微生物学报

Metabolite	CAS	Molecular formula	VIP^a	P-value	Fold change^b
VIP: Variable importance in the projection.^a: The importance of variables to the model.^b: Quantitative comparison between the same metabolite pH group and the control group (↑ represents upregulation and ↓ represents downregulation).
5-aminovaleric acid 3	660-88-8	C₅H₁₁NO₂	1.58	0.00	0.12 ↓
1, 5-anhydroglucitol	154-58-5	C₆H₁₂O₅	1.23	0.00	0.20 ↓
N(epsilon)-trimethyllysine	23284-33-5	C₉H₂₀N₂O₂	1.80	0.00	0.31 ↓
2-hydroxypyridine	142-08-5	C₅H₅NO	1.38	0.01	0.39 ↓
Tartronic acid	80-69-3	C₃H₄O₅	1.72	0.00	0.41 ↓
Cysteinylglycine 3	19246-18-5	C₅H₁₀N₂O₃S	1.48	0.01	0.44 ↓
Oxamic acid	471-47-6	C₂H₃NO₃	1.71	0.00	0.45 ↓
Lactamide 1	2043-43-8	C₃H₇NO₂	1.64	0.00	0.48 ↓
Tetracosane	646-31-1	C₂₄H₅₀	1.11	0.01	0.50 ↓
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	503-49-1	C₆H₁₀O₅	1.34	0.04	53.61 ↑
Maltitol	585-88-6	C₁₂H₂₄O₁₁	1.95	0.00	56.81 ↑

Metabolite	CAS	Molecular formula	VIP^a	P-value	Fold change^b
VIP: Variable importance in the projection.^a: The importance of variables to the model.^b: Quantitative comparison between the same metabolite pH group and the control group (↑ represents upregulation and ↓ represents downregulation).
5-aminovaleric acid 3	660-88-8	C₅H₁₁NO₂	1.58	0.00	0.12 ↓
1, 5-anhydroglucitol	154-58-5	C₆H₁₂O₅	1.23	0.00	0.20 ↓
N(epsilon)-trimethyllysine	23284-33-5	C₉H₂₀N₂O₂	1.80	0.00	0.31 ↓
2-hydroxypyridine	142-08-5	C₅H₅NO	1.38	0.01	0.39 ↓
Tartronic acid	80-69-3	C₃H₄O₅	1.72	0.00	0.41 ↓
Cysteinylglycine 3	19246-18-5	C₅H₁₀N₂O₃S	1.48	0.01	0.44 ↓
Oxamic acid	471-47-6	C₂H₃NO₃	1.71	0.00	0.45 ↓
Lactamide 1	2043-43-8	C₃H₇NO₂	1.64	0.00	0.48 ↓
Tetracosane	646-31-1	C₂₄H₅₀	1.11	0.01	0.50 ↓
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	503-49-1	C₆H₁₀O₅	1.34	0.04	53.61 ↑
Maltitol	585-88-6	C₁₂H₂₄O₁₁	1.95	0.00	56.81 ↑

Metabolite	pKa (strongest acid)	pKa (strongest base)	Super class	Pathway
pKa (strongest acid): The strongest dissociation constant of acidic groups; pKa (strongest base): The strongest dissociation constant of alkalic groups. −: None.
5-aminovaleric acid 3	4.5±0.4	10.7±0.4	Organic acids and derivatives	Map 00310 lysine degradation; map 00330 arginine and proline metabolism
1, 5-anhydroglucitol	13.2±1.0	−	Organooxygen compounds	−
N(epsilon)-trimethyllysine	4.5±0.4	−	Others	−
2-hydroxypyridine	4.9±0.4	−	Organoheterocyclic compounds	−
Tartronic acid	2.3±0.4	−	Organic acids and derivatives	−
Cysteinylglycine 3	3.1±0.4	7.1±0.5	Organic acids and derivatives	−
Oxamic acid	2.1±0.4	−	Others	−
Lactamide 1	13.5±0.9	1.2±0.5	Others	−
Tetracosane	−	−	Others	−
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	3.9±0.4	−	Lipids and lipid-like molecules	−
Maltitol	12.4±0.1	−	Lipids and lipid-like molecules	−

Metabolite	pKa (strongest acid)	pKa (strongest base)	Super class	Pathway
pKa (strongest acid): The strongest dissociation constant of acidic groups; pKa (strongest base): The strongest dissociation constant of alkalic groups. −: None.
5-aminovaleric acid 3	4.5±0.4	10.7±0.4	Organic acids and derivatives	Map 00310 lysine degradation; map 00330 arginine and proline metabolism
1, 5-anhydroglucitol	13.2±1.0	−	Organooxygen compounds	−
N(epsilon)-trimethyllysine	4.5±0.4	−	Others	−
2-hydroxypyridine	4.9±0.4	−	Organoheterocyclic compounds	−
Tartronic acid	2.3±0.4	−	Organic acids and derivatives	−
Cysteinylglycine 3	3.1±0.4	7.1±0.5	Organic acids and derivatives	−
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Lactamide 1	13.5±0.9	1.2±0.5	Others	−
Tetracosane	−	−	Others	−
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	3.9±0.4	−	Lipids and lipid-like molecules	−
Maltitol	12.4±0.1	−	Lipids and lipid-like molecules	−

结合代谢组学和转录组学分析恶臭假单胞菌Y-9主动稳定胞内外pH的机制

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聂铭 , 杨裕然 , 李振轮 ^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(1): 174-188

收起

微生物学报 | 研究报告 2024, 64(1): 174-188

结合代谢组学和转录组学分析恶臭假单胞菌Y-9主动稳定胞内外pH的机制

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聂铭, 杨裕然, 李振轮^*

作者信息

西南大学资源环境学院土壤多尺度界面过程与调控重庆市重点实验室, 重庆 400716

Mechanism ofPseudomonas putida Y-9 in actively stabilizing intracellular and extracellular pH: a study based on metabolomics and transcriptomics

Ming NIE, Yuran YANG, Zhenlun LI^*

Affiliations

Chongqing Key Laboratory of Soil Multiscale Interfacial Process, College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400716, China

出版时间: 2024-01-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230363

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摘要

收起

【目的】揭示恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) Y-9在氨氧化过程中主动调节胞外和胞内pH稳态机制。【方法】在初始pH为7.19和9.40的硝化培养基中培养Y-9生长48 h，利用代谢组学对比分析Y-9氨氧化过程中的显著差异代谢产物并预测解离常数(pKa)；结合转录组学对比分析Y-9氨氧化过程中的显著差异调控基因。【结果】Y-9在初始pH为7.19的相对酸性条件下，产生麦芽糖醇提高胞外pH；通过上调脱氨酶、脱亚胺酶和阳离子转运相关基因在相对酸性环境中的表达来维持细胞内pH稳定性。在初始pH为9.40的碱性条件下，产5-氨基戊酸3和草氨酸等有机酸及酸性物质降低胞外pH；通过调控NADH脱氢酶、细胞色素、ATP合酶和氨基酸转运相关基因的表达来维持细胞内酸度，应对碱性环境。【结论】本研究结果首先发现了Y-9具有稳定胞外pH的能力，探讨了其胞内pH稳态机制，拓展了对微生物与环境相互作用的认知，为进一步认识微生物脱氮过程中系统pH稳定机理提供了理论依据。

关键词

恶臭假单胞菌 / 代谢组学 / 转录组学 / pH稳态 / 解离常数

Abstract

收起

[Objective] To reveal the mechanisms ofPseudomonas putida Y-9 in actively regulating the extracellular and intracellular pH homeostasis during ammonia oxidation.[Methods] Y-9 was cultured in the nitrification media with initial pH 7.19 and 9.40, respectively, for 48 h. Metabolomics was employed to compare the differential metabolites and predict dissociation constant (pKa) during the ammonia oxidation. Transcriptomics was employed to compare the genes regulating.[Results] In the medium with initial pH 7.19, Y-9 produced maltitol to raise extracellular pH, and up-regulated the expression of the genes related to deaminase, deiminase, and cation transport to maintain intracellular pH stability. In the medium with initial pH 9.40, Y-9 produced acidic substances such as 5-aminovaleric acid 3 and oxamic acid to lower extracellular pH and regulated the expression of the genes associated with NADH dehydrogenase, cytochromes, ATP synthase, and amino acid transport to maintain intracellular acidity.[Conclusion] This study revealed the novel phenomenon of Y-9's extracellular pH stabilizing capacity and investigated its intracellular pH homeostasis mechanism. The findings enrich our knowledge about microorganism-environment interactions, and provide a theoretical basis for further understanding the pH stabilization mechanism in microbial denitrification processes.

Key words

Pseudomonas putida / metabolomics / transcriptomics / pH homeostasis / dissociation constant

引用本文

聂铭, 杨裕然, 李振轮. 结合代谢组学和转录组学分析恶臭假单胞菌Y-9主动稳定胞内外pH的机制. 微生物学报, 2024 , 64 (1) : 174 -188 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230363

Ming NIE, Yuran YANG, Zhenlun LI. Mechanism ofPseudomonas putida Y-9 in actively stabilizing intracellular and extracellular pH: a study based on metabolomics and transcriptomics[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (1) : 174 -188 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230363

正文

收起

适当的pH值对于细菌生长是至关重要的。细菌必须保持合适的细胞内pH值，以支持细胞生长和蛋白的最佳功能及结构完整性。大多数非极端细菌在外部pH 5.5–9.0的范围内生长，并将细胞质的pH值维持在7.4–7.8的狭窄范围内^[1]。当外部环境的pH值偏离此最佳范围时，无论细胞外环境如何，都需要一种有效的方法来保持细菌胞内pH值接近中性，从而确保细菌的正常生长。细菌维持生理上有利pH范围的过程称为pH稳态^[2-3]。目前，仅有少量研究报道了细菌代谢产物能够改变胞外pH值，因此，研究细菌胞内pH稳态机制及改变胞外pH机制，有助于进一步拓展在pH变化方面微生物与环境相互作用的认知。

以往对细菌pH稳态机制的研究主要分为3种。第1种是转运或吸收H⁺以维持胞内pH稳定。细菌可以通过一价阳离子/氢离子反转运蛋白实现胞内阳离子(如Na⁺和Li⁺)与胞外H⁺交换，这被认为是嗜碱菌维持细胞内pH稳态最重要的机制^[4]。第2种是细胞膜保护。细胞膜、细胞壁及细胞表面的聚合物可作为屏障，防止外部环境对细胞质的直接影响。嗜碱菌的细胞表面含有负电荷残基，可以排斥OH⁻，防止细胞质pH值升高^[5]。第3种是生成酸性或碱性物质以维持细胞内pH稳定性。细胞外pH值变化会影响细菌的代谢过程，细胞产生的酸或碱可以抵消培养基pH值变化带来的冲击^[6]。例如，当大肠杆菌(Escherichia coli)在高pH培养基中生长时，大肠杆菌通过上调脱氨酶、ATP合酶和细胞色素d氧化还原酶的相关基因表达来促进酸的产生。相反，在酸性胁迫下，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过激活脱氢酶和脱羧酶活性，从而消耗酸并产生碱性胺^[7]。

现有研究主要集中在细菌的胞内pH稳态机制上，有少量研究报道了细菌代谢能改变胞外pH，然而，对于细菌主动调节并稳定细胞外pH的研究还未见报道。恶臭假单胞菌Y-9是一株嗜中性细菌，能在pH为7.0–9.5的环境下生长，实验室前期研究表明，Y-9能够改变胞外pH。本研究设置菌株在生长的极端条件下(pH 7.19和9.40)培养，发现恶臭假单胞菌Y-9在氨氧化过程中不仅能够改变胞外pH值，还能主动调节并稳定外部环境pH，进而结合代谢组学和转录组学探讨了Y-9稳定胞内外pH机制。

1 材料与方法

收起

1.1 菌种来源

从贵州省德江县水田(N28°0′7.42″, E108°23′56.41″)中富集、分离、纯化得到一株耐冷好氧细菌，菌名为Pseudomonas putida Y-9 (GenBank No. KP410740)^[8]。

1.2 培养基

富集培养基(Luria-Bertani, LB) (pH 7.2) (g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，氯化钠10。固体LB在上述LB基础上添加2%的琼脂。

硝化培养基(nitrification medium, NM) (g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 1.3，(NH₄)₂SO₄ 0.24，CH₃COONa 2.56，FeSO₄·7H₂O 0.05，MgSO₄·7H₂O 0.1和Tris 2。

用H₂SO₄将上述培养基的初始pH调节至7.19或9.40。将含有100 mL培养基的锥形烧瓶(250 mL)在115 ℃高压灭菌15 min。

1.3Pseudomonas putida Y-9的生长与酸碱度测定

在LB固体板活化菌株Y-9，然后在100 mL的LB培养基制备种子液，在150 r/min、15 ℃的摇床中培养36 h。取出7 mL预培养的Y-9菌液，6 000 r/min离心5 min，弃上清液。用纯水清洗菌体2次，并接种到初始pH为7.19和9.40的100 mL NM培养基中，使初始OD₆₀₀为0.1。培养物在15 ℃有氧条件下，以150 r/min的转速培养。以接种高温杀灭的细胞处理作为空白对照。在0、12、24和48 h时，取样，测量细菌细胞的光密度(OD₆₀₀)。每个处理进行3次重复。

取20 mL培养基以8 000 r/min离心5 min，测定上清液pH作为细胞外pH。离心后收集的细胞用无菌水洗涤2次，然后用细胞破碎仪(MPFastPrep-24)破碎^[9]。将细胞破碎的混合物用10 mmol/L KCl重悬至20 mL的体积，以此pH值作为细胞内pH值(方法修改自土壤pH和微生物ZETA电位测定)^[10-12]。使用pH计在15 ℃下测量pH值(上海精密科学研究院)。

1.4 胞外代谢物检测和解离常数预测

菌株Y-9在NM中培养48 h后，8 000 r/min离心5 min，取上清液测定pH值及代谢物。样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行代谢组学分析。不同初始pH处理互为对照，所有实验均重复6次。飞行时间气相色谱/质谱(time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry, GC-TOFMS)分析使用Agilent 7890气相色谱仪结合飞行时间质谱仪进行。该系统采用DB-5MS毛细管柱为色谱柱，在无分裂模式下共注入1 μL样品；以氦气为载气，前入口吹扫流量为3 mL/min，通过柱的气体流速为1 mL/min。初始温度在50 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速率提高到310 ℃，并在310 ℃下保持8 min。注射温度、传输线温度和离子源温度分别为280、280和250 ℃。在电子冲击模式下，电离电压为‒70 eV。质谱数据在全扫描模式下获得，质量范围(m/z)为50–500，溶剂延迟6.27 min，扫描速率为12.5光谱/s。原始数据分析，包括峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分和峰对齐等分析，在Chroma TOF (v4.3x, LECO)软件上进行。使用LECO-Fiehn Rtx5数据库，通过质谱和保留指数(retention index)匹配进行代谢物鉴定(代谢产物后的数字是对于数据库中代谢产物保留指数数量增加的命名)^[13]。最后，去除质控(quality control, QC)样本中50%以下或QC样本中相对标准偏差(relative standard deviation, RSD) > 30%的峰^[13-14]。

使用ACD/Percepta 14.51.0 (内部版本3382)用于预测代谢物的解离常数(pKa)。

1.5 转录组学分析

转录组学分析在北京诺禾致源科技股份有限公司进行。菌株Y-9在硝化培养基中培养24 h后提取总RNA。在生物分析仪Agilent 2100系统(安捷伦科技公司)上使用RNA Nano 6000检测试剂盒测定RNA完整性。按照制造商的说明，将每个样品的3 μg RNA用作带有六碱基随机引物的模板，进行cDNA合成。测序文库采用聚合酶链反应扩增构建，使用Agilent 2100系统定量，并使用Illumina HiSeq平台(安捷伦科技公司)进行测序。

FASTQ格式的原始数据(raw reads)首先通过内部perl脚本进行处理。在此步骤中，从原始数据中通过过滤包含适配器的数据、包含ploy-N数据和低质量数据来获得可分析数据(clean reads)。同时，计算可分析数据的Q20、Q30和GC含量。所有下游分析均基于高质量的可分析数据(clean reads)。使用DESeq R软件(1.18.0)对2组进行差异表达分析，校正P < 0.05的基因被分别注释为差异表达。使用KOBAS软件统计注释在京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG;http://www.kegg.jp)数据库代谢通路中富集的差异表达基因。

1.6 数据处理和分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS Statistics 19对数据进行分析，使用Hiplot (科研数据可视化平台)、Office PowerPoint 2010和Origin Pro 2018C生成图表，结果以平均数±标准偏差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

收起

2.1Pseudomonas putida Y-9主动调节外部pH值

菌株Y-9在不同初始pH环境下的响应和生长如图1所示。在初始pH值为7.19的条件下培养24 h后，菌株Y-9的代谢产物提高了培养基中的碱度，胞外pH (extracellular pH, pHe)升至8.0，OD₆₀₀升至0.89。48 h后，pHe值继续上升至8.77，OD₆₀₀没有显著变化。在初始pH值为9.4的条件下培养24 h后，菌株的生长导致培养基的pHe降至8.70，OD₆₀₀仅增加到0.48。培养48 h后，OD₆₀₀迅速升高至1.172，而培养基的pHe仅增加0.27，升至8.97。在所有处理中，菌株Y-9的胞内pH (intracellular pH, pHi)均在6.89–7.19的狭窄范围内波动。结果表明，恶臭假单胞菌Y-9不仅可以调节细胞内pH以达到内部稳态，而且可以主动调节外部pH以稳定外部环境。在48 h培养过程中，Y-9将外部pH调节至8.77–8.97的狭窄范围。

2.2 不同pH培养条件下Pseudomonas putida Y-9的代谢特性

为了探究Y-9代谢物引起的培养基pH值变化，用GC-TOFMS分析了初始培养条件为pH 7.19和9.40的非靶代谢物。实验组为pH 7.19，对照组为pH 9.40。对原始数据进行峰提取和匹配后，保留了301个峰。以VIP > 1和P < 0.05的代谢物被认定为差异表达代谢物，130个显著下调，2个显著上调(图2)。根据LECO-Fiehn Rtx5数据库，可以注释差异的代谢物为51个。

为了进一步研究导致pH变化的显著差异代谢物，选择上调倍数变化(fold change, FC) > 2和下调倍数变化FC < 0.5的显著差异代谢物作为分析标准。用ACD/Percepta预测了这些代谢物的pKa，以确定显著差异代谢物对pH变化的不同贡献。如表1所示，培养48 h后，在初始pH值为7.19的处理中，只有2种代谢物显著上调，它们分别是麦芽糖醇(maltitol，56.81倍)和3-羟基-3-甲基谷氨酸(3-hydroxy-3-methylglutaric acid，53.61倍)，它们都是脂质化合物。根据亚类分类，3-羟基-3-甲基谷氨酸是含6个碳的中链脂肪酸，pKa (最强酸)为3.9±0.4 (表2)，表明其酸性高于麦芽糖醇。然而，培养基pH值的增加表明它不是导致pH值变化的主要因素，这可能是由于其绝对含量较低，无法影响培养基pH。麦芽糖醇的倍数上调最高，pKa (最强酸)值为12.4±0.1。从其物质本身的碱度来看，麦芽糖醇可能是培养基中pH值升高的原因。

显著下调的代谢产物有9种，分别为5-氨基戊酸3 (5-aminovaleric acid 3，0.12倍)、1, 5-脱水葡糖醇(1, 5-anhydroglucitol，0.20倍)、N(ε)-三甲基赖氨酸[N(epsilon)-trimethyllysine，0.31倍]、2-羟基吡啶(2-hydroxypyridine，0.39倍)、丙醇二酸(tartronic acid，0.41倍)、半胱氨酸甘氨酸3 (cysteinylglycine 3，0.44倍)、草氨酸(oxamic acid，0.45倍)、乳酰胺1 (lactamide 1，0.48倍)和二十四烷(tetracosane，0.50倍)。表2显示了显著上调和下调代谢物的pKa预测值。在下调代谢产物方面，5-氨基戊酸3的下调倍数最低，酸性基团的pKa为4.5±0.4，表明其酸性较强。丙醇二酸、半胱氨酸甘氨酸3和5-氨基戊酸3都是有机酸，丙醇二酸、半胱氨酸甘氨酸3的酸性基团的pKa最强，分别为2.3±0.4和3.1±0.4，仅次于酸性最高的草氨酸。结果表明，有机酸主导了对照组的pH降低。在未分类代谢产物中，草氨酸和N(ε)-三甲基赖氨酸也表现出较强的酸性，最强酸性基团的pKa分别为2.1±0.4和4.5±0.4。此外，乳酰胺1碱性基团中最强的pKa为1.2±0.5。二十四烷没有可解离基团，是一种中性物质，这表明未分类的代谢物也参与了对照组pH值的降低。2-羟基吡啶属于有机环化合物，酸性基团最强的pKa为4.9±0.4，这说明其也参与了降低培养基的pH值。

2.3 差异表达基因和KEGG通路分析

为了探究Y-9对不同初始pH培养条件的响应，该研究进一步做了转录组分析。数据质控显示，数据整体测序错误率为0.02 (< 0.05)，高质量数据Q20和Q30分别占总数据的98.63%和95.86%，G+C总数占碱基总数的59.9%。数据符合质量控制标准，可用于后续分析。通过RNA-seq共鉴定出4 613个基因，鉴定P < 0.05为差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，其中差异表达1 813个基因，上调DEGs为898个，下调DEGs为915个(图3A)。火山图描绘了差异基因log₂倍数变化和差异基因的KEGG代谢途径分类。

基于KEGG数据库的代谢途径富集分析，能揭示DEGs的代谢和信号传导途径。KEGG显著富集的结果(P < 0.05)如图3B所示。在差异基因显著富集的代谢途径中，只有核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，4个基因)完全富集了上调的差异基因，而鞭毛组装(flagella assembly，26个基因)、核糖体(ribosome，21个基因)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，20个基因)完全富集了下调的差异基因。此外，ABC转运蛋白(ABC transporters，64个基因)、双组分系统(two-component system，60个基因)和细菌趋化性(bacterial chemotaxis，17个基因)分布的下调基因较多，分别占其富集差异基因的58%、67%和82%。果糖和甘露糖代谢(fructose and mannose metabolism，6个基因)、细菌分泌系统(bacterial secretion system，13个基因)、组氨酸代谢(histidine metabolism，6个基因)和硫代谢(sulfur metabolism，11个基因)以上调基因为主，分别占其富集差异基因的83%、69%、83%和73%。

2.4Pseudomonas putida Y-9响应初始pH 7.19上调表达的基因

上调的基因响应初始外部pH值为7.19的外部环境(图4)。在组氨酸代谢途径中，与l-组氨酸(l-histidine)代谢为l-谷氨酸(l-glutamate)过程相关的基因均上调(图4A)。其中，编码组氨酸解氨酶的基因hutH和编码甲酰亚氨基谷氨酸脱亚氨酶的基因hutF分别上调1.94倍和1.18倍。在果糖和甘露糖代谢中，与GDP-d-甘露糖(GDP-d-mannose)转化为海藻酸盐(alginate)过程相关的基因上调。在核苷酸切除修复途径中，基因uvrA (1.25倍)和mfd (1.03倍)显著上调(图4B)。ABC转运和双组分系统途径中富集的上调基因主要与阳离子转运相关(图4C)。ABC转运中的基因PP4_52670 (1.13倍)、PP4_52000 (2.01倍)和PP4_52010 (1.41倍)编码与铁离子转运相关的蛋白质AfuBC。基因znuA (1.13倍)、znuB (1.13倍)和znuC (1.13倍)分别编码锌离子转运相关蛋白ZnuABC。在双组分系统中，kdpA (1.54倍)和kdpB (1.65倍)编码蛋白KdpA和KdpB参与了钾离子转运。

2.5Pseudomonas putida Y-9响应初始pH 9.40下调表达的基因

下调的基因响应外部初始pH为9.40的环境(图5)。在氧化磷酸化代谢过程中(图5A)，大量的基因和蛋白质功能已被证明与细菌的pH稳态有关^[15]。在复合物Ⅰ (complex Ⅰ, CI)中，与氢离子泵相关的基因nouC和nouB下调−1.16和−1.22。在复合物Ⅳ (CⅣ)中，大量编码细胞色素c氧化酶的基因被下调，如coxC (−2.01)、coxA (−2.08)、coxB (−2.03)、ccoN2 (−1.20)和ccoP2 (−1.23)，它们已被证明与驱动氢离子易位有关。参与编码F₁F₀-ATP酶的基因aptC也下调了−1.20。

在ABC转运途径中，15个与磷酸盐和氨基酸转运相关的基因被下调，它们负责胱氨酸、谷氨酸/天冬氨酸、精氨酸/鸟氨酸、一般l-氨基酸和支链氨基酸的转运(图5B)。在双组分系统通路中，C4-二羧酸(C4-dicarboxyrate)转运和氮同化基因下调(图5C)。氮同化相关基因ntrB (−2.61)、ntrC (−2.35)和spuI (−1.33)的调控可能是碱性条件下后期Y-9生长较好的原因。

3 讨论与结论

收起

大多数微生物保持狭窄的细胞质pH范围，通常适宜的pH环境更接近中性^[16]。例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)即使培养基pH值从6.0变为9.0，仍可将细胞质pH维持在7.5±0.5^[17]。本研究表明，当胞外pH值为7.19或9.40时，菌株Y-9可将细胞内pH维持在中性范围，这与前人研究结论一致。

在改变外部环境的pH值方面，细菌代谢产物会引起外部环境的酸化或碱化。以LB为培养基，在初始pH值为6.0、7.0和8.0的条件下培养恶臭假单胞菌KT2440至40 h，胞外pH均升高并收敛至8.8左右^[18]。这与在初始pH为7.19的条件下培养恶臭假单胞菌Y-9所显示的结果非常相似。更有趣的是，本研究发现在初始pH值为9.40时，培养Y-9也会导致外部pH值下降并趋向于8.77–8.97范围(图1)。由于这种主动调节细胞外pH值趋向于狭窄范围的现象与细菌胞内pH稳态机制相似，因此认为Y-9具有一套稳定外部pH的调节机制。

在过去的研究中，一些微生物的细胞质碱化伴随着代谢酸的产生，这平衡了细胞质pH并保护细胞免受损伤。许多嗜碱菌还可以产生有机酸，甚至可以显著降低培养基的pH值^[3]。在碱性pH条件下，与葡萄糖相关的糖发酵途径会转化葡萄糖产生更多的酸性物质，如乙酸盐^[4]。与pH 7.4相比，在pH 8.2的条件下培养具核梭杆菌，在培养后的培养物中观察到了乳酸、甲酸盐、乙酸盐和丁酸盐的产量增加^[19]。厌氧细菌植物乳秆菌(Lactobacillus plantarum)偏好酸性的生长环境，它可以通过代谢生产乳酸来降低土壤环境中的pH^[20]。芽孢杆菌Bacillus sp. ZM20和蜡状芽孢杆菌B.cereus在ZnO的抑制环境中培养，主要通过生产乳酸和乙酸来酸化胞外环境^[21]。在本研究中，Y-9也产生了有机酸，如丙醇二酸、半胱氨酸甘氨酸3和5-氨基戊酸3，以及高酸性的草氨酸(表2)。Y-9产有机酸响应外部较高的初始pH并降低了外部pH值。

在酸性环境中，细菌会响应外部环境而产生碱性物质。白色念珠菌(Candida albicans)可以分解氨基酸作为碳源，并转化成氨排出胞外，从而增加外部环境的pH值^[22]。然而，在本研究中，Y-9同化利用NH₄⁺，培养基中的NH₄⁺在Y-9的生长过程中逐渐减少。Y-9在初始pH值为7.19的培养过程中麦芽糖醇显著增加。麦芽糖醇的pKa值为12.4±0.1 (表2)，远大于NH₄⁺的9.25，这表明麦芽糖醇是导致Y-9胞外pH上升的原因之一。

耐酸相关基因上调是细菌应对酸应激的策略之一。在组氨酸代谢途径中，与组氨酸代谢为谷氨酸的过程相关基因均上调(图4A)。组氨酸脱氨酶和甲酰亚氨基谷氨酸脱亚氨酶在代谢过程中可产生氨。脱亚胺酶、脱氨酶和脲酶是产生碱性物质的主要酶系统，这些系统能够产生氨(NH₃)^[23]。此外，据报道，谷氨酸的存在可增加细菌的耐酸性^[24]。结果分析表明，Y-9可能将pH值为7.19的外部环境视为酸性环境。此外，在本研究中，与GDP-d-甘露糖代谢为海藻酸盐的相关基因均上调，这是否与pH稳态相关还有待进一步研究，以往研究中没有藻酸盐合成过程及其基因调控与细胞pH稳态相关的报道。

DNA在太酸或太碱环境中都会受损^[25]。在高碱性(pH > 10.0)条件下，DNA螺旋的2条链之间的氢键可能被破坏。DNA链受损，其复制和转录过程将因此被破坏。据报道，碱性胁迫下的大肠杆菌被诱导激活recA非依赖性DNA损伤修复系统(recA-independent DNA damage repair system)^[26]。在核苷酸切除修复途径中，蛋白UVRA负责在全基因组修复阶段监测基因组DNA损伤，然后MFD偶联的UVRA和UVRB对受损的DNA进行转录偶联修复^[27]。在中性培养条件下Y-9的核苷酸切除修复途径(图4B)相关基因上调，表明pH为7.19的外部条件可能引起了DNA损伤。

ABC转运和双组分系统途径中富集的上调基因主要集中在阳离子转运方面(图4C)。阳离子转运是pH稳态的众多机制之一，许多细菌主要通过对钾离子的摄取来补偿H⁺排出，从而在外部pH值偏低时碱化细胞质^[28]。尽管在过去的研究中没有直接证据表明锌离子和铁离子的转运与pH稳态有关。然而，嗜酸菌减少H⁺内流的机制可以产生内部正反转膜电位(Δψ)，吸收钾可以有效维持Δψ。有研究支持能量依赖性阳离子泵对Δψ的生产和维护起积极作用^[29]。这表明阳离子的流入对Y-9胞内pH稳态有积极影响。

初始pH值为7.19的条件下，胞外pH在Y-9培养过程中持续上升，结合代谢组和转录组的结果推测，外部中性pH可能被Y-9视为酸性压力环境。Y-9可能在中性pH条件下持续吸收外部H⁺，并通过阳离子转运和脱氨酶等机制维持细胞内pH稳态，并能合成碱性物质外排。

在Y-9的氧化磷酸化和鞭毛组装途径中显著下调的基因(图5A)与应对碱性环境相关。参与呼吸链复合物(复合物Ⅰ、复合物Ⅲ和复合物Ⅳ)的基因编码NADH-醌氧化还原酶亚基Ⅰ、细胞色素b亚基、细胞色素c1亚基和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ。这些基因的主要功能是H⁺的产生和易位^[30]。在外部pH为10.0时，嗜盐菌Egicoccus halophilus EGI 80 432^T中编码NADH-醌氧化还原酶亚基Ⅰ和细胞色素c1亚基的基因表达高于外部pH为8.0的环境，表明嗜盐菌EGI 80 432^T在碱性条件下，电子和H⁺可能在膜外表面上转移和积累^[31]。ATP合酶利用膜表面H⁺的电化学梯度合成ATP并将H⁺转移到细胞质中^[32]。同样，Y-9在碱性环境中也表现出相似的基因上调表达，表明Y-9也利用呼吸链复合物来稳定胞内pH值。此外，氢离子通道运动蛋白MotAB也参与pH稳态。

在初始pH为9.40的碱性环境中，Y-9的ABC转运途径中显著调节的基因编码胱氨酸、谷氨酸/天冬氨酸、精氨酸/鸟氨酸、一般l氨基酸和支链氨基酸的转运蛋白(图5B)。在pH为10.0的培养基中，粪肠杆菌(Enterobacter faecalis)编码氨基酸转运蛋白的基因均上调，氨基酸供应和转运增加^[33]。此外，转氨酶可将其他代谢物转化成酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸等，它们有助于细胞质酸化，这些酸性氨基酸也是氢离子的重要来源^[34]。这表明Y-9在碱性条件下，ABC转运蛋白可通过转运氨基酸帮助细胞内pH稳态。此外，脂多糖转运蛋白相关基因也受到显著调控。据报道，革兰氏阴性细菌膜含有脂多糖，这些脂多糖暴露在细胞外表面以排斥外部OH^−[3]。

在双组分系统代谢途径中，C4-二羧酸转运相关基因受到显著调节(图5B)。在好氧细菌中，二羧酸转运体(DctA)催化H⁺/Na⁺-二羧酸协同转运体摄取C4-二羧酸盐^[35]。该转运系统可能在调节嗜碱细菌细胞质中的pH稳态和钠循环中发挥重要作用^[36]。

综上所述，P.putida Y-9具有在外部pH值为7.19–9.40的环境中稳定外部pH的能力。代谢组分析表明，在初始pH为7.19的培养过程中，麦芽糖醇的产生提高了外部pH；在初始pH为9.40的培养过程中，有机酸和酸性物质的产生降低了外部pH值。转录组分析表明，在中性环境中，菌株Y-9通过上调脱氨酶、脱亚胺酶和阳离子转运相关基因维持了细胞内pH稳定性；通过调节NADH脱氢酶、细胞色素、ATP合酶和氨基酸转运的相关基因表达帮助维持细胞内酸度，应对碱性环境。本研究结果首先发现了P.putida Y-9具有稳定胞外pH的能力，探讨了其胞内pH稳态机制，拓展了对微生物与环境相互作用的认知，为进一步认识微生物脱氮过程中系统pH稳定机制提供了理论依据。

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2024年第64卷第1期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230363

接收时间：2023-05-25
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出版时间：2024-01-04

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收稿日期：2023-05-25
录用日期：2023-07-10

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Metabolite	CAS	Molecular formula	VIP^a	P-value	Fold change^b
VIP: Variable importance in the projection.^a: The importance of variables to the model.^b: Quantitative comparison between the same metabolite pH group and the control group (↑ represents upregulation and ↓ represents downregulation).
5-aminovaleric acid 3	660-88-8	C₅H₁₁NO₂	1.58	0.00	0.12 ↓
1, 5-anhydroglucitol	154-58-5	C₆H₁₂O₅	1.23	0.00	0.20 ↓
N(epsilon)-trimethyllysine	23284-33-5	C₉H₂₀N₂O₂	1.80	0.00	0.31 ↓
2-hydroxypyridine	142-08-5	C₅H₅NO	1.38	0.01	0.39 ↓
Tartronic acid	80-69-3	C₃H₄O₅	1.72	0.00	0.41 ↓
Cysteinylglycine 3	19246-18-5	C₅H₁₀N₂O₃S	1.48	0.01	0.44 ↓
Oxamic acid	471-47-6	C₂H₃NO₃	1.71	0.00	0.45 ↓
Lactamide 1	2043-43-8	C₃H₇NO₂	1.64	0.00	0.48 ↓
Tetracosane	646-31-1	C₂₄H₅₀	1.11	0.01	0.50 ↓
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	503-49-1	C₆H₁₀O₅	1.34	0.04	53.61 ↑
Maltitol	585-88-6	C₁₂H₂₄O₁₁	1.95	0.00	56.81 ↑

Metabolite

CAS

Molecular formula

VIP^a

P-value

Fold change^b

VIP: Variable importance in the projection.^a: The importance of variables to the model.^b: Quantitative comparison between the same metabolite pH group and the control group (↑ represents upregulation and ↓ represents downregulation).

5-aminovaleric acid 3

660-88-8

C₅H₁₁NO₂

1.58

0.00

0.12 ↓

1, 5-anhydroglucitol

154-58-5

C₆H₁₂O₅

1.23

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0.20 ↓

N(epsilon)-trimethyllysine

23284-33-5

C₉H₂₀N₂O₂

1.80

0.00

0.31 ↓

2-hydroxypyridine

142-08-5

C₅H₅NO

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Tartronic acid

80-69-3

C₃H₄O₅

1.72

0.00

0.41 ↓

Cysteinylglycine 3

19246-18-5

C₅H₁₀N₂O₃S

1.48

0.01

0.44 ↓

Oxamic acid

471-47-6

C₂H₃NO₃

1.71

0.00

0.45 ↓

Lactamide 1

2043-43-8

C₃H₇NO₂

1.64

0.00

0.48 ↓

Tetracosane

646-31-1

C₂₄H₅₀

1.11

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0.50 ↓

3-hydroxy-3-methylglutaric acid

503-49-1

C₆H₁₀O₅

1.34

0.04

53.61 ↑

Maltitol

585-88-6

C₁₂H₂₄O₁₁

1.95

0.00

56.81 ↑

Metabolite	pKa (strongest acid)	pKa (strongest base)	Super class	Pathway
pKa (strongest acid): The strongest dissociation constant of acidic groups; pKa (strongest base): The strongest dissociation constant of alkalic groups. −: None.
5-aminovaleric acid 3	4.5±0.4	10.7±0.4	Organic acids and derivatives	Map 00310 lysine degradation; map 00330 arginine and proline metabolism
1, 5-anhydroglucitol	13.2±1.0	−	Organooxygen compounds	−
N(epsilon)-trimethyllysine	4.5±0.4	−	Others	−
2-hydroxypyridine	4.9±0.4	−	Organoheterocyclic compounds	−
Tartronic acid	2.3±0.4	−	Organic acids and derivatives	−
Cysteinylglycine 3	3.1±0.4	7.1±0.5	Organic acids and derivatives	−
Oxamic acid	2.1±0.4	−	Others	−
Lactamide 1	13.5±0.9	1.2±0.5	Others	−
Tetracosane	−	−	Others	−
3-hydroxy-3-methylglutaric acid	3.9±0.4	−	Lipids and lipid-like molecules	−
Maltitol	12.4±0.1	−	Lipids and lipid-like molecules	−

Metabolite

pKa (strongest acid)

pKa (strongest base)

Super class

Pathway

pKa (strongest acid): The strongest dissociation constant of acidic groups; pKa (strongest base): The strongest dissociation constant of alkalic groups. −: None.

5-aminovaleric acid 3

4.5±0.4

10.7±0.4

Organic acids and derivatives

Map 00310 lysine degradation; map 00330 arginine and proline metabolism

1, 5-anhydroglucitol

13.2±1.0

−

Organooxygen compounds

−

N(epsilon)-trimethyllysine

4.5±0.4

−

Others

−

2-hydroxypyridine

4.9±0.4

−

Organoheterocyclic compounds

−

Tartronic acid

2.3±0.4

−

Organic acids and derivatives

−

Cysteinylglycine 3

3.1±0.4

7.1±0.5

Organic acids and derivatives

−

Oxamic acid

2.1±0.4

−

Others

−

Lactamide 1

13.5±0.9

1.2±0.5

Others

−

Tetracosane

−

Others

−

3-hydroxy-3-methylglutaric acid

3.9±0.4

−

Lipids and lipid-like molecules

−

Maltitol

12.4±0.1

−

Lipids and lipid-like molecules

−