微生物学报

分离菌株 Isolated bacteria	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter (mm)
XXLC06	24.71±0.49
XXLC08	20.01±0.34
XXLC17	11.16±0.53
XXLC24	10.02±0.32
XXLC31	14.11±0.46

分离菌株 Isolated bacteria	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter (mm)
XXLC06	24.71±0.49
XXLC08	20.01±0.34
XXLC17	11.16±0.53
XXLC24	10.02±0.32
XXLC31	14.11±0.46

生化项目 Biochemical item	XXLC06	XXLC08
VP试验 Voges-Proskauer test	-	-
碳源利用Carbon source utilization
d-葡萄糖d-glucose	+	+
d-纤维二糖d-cellobiose	+	-
阿拉伯糖Arabinose	+	+
菊糖Inulin	-	-
木糖Xylose	-	-
果糖Fructose	-	+
半乳糖Galactose	-	-
海藻糖Trehalose	-	-
蔗糖Sucrose	-	-
山梨醇Sorbitol	+	+
甘露醇Mannitol	+	+
木糖醇Xylitol	+	-
柠檬酸盐Citrate	-	-
酶活性Enzymatic activity
氧化酶Oxidase	-	-
溶菌酶Lysozyme	-	+
脂酶Lipase	+	-
过氧化氢酶Catalase	+	+
硝酸盐还原Nitrate reduction	-	-
赖氨酸脱羧酶肉汤 Lysine decarboxylase broth	+	+
l-精氨酸双水解酶 l-arginine dihydrolase	-	-
吲哚试验Indole test	-	-
水解活性Hydrolytic activity
淀粉Starch	+	+
七叶苷Esculin	-	-
明胶液化Gelatin liquefaction	-	-

生化项目 Biochemical item	XXLC06	XXLC08
VP试验 Voges-Proskauer test	-	-
碳源利用Carbon source utilization
d-葡萄糖d-glucose	+	+
d-纤维二糖d-cellobiose	+	-
阿拉伯糖Arabinose	+	+
菊糖Inulin	-	-
木糖Xylose	-	-
果糖Fructose	-	+
半乳糖Galactose	-	-
海藻糖Trehalose	-	-
蔗糖Sucrose	-	-
山梨醇Sorbitol	+	+
甘露醇Mannitol	+	+
木糖醇Xylitol	+	-
柠檬酸盐Citrate	-	-
酶活性Enzymatic activity
氧化酶Oxidase	-	-
溶菌酶Lysozyme	-	+
脂酶Lipase	+	-
过氧化氢酶Catalase	+	+
硝酸盐还原Nitrate reduction	-	-
赖氨酸脱羧酶肉汤 Lysine decarboxylase broth	+	+
l-精氨酸双水解酶 l-arginine dihydrolase	-	-
吲哚试验Indole test	-	-
水解活性Hydrolytic activity
淀粉Starch	+	+
七叶苷Esculin	-	-
明胶液化Gelatin liquefaction	-	-

受试药物 Test drug	标准抑菌圈直径 Standard inhibition zone diameter (mm)	Strain XXLC06	Strain XXLC08
头孢哌酮 Cefoperazone	≤15	16-20	≥21	28	S	27	S
头孢曲松 Ceftriaxone	≤13	14-20	≥21	27	S	27	S
头孢拉定 Cephradine	≤14	15-17	≥18	30	S	30	S
头孢噻吩 Cephalothin	≤14	15-17	≥18	25	S	22	S
头孢他啶 Ceftazidime	≤14	15-17	≥18	21	S	19	S
氨苄西林 Ampicillin	≤11	12-14	≥15	32	S	35	S
美罗培南 Meropenem	≤13	14-15	≥16	26	S	23	S
青霉素G Penicillin G	≤19	20-27	≥28	37	S	36	S
红霉素 Erythromycin	≤13	14-22	≥23	18	I	19	I
克拉霉素 Clarithromycin	≤13	14-17	≥18	27	S	26	S
氯霉素 Chloramphenicol	≤12	13-17	≥18	22	S	24	S
克林霉素 Clindamycin	≤14	15-20	≥21	24	S	27	S
链霉素 Streptomycin	≤11	12-14	≥15	23	S	20	S
阿米卡星 Amikacin	≤14	15-16	≥17	25	S	31	S
大观霉素 Spectinomycin	≤14	15-17	≥18	25	S	23	S
万古霉素 Vancomycin	≤14	15-16	≥17	25	S	22	S
复方新诺明 Sulfamethoxazole	≤10	11-15	≥16	35	S	37	S
利福平 Rifampicin	≤16	17-19	≥20	26	S	27	S
氧氟沙星 Ofloxacin	≤12	13-15	≥16	28	S	24	S
诺氟沙星 Norfloxacin	≤12	13-16	≥17	22	S	24	S
环丙沙星 Ciprofloxacin	≤15	16-20	≥21	25	S	24	S
四环素 Tetracycline	≤14	15-18	≥19	27	S	30	S
多西环素 Doxycycline	≤12	13-15	≥16	29	S	31	S
米诺环素 Minocycline	≤14	15-18	≥19	29	S	30	S

受试药物 Test drug	标准抑菌圈直径 Standard inhibition zone diameter (mm)	Strain XXLC06	Strain XXLC08
头孢哌酮 Cefoperazone	≤15	16-20	≥21	28	S	27	S
头孢曲松 Ceftriaxone	≤13	14-20	≥21	27	S	27	S
头孢拉定 Cephradine	≤14	15-17	≥18	30	S	30	S
头孢噻吩 Cephalothin	≤14	15-17	≥18	25	S	22	S
头孢他啶 Ceftazidime	≤14	15-17	≥18	21	S	19	S
氨苄西林 Ampicillin	≤11	12-14	≥15	32	S	35	S
美罗培南 Meropenem	≤13	14-15	≥16	26	S	23	S
青霉素G Penicillin G	≤19	20-27	≥28	37	S	36	S
红霉素 Erythromycin	≤13	14-22	≥23	18	I	19	I
克拉霉素 Clarithromycin	≤13	14-17	≥18	27	S	26	S
氯霉素 Chloramphenicol	≤12	13-17	≥18	22	S	24	S
克林霉素 Clindamycin	≤14	15-20	≥21	24	S	27	S
链霉素 Streptomycin	≤11	12-14	≥15	23	S	20	S
阿米卡星 Amikacin	≤14	15-16	≥17	25	S	31	S
大观霉素 Spectinomycin	≤14	15-17	≥18	25	S	23	S
万古霉素 Vancomycin	≤14	15-16	≥17	25	S	22	S
复方新诺明 Sulfamethoxazole	≤10	11-15	≥16	35	S	37	S
利福平 Rifampicin	≤16	17-19	≥20	26	S	27	S
氧氟沙星 Ofloxacin	≤12	13-15	≥16	28	S	24	S
诺氟沙星 Norfloxacin	≤12	13-16	≥17	22	S	24	S
环丙沙星 Ciprofloxacin	≤15	16-20	≥21	25	S	24	S
四环素 Tetracycline	≤14	15-18	≥19	27	S	30	S
多西环素 Doxycycline	≤12	13-15	≥16	29	S	31	S
米诺环素 Minocycline	≤14	15-18	≥19	29	S	30	S

注射样本类型 Injection sample type	宿主 Host	含菌量 Bacterial content (CFU/mL)
无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%) Sterile saline solution (0.65% NaCl by mass)	大口黑鲈 Micropterus salmoides	0
XXLC06	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸
XXLC08	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸

注射样本类型 Injection sample type	宿主 Host	含菌量 Bacterial content (CFU/mL)
无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%) Sterile saline solution (0.65% NaCl by mass)	大口黑鲈 Micropterus salmoides	0
XXLC06	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸
XXLC08	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸

大口黑鲈肠道源拮抗鰤鱼诺卡氏菌的芽孢杆菌的筛选鉴定及其生物学特性

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刘宸源 ¹ , 毛会丽 ¹ , 王乾坤 ¹ , 张荇荇 ¹ , 申长春 ¹ , 朱黎星 ¹ , 关树豪 ¹ , 孟攀 ¹ , 楚燕星 ¹ , 李旭东 ² , 关建义 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2026,66(3): 1088-1106

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(3): 1088-1106

大口黑鲈肠道源拮抗鰤鱼诺卡氏菌的芽孢杆菌的筛选鉴定及其生物学特性

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刘宸源¹, 毛会丽¹, 王乾坤¹, 张荇荇¹, 申长春¹, 朱黎星¹, 关树豪¹, 孟攀¹, 楚燕星¹, 李旭东², 关建义¹^,^*

作者信息

^1.河南医药大学生命科学技术学院，河南新乡

^2.河南省水产技术推广站，河南郑州

Screening, identification, and characterization of Bacillus strains antagonistic against Nocardia seriolae from the intestine of Micropterus salmoides

Chenyuan LIU¹, Huili MAO¹, Qiankun WANG¹, Xingxing ZHANG¹, Changchun SHEN¹, Lixing ZHU¹, Shuhao GUAN¹, Pan MENG¹, Yanxing CHU¹, Xudong LI², Jianyi GUAN¹^,^*

Affiliations

^1.School of Life Science and Technology, Henan Medical University, Xinxiang, Henan, China

^2.Fisheries Technology Extension Station in Henan Province, Zhengzhou, Henan, China

出版时间: 2026-03-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250640

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摘要

收起

目的从健康大口黑鲈(Micropterus salmoides)肠道中筛选对鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)具有拮抗作用的潜在益生菌。方法采集大口黑鲈肠道样本，经梯度稀释后涂布于TSA平板以分离和纯化菌株。采用打孔法筛选对鰤鱼诺卡氏菌具有拮抗效果的菌株作为后续实验菌。通过形态学特征、生理生化特性、16S rRNA基因序列同源性比对及系统发育树分析鉴定菌株种属，并对实验菌的生长特性、黏附能力、无细胞发酵上清液抑菌活性及生物安全性进行测定和分析。结果从40株分离菌中筛选出2株对鰤鱼诺卡氏菌具有稳定且显著拮抗作用的菌株XXLC06和XXLC08，分别鉴定为拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)与纺锤状赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。2株菌在温度25-37 ℃、盐度5‰-30‰、pH 5.5-9.0条件下生长良好，在0.3%和0.5%胆盐浓度下的存活率均高于53%。自聚集实验显示，8 h后XXLC06与XXLC08的自聚集率分别为68.09%和63.16%。在3种有机溶剂中，XXLC06与XXLC08的疏水率均高于50%。2菌株与鰤鱼诺卡氏菌静置共聚8 h后，共聚集率分别达54.62%和52.44%。XXLC06和XXLC08的无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌的抑菌圈直径分别为(28.15±0.44) mm和(22.63±0.52) mm。2菌株均未表现出溶血活性，对23种受试抗菌药物敏感；急性攻毒试验证实其对大口黑鲈无致病性。结论菌株XXLC06和XXLC08具有良好的生长适应性、黏附能力、生物安全性及稳定的体外拮抗活性，为防控鰤鱼诺卡氏菌提供了潜在的益生菌资源与实验依据。

关键词

肠道益生菌 / 拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌 / 纺锤状赖氨酸芽孢杆菌 / 大口黑鲈

Abstract

收起

Objective To screen potential probiotics with antagonistic effects against Nocardia seriolae from the intestine of healthy largemouth bass (Micropterus salmoides). Methods Intestinal samples were collected from healthy largemouth bass, and strains were isolated and purified via serial dilution and spreading on TSA plates. The hole-punch method was adopted to select strains with antagonistic effects against N. seriolae as test strains for subsequent experiments. The species of the test strains were identified through morphological characterization, physiological and biochemical tests, 16S rRNA gene sequence alignment, and phylogenetic analysis. Additionally, the growth characteristics, adhesion ability, antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants, and biosafety of the test strains were determined and analyzed. Results Among the 40 bacterial strains isolated from the intestinal samples of healthy largemouth bass, two strains (XXLC06 and XXLC08) with stable and significant antagonistic effects against N. seriolae were selected. XXLC06 was identified as Lysinibacillus macroides and XXLC08 as Lysinibacillus fusiformis. Both strains grew well at 25-37 ℃, salinities of 5‰-30‰, and pH 5.5-9.0, with survival rates higher than 53% at 0.3% and 0.5% bile salt concentrations. Auto-aggregation assays showed that the auto-aggregation rates of XXLC06 and XXLC08 after 8 h were 68.09% and 63.16%, respectively. In the three organic solvents, both XXLC06 and XXLC08 exhibited hydrophobicity rates exceeding 50%. After co-incubation with N. seriolae for 8 h, the co-aggregation rates of the two strains reached 54.62% and 52.44%, respectively. The diameters of the inhibition zones of cell-free fermentation supernatants of XXLC06 and XXLC08 against N. seriolae were (28.15±0.44) mm and (22.63±0.52) mm, respectively. Neither strain showed hemolytic activity, and both were sensitive to 23 tested antibacterial agents. Acute toxicity tests confirmed that they were non-pathogenic to largemouth bass. Conclusion Strains XXLC06 and XXLC08 exhibited favorable growth adaptability, adhesion capability, biosafety, and stable antagonistic activity in vitro . This study provides potential probiotic resources and experimental evidence for the control of N. seriolae.

Key words

intestinal probiotics / Lysinibacillus macroides / Lysinibacillus fusiformis / Micropterus salmoides

引用本文

刘宸源, 毛会丽, 王乾坤, 张荇荇, 申长春, 朱黎星, 关树豪, 孟攀, 楚燕星, 李旭东, 关建义. 大口黑鲈肠道源拮抗鰤鱼诺卡氏菌的芽孢杆菌的筛选鉴定及其生物学特性. 微生物学报, 2026 , 66 (3) : 1088 -1106 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250640

Chenyuan LIU, Huili MAO, Qiankun WANG, Xingxing ZHANG, Changchun SHEN, Lixing ZHU, Shuhao GUAN, Pan MENG, Yanxing CHU, Xudong LI, Jianyi GUAN. Screening, identification, and characterization of Bacillus strains antagonistic against Nocardia seriolae from the intestine of Micropterus salmoides[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (3) : 1088 -1106 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250640

正文

收起

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，也称加州鲈，隶属于鲈形目(Perciformes)太阳鱼科(Centrarchidae)黑鲈属(Micropterus)，原产于北美洲，是一种肉食性淡水养殖鱼类^[1]。自1983年引入中国内陆以来，大口黑鲈因其食性易于驯化、生长迅速、抗逆性强且营养丰富，展现出较高的经济价值^[2]。随着养殖模式的多元化和养殖规模的持续扩大，大口黑鲈现已发展成为我国重要的特色淡水经济养殖品种^[3]。然而，在大口黑鲈养殖产业蓬勃发展的同时，各类病害问题也日益凸显。其中，由鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)引起的诺卡氏菌病是当前大口黑鲈养殖中最具破坏性的细菌性疾病之一；该病具有潜伏期长、传染性强等特点^[4]，常导致养殖群体生长迟缓、死亡率上升，严重制约养殖产量与产品质量，给产业带来巨大经济损失。因此，探究鱼类诺卡氏菌病的有效防控策略，保障大口黑鲈养殖业的健康可持续发展，已成为当前水产养殖领域的重要研究方向。

近年来，益生菌在水产养殖领域的应用日益广泛，作为一种绿色、安全且高效的生物防控手段，其在维持水生动物肠道微生态平衡、增强机体免疫力以及抑制病原菌生长等方面发挥着重要作用^[5]。当前水产养殖中普遍应用的益生菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)以及酵母菌(Saccharomyces)等微生物^[6]。芽孢杆菌与其他益生菌相比，其显著特征是能够在细胞内形成具有耐热性、耐酸碱性、耐盐性、耐干燥以及抗氧化特性的厚壁芽孢，即内生孢子^[7]。这种生物学特性赋予了芽孢杆菌强大的环境适应性，使其能够在极端条件下维持生存。众多研究表明，从水生动物肠道中筛选出的芽孢杆菌类益生菌不仅能够有效调节肠道菌群结构，促进宿主对营养物质的消化吸收，还能通过产生抗菌物质、竞争黏附位点等机制抑制病原菌在肠道内的定殖与生长^[8-10]。

在当前国内水产养殖领域的研究中主要涉及的芽孢杆菌类益生菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)^[10-12]。相较于其他种类，赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)作为水产养殖益生菌的相关报道较少，但现有研究表明其具有独特应用潜力。例如，管立平等^[13]初步研究表明，持续添加赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长及存活具有一定促进作用，且显著调控养殖水质中铵态氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量及pH值；于珺妃等^[14]研究发现，源自鲤(Cyprinus carpio)肠道的赖氨酸芽孢杆菌具有良好的产二肽基肽酶-IV (DDP-IV)抑制剂能力，并具备潜在的降低血糖功能。

本研究从大口黑鲈肠道中筛选出对鰤鱼诺卡氏菌具有拮抗活性的菌株XXLC06和XXLC08，通过菌落形态特征、生理生化特性及基于16S rRNA基因序列的系统发育树分析，对2株目标菌进行了分类学鉴定。同时，对菌株XXLC06和XXLC08的生长特性、黏附能力等进行测定，有助于掌握其在大口黑鲈养殖环境中的适应能力，以便更好地发挥其防控病害的功效。此外，测定2株菌的无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌XXLX2的抑菌活性，并对菌株XXLC06和XXLC08进行溶血试验、药物敏感性试验及急性攻毒试验，以探究其作为益生菌候选株的潜力，从而为大口黑鲈诺卡氏菌病的生物防控奠定基础。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 材料鱼和试验菌株

本研究所有动物实验均获得新乡医学院动物伦理委员会批准，编号为XYLL-2020451。健康大口黑鲈[平均体长为(11.03±0.36) cm，平均体重为(13.42±0.71) g]购自河南省新乡市银丰养殖场。实验室水循环系统中各水箱采用有效浓度为200 mg/L的福尔马林溶液浸泡1 h，之后使用清水冲洗3-5次以去除甲醛残留。将采购的大口黑鲈置于有效浓度为15 mg/L的福尔马林溶液中浸浴15 min进行体表消毒，随后将其转移至经清洁处理的循环系统水箱内进行适应性暂养，同时开启循环系统下紫外灭菌灯，对循环水体进行持续灭菌，以维持洁净的水体环境。实验前随机选取10尾健康大口黑鲈开展细菌、病毒及寄生虫检测，确保实验鱼无病原微生物感染且未携带寄生虫。鰤鱼诺卡氏菌(N. seriolae) XXLX2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) XDMG、枯草芽孢杆菌(B. subtilis) XXWC11保存于本课题组实验室。

1.1.2 主要试剂和仪器

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar, TSA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth, TSB)培养基、细菌微量生化鉴定试剂盒，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒，宝日医生物技术(北京)有限公司；2×Taq MasterMix，江苏康为世纪生物科技股份有限公司；血琼脂平板，常德比克曼生物科技有限公司；细菌药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司。

扫描电子显微镜(SEM)，Hitachi公司；高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 肠道源拮抗菌的分离与筛选

1.2.1 细菌分离

随机选取8尾健康大口黑鲈，置于含有丁香酚(1:20 000)的水箱中进行麻醉处理。待鱼体出现明显的麻醉迹象后，将其捞出并在生物安全柜中进行解剖实验。使用75%乙醇棉球对鱼体表面进行消毒，消毒彻底后，使用无菌剪刀从泄殖孔处剪开并取出鲈鱼的肠道。利用无菌镊子小心地挤出肠道内的消化物，再用PBS冲洗3-4次。将8尾鲈鱼的前、中、后肠分别剪切成2 cm肠段，每尾鱼各肠段分别置于对应的无菌离心管中。每管加入1 mL PBS溶液，并在振荡仪中充分振荡以制备匀浆。将匀浆置于60 ℃水浴锅中恒温处理30 min，以4 000 r/min离心3 min，收集上层液，采用10倍梯度稀释法进行逐级稀释，制备成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度的稀释液。分别吸取各组稀释液100 μL，均匀涂布在对应的TSA培养基上进行筛选，每组样本涂布10个平板。将培养皿倒置于28 °C恒温培养箱中，在24-48 h的培养期间，根据不同的菌落形态和颜色挑选出单个菌落，并在TSA平板上进行反复划线纯化。将纯化后的单菌落接种于TSB培养基中，按照菌液与甘油1:1的体积比加入50%的无菌甘油，并保存于-80 ℃的冰箱中，菌株的编号依次为XXLC01-XXLC40。

1.2.2 拮抗菌初筛

通过打孔法对分离的细菌进行初步筛选，以鰤鱼诺卡氏菌XXLX2作为指示菌。将经121 ℃灭菌的TSA培养基冷却至45-50 ℃时倒平板，待培养基凝固并降至室温后，分别吸取100 μL鰤鱼诺卡氏菌悬液滴加至各培养基平板表面，使用无菌棉签均匀涂布，以无菌塑封膜密封，将培养皿倒置于28 ℃恒温箱中培养。48 h后取出平板，于生物安全柜中开启培养皿盖。以拮抗鰤鱼诺卡氏菌的枯草芽孢杆菌XXWC11作为阳性对照，TSB液体培养基作为阴性对照，使用无菌打孔器(直径7 mm)在平板上均匀制备3个孔位，每个平板中选取2孔，分别加入30 μL枯草芽孢杆菌XXWC11菌液和30 μL TSB液体培养基，剩余孔位分别加入30 μL上述各分离菌株菌液。随后正置于28 ℃恒温箱中继续培养，18 h后开始每隔2 h观察抑菌圈形成情况，直至抑菌圈显现，记录产生抑菌圈的菌株。

1.2.3 拮抗菌复筛

采用打孔法对产生抑菌圈的菌株进行复筛试验，指示菌同1.2.2节。待无菌TSA培养基平板凝固后，分别吸取100 μL鰤鱼诺卡氏菌悬液滴加至各培养基平板表面，使用无菌棉签涂布均匀，平板以无菌塑封膜密封，倒置于28 ℃恒温箱中培养48 h。培养结束后取出平板，于生物安全柜中开启培养皿盖，使用无菌打孔器(直径7 mm)在平板中央制备孔位，分别向各孔中加入30 μL初筛拮抗菌株菌液。每株拮抗菌样本进行3次平行实验，正置于28 ℃恒温条件下继续培养。综合初筛与复筛的数据结果，筛选出2株对鰤鱼诺卡氏菌具有稳定且显著拮抗作用的菌株XXLC06和XXLC08，并确定其为后续研究的目标菌株。

1.3 菌株种属鉴定

1.3.1 形态学观察

吸取分离纯化后的菌株XXLC06和XXLC08的菌悬液，经10倍梯度稀释法稀释至10^-4稀释度，分别吸取100 μL上述稀释菌液均匀涂布于相应的TSA培养基上，28 ℃培养24 h，观察2株菌的外观形态、大小、颜色等。同时，分别从2株菌中挑取单菌落接种于TSB培养基中，于28 ℃、180 r/min摇床培养至指数生长期(OD₆₀₀值为0.8-1.0)，吸取2 μL菌液置于无菌载玻片上，经革兰氏染色后，在显微镜下观察菌体特征。此外，分别吸取2株菌的培养菌悬液(OD₆₀₀值为0.8-1.0)各1.5 mL置于2 mL无菌离心管中，以4 ℃、4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沿管壁缓慢加入1.5 mL戊二醛固定液(25 mg/mL)至含有菌体沉淀的离心管内，将固定后的样品委托科学指南针测试平台进行扫描电镜观察。

1.3.2 生理生化特性检测

使用细菌生化鉴定试剂盒对菌株XXLC06和XXLC08进行生化指标检测，参照《常见细菌系统鉴定手册》^[15]和《伯杰细菌鉴定手册》^[16]进行生理生化鉴定，并以试剂盒说明书为依据，记录各项生化指标检测结果。

1.3.3 16S rRNA基因序列测定及系统发育树的构建

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株XXLC06和XXLC08的基因组DNA，分别以2株菌的基因组DNA为模板，使用2×Taq MasterMix及16S rRNA基因通用引物^[17](上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、下游引物5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行目标基因的PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：ddH₂O 9.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，29个循环；72 ℃终延伸5 min。经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化PCR产物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将所得基因序列通过BLAST在GenBank中进行同源性比对分析，并使用MEGA 11.0软件中邻接(neighbor joining, NJ)法构建系统发育树。

1.4 拮抗菌的生长特性分析

1.4.1 温度对拮抗菌生长的影响

参照高艳侠等^[18]的研究方法，将终浓度均为1.5×10⁸ CFU/mL的拮抗菌XXLC06和XXLC08的培养液，按照1%接种量转接至已灭菌的TSB培养基中，并置于不同温度(25、28、32、35、37 ℃)的恒温摇床中180 r/min培养。

1.4.2 盐度对拮抗菌生长的影响

将菌株XXLC06和XXLC08的培养液以1%接种量分别转接至盐度梯度为5‰、20‰、30‰、40‰的无菌TSB培养基中，在最适温度、最适初始pH条件下180 r/min培养。

1.4.3 酸碱对拮抗菌生长的影响

将菌株XXLC06和XXLC08的培养液按照1%接种量分别转接至已灭菌的初始pH值分别为3.0、5.5、7.0、8.0、9.0、11.0的TSB培养基中，在最适生长温度条件下180 r/min培养。

上述实验均进行3次重复，每隔2 h取菌株培养液，使用紫外可见分光光度计于600 nm波长处测量其光密度(OD₆₀₀)值，以此监测细菌生长动态，并绘制不同条件下的生长曲线。

1.4.4 胆盐对拮抗菌生长的影响

分别取2株拮抗菌的新鲜菌液各5 mL，接种至含有不同浓度胆盐(0.3%、0.5%)的100 mL TSB培养基中，置于32 ℃、180 r/min的摇床内，分别振荡培养0、1、2、3、5 h后，采用稀释涂布法对各组处理后的存活菌落进行计数。实验设置3次独立重复，每次重复包含3个平行实验。将起始时刻的数据记为T₀，其余时刻的数据记为T_n (n=1、2、3、5)，并按照公式(1)计算存活率。

存活率=T_n/T₀×100%(1)

1.5 拮抗菌的黏附能力测定

1.5.1 拮抗菌的自聚集能力测定

参照向鑫玲等^[19]的研究方法，将菌株XXLC06和XXLC08分别接种在TSB培养基中，32 °C、180 r/min培养12 h后，于5 mL离心管中4 ℃、5 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，使用PBS洗涤2-3次后，将每管菌体沉淀重悬于4 mL PBS缓冲液中，振荡30 s混匀后静置。同时，以枯草芽孢杆菌XXWC11作为阳性对照，以PBS溶液作为空白对照，分别于0、2、4、6、8 h从每管中吸取1 mL上层菌悬液与2 mL PBS混合，测定3株菌在波长600 nm处的吸光值，按照公式(2)计算菌株的自聚集率。

A=(A₀-A_t)/A₀×100%(2)

式中：A₀为在600 nm处初始时间0 h的吸光值；A_t为在600 nm处对应不同时间的吸光值。

1.5.2 拮抗菌的疏水能力测定

同1.5.1节的方法，待PBS缓冲液洗涤2-3次后，将菌体沉淀重悬于PBS中。吸取2 mL菌悬液，分别与3种有机溶剂(二甲苯、氯仿和乙酸乙酯)各1 mL混合，振荡30 s后静置10 s，再涡旋3 min以充分混匀，随后静置60 min分层。分别取各组水相，以PBS作为空白对照，测定各组在波长600 nm处的吸光值，按照公式(3)计算菌株的疏水率。

H=(A₀-A)/A₀×100%(3)

式中：A₀为与3种有机试剂混合前600 nm的吸光值；A为与3种有机试剂混合后600 nm的吸光值。

1.5.3 拮抗菌的共聚集能力测定

依照1.5.1节的方法，用PBS洗涤细胞2-3次后，将沉淀重新悬浮于PBS中。同时，鰤鱼诺卡氏菌XXLX2也采用相同方法悬浮于PBS缓冲液中。分别吸取2 mL菌株XXLC06和XXLC08的菌悬液，与等量的菌株XXLX2菌悬液混合于5 mL的收集管中，通过涡旋振荡30 s以充分混匀。同时，在0、2、4、6、8 h分别测定其在波长600 nm处的吸光值，按照公式(4)计算拮抗菌与致病菌的共聚集率。

A=(A₀-A_mix)/A₀×100%(4)

式中：A₀为初始时间0 h混合菌悬液在600 nm处的吸光值；A_mix为各个时间点的混合菌悬液在600 nm处的吸光值。

1.6 无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌的抑菌效果测定

菌株XXLC06和XXLC08分别接种于TSB培养基中，在32 °C、180 r/min条件下培养48 h后，将培养液以5 000 r/min离心10 min，分别收集2株菌的发酵上清液，经0.22 μm无菌滤膜过滤3次，转移至无菌收集管，4 ℃保存备用。吸取100 μL鰤鱼诺卡氏菌悬液滴加至TSA培养基平板上，使用无菌棉签涂布均匀，利用无菌打孔器(直径7 mm)在含菌的TSA平板上均匀打3个孔，对照孔中加入100 μL无菌TSB培养基，而试验孔则加入等量的菌株XXLC06和XXLC08的无细胞发酵上清液，进行3次平行试验，将平板正置于28 °C恒温培养箱中培养4 d，观察并测量抑菌圈的直径。所得数据采用SPSS 21.0软件进行分析处理。

1.7 安全性评价

1.7.1 拮抗菌溶血性测定

将菌株XXLC06和XXLC08的菌悬液采用打孔法接种于血琼脂平板上，以具备溶血特性的嗜水气单胞菌XDMG作为阳性对照，以无菌的TSB培养基作为阴性对照。在每组的加样孔中均注入30 μL的相应样品液，32 °C恒温培养24 h，观察平板上样品孔周围是否出现溶血现象。

1.7.2 药敏试验

将XXLC06和XXLC08的菌悬液浓度均调整至1.0×10⁸CFU/mL，并依据(Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI)的标准进行操作。分别取2株菌的菌悬液各100 μL，均匀涂布于相应的TSA培养基平板表面，使用无菌镊子将24种药敏片分别贴置于各平板中央区域。采用塑封膜密封平板后，于32 °C恒温箱中正置培养24 h，测量各药敏纸片周围抑菌圈的直径。参照药敏纸片说明书，评估2株受试菌株的药物敏感性。

1.7.3 急性攻毒试验

选取健康且规格相近的大口黑鲈进行急性攻毒试验，每组设置3个平行，每个平行包含10尾鱼，各组分别腹腔注射100 μL无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%)、1.0×10⁸ CFU/mL的XXLC06、XXLC08。试验周期为7 d，水箱内水温控制在(25±2) °C，其间每天观察并记录各组大口黑鲈的生长和死亡情况。

2 结果与分析

收起

2.1 细菌的分离纯化及拮抗菌筛选

基于菌落形态特征与生长时间差异，从健康大口黑鲈肠道样本中分离获得40株细菌。初筛结果表明，其中5株细菌对鰤鱼诺卡氏菌具有拮抗活性(图1A-1E)。通过对这5株潜在拮抗菌株进行复筛试验，最终筛选出拮抗性能稳定且抑菌活性较强的菌株XXLC06和XXLC08 (表1)，并将这2株菌作为后续研究的实验菌株。

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 形态特征观察

在TSA培养基平板上，菌株XXLC06和XXLC08的菌落形态呈近圆形，中心部位略微隆起，质地湿润、黏稠且不透明(图2)。其中，XXLC06菌株形成的菌落呈淡黄色，而XXLC08菌株在TSA培养基平板上的菌落呈米白色。扫描电子显微镜观察显示，与XXLC08菌株相比，XXLC06菌株呈长杆状；此外，这2株菌均存在菌体相互聚集的特征。经革兰氏染色法镜检观察，这2株菌均被鉴定为革兰氏阳性菌，其细胞形态表现为杆状。

2.2.2 生理生化特性鉴定

菌株XXLC06和XXLC08的生理生化指标检测结果如表2所示，2株菌均能以d-葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇作为碳源进行生长，而不能利用菊糖、木糖、半乳糖、海藻糖、蔗糖、柠檬酸盐；同时，XXLC06可利用d-纤维二糖及代谢木糖醇，而XXLC08可利用果糖。酶活性分析显示，这2株菌的过氧化氢酶和赖氨酸脱羧酶活性均为阳性，而氧化酶、硝酸盐还原、l-精氨酸双水解酶活性及吲哚试验均为阴性；其中，XXLC06菌株脂酶检测为阳性，XXLC08溶菌酶检测呈阳性。此外，2株菌均可水解淀粉，但不水解七叶苷，不液化明胶，VP试验结果为阴性。依据《常见细菌系统鉴定手册》^[15]及《伯杰细菌鉴定手册》^[16]所载细菌生理生化指标，推测2株菌可能隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.2.3 16S rRNA基因序列分析与系统发育树构建

测序结果显示，XXLC06和XXLC08的16S rRNA基因片段长度分别为1 461 bp和1 449 bp。通过BLAST在线比对分析，XXLC06的16S rRNA基因与NCBI数据库中的拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌(GenBank登录号为KR085803.1)的核苷酸序列具有99.72%的相似性；而XXLC08的16S rRNA基因与NCBI数据库中的纺锤状赖氨酸芽孢杆菌(GenBank登录号为MK753026.1)的核苷酸序列相似性高达99.93%。基于16S rRNA基因序列，在种属水平上利用MEGA 11.0软件，采用邻接(neighbor joining, NJ)法构建系统发育树(图3)。结果显示，XXLC06与拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌、XXLC08与纺锤状赖氨酸芽孢杆菌自然聚类于同一分支。综合菌株形态特征和生理生化特性，鉴定XXLC06为拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌，XXLC08为纺锤状赖氨酸芽孢杆菌。

2.3 菌株XXLC06和XXLC08的生长特性研究

研究结果显示，菌株XXLC06和XXLC08在25-37 °C的温度范围内均表现出良好的生长能力，2株菌的最适生长温度均为32 °C；在32-37 ℃的环境中，2株试验菌能够更早地达到生长稳定期(图4A、4B)。菌株XXLC06和XXLC08在不同盐度条件下的生长情况表明，2株菌在5‰-30‰的盐度范围内可正常生长，在5‰盐度条件下进入稳定期时其OD₆₀₀值达到最大；且在盐度为5‰-30‰的情况下，2株菌均能在14-18 h内达到稳定期(图4C-4D)。菌株XXLC06和XXLC08在不同pH条件下的生长特性表明，2株菌在环境pH值为5.5-9.0时能够生长，其最适初始pH值均为7.0；而在pH为3.0和11.0的极端条件下，菌株XXLC06和XXLC08的生长活性被完全抑制(图4E-4F)。此外，在不同胆盐浓度(0.3%、0.5%)条件下，菌株XXLC06和XXLC08的存活率随处理时间延长呈持续降低趋势(图4G、4H)；然而经5 h处理后，2株菌在2种胆盐环境中的存活率均高于53%，表明其对浓度不超过0.5%的胆盐均具有较强耐受性。

2.4 菌株XXLC06和XXLC08的黏附能力测定

2.4.1 菌株XXLC06和XXLC08的自聚集能力测定

细菌的自聚集现象是指在一定条件下，细菌通过相互作用自发地聚集形成群体结构，该现象与细菌的黏附能力紧密相关。3株菌的自聚集结果如图5A所示，菌株XXLC06和XXLC08的自聚集能力均强于阳性对照菌XXWC11，并且在8 h的静置培养过程中，3株菌的自聚集率随着时间的推移均显著升高(P<0.05)。其中，XXLC08菌株在8 h的自聚集率为63.16%，而XXLC06菌株的自聚集能力更为突出，其在8 h的自聚集率达到了68.09%。

2.4.2 菌株XXLC06和XXLC08的疏水能力测定

在本研究中，菌株XXLC06和XXLC08对3种有机溶剂(二甲苯、氯仿和乙酸乙酯)的黏附能力被用作评估菌体表面疏水性的指标。如图5B所示，XXLC06和XXLC08在二甲苯和氯仿2种有机溶剂中的疏水性并无显著差异(P>0.05)，但2株菌在氯仿中的疏水性显著高于在乙酸乙酯中的疏水性(P<0.05)。综合分析显示，菌株XXLC06和XXLC08在3种有机溶剂中均表现出良好的表面疏水性，其疏水率分别超过60%和50%。

2.4.3 菌株XXLC06和XXLC08的共聚集能力测定

共聚集率反映了不同菌株之间相互结合的能力，这种能力为益生菌在肠道内的定殖提供了优势。菌株XXLC06和XXLC08分别与鰤鱼诺卡氏菌XXLX2的共聚集结果如图5C所示，在8 h的静置共聚期间，2株拮抗菌与鰤鱼诺卡氏菌XXLX2的共聚集率均随着时间的延长而显著上升(P<0.05)。同时，拮抗菌XXLC06和XXLC08在8 h的共聚集率分别达到54.62%和52.44%，由此可见，2株拮抗菌均表现出与鰤鱼诺卡氏菌XXLX2有良好的共聚集作用。

2.5 无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌的抑菌实验结果

抑菌实验结果如图6所示，菌株XXLC06和XXLC08的无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌的抑菌圈直径分别为(28.15±0.44) mm和(22.63±0.52) mm，表明2株菌的抗菌活性物质主要存在于发酵上清液中，且菌株XXLC06对鰤鱼诺卡氏菌可能具有更强的抑菌活性。

2.6 菌株XXLC06和XXLC08的安全性

2.6.1 菌株XXLC06和XXLC08的溶血性结果

如图7所示，采用打孔法将新鲜培养的XXLC06和XXLC08菌悬液、阴性对照TSB培养基以及阳性对照嗜水气单胞菌XDMG分别添加至血琼脂平板中，32 ℃培养24 h后，观察到阳性对照嗜水气单胞菌XDMG产生了明显的溶血环。相比之下，2株拮抗菌与阴性对照均未出现溶血圈现象，即表现为不溶血。

2.6.2 菌株XXLC06和XXLC08的药敏试验结果

药敏试验结果显示(表3)，菌株XXLC06和XXLC08对包括头孢哌酮、克拉霉素、氯霉素在内的23种抗菌药物表现出敏感性，而对红霉素则呈现中度敏感。

2.6.3 菌株XXLC06和XXLC08的急性攻毒试验结果

对各组大口黑鲈分别腹腔注射100 μL无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%)、1.0×10⁸ CFU/mL的XXLC06、1.0×10⁸ CFU/mL的XXLC08，结果显示拮抗菌攻毒实验组大口黑鲈未表现出异常反应，与对照组相比无明显差异，生理状态保持健康良好。此外，实验全程未观察到大口黑鲈发病或死亡现象(表4)。

3 讨论

收起

3.1 肠道源潜在益生菌的分离鉴定及环境适应性分析

大口黑鲈作为一种广泛养殖的淡水经济鱼类，因其肉质鲜美而受到市场青睐。然而，在养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的慢性肉芽肿病发病率逐渐上升，对该鱼类的健康养殖构成严重威胁^[20]。目前该病的防治主要依赖化学药物和抗生素，但这类方法存在显著局限性，包括药物残留积累、诱导病原菌产生耐药性，以及对养殖环境和食品安全带来潜在风险^[20-22]。因此，研发更为安全且高效的防治措施显得尤为重要。

在水产养殖中，向养殖水体和饵料中添加益生菌可有效调节并优化养殖生态环境及养殖生物肠道微生态，从而增强养殖动物免疫力，抑制病原微生物增殖，降低病害发生率^[23-24]。水产益生菌的来源主要依据其与养殖动物的关系分为2类：一类是宿主源性菌株，即从养殖目标动物肠道或其生活的水体环境中分离、筛选出的土著菌种；另一类是从非目标宿主或土壤、发酵食品等其他非养殖环境中筛选获得，并经适应性验证后引入养殖系统的非宿主源性菌株^[25]。鉴于生存环境存在差异，水生动物肠道菌群组成可能与陆生动物有所不同^[26]；因此，在筛选具有特定功能的潜在益生菌时菌株的来源至关重要；不恰当使用非水生来源的商业益生菌通常会降低其对水生动物的免疫调节作用及生长促进效果^[18]。目前，关于大口黑鲈肠道益生菌的筛选及其在防治鱼类诺卡氏菌病方面的相关研究鲜有报道。因此，本研究从大口黑鲈肠道中筛选对鰤鱼诺卡氏菌具有拮抗作用的潜在益生菌，最终获得2株拮抗效果较为良好的菌株XXLC06和XXLC08。

通过菌株形态学观察、理化特性试验分析、16S rRNA基因序列比对以及系统发育树构建对菌株XXLC06和XXLC08进行鉴定，确定2株菌分别为拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌和纺锤状赖氨酸芽孢杆菌。菌株XXLC06和XXLC08在温度25-37 ℃、盐度5‰-30‰范围内生长态势良好，与Kanbe等^[27]的研究结果基本一致。大口黑鲈最适宜生长水温为28.1-28.6 ℃，其养殖水体盐度通常低于5‰^[28-29]。由此可见，这2株拮抗菌在鲈鱼适宜生长的温度区间及养殖水域环境中具备生长优势，能够在较短时间内实现快速大量增殖，进而产生抗菌物质并发挥潜在益生作用。益生菌作为一类有益微生物，常被添加至鱼类饲料中，经口服途径在宿主肠道内定殖并对其健康产生积极促进作用^[30]。大口黑鲈的消化进程涉及不同酸碱度及胆盐环境，其中胃部环境呈酸性，肠道环境则相对偏弱碱性^[31]；此外，进食前肠道内胆盐浓度较低；摄食后，随着食物在胃部逐渐消化并将食糜送入肠道，胆囊收缩并分泌胆汁，导致肠道内胆盐浓度升高^[32]。因此，益生菌的酸碱耐受性及其在胆盐环境中的生存能力是影响益生菌能否在到达胃肠环境后发挥益生作用的关键因素。本研究中，菌株XXLC06和XXLC08在pH 5.5-9.0及胆盐浓度≤0.5%条件下的生长适应性与姚雨馨^[33]从大黄鱼(Larimichthys crocea)肠道中筛选的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)对环境的耐受性特征相似，表明2株拮抗菌具有作为水产益生菌的应用潜力。然而，鉴于其对酸性环境的耐受性较弱，如何开发保护机制以确保其顺利通过鲈鱼胃部的酸性屏障仍需进一步研究。

3.2 益生菌的黏附性能及抑菌实验分析

益生菌能否在宿主肠道黏膜表面实现稳定附着是其发挥潜在益生功效的关键前提。研究表明，具备较强黏附能力的益生菌能够更有效地在肠道黏膜表面定殖，进而形成稳定的菌群^[9,34]。此外，益生菌可通过分泌特定抗菌物质抑制有害菌的生长，同时促进有益菌的增殖，以维系肠道微生态的平衡^[35]。Del Re等^[36]研究发现，菌株的自聚集率和疏水率与其黏附能力密切相关。菌株与病原菌的共聚集效应既能表征菌株的黏附能力，也能够反映菌株对病原菌的拮抗能力^[19]。乔硕^[37]对筛选的赖氨酸芽孢杆菌G117进行细胞表面理化性质测定，结果表明试验菌株5 h后的自聚集率为87.68%，其在三氯甲烷和二甲苯中的疏水率分别达到92.11%和90.36%；本研究2株菌的自聚集率及在3种有机溶剂中的疏水率虽均低于菌株G117，但已处于较高水平。在一定时间内，2株菌的自聚集率以及与病原菌的共聚集率随时间的推移而升高，这一结果与大多数研究者对菌株黏附能力的测定结果趋于一致^[19,38-39]。

目前，针对赖氨酸芽孢杆菌的研究主要集中于其在环境修复与促进植物生长领域的应用，而该菌属在水生动物致病菌生物防治方面的潜力尚未得到充分探索。已有研究报道，赖氨酸芽孢杆菌分泌的细菌素具有一定的物理稳定性和广谱抑菌潜力^[40]。Fang等^[41]从鲤科鱼类肠道中分离得到赖氨酸芽孢杆菌，经研究验证该菌株的无细胞上清液对嗜水气单胞菌(A. hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)具有较强的抑制作用。此外，饲喂该菌能够提升养殖鱼类的饲料利用率，并且有助于维护宿主肠道健康。Zhou等^[42]筛选获得的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)可显著促进杂交鳢(Channa maculata ♀×Channa argus♂)的生长，提高肠道消化酶活性，并在人工感染鰤鱼诺卡氏菌后降低杂交鳢的死亡率。本研究揭示了拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌XXLC06、纺锤状赖氨酸芽孢杆菌XXLC08以及其无细胞发酵产物对鰤鱼诺卡氏菌的抑制作用。2株菌的无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌的抑菌活性与已报道的拮抗菌LF01^[18]的效果相近(平均抑菌圈直径28.3 mm)，这表明2株菌同样具有良好的抑菌效果，具备用于防控鱼类诺卡氏菌病的潜力。

3.3 益生菌的生物安全性分析

随着水产养殖集约化程度的不断提高，合理应用益生菌已成为确保养殖生物健康和改善养殖环境的关键措施。在评估益生菌的生物安全性时需要从多个角度进行综合考量，包括确保益生菌无溶血活性、无抗生素耐药性，以及对宿主无毒性风险。在血琼脂平板上，根据细菌对红细胞的溶解作用差异，可将其分为3种溶血类型(α、β、γ)；其中，β溶血型细菌能产生强效溶血素，致使红细胞完全溶解，通常具有较强的致病性，不宜作为益生菌候选株；α溶血型细菌可引起红细胞部分溶解，虽其溶血活性相对较弱，但仍可能存在潜在的致病风险；而γ溶血型细菌不产生溶血素，无红细胞溶解现象，因此更符合潜在益生菌的安全性要求^[43]。薛媛^[44]从凡纳滨对虾养殖池塘的水体和底泥中分离获得的菌株GXW1，经鉴定为不溶血的γ类型赖氨酸芽孢杆菌；在后续的动物实验研究中发现菌株GXW1能够优化对虾的肠道微生物群落结构，提升有益菌的丰度，并且可有效抑制潜在致病菌的数量；这表明不具有溶血性的GXW1菌株在对虾养殖领域具备潜在的应用价值。

当细菌具备或演化出能够规避药物作用机制的能力时，即形成抗生素耐药性^[45]。研究表明，耐药菌株能够通过多种机制传播耐药性，例如借助质粒及其他遗传元件进行水平基因转移^[46]。因此，在益生菌筛选过程中对候选菌株进行药物敏感性试验是评估其安全性的关键环节。本研究对菌株XXLC06和XXLC08进行了系统的生物安全性评估。急性攻毒试验中鲈鱼未出现任何异常反应或死亡现象；溶血试验显示2株菌均无溶血活性，药敏试验表明其对23种受试抗菌药物均敏感，提示2株菌不产生溶血素且未携带相关耐药基因，在应用中不存在向其他菌种传播耐药因子的风险。综合表明，菌株XXLC06和XXLC08具备良好的生物安全性，契合益生菌筛选的基本准则。

4 结论

收起

本研究从健康大口黑鲈肠道筛选获得拟长杆状赖氨酸芽孢杆菌XXLC06与纺锤状赖氨酸芽孢杆菌XXLC08；2株菌在温度25-37 ℃范围和盐度5‰-30‰条件下生长良好，同时具备耐碱性、胆盐耐受性及较强的黏附能力。此外，2菌株及其无细胞发酵上清液对鰤鱼诺卡氏菌均具有显著抑制作用。安全性评估显示，2株菌均无溶血活性且对23种受试抗菌药物敏感；急性攻毒试验中试验鱼未见异常反应。综上所述，XXLC06和XXLC08符合益生菌安全性标准，具备了开发为防控鱼类诺卡氏菌病的益生菌制剂的良好基础。

基金

收起

河南省科技厅科技攻关项目(202102110261)
河南省科技厅科技攻关项目(212102110383)
河南省现代农业产业技术体系建设专项资金(HARS-23-16-T)

参考文献

收起

文献

收起

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2026年第66卷第3期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250640

接收时间：2025-08-19
首发时间：2026-03-12
出版时间：2026-03-04

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收稿日期：2025-08-19
录用日期：2025-11-30

基金

Science and Technology Agency Program of Henan Province(202102110261)

河南省科技厅科技攻关项目(202102110261)

Science and Technology Agency Program of Henan Province(212102110383)

河南省科技厅科技攻关项目(212102110383)

Special Fund for Henan Provincial Agriculture Research System(HARS-23-16-T)

河南省现代农业产业技术体系建设专项资金(HARS-23-16-T)

作者信息

^1.河南医药大学生命科学技术学院，河南新乡

^2.河南省水产技术推广站，河南郑州

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参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250640

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

分离菌株 Isolated bacteria	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter (mm)
XXLC06	24.71±0.49
XXLC08	20.01±0.34
XXLC17	11.16±0.53
XXLC24	10.02±0.32
XXLC31	14.11±0.46

分离菌株

Isolated bacteria

抑菌圈直径

Inhibition zone diameter (mm)

XXLC06

24.71±0.49

XXLC08

20.01±0.34

XXLC17

11.16±0.53

XXLC24

10.02±0.32

XXLC31

14.11±0.46

生化项目 Biochemical item	XXLC06	XXLC08
VP试验 Voges-Proskauer test	-	-
碳源利用Carbon source utilization
d-葡萄糖d-glucose	+	+
d-纤维二糖d-cellobiose	+	-
阿拉伯糖Arabinose	+	+
菊糖Inulin	-	-
木糖Xylose	-	-
果糖Fructose	-	+
半乳糖Galactose	-	-
海藻糖Trehalose	-	-
蔗糖Sucrose	-	-
山梨醇Sorbitol	+	+
甘露醇Mannitol	+	+
木糖醇Xylitol	+	-
柠檬酸盐Citrate	-	-
酶活性Enzymatic activity
氧化酶Oxidase	-	-
溶菌酶Lysozyme	-	+
脂酶Lipase	+	-
过氧化氢酶Catalase	+	+
硝酸盐还原Nitrate reduction	-	-
赖氨酸脱羧酶肉汤 Lysine decarboxylase broth	+	+
l-精氨酸双水解酶 l-arginine dihydrolase	-	-
吲哚试验Indole test	-	-
水解活性Hydrolytic activity
淀粉Starch	+	+
七叶苷Esculin	-	-
明胶液化Gelatin liquefaction	-	-

生化项目

Biochemical item

XXLC06

XXLC08

VP试验 Voges-Proskauer test

碳源利用Carbon source utilization

d-葡萄糖d-glucose

d-纤维二糖d-cellobiose

阿拉伯糖Arabinose

菊糖Inulin

木糖Xylose

果糖Fructose

半乳糖Galactose

海藻糖Trehalose

蔗糖Sucrose

山梨醇Sorbitol

甘露醇Mannitol

木糖醇Xylitol

柠檬酸盐Citrate

酶活性Enzymatic activity

氧化酶Oxidase

溶菌酶Lysozyme

脂酶Lipase

过氧化氢酶Catalase

硝酸盐还原Nitrate reduction

赖氨酸脱羧酶肉汤

Lysine decarboxylase broth

l-精氨酸双水解酶

l-arginine dihydrolase

吲哚试验Indole test

水解活性Hydrolytic activity

淀粉Starch

七叶苷Esculin

明胶液化Gelatin liquefaction

受试药物 Test drug	标准抑菌圈直径 Standard inhibition zone diameter (mm)	Strain XXLC06	Strain XXLC08
头孢哌酮 Cefoperazone	≤15	16-20	≥21	28	S	27	S
头孢曲松 Ceftriaxone	≤13	14-20	≥21	27	S	27	S
头孢拉定 Cephradine	≤14	15-17	≥18	30	S	30	S
头孢噻吩 Cephalothin	≤14	15-17	≥18	25	S	22	S
头孢他啶 Ceftazidime	≤14	15-17	≥18	21	S	19	S
氨苄西林 Ampicillin	≤11	12-14	≥15	32	S	35	S
美罗培南 Meropenem	≤13	14-15	≥16	26	S	23	S
青霉素G Penicillin G	≤19	20-27	≥28	37	S	36	S
红霉素 Erythromycin	≤13	14-22	≥23	18	I	19	I
克拉霉素 Clarithromycin	≤13	14-17	≥18	27	S	26	S
氯霉素 Chloramphenicol	≤12	13-17	≥18	22	S	24	S
克林霉素 Clindamycin	≤14	15-20	≥21	24	S	27	S
链霉素 Streptomycin	≤11	12-14	≥15	23	S	20	S
阿米卡星 Amikacin	≤14	15-16	≥17	25	S	31	S
大观霉素 Spectinomycin	≤14	15-17	≥18	25	S	23	S
万古霉素 Vancomycin	≤14	15-16	≥17	25	S	22	S
复方新诺明 Sulfamethoxazole	≤10	11-15	≥16	35	S	37	S
利福平 Rifampicin	≤16	17-19	≥20	26	S	27	S
氧氟沙星 Ofloxacin	≤12	13-15	≥16	28	S	24	S
诺氟沙星 Norfloxacin	≤12	13-16	≥17	22	S	24	S
环丙沙星 Ciprofloxacin	≤15	16-20	≥21	25	S	24	S
四环素 Tetracycline	≤14	15-18	≥19	27	S	30	S
多西环素 Doxycycline	≤12	13-15	≥16	29	S	31	S
米诺环素 Minocycline	≤14	15-18	≥19	29	S	30	S

受试药物

Test drug

标准抑菌圈直径

Standard inhibition zone diameter (mm)

Strain XXLC06

Strain XXLC08

不敏感

Insensitive (R)

中度敏感

Moderately sensitive (I)

敏感

Sensitive (S)

抑菌圈直径

Inhibition zone diameter (mm)

敏感度

Sensitivity

抑菌圈直径

Inhibition zone diameter (mm)

敏感度Sensitivity

头孢哌酮

Cefoperazone

≤15

16-20

≥21

头孢曲松

Ceftriaxone

≤13

14-20

≥21

头孢拉定

Cephradine

≤14

15-17

≥18

头孢噻吩

Cephalothin

≤14

15-17

≥18

头孢他啶

Ceftazidime

≤14

15-17

≥18

氨苄西林

Ampicillin

≤11

12-14

≥15

美罗培南

Meropenem

≤13

14-15

≥16

青霉素G

Penicillin G

≤19

20-27

≥28

红霉素

Erythromycin

≤13

14-22

≥23

克拉霉素

Clarithromycin

≤13

14-17

≥18

氯霉素

Chloramphenicol

≤12

13-17

≥18

克林霉素

Clindamycin

≤14

15-20

≥21

链霉素

Streptomycin

≤11

12-14

≥15

阿米卡星

Amikacin

≤14

15-16

≥17

大观霉素

Spectinomycin

≤14

15-17

≥18

万古霉素

Vancomycin

≤14

15-16

≥17

复方新诺明

Sulfamethoxazole

≤10

11-15

≥16

利福平

Rifampicin

≤16

17-19

≥20

氧氟沙星

Ofloxacin

≤12

13-15

≥16

诺氟沙星

Norfloxacin

≤12

13-16

≥17

环丙沙星

Ciprofloxacin

≤15

16-20

≥21

四环素

Tetracycline

≤14

15-18

≥19

多西环素

Doxycycline

≤12

13-15

≥16

米诺环素

Minocycline

≤14

15-18

≥19

注射样本类型 Injection sample type	宿主 Host	含菌量 Bacterial content (CFU/mL)
无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%) Sterile saline solution (0.65% NaCl by mass)	大口黑鲈 Micropterus salmoides	0
XXLC06	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸
XXLC08	大口黑鲈 Micropterus salmoides	1.0×10⁸

注射样本类型

Injection sample type

宿主

Host

含菌量

Bacterial content (CFU/mL)

死亡数

Death count

无菌生理盐水(NaCl的质量分数为0.65%)

Sterile saline solution (0.65% NaCl by mass)

大口黑鲈

Micropterus salmoides

XXLC06

大口黑鲈

Micropterus salmoides

1.0×10⁸

XXLC08

大口黑鲈

Micropterus salmoides

1.0×10⁸

受试药物 Test drug	标准抑菌圈直径 Standard inhibition zone diameter (mm)			Strain XXLC06		Strain XXLC08
受试药物 Test drug	不敏感 Insensitive (R)	中度敏感 Moderately sensitive (I)	敏感 Sensitive (S)	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter (mm)	敏感度 Sensitivity	抑菌圈直径 Inhibition zone diameter (mm)	敏感度Sensitivity
头孢哌酮 Cefoperazone	≤15	16-20	≥21	28	S	27	S
头孢曲松 Ceftriaxone	≤13	14-20	≥21	27	S	27	S
头孢拉定 Cephradine	≤14	15-17	≥18	30	S	30	S
头孢噻吩 Cephalothin	≤14	15-17	≥18	25	S	22	S
头孢他啶 Ceftazidime	≤14	15-17	≥18	21	S	19	S
氨苄西林 Ampicillin	≤11	12-14	≥15	32	S	35	S
美罗培南 Meropenem	≤13	14-15	≥16	26	S	23	S
青霉素G Penicillin G	≤19	20-27	≥28	37	S	36	S
红霉素 Erythromycin	≤13	14-22	≥23	18	I	19	I
克拉霉素 Clarithromycin	≤13	14-17	≥18	27	S	26	S
氯霉素 Chloramphenicol	≤12	13-17	≥18	22	S	24	S
克林霉素 Clindamycin	≤14	15-20	≥21	24	S	27	S
链霉素 Streptomycin	≤11	12-14	≥15	23	S	20	S
阿米卡星 Amikacin	≤14	15-16	≥17	25	S	31	S
大观霉素 Spectinomycin	≤14	15-17	≥18	25	S	23	S
万古霉素 Vancomycin	≤14	15-16	≥17	25	S	22	S
复方新诺明 Sulfamethoxazole	≤10	11-15	≥16	35	S	37	S
利福平 Rifampicin	≤16	17-19	≥20	26	S	27	S
氧氟沙星 Ofloxacin	≤12	13-15	≥16	28	S	24	S
诺氟沙星 Norfloxacin	≤12	13-16	≥17	22	S	24	S
环丙沙星 Ciprofloxacin	≤15	16-20	≥21	25	S	24	S
四环素 Tetracycline	≤14	15-18	≥19	27	S	30	S
多西环素 Doxycycline	≤12	13-15	≥16	29	S	31	S
米诺环素 Minocycline	≤14	15-18	≥19	29	S	30	S