微生物学报

菌株/质粒 Strains/Plasmids	主要特征 Features	来源 Origin
Leuconostocpseudomesenteroides L64	Wild type	Lab
Escherichiacoli TOP10	F^-, mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139 Δ(ara, leu)7697, galU, galK, rpsL, (Str^r)endA1, nupG	ThermoFisher Scientific
Escherichiacoli BL21(DE3)	F^-, ompT, gal, dcm, lon, hsdSB(rB^-mB^-), (DE3)	Novagene
Escherichiacoli BTH101	F^-, cya-99, araD139, galE15, galK16, rpsL1 (Str^r ), hsdR2, mcrA1, mcrB1, relA1	Euromedex
Escherichiacoli XL1-Blue	F^- [proAB, lacIq, lacZ, ΔM15, Tn10], endA1, gyrA96, lac, Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, recA1, relA1, supE44, thi-1	ThermoFisher Scientific
His-LacZ	pUC ori, araC, bla, promoter-less lacZ	Lab
pACYCDuet-1	P15A ori, lacI, cat, two MCSs	Novegene
pBAD/myc-hisA	pBR322 ori, bla, araC, pBAD	Life Tech.
pUT18C	pUC ori, T18, bla	Euromedex
pKT25	pUC ori, T25, kan	Euromedex
pBAD-F1	Expression of MazF1-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F2	Expression of MazF2-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F3	Expression of MazF3-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pUT18C-zipper	pUC ori, zipper-T18, bla	Euromedex
pKT25-zipper	pUC ori, zipper-T25, kan	Euromedex
pPef1-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-lacZ-Pcat-EF1	Simultaneous expression of MazEF1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-IRM-lacZ	Mutation of IR in promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-IRM-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-IRM-lacZ	This study
pPdlt-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of dlt operon	This study
pPdlt-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPdlt-lacZ	This study
pACYC-his-E1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag	This study
pACYC-his-E1-F1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag and label free MazF1-Leup	This study
pUT18C-mazE1	Fusion expression of MazE1 and T18	This study
pKT25-mazF1	Fusion expression of MazF1 and T25	This study

菌株/质粒 Strains/Plasmids	主要特征 Features	来源 Origin
Leuconostocpseudomesenteroides L64	Wild type	Lab
Escherichiacoli TOP10	F^-, mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139 Δ(ara, leu)7697, galU, galK, rpsL, (Str^r)endA1, nupG	ThermoFisher Scientific
Escherichiacoli BL21(DE3)	F^-, ompT, gal, dcm, lon, hsdSB(rB^-mB^-), (DE3)	Novagene
Escherichiacoli BTH101	F^-, cya-99, araD139, galE15, galK16, rpsL1 (Str^r ), hsdR2, mcrA1, mcrB1, relA1	Euromedex
Escherichiacoli XL1-Blue	F^- [proAB, lacIq, lacZ, ΔM15, Tn10], endA1, gyrA96, lac, Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, recA1, relA1, supE44, thi-1	ThermoFisher Scientific
His-LacZ	pUC ori, araC, bla, promoter-less lacZ	Lab
pACYCDuet-1	P15A ori, lacI, cat, two MCSs	Novegene
pBAD/myc-hisA	pBR322 ori, bla, araC, pBAD	Life Tech.
pUT18C	pUC ori, T18, bla	Euromedex
pKT25	pUC ori, T25, kan	Euromedex
pBAD-F1	Expression of MazF1-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F2	Expression of MazF2-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F3	Expression of MazF3-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pUT18C-zipper	pUC ori, zipper-T18, bla	Euromedex
pKT25-zipper	pUC ori, zipper-T25, kan	Euromedex
pPef1-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-lacZ-Pcat-EF1	Simultaneous expression of MazEF1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-IRM-lacZ	Mutation of IR in promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-IRM-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-IRM-lacZ	This study
pPdlt-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of dlt operon	This study
pPdlt-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPdlt-lacZ	This study
pACYC-his-E1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag	This study
pACYC-his-E1-F1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag and label free MazF1-Leup	This study
pUT18C-mazE1	Fusion expression of MazE1 and T18	This study
pKT25-mazF1	Fusion expression of MazF1 and T25	This study

引物 Primers name	序列 Primer sequences (5′→3′)
mazF1-f	GGGCTCGAGATGAGTGATGATATTCGCG
mazF1-r	CCCGGTACCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGC
mazF2-f	GGGCTCGAGATGAGTTACAAGCCTAGGC
mazF2-r	CCCGGTACCTTAAACCCAACTGGCTGG
mazF3-f	GGGCTCGAGATGAGTGAATTAGATCCCAG
mazF3-r	CCCGGTACCTTATCCTTTGAAAGGTATCTTTC
mazF1-R28A-f	TGGCTCCGGCATTTGTAGTGAAATACG
mazF1-R28A-r	TACAAATGCCGGAGCCACCTTGGAGCCTACTTCTCGC
mazF1-T46A-f	AGCTAGTCAATATGATGATAAATCAGAATATTTTAAG
mazF1-T46A-r	CATCATATTGACTAGCTATTTTGTAATAAGTAATCCGCTGATTATC
mazF2-I50T-f	GCCAATAACTCACGGTGATTGGGAGTTTGC
mazF2-I50T-r	CACCGTGAGTTATTGGCGTCACAATGGCAA
mazF3-E18G&K20E-f	CCATATGGAGACGAAAGTGATTCAAAAACTAGACCTGCTTTA
mazF3-E18G&K20E-r	CTTTCGTCTCCATATGGTATGTTTACCACGTAAACTTTCA
HisE1OE-f	ACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTCG
HisE1OE-r	CTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTCATTGCAAAAATTCCTCACGG
HisE1-F1-OE-f	GCCACGCGATCGCTGACGTCGGTACCATGAGTGATGATATTCGCGAGCA
HisE1-F1-OE-r	GCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTCATTCTAAATCAGATAAAAACGCCA
F1-KT25-f	GGCGGGCTGCAGGGTCGACTCTAGAGATGAGTGATGATATTCGCGAGCA
F1-KT25-r	TACGCTGGATAGGTACCCGGGGATCCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGCCA
E1-UT18C-f	AACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGAGATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTCG
E1-UT18C-r	AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCATTGCAAAAATTCCTCACGG
EF1-prom-f	CCCGCGGCCGCGCTTTCTCTAGATAGCAAGC
EF1-prom-r	CCCGGATCCGCTTTCATAATGTGCACCC
EF1-prom-IRM-f	ACATATACGCCATAAATGTGTTATAATTTAAGTAAAG
EF1-prom-IRM-r	ACACATTTATGGCGTATATGTTATCTATTGTTAGTAATTATG
EF1-probe-FAM-r	GCTTTCATAATGTGCACCC
cat-prom-f	CACTGGTGATACCATTCGCGATGATCGGCACGTAAGAGGTTC
cat-prom-r	TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAAT
EF1-cat-prom-f	CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTC
EF1-cat-prom-r	TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTCTAAATCAGATAAAAACGCC
E1-cat-prom-r	TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTGCAAAAATTCCTCACGG
Pef1-3510D-f	TTAAGTAAAGTATATTAAGTGGGG
Pef1-3510D-r	ACTTAATATACTTTACTTAAGTTAGTAATTATGCTGAATTGG
16SqF	CAATGGGCGAAAGCCTGATG
16SqR	GCACGTATTTAGCCGTCCCT
E1qF	GCTCGTGTTGATCCAAGCAT
E1qR	GGCTGTTGATGGGTCTCTTGA
F1qF	CAAGGTGAGACCGGCATTTG
F1qR	GCCCGCATAAACCCAATCTT
dlt-acpS-f	ACCTTTCTTCGCCAAGGGTT
dlt-acpS-r	CCTGCCAATGGACTTTTTCACC
acpS-alr-f	AGTCCATTGGCAGGATATTGAA
acpS-alr-r	GTTGCAACAGCAAAGTCCGT
Pdlt-f	GAGACCGGTCGTTTTGCGGCCGCGTCGCTCCAATATTGAAACACAAT
Pdlt-r	ACGGGATCTATCATTGGATCCCCGCTGAAAAAACTGTTTTATCAT
Pdlt-probe-f-fam	GTCGCTCCAATATTGAAACAC
Pdlt-probe-r	CCGCTGAAAAAACTGTTTTATC

引物 Primers name	序列 Primer sequences (5′→3′)
mazF1-f	GGGCTCGAGATGAGTGATGATATTCGCG
mazF1-r	CCCGGTACCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGC
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E1qR	GGCTGTTGATGGGTCTCTTGA
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Pdlt-r	ACGGGATCTATCATTGGATCCCCGCTGAAAAAACTGTTTTATCAT
Pdlt-probe-f-fam	GTCGCTCCAATATTGAAACAC
Pdlt-probe-r	CCGCTGAAAAAACTGTTTTATC

编号 Number	毒素 Toxin	抗毒素 Antitoxin	毒素-抗毒素结构域 Toxin-antitoxin domain
mazEF1-Leup	OYT93_01690	OYT93_01685	MazF-RelB/DinJ
mazEF2-Leup	OYT93_03030	OYT93_03025	MazF-PemK
mazEF3-Leup	OYT93_04285	OYT93_04280	MazF-MazE

编号 Number	毒素 Toxin	抗毒素 Antitoxin	毒素-抗毒素结构域 Toxin-antitoxin domain
mazEF1-Leup	OYT93_01690	OYT93_01685	MazF-RelB/DinJ
mazEF2-Leup	OYT93_03030	OYT93_03025	MazF-PemK
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基因编号 Gene number	编码的蛋白功能 Protein function	回文序列 Palindromic sequence
OYT93_01685	Antitoxin MazE1-Leup	TAACAaaatgTGTTA
OYT93_01215	DltX	TAACAtattgaaatatatgTGTTA
OYT93_01245	Alanine racemase Alr	TAACAcgatTGTTA
OYT93_00860	NADH-dependent flavin oxidoreductase	TAACAtatcgTGTTA
OYT93_06375	phage tail tube assembly chaperone	TAACAttcaaTGTTA
OYT93_07930	Hypothetical protein	TAACAcTGTTA
OYT93_08975	LysM and FRQ1 domains containing protein	TAACAtTGTTA

基因编号 Gene number	编码的蛋白功能 Protein function	回文序列 Palindromic sequence
OYT93_01685	Antitoxin MazE1-Leup	TAACAaaatgTGTTA
OYT93_01215	DltX	TAACAtattgaaatatatgTGTTA
OYT93_01245	Alanine racemase Alr	TAACAcgatTGTTA
OYT93_00860	NADH-dependent flavin oxidoreductase	TAACAtatcgTGTTA
OYT93_06375	phage tail tube assembly chaperone	TAACAttcaaTGTTA
OYT93_07930	Hypothetical protein	TAACAcTGTTA
OYT93_08975	LysM and FRQ1 domains containing protein	TAACAtTGTTA

假肠膜明串珠菌L64中 mazEF 类II型毒素-抗毒素系统的识别和鉴定

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李鹏 ^* , 刘兰 , 章帅文 , 王通 , 黄筱萍

微生物学报 | 研究报告 2025,65(3): 1070-1088

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(3): 1070-1088

假肠膜明串珠菌L64中 mazEF 类II型毒素-抗毒素系统的识别和鉴定

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李鹏^*, 刘兰, 章帅文, 王通, 黄筱萍

作者信息

江西省科学院微生物研究所，江西南昌

Identification and characterization of mazEF family type II toxin-antitoxin systems of Leuconostocpseudomesenteroides L64

Peng LI^*, Lan LIU, Shuaiwen ZHANG, Tong WANG, Xiaoping HUANG

Affiliations

Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang, Jiangxi, China

出版时间: 2025-03-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240713

文章导航

摘要

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【目的】 鉴定假肠膜明串珠菌L64基因组中编码的mazEF类II型毒素-抗毒素系统，并初步探讨mazEF系统协助宿主应对环境酸压力的分子机制。 【方法】 在大肠杆菌中诱导表达MazF毒素，或同时表达其对应的抗毒素蛋白，以检测MazF是否抑制宿主的正常生长，并验证对应的抗毒素是否能中和MazF的毒性。基于lacZ报告系统及电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)等体内外试验确定mazEF系统的自调控机制。通过生物信息学预测及体内外试验确定受MazE调控的下游基因。 【结果】 在假肠膜明串珠菌L64基因组编码的3对潜在mazEF毒素-抗毒素系统中，仅有mazEF1-Leup (OYT_01690-OYT_01685)编码真正的毒素-抗毒素系统。抗毒素MazE1-Leup (OYT_01685)通过与启动子中的回文序列(TAACAaaatgTGTTA)结合，抑制mazEF1-Leup启动子的转录；同时，MazE1-Leup通过与dlt-acpS-alr操纵子启动子中的相同回文序列(TAACAtattgaaatatatgTGTTA)结合，抑制dlt-acpS-alr的转录。 【结论】 OYT_01690-OYT_01685编码一个真正的mazEF类毒素-抗毒素系统，该系统不仅参与自身转录的调控，还抑制dlt-acpS-alr操纵子的转录，从而协助假肠膜明串珠菌L64应对环境中的酸压力。

关键词

假肠膜明串珠菌 / II型毒素-抗毒素系统 / mazEF家族 / 回文序列 / 酸压力

Abstract

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[Objective] To identify mazEF family type II toxin-antitoxin systems of Leuconostocpseudomesenteroides L64 and to elucidate the molecular roles of the mazEF systems in the host exposed to environmental acid stress. [Methods] Putative MazF toxins were induced alone or co-expressed with their cognate antitoxins in Escherichiacoli. The toxic effect of MazF on bacterial growth and the antitoxic effects of cognate antitoxins were examined. The lacZ reporter system and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) were used to decipher the auto-regulation mechanism of the mazEF system invivo and invitro. The putative target genes regulated by MazE were predicted and validated through invivo and invitro experiments. [Results] Among the three putative mazEF systems in L. pseudomesenteroides L64, mazEF1-Leup (OYT_01690-OYT_01685) encoded a functional type II toxin-antitoxin system. MazE1-Leup (OYT_01685) inhibited mazEF1-Leup transcription by binding to the palindromic sequence (TAACAaaatgTGTTA) in the promoter. In addition, MazE1-Leup inhibited transcription of the dlt-acpS-alr operon by binding to the similar palindromic sequence (TAACAtattgaaatatatgTGTTA) in the promoter of dlt-acpS-alr. [Conclusion] mazEF1-Leup (OYT_01690-OYT_01685) encodes a functional mazEF family type II toxin-antitoxin system. Beyond regulating its own operon, MazE1-Leup regulates the transcription of dlt-acpS-alr and finally assists L. pseudomesenteroides L64 in response to low acid stress.

Key words

Leuconostocpseudomesenteroides / type II toxin-antitoxin system / mazEF family / palindromic sequence / acid stress

引用本文

李鹏, 刘兰, 章帅文, 王通, 黄筱萍. 假肠膜明串珠菌L64中 mazEF 类II型毒素-抗毒素系统的识别和鉴定. 微生物学报, 2025 , 65 (3) : 1070 -1088 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240713

Peng LI, Lan LIU, Shuaiwen ZHANG, Tong WANG, Xiaoping HUANG. Identification and characterization of mazEF family type II toxin-antitoxin systems of Leuconostocpseudomesenteroides L64[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (3) : 1070 -1088 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240713

正文

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毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system, TA system)最初发现于低拷贝质粒中，其通过分裂后自杀机制确保质粒的稳定遗传^[1-2]。然而，近年来的研究表明，TA系统还广泛分布于细菌和古菌的染色体中。根据抗毒素的性质(蛋白质或RNA)以及抗毒素中和毒素毒性的不同机制，TA系统被划分为8大类^[3]。其中，II型TA系统不仅分布最为广泛，而且展现出更高的多样性^[4-6]。典型的II型TA系统由2个共转录的基因组成，分别编码稳定的毒素和相对不稳定的抗毒素。在正常条件下，抗毒素与毒素紧密结合，形成TA复合物，从而有效中和毒素的毒性。当细胞处于压力环境时，不稳定的抗毒素易受Lon蛋白酶或Clp蛋白酶的降解，导致毒素从TA复合物中释放并发挥其毒性作用。然而，近年来这一观点受到了挑战。Leroux等^[7]的研究表明，虽然压力条件可以诱导TA系统的转录，但并不会直接激活毒素。游离的II型毒素蛋白主要通过干扰DNA复制、转录^[8-9]、翻译^[10-13]及其他重要生理生化过程^[14-15]，进而影响细胞的正常功能。尽管关于II型TA系统的激活机制仍存在争议，但普遍认为TA系统在协助细菌应对外界压力挑战中发挥重要作用^[16]。

在II型TA系统中，抗毒素基因通常位于毒素基因的上游，但也有少数II型TA系统呈现出相反的遗传结构，即毒素基因位于抗毒素基因的上游。Li等^[17]的研究表明，无论遗传结构如何，抗毒素的表达水平总是高于毒素。抗毒素具有明显的模块化结构，分别具备与毒素和DNA结合的功能；在正常条件下，过量的抗毒素通过其HTH结构域与TA系统启动子中的反向重复序列(inverted repeat, IR)结合，以此实现对TA系统转录的调控。同时，毒素与抗毒素的结合会进一步抑制TA系统的转录。除了参与II型TA系统的自调控外，越来越多的研究表明，抗毒素还作为转录因子在调控细菌其他关键的生理生化过程中发挥重要作用。例如，MqsA通过抑制多效性转录因子rpoS和csgD的转录，参与细菌压力应答和生物膜形成的调控过程^[18-19]；铜绿假单胞菌编码的HigA直接抑制毒素基因mvfR的表达，并在压力条件下诱导其他毒力因子的转录^[20-21]；HipB与relA启动子结合，抑制其转录^[22]；DinJ则通过抑制cspE的转录，进而降低RpoS的蛋白水平^[23]。

尽管II型TA系统在其他细菌中，尤其是条件致病菌中得到了广泛研究，但关于乳酸菌，特别是明串珠菌来源的TA系统研究仍相对匮乏^[24-25]。明串珠菌作为一类重要的乳酸菌，在食品行业中有着广泛的应用和重要的价值。作为有机酸的重要生产者，乳酸菌在生长过程中积累的有机酸会迅速降低环境pH值，给乳酸菌自身的生长带来了巨大挑战^[26-27]。为了应对这种酸压力，乳酸菌采用了多种机制来增强自身的酸耐受性^[28-30]。例如，TCSR7蛋白通过正调控dlt操纵子来增强乳酸乳球菌的酸耐受性^[31]。然而，作为细菌中重要的压力应答元件，II型TA系统是否参与乳酸菌的酸压力应答过程尚不清楚。鉴于此，本研究基于假肠膜明串珠菌L64的全基因组序列，识别和鉴定潜在的mazEF类TA系统，通过研究其自调控机制，初步探讨抗毒素MazE在协助假肠膜明串珠菌应对外界酸压力过程中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及培养条件

本研究所用菌株和质粒的详细信息见表1。大肠杆菌在LB培养基中37 ℃、180 r/min培养12 h，假肠膜明串珠菌L64在MRS培养基中30 ℃、120 r/min培养16 h。培养含pBAD/myc-hisA相关质粒或His-LacZ相关质粒的细菌时添加100 μg/mL的氨苄青霉素，培养含pACYCDuet-1相关质粒的细菌时添加25 μg/mL的氯霉素，培养含pKT25相关质粒的细菌时添加50 μg/mL的卡那霉素。

1.1.2 主要试剂和仪器

高保真DNA聚合酶I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix，北京擎科生物科技股份有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNase I，赛默飞世尔科技公司；DNA聚合酶2×Taq Mix、逆转录试剂盒、质粒小提试剂盒、qPCR试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、无缝克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；RNA提取试剂盒，杭州倍沃医学科技有限公司；抗生素，阿拉丁试剂(上海)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、邻硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷、Gel-Shift结合缓冲液，上海碧云天生物技术股份有限公司。

水平电泳仪、垂直电泳仪、成像仪(荧光成像)，上海天能科技有限公司；PCR仪，Bio-Rad公司；摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酶联免疫分析仪，杭州奥盛仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；分光光度计，Eppendorf公司；荧光定量PCR系统，ThermoFisher Scientific公司。

1.1.3 引物

本研究所用引物见表2，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 重组质粒的构建

1.2.1 潜在毒素蛋白毒性验证质粒的构建

按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取假肠膜明串珠菌L64的全基因组DNA。以该基因组DNA为模板，利用特异性引物mazF1-f/r、mazF2-f/r及mazF3-f/r (表2)，分别扩增潜在毒素蛋白编码基因mazF1-Leup、mazF2-Leup及mazF3-Leup。PCR反应体系(50 μL)：2×High-Fidelity Master Mix 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10.5 µL。PCR反应条件：98 °C预变性2 min；98 °C变性10 s，55 °C退火10 s，72 °C延伸30 min，35个循环；72 °C终延伸5 min。本研究后续的PCR反应体系及程序与此次类似，但会根据不同引物及预期产物大小调整退火温度和延伸时间。PCR产物经过胶回收后，使用Kpn I及Xho I进行酶切处理，与经过相同酶切处理的pBAD/myc-hisA连接，连接产物随即被转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，最终获得质粒pBAD-F1、pBAD-F2及pBAD-F3。

1.2.2 毒素蛋白定点突变相关载体的构建

按照质粒抽提试剂盒说明书从大肠杆菌TOP10/pBAD-F1中提取重组质粒pBAD-F1。以提取的质粒pBAD-F1为模板，使用引物mazF1-R28A-f/r (表2)进行反向PCR扩增，以获得线性化的载体。通过Dpn I酶处理，降解残留的环形质粒模板。在T4 DNA连接酶的作用下，线性化载体发生自连。将自连产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，从而获得含有突变毒素蛋白表达载体pBAD-F1 (R28A)。采用同样的方法构建pBAD-F1 (T46A)、pBAD-F2 (I50T)及pBAD-F3 (E18G&K20E)等重组质粒。

1.2.3 细菌双杂交质粒的构建

以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，利用引物对F1-KT25-f/r及E1-UT18C-f/r (表2)分别扩增基因mazF1-Leup及mazE1-Leup。使用Xba I及BamH I处理pKT25及pUT18C，获得线性化的pKT25及pUT18C。按照无缝克隆试剂盒说明书，获得重组质粒pKT25-mazF1及pUT18C-mazE1。

1.2.4 抗毒素MazE1-Leup及毒素抗毒素复合物MazEF1-Leup表达质粒的构建

以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，使用引物HisE1OE-f/r (表2)扩增抗毒素基因mazE1-Leup。使用BamH I及Hind III处理pACYCDuet-1，获得线性化的pACYCDuet-1。利用无缝克隆试剂盒，获得N端融合His标签的MazE1-Leup表达质粒pACYC-His-E1。再次以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，使用引物HisE1-F1-OE-f/r (表2)扩增毒素基因mazF1-Leup。之后，使用Kpn I及Xho I对pACYC-His-E1进行酶切处理，使其线性化。利用无缝克隆试剂盒将mazF1-Leup克隆至pACYC-His-E1的第2个多克隆位点，获得质粒pACYC-His-E1-F1。

1.2.5 基于LacZ的相关报告质粒的构建

以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，使用引物EF1-prom-f/r (表2)扩增mazEF1-Leup上游的非编码序列Pef1。经过凝胶回收纯化后，用Not I及BamH I处理Pef1，与经过相同酶切处理的His-LacZ连接。将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，最终获得重组质粒pPef1-lacZ。采用相同的方法构建pPdlt-lacZ。以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，使用引物EF1-cat-prom-f/r (表2)扩增mazEF1的编码区。同时，以pACYCDuet-1为模板，使用引物cat-prom-f/r (表2)扩增氯霉素抗性基因的启动子Pcat。通过SOE-PCR将mazEF1与Pcat进行融合。利用无缝克隆试剂盒将融合片段Pcat-mazEF1克隆至pPef1-lacZ，获得质粒pPef1-lacZ-Pcat-EF1。采用相同的方法构建重组质粒pPef1-lacZ-Pcat-E1和pPdlt-lacZ-Pcat-E1。此外，以pPef1-lacZ为模板，使用引物Pef1-3510D-f/r (表2)，通过反向PCR及Dpn I处理后，删除启动子Pef1中的-35和-10区，获得质粒pPef1-3510D-LacZ。采用相同的方法构建pPef1-IR1M-lacZ和pPef1-IR1M-lacZ-Pcat-E1。

1.3 检测毒素对宿主细胞的毒性及抗毒素对毒素的中和作用

将包含pBAD/myc-hisA或潜在毒素蛋白诱导表达质粒的大肠杆菌TOP10接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃、220 r/min振荡培养过夜。随后，以1%的接种量转接至新鲜的LB培养基，37 ℃培养至OD₆₀₀值达到0.2-0.3。将培养物均分为2等份，分别加入0.2%葡萄糖及0.2%的l-阿拉伯糖进行诱导，然后37 ℃继续培养1 h。之后，进行梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，每个梯度取3 μL点样至LA平板，37 ℃培养箱倒置培养12 h后，观察并记录生长情况。

将包含pBAD-F1及pACYC-his-E1的大肠杆菌BL21(DE3)接种至含100 μg/mL氨苄青霉素及25 μg/mL氯霉素的LB培养基，37 ℃培养过夜。同样地，以1%的接种量转接至新鲜的LB培养基，37 ℃培养至OD₆₀₀值达到0.2-0.3，将培养物均分成4份，分别加入0.2%葡萄糖、0.5 mmol/L的IPTG、0.2% l-阿拉伯糖及0.5 mmol/L的IPTG和0.2% l-阿拉伯糖，37 ℃继续培养，每隔半小时取样测定OD₆₀₀，连续测定2 h。诱导1 h后，取样进行梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，每个梯度取3 μL点样至LA平板，37 ℃培养箱倒置培养12 h后，观察并记录生长情况。

1.4 抗毒素MazE1-Leup及毒素-抗毒素复合物MazEF1-Leup的表达与纯化

将表达质粒pACYC-his-E1及pACYC-his-E1-F1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得相应的表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pACYC-his-E1及大肠杆菌BL21(DE3)/pACYC-his-E1-F1。以MazE1-Leup的表达与纯化为例进行阐述：将大肠杆菌BL21(DE3)/pACYC-his-E1接种于含25 μg/mL氯霉素的LB培养基中，于37 ℃、220 r/min振荡培养过夜。以1%的接种量转接至含25 μg/mL氯霉素的新鲜LB培养基， 37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀达到0.5-0.6之间，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导MazE1-Leup的表达。诱导结束后，4 ℃、8 000 r/min离心5 min收集菌体。用buffer A (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、150 mmol/L NaCl)重悬菌体，并通过超声破碎菌体，将破碎后的菌体裂解液于4 ℃、12 000 r/min离心45 min，保留上清液。基于重组蛋白His₆-MazE1-Leup中的His标签，利用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化MazE1-Leup。利用buffer B (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑)洗涤杂蛋白，然后用buffer C (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、150 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)洗脱，获得目标蛋白His₆-MazE1-Leup。最终利用buffer D (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、150 mmol/L NaCl、5%甘油)通过超滤对目标蛋白进行脱盐及浓缩。通过SDS-PAGE检测目标蛋白MazE1-Leup的表达情况与纯度。基于MazE1-Leup与MazF1-Leup的直接相互作用，利用MazE1-Leup携带的His标签来纯化MazEF1-Leup复合物。纯化过程与MazE1-Leup的纯化过程相同。最后，利用MALDI-TOF MS对纯化产物进行鉴定。

1.5 细菌双杂交(bacterial adenylate cyclase-based two-hybrid, BACTH)

将包含pKT25-mazF1及pUT18C-mazE1的大肠杆菌BTH101接种于含50 μg/mL卡那霉素及100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30 ℃培养过夜。以1%的接种量转接至新鲜LB培养基，继续培养至OD₆₀₀值达到0.1左右，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG进行诱导，数小时后取样测定细胞内β-半乳糖苷酶的活性。同时，取100 μL培养物，4 ℃、8 000 r/min离心5 min收集菌体，用5 μL新鲜LB培养基重悬菌体后点样至含有X-gal的LA平板，30 ℃培养箱倒置培养过夜，观察颜色变化。采用同样的方法处理阳性对照大肠杆菌BTH101/pKT25-zipper/pUT18C-zipper及阴性对照大肠杆菌BTH101/pKT25/pUT18C。

1.6 凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

参考Li等^[32]的方法进行EMSA实验。以假肠膜明串珠菌L64的基因组DNA为模板，使用引物EF1-prom-f/EF1-probe-FAM-r (表2)，扩增预测的mazEF1-Leup启动子作为探针，该探针的5′末端携带FAM荧光标记。配制包含结合缓冲液、FAM标记的DNA探针(200 ng)及不同量的His₆-MazE1-Leup或His₆-MazEF1-Leup的结合反应体系，室温孵育30 min后，在8%非变性PAGE胶中以100 V低温电泳1 h。电泳结束后，采用天能凝胶成像系统(荧光成像模式)观察蛋白与探针的结合情况。

1.7 总RNA的提取、RT-PCR及RT-qPCR

将假肠膜明串珠菌L64的30 ℃过夜培养物接种至新鲜的d-乳酸发酵培养基。对照组在发酵培养基中加入55 g/L的CaCO₃，以中和产生的乳酸并稳定培养基的pH；实验组则不添加CaCO₃，其他成分保持一致。经过48 h发酵后，按照RNA抽提试剂盒的操作说明书抽提总RNA，并使用DNase I在37 ℃处理RNA，去除残留的基因组DNA。随后，利用逆转录试剂盒合成cDNA。设计特异性RT-qPCR引物(表2)，并按照ChamQ Universal SYBR qPCR试剂盒的操作说明配制反应体系，以定量检测实验条件下目标基因mRNA水平的变化。

2 结果与分析

收起

2.1 假肠膜明串珠菌L64基因组编码3对潜在的MazEF类II型毒素-抗毒素系统

利用TADB 3.0在线工具TAfinder 2.0^[6]，在假肠膜明串珠菌L64基因组中成功识别出2对潜在的mazEF家族TA系统，分别是OYT_03030-OYT_03025和OYT_04285-OYT_04280。其中，OYT_03030和OYT_04285分别编码194个和122个氨基酸残基的MazF毒素蛋白，与大肠杆菌编码的MazF的序列一致性分别仅为15.82%和10.49%。这2对系统中的上游基因OYT_RS03025和OYT_RS04280分别编码PemK和MazE抗毒素。此外，通过BLASTp在假肠膜明串珠菌L64基因组中还发现了另一个潜在的MazF蛋白OYT_01690，与大肠杆菌来源的MazF的序列一致性为11.19%。值得注意的是，上游基因OYT_01685编码RelB/DinJ抗毒素，并且与OYT_01690存在4个核苷酸的重叠区域。综上所述，假肠膜明串珠菌L64基因组编码3对潜在的mazEF类II型TA系统(表3)，为便于后续描述，将OYT_01690-OYT_01685、OYT_03030-OYT_03025及OYT_04285-OYT_04280分别命名为mazEF1-Leup、mazEF2-Leup及mazEF3-Leup。

2.2 毒素蛋白MazF1-Leup对大肠杆菌具有强烈毒性

构建潜在毒素蛋白过表达质粒并分别导入大肠杆菌TOP10细胞中，同时，将空白质粒pBAD/myc-hisA导入大肠杆菌TOP10细胞中作为对照。在抑制条件(添加0.2%葡萄糖)和诱导条件(添加0.2% l-阿拉伯糖)下分别生长1 h后，通过稀释点板实验检测毒素的表达对宿主生长的影响。在抑制条件下，毒素蛋白表达宿主与空白对照一样，均正常生长；在诱导条件下，大肠杆菌TOP10/pBAD-MazF1的生长受到明显抑制，而大肠杆菌TOP10/pBAD-MazF2和大肠杆菌TOP10/pBAD-MazF3与空白对照大肠杆菌TOP10/pBAD一样，均正常生长(图1A)，表明MazF1-Leup对大肠杆菌具有强烈毒性，而MazF2-Leup和MazF3-Leup无毒性(图1A)。通过多序列比对识别MazF1-Leup中保守活性位点(图1B)，将R28和T46分别突变为Ala后，结果显示突变后的MazF1-Leup毒性消失，进一步证明mazF1-Leup编码的是MazF类毒素蛋白。

多序列比对结果显示，MazF2-Leup和MazF3-Leup的潜在活性位点均发生突变，具体来说，MazF2-Leup的Ile (50)取代了Thr，MazF3-Leup的Glu (18)和Lys (20)分别取代了Gly和Glu (图1B)。为了验证这些活性位点的突变是否导致毒性的丧失，将MazF2-Leup的I50突变为T，将MazF3-Leup的E18和K20分别突变为G和E，获得了突变蛋白MazF2-Leup^I50T和MazF3-Leup^E18G&K20E的表达基因，将它们分别导入大肠杆菌TOP10细胞中。诱导表达突变体后，宿主细胞依然正常生长，表明突变后的MazF2-Leup和MazF3-Leup仍然无毒性(图1C)。以上结果表明，MazF1-Leup是II型MazF毒素蛋白，MazF2-Leup和MazF3-Leup在当前实验条件下均无毒性。

2.3 抗毒素MazE1-Leup可以中和MazF1-Leup的毒性

将MazE1-Leup过表达载体pACYC-His-E1与MazF1-Leup过表达载体pBAD-F1共同导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。作为对照，将pACYCDuet-1及pBAD/myc-hisA也导入大肠杆菌BL21(DE3)。在培养基中分别加入IPTG、阿拉伯糖或IPTG和阿拉伯糖，检测宿主生长曲线。加入IPTG诱导MazE1-Leup的表达后，宿主细胞与空白对照一样正常生长(图2A、2B)；加入阿拉伯糖诱导MazF1-Leup的表达后，菌株的生长受到了明显抑制(图2A、2B)；当同时加入IPTG和阿拉伯糖时，宿主细胞又恢复正常生长(图2A、2B)，表明MazE1-Leup能够有效中和MazF1-Leup的毒性。由于II型抗毒素通过与毒素蛋白的直接相互作用来中和毒素毒性，为检测MazE1-Leup与MazF1-Leup之间的相互作用，基于细菌双杂交系统构建质粒pUT18C-E1和pKT25-F1，并将它们共同导入大肠杆菌BTH101感受态细胞。与空白对照相比，IPTG诱导后能够检测到明显的β-半乳糖苷酶活性(图2C)，表明MazE1-Leup与MazF1-Leup之间存在直接相互作用。为进一步验证它们之间的相互作用，构建了N端融合His标签的MazE1-Leup及不含任何标签的MazF1-Leup的表达质粒pACYC-His-E1-F1。由于His₆-MazE1-Leup与MazF1-Leup的分子量非常接近，在SDS-PAGE结果中只能观察到一条条带(图2D)。因此，利用MALDI-TOF质谱对泳道3的条带进行了检测，结果显示亲和层析纯化的His-MazE1-Leup同时分离到了MazF1-Leup，进一步证明了MazE1-Leup与MazF1-Leup之间存在相互作用。

2.4 mazE1-Leup 与 mazF1-Leup 形成操纵子

II型抗毒素与毒素基因形成操纵子结构，mazE1-Leup与mazF1-Leup之间存在4个碱基的重叠(图3A)，暗示它们可能发生共转录。因此，通过RT-PCR验证mazEF1-Leup是否形成操纵子。分别设计特异性引物检测mazE1-Leup和mazF1-Leup的转录，以RNA为模板进行PCR时未获得任何条带(图3B)，表明RNA中无残留的基因组DNA。以基因组DNA或cDNA为模板时均获得了预期的目的条带(图3B)，表明mazE1-Leup和mazF1-Leup均能正常转录。使用跨越mazEF1-Leup的引物E1qF/F1qR进行扩增时，以基因组DNA或cDNA为模板均获得了与预期大小相符的目的条带(图3B)。对目的条带进行测序后，发现序列与预期一致。以上结果表明mazE1-Leup与mazF1-Leup发生共转录，形成操纵子结构。

2.5 MazE1-Leup及MazEF1-Leup复合物均能抑制自身启动子的转录活性

利用在线工具BPROM，在mazEF1-Leup的上游非编码区识别到了一个潜在的启动子Pef1(图4A)，将Pef1克隆至报告基因lacZ的上游，构建了报告载体pPef1-lacZ (图4B)。β-半乳糖苷酶活性检测结果表明Pef1包含活性启动子，而当删除Pef1中的潜在-35和-10区(pPef1-3510D-lacZ)后(图4B)，Pef1则丧失了转录活性(图4C)。为了确定抗毒素MazE1-Leup是否能够抑制Pef1的转录，构建了pPef1-lacZ-Pcat-E1载体 (图4B)。在表达MazE1-Leup后，宿主的β-半乳糖苷酶活性显著降低，表明MazE1-Leup能够抑制Pef1的转录活性(图4C)。此外，还构建了pPef1-lacZ-Pcat-EF1载体(图4B)，并发现当同时表达MazE1-Leup和MazF1-Leup时，β-半乳糖苷酶活性进一步降低，表明MazF1-Leup能增强MazE1-Leup对Pef1转录的抑制效果(图4C)。在体外实验中，EMSA的结果也表明MazE1-Leup与Pef1之间存在特异性的相互作用(图4D-4F)。

已知的II型抗毒素通过与启动子中的反向重复序列(inverted repeat, IR)结合来抑制启动子的转录，在Pef1中识别到一个IR (TAACAaaatgTGTTA)，位于-35区和-10区之间，并且部分与-10区重叠(图4A)，推测该IR可能是MazE1-Leup与Pef1的结合位点。为验证这一猜想，将该IR中的TAACA突变成GCCAT (图5A)，并构建了相关报告质粒pPef1-IRM-lacZ及pPef1-IRM-lacZ-Pcat-E1，结果表明当Pef1中的IR发生突变后，MazE1-Leup则无法再抑制Pef1的转录(图5B)。同时，EMSA的结果也表明MazE1-Leup不能与突变后的Pef1结合(图5C)，进一步证实了MazE1-Leup是通过与IR (TAACAaaatgTGTTA)序列结合来抑制Pef1的转录活性。

2.6 酸压力诱导 mazEF1-Leup 的转录

假肠膜明串珠菌L64发酵合成乳酸时，随着乳酸的不断积累，培养基中的pH值会发生显著变化。在发酵48 h后，与对照组(即在培养基中加入55 g/L的CaCO₃以调节并保持pH稳定)相比，实验组的pH从6.2降低至4.5。为了探究培养基中pH值的变化是否能诱导mazEF1-Leup的转录，利用RT-qPCR检测了发酵过程中mazEF1-Leup的mRNA水平变化。结果显示，与对照组相比，mazE1-Leup的mRNA水平升高了约4倍(图6A)。以上结果表明酸压力条件能诱导mazEF1-Leup的转录。

2.7 MazE1-Leup抑制 dlt-acpS-alr 操纵子的转录

利用MEME中在线工具FIMO^[33]，在假肠膜明串珠菌L64全基因组范围内查找包含与IR (TAACAaaatgTGTTA)相同或相似的重复序列的启动子，在OYT93_01215的上游非编码区识别到了一个相似的IR (TAACAtattgaaatatatgTGTTA) (图6B)。BLASTp比对结果显示，OYT93_01215编码DltX，其下游相邻基因分别编码DltA、DltB、DltC、DltD、AcpS及Alr。其中，dltX、dltA、dltB、dltC及dltD形成dlt操纵子，而acpS与alr基因存在4个核苷酸重叠，暗示它们可能发生共转录，而dltD与acpS基因之间只有71个核苷酸的间隔，推测dlt与acpS-alr形成一个更大的操纵子，RT-PCR结果证实了这一猜想(图6C)。RT-qPCR结果显示，与mazEF1-Leup一样，酸压力也显著诱导了dltA的转录，其mRNA水平升高了大约5倍(图6A)。为了探究MazE1-Leup是否直接抑制dlt-acpS-alr操纵子的转录，构建了报告质粒pPdlt-lacZ及pPdlt-lacZ-E1。β-半乳糖苷酶活性检测结果表明，同时表达MazE1-Leup后，dlt-acpS-alr启动子的转录活性显著降低(图6D)，表明MazE1-Leup直接抑制dlt-acpS-alr的转录。EMSA结果进一步证实了MazE1-Leup能与dlt-acpS-alr的启动子结合(图6E)。

3 讨论与结论

收起

本研究在假肠膜明串珠菌L64基因组中识别到了3对潜在的mazEF类TA系统，分别是OYT_01690-01685、OYT_03030-03025及OYT_04285-04280。根据以下实验结果确定mazEF1-Leup (OYT_01690-01685)编码一个真正的II型TA系统。(1) 在3个潜在的毒素蛋白中，仅MazF1-Leup (OYT_01690)能够抑制大肠杆菌的正常生长，而其保守活性位点的突变则导致其毒性丧失，mazE1-Leup (OYT_01685)编码的抗毒素蛋白，通过与MazF1-Leup直接相互作用，达到中和其毒性的目的；(2) mazE1-Leup与mazF1-Leup发生共转录，形成操纵子结构；(3) MazE1-Leup及MazEF1-Leup复合物能够抑制自身启动子的转录；(4) MazE1-Leup通过与启动子中的IR序列 (TAACAaaatgTGTTA)结合抑制自身转录。

II型TA系统作为全局调控元件正日益受到关注，其主要原因之一在于II型毒素蛋白利用RNA酶活性在全局范围内选择性切割mRNA，从而调控全局性蛋白翻译。除毒素外，越来越多的实验证据表明，同时包含与毒素结合和DNA结合的模块化结构的抗毒素，可能作为通用型转录调控因子参与细菌其他重要生理生化过程的调控。在本研究中，在dlt操纵子的启动子中发现了与IR (TAACAaaatgTGTTA)相似的回文序列TAACAtattgaaatatatgTGTTA。同时，RF-qPCR结果显示，随着生长过程中乳酸等有机酸的积累导致环境pH下降，会诱导mazEF1-Leup和dlt操纵子转录水平上升。因此，推测MazE1-Leup可能通过调控dlt操纵子的转录增强宿主的耐酸性。研究发现，dlt操纵子广泛分布于革兰氏阳性细菌，参与细胞壁中脂磷壁酸(lipo-teichoic acid, LTA)的d-丙氨酰化修饰，与乳酸菌的酸耐受性相关^[31,34]。细菌并不能直接合成d-丙氨酸，它需要由丙氨酸消旋酶(alanine racemase, Alr)催化l-丙氨酸转化而来。本研究发现假肠膜明串珠菌L64的dlt操纵子与下游的acpS和alr基因共转录，形成操纵子结构，这种遗传结构在其他细菌中较为罕见。通过构建dlt-acpS-alr操纵子启动子活性检测的报告载体，发现同时表达MazE1-Leup时，dlt-acpS-alr操纵子的启动子转录活性显著降低，即MazE1-Leup能够直接抑制dlt-acpS-alr操纵子的转录。同时，体外的EMSA反应结果也显示MazE1-Leup与dlt-acpS-alr操纵子的启动子之间存在直接相互作用。基于上述实验结果，推测MazE1-Leup参与假肠膜明串珠菌L64应答酸压力的分子机制如下(图7)：当假肠膜明串珠菌L64处于正常生长条件时，过量的抗毒素MazE1-Leup通过与dlt-acpS-alr操纵子的启动子中的回文序列(TAACAtattgaaatatatgTGTTA)结合，部分抑制其转录水平，导致Alr蛋白水平较低，细胞内d-丙氨酸含量相对较低。同时，参与LTA的d-丙氨酰化修饰的DltX、DltA、DltB、DltC、DltD含量也较少，使得细胞壁中LTA的d-丙氨酰化修饰维持较低水平。随着生长进程中乳酸等有机酸的大量积累，导致环境pH下降，ClpPX或Lon蛋白酶被激活，进而导致不稳定的MazE1-Leup被降解，解除了对自身转录及dlt-acpS-alr转录的抑制，使d-丙氨酰化修饰相关蛋白的含量升高，从而增强了细胞壁中LTA的d-丙氨酰化修饰程度，最终提高了假肠膜明串珠菌L64对酸的耐受性。

在dlt-acpS-alr操纵子的内部还识别到了一个与IR (TAACAaaatgTGTTA)相似的回文序列TAACAcgatTGTTA (表4)，正好位于alr基因的上游，即acpS基因的编码区内部，并且在该段DNA中预测到了一个潜在启动子。然而，在当前实验条件下，未能检测到该启动子的转录活性，因此，是否存在第2个启动子单独控制alr基因的转录还需进一步验证。除dlt-acpS-alr操纵子外，在假肠膜明串珠菌L64基因组中还识别到了几个包含相似回文序列的基因(表4)。其中，OYT93_08975编码一个融合蛋白，同时包含LysM结构域、FRQ1结构域及CAP结构域。LysM结构域广泛分布于细菌和真菌中，在细菌中，负责与细胞壁中的肽聚糖结合，参与肽聚糖的水解，其表达受到严格的时间和空间调控^[35]；在真核生物中，FRQ1结构域蛋白是一种Ca²⁺信号传感器^[36]；CAP结构域的功能尚不清楚。MazE1-Leup是否通过调控OYT93_08975参与假肠膜明串珠菌L64与Ca²⁺信号相关的生理生化代谢通路的调控还有待进一步研究。

基金

收起

江西省科学院重点研发计划(2022YSBG22011)
江西省科学院重点研发计划(2021YSBG21014)
江西省科学院重点研发计划(2022YSBG21007)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2025年第65卷第3期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240713

接收时间：2024-11-12
首发时间：2026-02-10
出版时间：2025-03-04

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收稿日期：2024-11-12
录用日期：2024-12-11

基金

Key Research and Development Program of Jiangxi Academy of Sciences(2022YSBG22011)

江西省科学院重点研发计划(2022YSBG22011)

Key Research and Development Program of Jiangxi Academy of Sciences(2021YSBG21014)

江西省科学院重点研发计划(2021YSBG21014)

Key Research and Development Program of Jiangxi Academy of Sciences(2022YSBG21007)

江西省科学院重点研发计划(2022YSBG21007)

作者信息

江西省科学院微生物研究所，江西南昌

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20240713

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

菌株/质粒 Strains/Plasmids	主要特征 Features	来源 Origin
Leuconostocpseudomesenteroides L64	Wild type	Lab
Escherichiacoli TOP10	F^-, mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139 Δ(ara, leu)7697, galU, galK, rpsL, (Str^r)endA1, nupG	ThermoFisher Scientific
Escherichiacoli BL21(DE3)	F^-, ompT, gal, dcm, lon, hsdSB(rB^-mB^-), (DE3)	Novagene
Escherichiacoli BTH101	F^-, cya-99, araD139, galE15, galK16, rpsL1 (Str^r ), hsdR2, mcrA1, mcrB1, relA1	Euromedex
Escherichiacoli XL1-Blue	F^- [proAB, lacIq, lacZ, ΔM15, Tn10], endA1, gyrA96, lac, Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, recA1, relA1, supE44, thi-1	ThermoFisher Scientific
His-LacZ	pUC ori, araC, bla, promoter-less lacZ	Lab
pACYCDuet-1	P15A ori, lacI, cat, two MCSs	Novegene
pBAD/myc-hisA	pBR322 ori, bla, araC, pBAD	Life Tech.
pUT18C	pUC ori, T18, bla	Euromedex
pKT25	pUC ori, T25, kan	Euromedex
pBAD-F1	Expression of MazF1-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F2	Expression of MazF2-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pBAD-F3	Expression of MazF3-Leup controlled by arabinose inducible promoter	This study
pUT18C-zipper	pUC ori, zipper-T18, bla	Euromedex
pKT25-zipper	pUC ori, zipper-T25, kan	Euromedex
pPef1-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-lacZ-Pcat-EF1	Simultaneous expression of MazEF1-Leup on the basis of pPef1-lacZ	This study
pPef1-IRM-lacZ	Mutation of IR in promoter of mazEF1-Leup	This study
pPef1-IRM-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-IRM-lacZ	This study
pPdlt-lacZ	Expression of report gene lacZ controlled by promoter of dlt operon	This study
pPdlt-lacZ-Pcat-E1	Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPdlt-lacZ	This study
pACYC-his-E1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag	This study
pACYC-his-E1-F1	Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag and label free MazF1-Leup	This study
pUT18C-mazE1	Fusion expression of MazE1 and T18	This study
pKT25-mazF1	Fusion expression of MazF1 and T25	This study

菌株/质粒

Strains/Plasmids

主要特征

Features

来源

Origin

Leuconostocpseudomesenteroides L64

Wild type

Lab

Escherichiacoli TOP10

F^-, mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139 Δ(ara, leu)7697, galU, galK, rpsL, (Str^r)endA1, nupG

ThermoFisher Scientific

Escherichiacoli BL21(DE3)

F^-, ompT, gal, dcm, lon, hsdSB(rB^-mB^-), (DE3)

Novagene

Escherichiacoli BTH101

F^-, cya-99, araD139, galE15, galK16, rpsL1 (Str^r ), hsdR2, mcrA1, mcrB1, relA1

Euromedex

Escherichiacoli XL1-Blue

F^- [proAB, lacIq, lacZ, ΔM15, Tn10], endA1, gyrA96, lac, Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, recA1, relA1, supE44, thi-1

ThermoFisher Scientific

His-LacZ

pUC ori, araC, bla, promoter-less lacZ

Lab

pACYCDuet-1

P15A ori, lacI, cat, two MCSs

Novegene

pBAD/myc-hisA

pBR322 ori, bla, araC, pBAD

Life Tech.

pUT18C

pUC ori, T18, bla

Euromedex

pKT25

pUC ori, T25, kan

Euromedex

pBAD-F1

Expression of MazF1-Leup controlled by arabinose inducible promoter

This study

pBAD-F2

Expression of MazF2-Leup controlled by arabinose inducible promoter

This study

pBAD-F3

Expression of MazF3-Leup controlled by arabinose inducible promoter

This study

pUT18C-zipper

pUC ori, zipper-T18, bla

Euromedex

pKT25-zipper

pUC ori, zipper-T25, kan

Euromedex

pPef1-lacZ

Expression of report gene lacZ controlled by promoter of mazEF1-Leup

This study

pPef1-lacZ-Pcat-E1

Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-lacZ

This study

pPef1-lacZ-Pcat-EF1

Simultaneous expression of MazEF1-Leup on the basis of pPef1-lacZ

This study

pPef1-IRM-lacZ

Mutation of IR in promoter of mazEF1-Leup

This study

pPef1-IRM-lacZ-Pcat-E1

Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPef1-IRM-lacZ

This study

pPdlt-lacZ

Expression of report gene lacZ controlled by promoter of dlt operon

This study

pPdlt-lacZ-Pcat-E1

Simultaneous expression of MazE1-Leup on the basis of pPdlt-lacZ

This study

pACYC-his-E1

Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag

This study

pACYC-his-E1-F1

Expression of MazE1-Leup with N-terminus His tag and label free MazF1-Leup

This study

pUT18C-mazE1

Fusion expression of MazE1 and T18

This study

pKT25-mazF1

Fusion expression of MazF1 and T25

This study

引物 Primers name	序列 Primer sequences (5′→3′)
mazF1-f	GGGCTCGAGATGAGTGATGATATTCGCG
mazF1-r	CCCGGTACCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGC
mazF2-f	GGGCTCGAGATGAGTTACAAGCCTAGGC
mazF2-r	CCCGGTACCTTAAACCCAACTGGCTGG
mazF3-f	GGGCTCGAGATGAGTGAATTAGATCCCAG
mazF3-r	CCCGGTACCTTATCCTTTGAAAGGTATCTTTC
mazF1-R28A-f	TGGCTCCGGCATTTGTAGTGAAATACG
mazF1-R28A-r	TACAAATGCCGGAGCCACCTTGGAGCCTACTTCTCGC
mazF1-T46A-f	AGCTAGTCAATATGATGATAAATCAGAATATTTTAAG
mazF1-T46A-r	CATCATATTGACTAGCTATTTTGTAATAAGTAATCCGCTGATTATC
mazF2-I50T-f	GCCAATAACTCACGGTGATTGGGAGTTTGC
mazF2-I50T-r	CACCGTGAGTTATTGGCGTCACAATGGCAA
mazF3-E18G&K20E-f	CCATATGGAGACGAAAGTGATTCAAAAACTAGACCTGCTTTA
mazF3-E18G&K20E-r	CTTTCGTCTCCATATGGTATGTTTACCACGTAAACTTTCA
HisE1OE-f	ACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTCG
HisE1OE-r	CTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTCATTGCAAAAATTCCTCACGG
HisE1-F1-OE-f	GCCACGCGATCGCTGACGTCGGTACCATGAGTGATGATATTCGCGAGCA
HisE1-F1-OE-r	GCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTCATTCTAAATCAGATAAAAACGCCA
F1-KT25-f	GGCGGGCTGCAGGGTCGACTCTAGAGATGAGTGATGATATTCGCGAGCA
F1-KT25-r	TACGCTGGATAGGTACCCGGGGATCCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGCCA
E1-UT18C-f	AACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGAGATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTCG
E1-UT18C-r	AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCATTGCAAAAATTCCTCACGG
EF1-prom-f	CCCGCGGCCGCGCTTTCTCTAGATAGCAAGC
EF1-prom-r	CCCGGATCCGCTTTCATAATGTGCACCC
EF1-prom-IRM-f	ACATATACGCCATAAATGTGTTATAATTTAAGTAAAG
EF1-prom-IRM-r	ACACATTTATGGCGTATATGTTATCTATTGTTAGTAATTATG
EF1-probe-FAM-r	GCTTTCATAATGTGCACCC
cat-prom-f	CACTGGTGATACCATTCGCGATGATCGGCACGTAAGAGGTTC
cat-prom-r	TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAAT
EF1-cat-prom-f	CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTC
EF1-cat-prom-r	TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTCTAAATCAGATAAAAACGCC
E1-cat-prom-r	TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTGCAAAAATTCCTCACGG
Pef1-3510D-f	TTAAGTAAAGTATATTAAGTGGGG
Pef1-3510D-r	ACTTAATATACTTTACTTAAGTTAGTAATTATGCTGAATTGG
16SqF	CAATGGGCGAAAGCCTGATG
16SqR	GCACGTATTTAGCCGTCCCT
E1qF	GCTCGTGTTGATCCAAGCAT
E1qR	GGCTGTTGATGGGTCTCTTGA
F1qF	CAAGGTGAGACCGGCATTTG
F1qR	GCCCGCATAAACCCAATCTT
dlt-acpS-f	ACCTTTCTTCGCCAAGGGTT
dlt-acpS-r	CCTGCCAATGGACTTTTTCACC
acpS-alr-f	AGTCCATTGGCAGGATATTGAA
acpS-alr-r	GTTGCAACAGCAAAGTCCGT
Pdlt-f	GAGACCGGTCGTTTTGCGGCCGCGTCGCTCCAATATTGAAACACAAT
Pdlt-r	ACGGGATCTATCATTGGATCCCCGCTGAAAAAACTGTTTTATCAT
Pdlt-probe-f-fam	GTCGCTCCAATATTGAAACAC
Pdlt-probe-r	CCGCTGAAAAAACTGTTTTATC

引物

Primers name

序列

Primer sequences (5′→3′)

mazF1-f

GGGCTCGAGATGAGTGATGATATTCGCG

mazF1-r

CCCGGTACCTCATTCTAAATCAGATAAAAACGC

mazF2-f

GGGCTCGAGATGAGTTACAAGCCTAGGC

mazF2-r

CCCGGTACCTTAAACCCAACTGGCTGG

mazF3-f

GGGCTCGAGATGAGTGAATTAGATCCCAG

mazF3-r

CCCGGTACCTTATCCTTTGAAAGGTATCTTTC

mazF1-R28A-f

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mazF1-R28A-r

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mazF1-T46A-f

AGCTAGTCAATATGATGATAAATCAGAATATTTTAAG

mazF1-T46A-r

CATCATATTGACTAGCTATTTTGTAATAAGTAATCCGCTGATTATC

mazF2-I50T-f

GCCAATAACTCACGGTGATTGGGAGTTTGC

mazF2-I50T-r

CACCGTGAGTTATTGGCGTCACAATGGCAA

mazF3-E18G&K20E-f

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mazF3-E18G&K20E-r

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HisE1OE-r

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HisE1-F1-OE-f

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HisE1-F1-OE-r

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F1-KT25-f

GGCGGGCTGCAGGGTCGACTCTAGAGATGAGTGATGATATTCGCGAGCA

F1-KT25-r

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E1-UT18C-f

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E1-UT18C-r

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EF1-prom-f

CCCGCGGCCGCGCTTTCTCTAGATAGCAAGC

EF1-prom-r

CCCGGATCCGCTTTCATAATGTGCACCC

EF1-prom-IRM-f

ACATATACGCCATAAATGTGTTATAATTTAAGTAAAG

EF1-prom-IRM-r

ACACATTTATGGCGTATATGTTATCTATTGTTAGTAATTATG

EF1-probe-FAM-r

GCTTTCATAATGTGCACCC

cat-prom-f

CACTGGTGATACCATTCGCGATGATCGGCACGTAAGAGGTTC

cat-prom-r

TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAAT

EF1-cat-prom-f

CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAAAGCAATTCAAGTATCTGCTC

EF1-cat-prom-r

TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTCTAAATCAGATAAAAACGCC

E1-cat-prom-r

TCGTCATCCGGAGGCTCGCGATCATTGCAAAAATTCCTCACGG

Pef1-3510D-f

TTAAGTAAAGTATATTAAGTGGGG

Pef1-3510D-r

ACTTAATATACTTTACTTAAGTTAGTAATTATGCTGAATTGG

16SqF

CAATGGGCGAAAGCCTGATG

16SqR

GCACGTATTTAGCCGTCCCT

E1qF

GCTCGTGTTGATCCAAGCAT

E1qR

GGCTGTTGATGGGTCTCTTGA

F1qF

CAAGGTGAGACCGGCATTTG

F1qR

GCCCGCATAAACCCAATCTT

dlt-acpS-f

ACCTTTCTTCGCCAAGGGTT

dlt-acpS-r

CCTGCCAATGGACTTTTTCACC

acpS-alr-f

AGTCCATTGGCAGGATATTGAA

acpS-alr-r

GTTGCAACAGCAAAGTCCGT

Pdlt-f

GAGACCGGTCGTTTTGCGGCCGCGTCGCTCCAATATTGAAACACAAT

Pdlt-r

ACGGGATCTATCATTGGATCCCCGCTGAAAAAACTGTTTTATCAT

Pdlt-probe-f-fam

GTCGCTCCAATATTGAAACAC

Pdlt-probe-r

CCGCTGAAAAAACTGTTTTATC

编号 Number	毒素 Toxin	抗毒素 Antitoxin	毒素-抗毒素结构域 Toxin-antitoxin domain
mazEF1-Leup	OYT93_01690	OYT93_01685	MazF-RelB/DinJ
mazEF2-Leup	OYT93_03030	OYT93_03025	MazF-PemK
mazEF3-Leup	OYT93_04285	OYT93_04280	MazF-MazE

编号

Number

毒素

Toxin

抗毒素

Antitoxin

毒素-抗毒素结构域

Toxin-antitoxin domain

mazEF1-Leup

OYT93_01690

OYT93_01685

MazF-RelB/DinJ

mazEF2-Leup

OYT93_03030

OYT93_03025

MazF-PemK

mazEF3-Leup

OYT93_04285

OYT93_04280

MazF-MazE

基因编号 Gene number	编码的蛋白功能 Protein function	回文序列 Palindromic sequence
OYT93_01685	Antitoxin MazE1-Leup	TAACAaaatgTGTTA
OYT93_01215	DltX	TAACAtattgaaatatatgTGTTA
OYT93_01245	Alanine racemase Alr	TAACAcgatTGTTA
OYT93_00860	NADH-dependent flavin oxidoreductase	TAACAtatcgTGTTA
OYT93_06375	phage tail tube assembly chaperone	TAACAttcaaTGTTA
OYT93_07930	Hypothetical protein	TAACAcTGTTA
OYT93_08975	LysM and FRQ1 domains containing protein	TAACAtTGTTA

基因编号

Gene number

编码的蛋白功能

Protein function

回文序列

Palindromic sequence

OYT93_01685

Antitoxin MazE1-Leup

TAACAaaatgTGTTA

OYT93_01215

DltX

TAACAtattgaaatatatgTGTTA

OYT93_01245

Alanine racemase Alr

TAACAcgatTGTTA

OYT93_00860

NADH-dependent flavin oxidoreductase

TAACAtatcgTGTTA

OYT93_06375

phage tail tube assembly chaperone

TAACAttcaaTGTTA

OYT93_07930

Hypothetical protein

TAACAcTGTTA

OYT93_08975

LysM and FRQ1 domains containing protein

TAACAtTGTTA