表明基于本优化条件下制作的固定化菌球对Pb²⁺的吸附能力强，能够满足去除含Pb²⁺废水的净水要求。

为探求本固定化菌球在实际生产过程中的作用效果，判定是否可通过吸附-解吸-再吸附从而多次重复利用，以节约处理成本。结果显示，各白腐真菌处理组Pb²⁺吸附量与解吸量均存在一定的差值，其中固定化白腐真菌其吸附能力、Pb²⁺解吸量远高于游离白腐真菌，且吸附量与解吸量二者差值远远低于游离白腐真菌，可知，固定化菌球的Pb²⁺吸附能力与重复利用性远高于游离白腐真菌。考虑到固定化菌球差值的产生可能是由于载体介质残留的问题，2015年黄真真^[26]利用固定化无菌小球吸附重金属污染物，而后将其置于解吸液中，结果显示重金属离子解吸率为100%，证明了固定化菌球介质不会滞留重金属离子。为检验本实验固定化菌球是否存在特殊情况，在最优混菌配比、最佳固定化配方及环境条件下对固定化无菌小球做了Pb²⁺吸附-解吸实验，结果显示Pb²⁺解吸率为100%，证明了本固定化菌球载体不存在残留Pb²⁺的问题。因此，推测此部分差值的出现是由于Pb²⁺进入白腐真菌体内。可推知，无论固定化与否都有一定量的Pb²⁺进入到白腐真菌体内，但进入固定化后的白腐真菌体内的Pb²⁺含量微乎其微，其体内Pb²⁺含量是游离白腐真菌的10%，可见固定化菌球抵御Pb²⁺能力强。此外，固定化的白腐真菌前7次重复利用时对Pb²⁺基本保持原有的吸附性能，几乎没有损失，具有良好的可重复利用性和稳定性，而多次解吸后期Pb²⁺去除量开始下降。陈旭婷^[38]利用枯草杆菌去除镉离子时发现镉离子对枯草芽孢杆菌的毒性存在积累作用，推测本试验中Pb²⁺对白腐真菌的损害同样存在剂量效应。即本固定化菌球在重复利用超过7次后，Pb²⁺吸附量及解吸量显著下降的主要原因或为白腐真菌长期处于逆境条件下，Pb²⁺的持续胁迫导致其生长机理受损，使得白腐真菌EPS产量下降，导致胞外Pb²⁺螯合能力减弱，进而有少量Pb²⁺进入白腐真菌体内，在多次使用后，由于抵抗能力下降，前期进入白腐真菌体内的Pb²⁺达到阈值，进而对其产生毒害作用，从而使白腐真菌的吸附量显著下降。此结论与循环利用7次以后，Pb²⁺去除率显著下降相呼应。

4 结论

收起

本研究探究了利用复合白腐真菌治理铅污染废水的新型固定化工艺。吸附Pb²⁺的最优白腐真菌混菌菌种为云芝与凤尾菇，其最佳比例为云芝: 凤尾菇为1:1 (体积比)。固定化菌球最佳制作配方为SA质量浓度20.0 g/L、生物炭质量浓度15.0 g/L、白腐真菌孢子量2.0×10⁶个/mL，在此基础上以5 mg/L Pb²⁺模拟废水冷藏，选用0.2 mol/L NaH₂PO₄的饱和硼酸溶液作为交联剂，交联过程中加入SiO₂和沸石，交联时间4 h。此外，环境条件为pH 5.64，固定化菌球投加量8.35 g/L，Pb²⁺初始浓度41.36 mg/L，最有利于混合菌株EPS的合成与运输，不影响其对Pb²⁺的吸附性能的同时，可充分利用其表面的羟基(−OH)、酰胺基(−C−O−NH₂)、羧基(−COOH)等官能团高效络合铅离子形成共价键，达到有效去除废水中金属离子目的，最终使得Pb²⁺去除率达97.45%。此外，本固定化菌球在实际使用过程中，可通过吸附-解吸-再吸附保持高效净水能力且重复利用7次以上，满足实际应用需求，与此同时可向废水中投放碳源、氮源等白腐真菌所需的营养物质，进一步延长其使用寿命。

本固定化菌球缓解了游离化白腐真菌在应用过程中因振荡、搅拌等操作受到强剪切力作用而影响其吸附效率的问题，在各Pb²⁺胁迫环境均具有良好的吸附能力，兼具专一性强、菌体耐受性好、固定化小球机械强度高等优势，可有效处理含铅废水，可用于蓄电池生产、石油加工等含铅工业污水的治理，扩宽污染水体的可修复范畴，为环境生态的治理与保护增添新思路。

基金

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国家自然科学基金(32001224)
国家自然科学基金(41702181)
金华市科技计划公益项目(2022-4-049)

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2024年第64卷第1期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230427

接收时间：2023-06-20
首发时间：2026-03-18
出版时间：2024-01-04

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收稿日期：2023-06-20
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浙江师范大学生命科学学院植物学实验室, 浙江金华 321004

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Experimental No.	Phanerochaete chrysosporium	Coriolus versicolor	Lentinus sajor-caju	Pleurotus ostreatus	Pb²⁺ removal rate (%)
1	0.250	0.250	0.250	0.250	29.37±0.15
2	0.125	0.625	0.125	0.125	35.83±0.67
3	0.125	0.125	0.625	0.125	32.89±0.89
4	0.125	0.125	0.125	0.625	27.10±0.21
5	0.625	0.125	0.125	0.125	21.92±0.37
6	1.000	0.000	0.000	0.000	36.12±0.09
7	0.000	1.000	0.000	0.000	39.23±0.17
8	0.000	0.000	1.000	0.000	37.29±0.23
9	0.000	0.000	0.000	1.000	28.39±0.81
10	0.500	0.500	0.000	0.000	32.26±0.34
11	0.500	0.000	0.500	0.000	34.33±0.14
12	0.500	0.000	0.000	0.500	18.81±0.26
13	0.000	0.500	0.500	0.000	48.23±0.31
14	0.000	0.500	0.000	0.500	33.94±0.42
15	0.000	0.000	0.500	0.500	30.21±0.10

Experimental No.

Phanerochaete chrysosporium

Coriolus versicolor

Lentinus sajor-caju

Pleurotus ostreatus

Pb²⁺ removal rate (%)

0.250

29.37±0.15

0.125

0.625

0.125

35.83±0.67

0.125

0.625

0.125

32.89±0.89

0.125

0.625

27.10±0.21

0.625

0.125

21.92±0.37

1.000

0.000

36.12±0.09

0.000

1.000

0.000

39.23±0.17

0.000

1.000

0.000

37.29±0.23

0.000

1.000

28.39±0.81

0.500

0.000

32.26±0.34

0.500

0.000

0.500

0.000

34.33±0.14

0.500

0.000

0.500

18.81±0.26

0.000

0.500

0.000

48.23±0.31

0.000

0.500

0.000

0.500

33.94±0.42

0.000

0.500

30.21±0.10

Volume ratios	Removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
1:3	13.19±0.66d	16.33±0.48c	21.50±0.35b	26.71±0.33c	30.80±0.32c	35.34±0.32c	36.11±0.36c	37.20±0.43c
1:2	11.52±0.96c	17.63±0.58c	25.10±0.24a	29.89±0.53b	33.41±0.28b	36.00±0.38c	38.16±0.74b	38.54±0.09b
1:1	23.14±0.04a	24.92±0.72a	25.32±0.44a	31.60±0.20a	38.17±0.08a	41.51±0.88a	43.42±0.94a	46.80±0.22a
2:1	17.38±0.66b	19.17±0.98b	22.27±0.55b	27.00±0.58c	31.92±0.78c	37.81±0.18b	38.91±0.44b	39.20±0.58b
3:1	6.33±0.24e	9.51±0.32d	12.71±0.21c	16.77±0.61d	21.31±0.82d	27.54±0.12d	30.79±0.76d	31.34±0.29d

Volume ratios

Removal rate (%)

12 h

24 h

36 h

48 h

60 h

72 h

84 h

96 h

Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).

1:3

13.19±0.66d

16.33±0.48c

21.50±0.35b

26.71±0.33c

30.80±0.32c

35.34±0.32c

36.11±0.36c

37.20±0.43c

1:2

11.52±0.96c

17.63±0.58c

25.10±0.24a

29.89±0.53b

33.41±0.28b

36.00±0.38c

38.16±0.74b

38.54±0.09b

1:1

23.14±0.04a

24.92±0.72a

25.32±0.44a

31.60±0.20a

38.17±0.08a

41.51±0.88a

43.42±0.94a

46.80±0.22a

2:1

17.38±0.66b

19.17±0.98b

22.27±0.55b

27.00±0.58c

31.92±0.78c

37.81±0.18b

38.91±0.44b

39.20±0.58b

3:1

6.33±0.24e

9.51±0.32d

12.71±0.21c

16.77±0.61d

21.31±0.82d

27.54±0.12d

30.79±0.76d

31.34±0.29d

Experimental No./Factors	SA mass concentration (g/L)	Biochar mass concentration (g/L)	White rot fungus spore volume (×10⁶ CFU/mL)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
k₁ means Pb²⁺ removal rate of SA at different factor levels;k₂ means Pb²⁺ removal rate of white-rot fungus at different factor levels;k₃ means Pb²⁺ removal rate of biochar at different factor levels.R means measures of variation byk₁,k₂ andk₃. The larger theR, the more effect of a change of that factor on the indicator for that experiment, means the more important the factor is; Conversely, the smaller theR, the less important the factor. Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05). /: No data (except “/” in parentheses).
1	15.0	10.0	1.5	86.65±0.16b
2	15.0	15.0	2.0	90.42±0.35a
3	15.0	20.0	2.5	83.07±0.01c
4	20.0	10.0	2.5	90.54±0.56a
5	20.0	15.0	2.0	90.63±0.74a
6	20.0	20.0	1.5	89.59±0.21b
7	25.0	10.0	2.5	84.21±1.47c
8	25.0	15.0	1.5	86.99±0.83b
9	25.0	20.0	2.0	87.29±0.82a
k₁/%	80.34	86.39	85.66	/
k₂/%	85.34	88.14	89.98	/
k₃/%	79.16	84.73	86.61	/
R/%	6.18	3.41	4.32	/

Experimental No./Factors

SA mass concentration (g/L)

Biochar mass concentration (g/L)

White rot fungus spore volume (×10⁶ CFU/mL)

96 h Pb²⁺ removal rate (%)

k₁ means Pb²⁺ removal rate of SA at different factor levels;k₂ means Pb²⁺ removal rate of white-rot fungus at different factor levels;k₃ means Pb²⁺ removal rate of biochar at different factor levels.R means measures of variation byk₁,k₂ andk₃. The larger theR, the more effect of a change of that factor on the indicator for that experiment, means the more important the factor is; Conversely, the smaller theR, the less important the factor. Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05). /: No data (except “/” in parentheses).

15.0

10.0

1.5

86.65±0.16b

15.0

2.0

90.42±0.35a

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83.07±0.01c

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90.54±0.56a

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90.63±0.74a

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1.5

89.59±0.21b

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10.0

2.5

84.21±1.47c

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1.5

86.99±0.83b

25.0

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2.0

87.29±0.82a

k₁/%

80.34

86.39

85.66

k₂/%

85.34

88.14

89.98

k₃/%

79.16

84.73

86.61

R/%

6.18

3.41

4.32

Projects	Specific treatments	Mechanical strengths (mN)	96 h Pb²⁺ removal rate (%)
Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).
Crosslinking time	0.5 h	1 531±47.49e	90.45±1.77b
1 h	1 944±64.40d	93.32±0.55a
2 h	2 024±44.92c	89.85±1.59b
3 h	2 103±85.02b	75.55±1.62c
4 h	2 388±41.54a	73.33±2.15d
Storage methods	Freezing	2 054±64.23d	80.67±0.51c
0.2 mol/L NaH₂PO₄ in saturated boric acid	2 411±45.41b	83.54±1.03b
Humid and refrigeration	2 326±06.43c	84.34±1.27b
Refrigeration in 5 mg/L Pb²⁺ wastewater	2 513±56.65a	91.44±1.35a
SiO₂ and zeolite addition	Without SiO₂ and modified zeolite	2 294±31.46c	71.50±2.96c
No SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 321±36.32b	84.65±1.79b
10 g SiO₂ added, no modified zeolite	2 362±42.68a	85.65±0.47b
10 g SiO₂ added, 5 g modified zeolite	2 376±12.54a	92.12±1.68a

Projects

Specific treatments

Mechanical strengths (mN)

96 h Pb²⁺ removal rate (%)

Different lower case letters indicate significant differences between different treatment groups for the same period (P < 0.05).

Crosslinking time

0.5 h

1 531±47.49e

90.45±1.77b

1 h

1 944±64.40d

93.32±0.55a

2 h

2 024±44.92c

89.85±1.59b

3 h

2 103±85.02b

75.55±1.62c

4 h

2 388±41.54a

73.33±2.15d

Storage methods

Freezing

2 054±64.23d

80.67±0.51c

0.2 mol/L NaH₂PO₄ in saturated boric acid

2 411±45.41b

83.54±1.03b

Humid and refrigeration

2 326±06.43c

84.34±1.27b

Refrigeration in 5 mg/L Pb²⁺ wastewater

2 513±56.65a

91.44±1.35a

SiO₂ and zeolite addition

Without SiO₂ and modified zeolite

2 294±31.46c

71.50±2.96c

No SiO₂ added, 5 g modified zeolite

2 321±36.32b

84.65±1.79b

10 g SiO₂ added, no modified zeolite

2 362±42.68a

85.65±0.47b

10 g SiO₂ added, 5 g modified zeolite

2 376±12.54a

92.12±1.68a

Indicators	Results
Load capacity (CFU/mL)	(5.48±0.02)×10⁶
True density (g/L)	1.376±0.013
Bulk density (g/L)	0.782±0.001
Water content multiplication (%)	52.40±2.46
Water content (%)	1.10±0.04
Specific surface area (m²/g)	332.89±4.23
Diameter(cm)	0.413±0.028
Broken ratio (%)	39.71±1.24
Transmissibility (%)	79.44±3.09

Indicators

Results

Load capacity (CFU/mL)

(5.48±0.02)×10⁶

True density (g/L)

1.376±0.013

Bulk density (g/L)

0.782±0.001

Water content multiplication (%)

52.40±2.46

Water content (%)

1.10±0.04

Specific surface area (m²/g)

332.89±4.23

Diameter(cm)

0.413±0.028

Broken ratio (%)

39.71±1.24

Transmissibility (%)

79.44±3.09

Item	C (%)	H (%)	N (%)	O (%)	H/C	O/C	(N+O)/C
BC means native biochar; MB-SA means biochar containing sodium alginate; MB-Bas means biochar containing saturated boric acid solution; MB-SiO₂ means biochar containing SiO₂.
BC	68.21	3.22	1.24	17.91	0.047	0.26	0.28
MB-SA	56.44	3.12	0.64	14.21	0.055	0.25	0.26
MB-Bas	45.58	2.18	0.77	9.45	0.049	0.21	0.22
MB-SiO₂	43.20	2.25	0.79	11.76	0.052	0.27	0.29

Item

C (%)

H (%)

N (%)

O (%)

H/C

O/C

(N+O)/C

BC means native biochar; MB-SA means biochar containing sodium alginate; MB-Bas means biochar containing saturated boric acid solution; MB-SiO₂ means biochar containing SiO₂.

68.21

3.22

1.24

17.91

0.047

0.26

0.28

MB-SA

56.44

3.12

0.64

14.21

0.055

0.25

0.26

MB-Bas

45.58

2.18

0.77

9.45

0.049

0.21

0.22

MB-SiO₂

43.20

2.25

0.79

11.76

0.052

0.27

0.29

Experimental No.	Before biosorption (cm⁻¹)	After biosorption (cm⁻¹)	Types of functional groups
Number 1−9 indicates the characteristic absorption peaks of different functional group; − means not observed.
1	3 735	−	−NH₂
2	3 412	3 401	−OH
3	2 938	−	−CH₂
4	2 360	2 356	−PH
5	2 325	2 319	−PH
6	1 644	1 641	−C=O
7	1 376	−	−CH₃
8	1 104	1 102	−C–O
9	616	−	Metal−O

Experimental No.

Before biosorption (cm⁻¹)

After biosorption (cm⁻¹)

Types of functional groups

Number 1−9 indicates the characteristic absorption peaks of different functional group; − means not observed.

3 735

−

−NH₂

3 412

3 401

−OH

2 938

−

−CH₂

2 360

2 356

−PH

2 325

2 319

−PH

1 644

1 641

−C=O

1 376

−

−CH₃

1 104

1 102

−C–O

616

−

Metal−O