微生物学报

Primers and probes (100 μmol/L)	Combinations of primer probes at different concentrations (μL)
M. bovis-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6
P.m-F	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-R	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.4	1.8
M.h-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.8	1.0

Primers and probes (100 μmol/L)	Combinations of primer probes at different concentrations (μL)
M. bovis-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6
P.m-F	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-R	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.4	1.8
M.h-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.8	1.0

Dilution	P.m average C_t value	M.h average C_t value	M. bovis average C_t value
Bacteria liquid	19.67	20.60	26.65
10^-1	23.06	23.91	29.04
10^-2	26.50	26.35	32.76
10^-3	29.91	30.83	34.51
10^-4	33.69	34.42	N/A
10^-5	36.88	38.29	N/A
10^-6	39.51	N/A	N/A
Blank control	N/A	N/A	N/A

Dilution	P.m average C_t value	M.h average C_t value	M. bovis average C_t value
Bacteria liquid	19.67	20.60	26.65
10^-1	23.06	23.91	29.04
10^-2	26.50	26.35	32.76
10^-3	29.91	30.83	34.51
10^-4	33.69	34.42	N/A
10^-5	36.88	38.29	N/A
10^-6	39.51	N/A	N/A
Blank control	N/A	N/A	N/A

Number	Primers name	Primer sequences (5′→3′)
1	MB/F1	CAGTGCTGATGTTGAATA
MB/R1	GCTTCATTAACTTGTTGTA
MB/P1	FAM-ACCGCCATCAGCTATAACTAAGTCAT-BHQ1
2	MB/F2	GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA
MB/R2	GCAATGCCTCTTTATTTGTTTTACAG
MB/P2	FAM-TGACGGCGCTATTAA-MGB
3	MB/F4	AAACCAAAGCCTTAATTGACCT
MB/R4	TCCATATTTGGACCTAGTCCTT
MB/P4	FAM-ACCGGTTTGCAAAGTCGCACT-BHQ1
4	PM/5F	GGAGTTTGGTGTGTTGAG
PM/5R	CAGACTGACAAGGAAATATAAAC
PM/5P	VIC-AATCTGCTTCCTTGACAACGGC-BHQ1
5	PM/6F	CCTTGTCAGTCTGATTTATC
PM/6R	GACCAAAATAGGTAACCAATA
PM/6P	VIC-CCGCTCTGTCGTTAATGGCTTC-BHQ1
6	PM/7F	GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT
PM/7R	GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT
PM/7P	VIC-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1
7	MH/8F	GATCGAATTATTGTGATG
MH/8R	GGTGTAAGTAGGAATAAAGTC
MH/8P	Cy5-CAAGGCAAGCACCACGAATTACT-BHQ2
8	MH/9F	TATTAGCAACCATTGGGCAACA
MH/9R	CAATCACTTGCCCTGATAGCAT
MH/9P	Cy5-ACCTTTGGCTAGGGGCACACT-BHQ2
9	MH/F1	TGTTAGAGGCCACCGCTCTG
MH/R1	CGCATCCGGGCTAATATGTTT
MH/P1	Cy5-CACCTCCTGCCCTGCTGCAACAA-BHQ2

Number	Primers name	Primer sequences (5′→3′)
1	MB/F1	CAGTGCTGATGTTGAATA
MB/R1	GCTTCATTAACTTGTTGTA
MB/P1	FAM-ACCGCCATCAGCTATAACTAAGTCAT-BHQ1
2	MB/F2	GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA
MB/R2	GCAATGCCTCTTTATTTGTTTTACAG
MB/P2	FAM-TGACGGCGCTATTAA-MGB
3	MB/F4	AAACCAAAGCCTTAATTGACCT
MB/R4	TCCATATTTGGACCTAGTCCTT
MB/P4	FAM-ACCGGTTTGCAAAGTCGCACT-BHQ1
4	PM/5F	GGAGTTTGGTGTGTTGAG
PM/5R	CAGACTGACAAGGAAATATAAAC
PM/5P	VIC-AATCTGCTTCCTTGACAACGGC-BHQ1
5	PM/6F	CCTTGTCAGTCTGATTTATC
PM/6R	GACCAAAATAGGTAACCAATA
PM/6P	VIC-CCGCTCTGTCGTTAATGGCTTC-BHQ1
6	PM/7F	GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT
PM/7R	GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT
PM/7P	VIC-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1
7	MH/8F	GATCGAATTATTGTGATG
MH/8R	GGTGTAAGTAGGAATAAAGTC
MH/8P	Cy5-CAAGGCAAGCACCACGAATTACT-BHQ2
8	MH/9F	TATTAGCAACCATTGGGCAACA
MH/9R	CAATCACTTGCCCTGATAGCAT
MH/9P	Cy5-ACCTTTGGCTAGGGGCACACT-BHQ2
9	MH/F1	TGTTAGAGGCCACCGCTCTG
MH/R1	CGCATCCGGGCTAATATGTTT
MH/P1	Cy5-CACCTCCTGCCCTGCTGCAACAA-BHQ2

Triple primer probe combination	Primer probe number
Group 1	1	4	7
Group 2	1	5	7
Group 3	2	6	9
Group 4	2	4	8
Group 5	3	4	9
Group 6	2	4	9

Triple primer probe combination	Primer probe number
Group 1	1	4	7
Group 2	1	5	7
Group 3	2	6	9
Group 4	2	4	8
Group 5	3	4	9
Group 6	2	4	9

Pathogen	Bacterial isolation result	Triple qPCR result	Kappa coefficient
M. bovis	Negative	116	0	1.000 0
Positive	0	9
P.m	Negative	115	1	0.984 0
Positive	1	8
M.h	Negative	109	2	0.976 0
Positive	1	13

Pathogen	Bacterial isolation result	Triple qPCR result	Kappa coefficient
M. bovis	Negative	116	0	1.000 0
Positive	0	9
P.m	Negative	115	1	0.984 0
Positive	1	8
M.h	Negative	109	2	0.976 0
Positive	1	13

Pathogen	Number of positive samples	Positivity rate (%, 95% CI)
P.m	412	32.9 (30.3-35.6)
M. bovis	328	26.2 (23.8-28.7)
M.h	267	21.3 (19.1-23.7)

Pathogen	Number of positive samples	Positivity rate (%, 95% CI)
P.m	412	32.9 (30.3-35.6)
M. bovis	328	26.2 (23.8-28.7)
M.h	267	21.3 (19.1-23.7)

Region	M.bovis positive rate (%, 95% CI)	P.m positive rate (%, 95% CI)	M.h positive rate (%, 95% CI)	Province/city/Autonomous region with high incidence
Northeast China	40.7 (33.1-48.8)	48.5 (40.8-56.3)	28.1 (21.7-35.6)	Hulunbuir, Tongliao, Chifeng
North China	41.1 (34.7-47.8)	46.8 (40.2-53.5)	23.4 (18.1-29.5)	Hohhot, Baotou, Ulanqab
Northwest	37.3 (29.6-45.7)	44.4 (36.3-52.7)	23.9 (17.5-31.7)	Bayannur, Ningxia Hui Autonomous Region, Xinjiang Uygur Autonomous Region
East China	15.7 (10.9-22.0)	20.2 (14.7-27.0)	11.8 (7.6-17.7)	Shandong, Anhui, Jiangsu
Central China	14.6 (8.4-23.6)	19.1 (11.9-28.8)	10.1 (5.1-18.3)	Henan, Hubei, Hunan
Southwest China	8.9 (2.9-21.3)	15.6 (6.9-29.8)	6.7 (1.8-18.5)	Yunnan

Region	M.bovis positive rate (%, 95% CI)	P.m positive rate (%, 95% CI)	M.h positive rate (%, 95% CI)	Province/city/Autonomous region with high incidence
Northeast China	40.7 (33.1-48.8)	48.5 (40.8-56.3)	28.1 (21.7-35.6)	Hulunbuir, Tongliao, Chifeng
North China	41.1 (34.7-47.8)	46.8 (40.2-53.5)	23.4 (18.1-29.5)	Hohhot, Baotou, Ulanqab
Northwest	37.3 (29.6-45.7)	44.4 (36.3-52.7)	23.9 (17.5-31.7)	Bayannur, Ningxia Hui Autonomous Region, Xinjiang Uygur Autonomous Region
East China	15.7 (10.9-22.0)	20.2 (14.7-27.0)	11.8 (7.6-17.7)	Shandong, Anhui, Jiangsu
Central China	14.6 (8.4-23.6)	19.1 (11.9-28.8)	10.1 (5.1-18.3)	Henan, Hubei, Hunan
Southwest China	8.9 (2.9-21.3)	15.6 (6.9-29.8)	6.7 (1.8-18.5)	Yunnan

牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌三重qPCR方法的建立与流行病学调查

PDF下载

马彦颖 ¹ , 高磊 ¹ , 宫枫举 ² , 吴雨伦 ¹ , 李旭雯 ¹ , 张志 ² , 孙学强 ² , 潘子豪 ¹ , 姚火春 ¹

微生物学报 | 技术与方法 2025,65(9): 4198-4210

收起

微生物学报 | 技术与方法 2025, 65(9): 4198-4210

牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌三重qPCR方法的建立与流行病学调查

全屏

马彦颖¹, 高磊¹, 宫枫举², 吴雨伦¹, 李旭雯¹, 张志², 孙学强², 潘子豪¹, 姚火春¹

作者信息

1 南京农业大学动物医学院，猪链球菌病WOAH参考实验室，江苏南京

2 青岛立见生物科技有限公司，山东青岛

Establishment of a triplex qPCR detection method for Mycoplasma bovis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica and an epidemiological investigation

Yanying MA¹, Lei GAO¹, Fengju GONG², Yulun WU¹, Xuwen LI¹, Zhi ZHANG², Xueqiang SUN², Zihao PAN¹, Huochun YAO¹

Affiliations

1 The WOAH Reference Laboratory for Swine Streptococcosis, College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China

2 Qingdao Lijian Bio-Tech Co. , Ltd. , Qingdao, Shandong, China

出版时间: 2025-09-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250147

文章导航

摘要

收起

【目的】 建立牛支原体(Mycoplasma bovis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, P.m)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica, M.h)的三重qPCR检测方法，并开展规模化奶牛养殖场牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex, BRDC)的流行病学调查。 【方法】 以实验室分离鉴定后纯化的菌株制备敏感性质控样品；选取国内主要流行株的保守基因，分别以牛支原体的uvrC基因、多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因和溶血性曼氏杆菌的lktD基因作为靶标，建立多重探针和引物体系，优化反应体系参数，构建三重qPCR方法。验证该方法的敏感性、重复性和特异性，并与细菌分离鉴定方法进行符合率验证。利用该方法对1 252份临床疑似BRDC的样本进行病原学检测，分析病原的流行特征和时空分布特征。 【结果】 三重qPCR方法的标准曲线R²值分别为0.998 6、0.994 6和0.998 6；牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的最低检出量分别为2.50×10³、1.26×10³和7.50×10² CFU/mL。批内和批间变异系数均小于2%，仅3种菌的敏感性质控样品出现特异性扩增曲线。符合率试验结果显示，牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌与细菌分离鉴定方法的符合率分别为100.00%、98.40%和97.60%。流行病学调查显示，BRDC细菌性病原总阳性率为75.9% [95% confidence interval (CI), 73.4%-78.3%]，其中混合感染占比48.8%，冬季为高发期，北方地区阳性率显著高于南方(P<0.001)。 【结论】 本研究建立的三重qPCR方法具有良好的特异性、稳定性和重复性，为我国BRDC主要病原的一步法检测提供了候选方案。本研究还分析了BRDC细菌病原的协同感染特征及地理-季节分布规律，为精准防控策略的制定提供了参考。

关键词

牛支原体 / 多杀性巴氏杆菌 / 溶血性曼氏杆菌 / 流行病学调查 / 多重qPCR

Abstract

收起

[Objective] To establish a triple qPCR detection method for Mycoplasma bovis, Pasteurella multocida (P.m) and Mannheimia haemolytica (M.h), and to conduct an epidemiological investigation of bovine respiratory disease complex (BRDC) in large-scale dairy farms with it. [Methods] Sensitive quality control samples were prepared using the purified strains isolated and identified in our laboratory. The conserved genes of the major prevalent strains in China were used as targets, including the uvrC of M. bovis, Kmt1 of P.m, and lktD of M.h, to establish a multiplex qPCR containing multiple pairs of primers and probes. By optimizing the parameters of the reaction system, a triple qPCR method was established and its sensitivity, repeatability and specificity were verified. The coincidence rate with the bacterial isolation and identification method was verified. A total of 1 252 clinical samples suspected of BRDC were tested using the established method, and the prevalence and spatiotemporal distribution characteristics of three pathogens were analyzed based on the test results. [Results] The R² values of the standard curves for the triple qPCR for detecting M. bovis, P.m, and M.h were 0.998 6, 0.994 6 and 0.998 6 respectively; the minimum detectable quantities were 2.50×10³, 1.26×10³ and 7.50×10² CFU/mL, respectively. The intra-batch and inter-batch coefficients of variation of the reaction system were both less than 2%, and only the specific amplification curves were observed for the three sensitive quality control samples established. The results of the test showed that the concordance rates of M. bovis, P.m, and M.h with bacterial isolation and identification methods were 100.00%, 98.40% and 97.60%, respectively. The epidemiological survey indicated that the total positive rate of bacterial pathogens in BRDC was 75.9% (95% confidence interval (CI), 73.4%-78.3%), among which the proportion of mixed infections was 48.8%. The incidence was higher in winter, and the positive rate in the northern region was significantly higher than that in the southern region (P<0.001). [Conclusion] The multiple qPCR method established in this study demonstrated excellent specificity, stability and repeatability, which provided a candidate solution for the detection of major pathogens of BRDC in China. The analysis of the co-infection characteristics and geographical-seasonal distribution patterns of BRDC bacterial pathogens offered meaningful references for the formulation of precise prevention and control strategies.

Key words

Mycoplasma bovis / Pasteurella multocida / Mannheimia haemolytica / epidemiological investigation / multiplex qPCR

引用本文

马彦颖, 高磊, 宫枫举, 吴雨伦, 李旭雯, 张志, 孙学强, 潘子豪, 姚火春. 牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌三重qPCR方法的建立与流行病学调查. 微生物学报, 2025 , 65 (9) : 4198 -4210 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250147

Yanying MA, Lei GAO, Fengju GONG, Yulun WU, Xuwen LI, Zhi ZHANG, Xueqiang SUN, Zihao PAN, Huochun YAO. Establishment of a triplex qPCR detection method for Mycoplasma bovis, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica and an epidemiological investigation[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (9) : 4198 -4210 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250147

正文

收起

牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex, BRDC)是全球肉牛和奶牛养殖业中最重要的健康问题之一^[1]，其发病机制复杂，常由多种病毒和细菌协同作用引发^[2]。其中，多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体是主要的细菌性病原^[2]。BRDC在全球范围内具有较高的发病率和死亡率^[3]，目前国内养牛业中65%的疾病均与BRDC相关，感染率为100%，死亡率不低于35%^[4]，导致了严重的经济损失。研究表明牛支原体是BRDC的主要病原体^[5]，具有独特的生物学特性和广泛的致病性^[6-7]，且不同地区的菌株表现出显著的基因组多样性和耐药性^[8]。溶血性曼氏杆菌常定殖于健康反刍动物的上呼吸道^[9]，在特定条件下可引发严重的呼吸道疾病^[10]，其生物被膜的形成增强了抗生素耐药性和耐药基因的传播^[11-13]。多杀性巴氏杆菌的致病常与运输、拥挤等应激因素相关^[14]，且能与其他病原体协同作用^[15]。

近年来，多重qPCR因其高灵敏度和高通量的优势被广泛应用于病原检测^[16]，但现有的BRDC检测体系多针对单一病原，或缺乏标准化验证^[17]。此外，我国BRDC的流行病学数据较为零散，病原体的协同作用机制及其时空分布规律尚未得到系统阐明^[18]。因此本研究选取牛支原体的uvrC基因、多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因和溶血性曼氏杆菌的lktD基因作为靶标，建立三重qPCR检测方法，并对全国51个牧场进行流行病学调查。

1 材料与方法

收起

1.1 样品来源

110份呼吸道拭子样本和15份内脏样本(通过南京农业大学实验动物福利与伦理委员会审批，编号：NJAULLSC2022085)作为符合率试验的临床样本，均采集于安徽蚌埠某牧业。1 184份呼吸道拭子样本和68份组织样本作为流行病学调查样本，采集自全国各地的51个牧场。所有纳入流行病学调查的临床样本均来自呈现典型呼吸道症状的牛只，包括咳嗽、气喘、呼吸困难；同时伴随全身性临床症状，如体温显著升高(≥39.5 ℃)、食欲减退及精神沉郁，部分病例还可见产奶量下降。每个牧场按呼吸道症状牛存栏量的5%抽取样本，优先选择急性期症状明显的牛只，所有采样牛均来自规模化牛场。

1.2 菌株、主要试剂和仪器

大肠埃希氏菌、肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌、乳酸乳球菌、肉芽肿曼氏杆菌、丝状支原体、牛鼻支原体、病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛疱疹病毒1型、昏睡嗜血杆菌、牛结核分枝杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎链球菌，均由南京农业大学保存。

参考菌株：多杀性巴氏杆菌SX1804-1 (2018年分离自陕西省某牧场患肺炎奶牛肺组织，血清型为A型)、溶血性曼氏杆菌HB2011-1 (2011年分离自河北省某牧场牛拭子，血清型为A1)由本实验室分离鉴定保存。牛支原体HB08-1 (登录号为NC_018077.1)由华中农业大学郭爱珍老师惠赠。

1×Taq Master Mix，青岛立见生物科技有限公司。

自动核酸提取仪及耗材，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；荧光定量PCR仪，西安天隆科技有限公司。

1.3 敏感性质控样品制备

依据Rossetti等^[19]、许腾林等^[20]、Klima等^[21]的研究，选用针对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体的荧光PCR引物和探针，交由百力格生物科技(上海)股份有限公司合成。将P.m和M.h参考菌株接种于THB液体培养基，37 ℃ 180 r/min恒温摇床中培养8–10 h，M. bovis参考菌株接种于PPLO肉汤培养基，37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养48 h。提取核酸后进行10倍梯度稀释，利用荧光定量PCR验证，选定C_t值在25-30的稀释度，冻干保存，制备成质控品Mb/QC/DNA、Pm/QC/DNA、Mh/QC/DNA，并于-20 ℃保存。

1.4 引物探针设计与制备

从GenBank数据库选取11株牛支原体的uvrC基因、7株多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因和11株溶血性曼氏杆菌的lktD基因，使用DNAStar 11.1软件进行序列比对，筛选出靶基因的保守区域后，针对各基因序列保守且同源性高的区域，利用Primer Express 3.0软件评估引物二聚体(ΔG值>-10 kcal/mol)和发夹结构，设计引物和探针。采用独立荧光通道(FAM、VIC、Cy5)分离信号，以减少交叉干扰。共筛选出6种三重引物探针组合，并交由百力格生物科技(上海)股份有限公司合成。

将筛选的引物和探针以100 μmol/L的浓度复溶后配制反应体系。将核酸阳性质控样品Mb/QC/DNA、Pm/QC/DNA、Mh/QC/DNA用1×TE缓冲液10倍稀释至10^-5作为模板，每个稀释度设置3个重复。三重qPCR反应体系(25 μL)：1×Taq Master Mix 12 µL，M. bovis、P.m、M.h的上、下游引物(100 µmol/L)各0.06 µL，探针(100 µmol/L)各0.03 µL，DNA模板5 µL，ddH₂O 7.85 µL。三重qPCR反应条件：37 °C预孵育2 min，95 °C预变性3 min；95 °C变性10 s，60 °C退火30 s，共40个循环。收集FAM、VIC、Cy5荧光信号。通过比较各引物探针组合的C_t值和扩增曲线，选择C_t值最小且扩增曲线最典型的组合。

1.5 反应优化

对引物探针浓度、退火温度和延伸时间分别进行优化。通过配制不同引物探针浓度的反应液体系(表1)，选择检测C_t值最小且扩增曲线最典型的浓度进行优化。以最优浓度为基础，改变退火温度(55-65 °C，以2 °C为梯度)进行反应，选择最佳退火温度。在最佳浓度和退火温度条件下，改变延伸时间(10-60 s，以10 s为梯度)，通过对比检测C_t值和扩增曲线，确定最佳延伸时间。

1.6 标准曲线建立

采用平板菌落计数法确定菌株浓度后，用TE缓冲液进行10倍梯度稀释至10^-7CFU/mL。以每个稀释度的核酸为模板，进行5次重复反应。在已优化的程序下，使用最佳浓度的三重荧光PCR反应液进行反应。以C_t值为纵坐标，lg CFU/mL为横坐标，利用GraphPad Prism 10.0绘制标准曲线，并计算R²值和扩增效率。

1.7 敏感性验证

将核酸敏感性质控样品进行10倍梯度稀释至10^-6CFU/mL，选取出现C_t值的最低浓度及其邻近浓度，分别重复测定20次，以95%置信区间内至少19次阳性为判定标准。

1.8 重复性验证

预先配制三批三重荧光反应液，随机选取一批，以3种敏感性质控样品为模板进行3种梯度稀释(10⁰、10^-1、10^-2)，每种稀释度重复8次反应，其余两批按相同方法操作，记录C_t值，并统计分析变异率。

1.9 特异性验证

选取牛呼吸道及环境中常见的病原菌，包括大肠埃希氏菌、肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌、乳酸乳球菌、肉芽肿曼氏杆菌、丝状支原体、牛鼻支原体、病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛疱疹病毒1型、昏睡嗜血杆菌、牛结核分枝杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎链球菌，使用优化后的方法进行检测，观察其是否出现扩增曲线和C_t值。

1.10 流行病学调查

本研究于2023-2024年从全国51个牧场采集了1 252份临床样本(2023年825份，2024年427份)，所有样本均来自具有呼吸道临床症状的牛只。应用本研究建立的三重qPCR方法检测牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。数据采用卡方检验(χ²)比较区域间差异，置信区间计算基于二项分布。

2 结果与分析

收起

2.1 敏感性质控品制备

通过平板菌落计数，牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌在梯度稀释前的浓度分别为5.0×10⁵、4.1×10⁷和3.0×10⁷ CFU/mL。当C_t值约为25时，这些细菌的敏感性质控品Mb/QC/DNA、Pm/QC/DNA和Mh/QC/DNA对应的CFU分别为5.0×10⁵、4.1×10⁵和3.0×10⁵ CFU/mL (表2)。将此时的核酸浓度稀释后进行冻干处理，即可得到白色粉末状的冻干质控品。

2.2 引物、探针筛选结果

通过软件共设计了9套引物探针(表3)，其中牛支原体的探针为FAM，多杀性巴氏杆菌的探针为VIC，溶血性曼氏杆菌的探针为Cy5。利用DNAStar 11.1软件分析引物二聚体和发夹结构的ΔG值(>-10 kcal/mol)，最终选出6组可匹配的三重引物探针组合(表4)。通过比较这6组的检测C_t值和扩增曲线，选择了组合6作为最佳方案，其C_t值最小，3个通道均显示完整的扩增曲线，且扩增曲线最为典型(图1)。

2.3 反应条件优化结果

对引物、探针浓度、退火温度和延伸时间分别进行优化后，确定的最佳浓度比例：反应体系25 μL，3种病原体的上、下游引物均为(100 μmol/L) 0.2 μL，探针均为0.08 μL；其余用酶反应液补足至20 μL，反应模板为5 μL。

最终确定的反应程序：37 °C孵育2 min；95 °C预变性5 min；95 °C变性10 s，59 °C退火20 s，共40个循环；在59 °C时收集FAM、VIC和Cy5荧光信号。

2.4 建立的标准曲线

溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和牛支原体的初始浓度分别为8×10⁷、4×10⁷、4×10⁷ CFU/mL，提取核酸并进行梯度稀释后在最佳反应条件下进行反应。通过软件分析，生成了三重qPCR标准曲线(图2)。结果显示，标准曲线线性关系良好，引物扩增效率分别为92%、93%和93%，符合要求。

2.5 敏感性试验结果

质控品在10^‒2稀释度下均能检测出C_t值(图3)，进一步将质控品稀释至原始浓度的0.500 0%、0.250 0%、0.125 0%和0.062 5%，并进行20次重复实验。结果表明，3种质控品均在0.250 0%浓度时检出C_t值的次数≥19次：Mb/QC/DNA在0.250 0%浓度时平均C_t值为38.39，最低检出量为2.50×10³ CFU/mL；Pm/QC/DNA在0.250 0%浓度时平均C_t值为37.43，最低检出量为1.26×10³ CFU/mL；Mh/QC/DNA在0.250 0%浓度时平均C_t值为37.68，最低检出量为7.50×10² CFU/mL。通过GraphPad 10.0软件绘制ROC曲线，采用约登指数确定最佳cut-off值为38.75，该阈值对应灵敏度与特异性的最大平衡。

2.6 重复性试验结果

对不同浓度质控品进行检测后，3批预混酶反应液的C_t值变异率(图4)显示，批内和批间变异系数均小于2%，表明该多重荧光PCR检测方法具有较好的重复性。

2.7 特异性试验结果

对1.9节中提到的17种病原菌的核酸进行特异性检测。结果表明，仅Pm、Mh和Mb的敏感性质控品显示出扩增曲线(图5)，表明本研究建立的三重荧光PCR检测方法具有较高的特异性。

2.8 临床检测结果

对安徽某牧场样本的符合率分析显示(表5)，牛支原体的阳性和总体符合率均为100.00%；多杀性巴氏杆菌的阳性符合率为88.00%，总体符合率为98.40%；溶血性曼氏杆菌的阳性符合率为92.86%，总体符合率为97.60%。

2.9 BRDC细菌性病原体在我国的流行病学特征

2.9.1 病原体流行特征

应用本研究建立的牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌三重qPCR方法对2023年1月至2024年12月期间采集的1 252份BRDC临床样本进行检测。结果显示，950份样本(75.9%, 95% CI 73.4%-78.3%)至少检测到一种目标细菌性病原体阳性。其中，多杀性巴氏杆菌的阳性率显著高于其他两种病原体(χ²=47.6, P<0.001)，提示其在BRDC发病中可能占据主导地位(表6)。

在950份阳性样本中，混合感染占比48.8% (463/950)，双重感染为主导，占比36.0% (342/950)，其中“牛支原体+多杀性巴氏杆菌”组合占58.2% (199/342)，三重感染占12.8% (121/950) (图6)。

2.9.2 地理分布规律

BRDC主要细菌性病原体地理分布总体呈现北高南低的趋势(表7)，华北、东北和西北地区为高发区，平均阳性率均超过35.0%，其中多杀性巴氏杆菌在东北地区的阳性率高达48.5%，显著高于其他区域(χ²=47.6, P<0.001)。

2.9.3 季节分布规律

冬季(12月至次年2月)为全年感染高峰，多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性样本数最多，混合感染占比最高，以“牛支原体+巴氏杆菌”组合为主(58%)。夏季(6-8月)感染强度整体下降，但牛支原体仍保持一定活跃度。值得注意的是，虽然夏季溶血性曼氏杆菌阳性样本数较低，但云南地区雨季(6-9月)溶血性曼氏杆菌感染风险较旱季有所升高，可能与高湿度(>80%)环境下细菌生物被膜形成能力增强密切相关。春季(3-5月)和秋季(9-11月)为过渡期，多杀性巴氏杆菌感染规模逐步上升，可能与动物运输和气候应激相关(图7)。

3 讨论

收起

3.1 方法学创新

相较于传统检测手段，本研究建立的同步检测体系具有显著优势。在靶基因选择上，本研究采用uvrC、Kmt1和lktD基因，避免了传统16S rRNA靶标因保守性过高而导致的交叉反应问题^[22]。牛支原体的uvrC基因作为DNA修复基因^[23]，具有高保守性和高灵敏度，能够检测低至83个基因拷贝的感染^[24]，且在奶样、组织样本等多种临床样本中表现出良好的稳定性^[25]。多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因具有较高保守性，针对该基因的实时定量PCR表现出高灵敏度和特异性^[26]。溶血性曼氏杆菌的lktD基因编码白细胞毒素，具有高度特异性^[27]，能够有效区分曼氏杆菌与其他类似病原，尤其在混合感染情况下显著降低了假阳性率^[28]。

与传统培养法需要48-72 h相比，本方法能在3 h内完成检测，且单次反应成本降低了约40%^[29]。对于混合感染样本，三重qPCR体系在灵敏度上优于单重qPCR，尤其在三重感染的精准识别上表现更为突出，为处理复杂临床病例提供了新的解决方案^[24]。

3.2 流行病学特征

本研究通过对全国51个牧场的1 252份临床样本进行检测，揭示了我国BRDC细菌性病原体的流行特征具有时空特异性。结果显示，多杀性巴氏杆菌的总体阳性率最高，牛支原体次之，两者混合感染占比达58.2%。牛支原体全年检出稳定，推测其免疫逃逸与耐药性进化可能支持其长期定殖^[30]；而多杀性巴氏杆菌冬季阳性率显著升高，可能与低温应激及黏膜屏障功能削弱有关^[31]。混合感染占比48.8%，其中三重感染病例(12.8%)多伴随严重临床症状，提示病原体的协同作用可能通过基因水平转移加速耐药性扩散^[32-33]。

从地理分布来看，北方地区病原阳性率普遍高于南方，其中东北地区多杀性巴氏杆菌阳性率高达48.5%，可能与寒冷气候延长病原气溶胶存活时间及规模化牧场密集有关^[34]。此外，云南雨季(6-9月)溶血性曼氏杆菌感染率异常升高，可能与高湿度促进其生物被膜形成能力相关^[35]。

3.3 局限性及未来方向

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，本研究未涉及病毒病原体的检测。BRDC通常由病毒与细菌共同感染引起，未来研究应加入病毒检测(如BRSV、BPIV3)，以更全面地分析病原体的协同作用^[36]。其次，本研究样本主要来源于规模化牧场，缺乏对散养牛群和不同品种感染差异的探讨。未来可扩大采样范围，进一步完善流行病学数据。此外，尽管本研究发现了较高比例的混合感染，但未深入分析病原体的耐药基因分布。抗生素滥用可能加剧BRDC治疗的难度，未来可结合基因组测序深入探讨病原耐药性的发展趋势^[37-38]。

4 结论

收起

本研究成功建立了一种基于牛支原体uvrC基因、多杀性巴氏杆菌Kmt1基因及溶血性曼氏杆菌lktD基因的三重荧光定量PCR检测方法。该方法灵敏度高(最低检出限为7.5×10²- 2.5×10³ CFU/mL)、特异性强(与其他呼吸道病原无交叉反应)，且重复性优异(批内/批间变异系数<2%)。临床样本检测显示，牛支原体、溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的总体符合率分别为100.00%、97.60%和98.40%，显著优于传统培养法。流行病学调查表明，在1 252份临床样本中细菌性病原总体检出率为75.9%，混合感染占比48.8%，冬季为发病高峰。牛支原体为全年稳定存在的核心病原，多杀性巴氏杆菌冬季检出率显著升高。需要强调的是，BRDC的典型发病机制中，病毒的初始感染可破坏呼吸道屏障并抑制宿主免疫，为条件致病菌的继发感染提供条件。本研究未将病毒性病原纳入研究范围，未来将进一步结合病毒检测数据以明确其动态机制。

基金

收起

青岛立见诊断技术发展中心企业横向课题(HMSY21001)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

GOTO

, FUKUNARI

, SUZUKI

. Multiplex RT-qPCR application in early detection of bovine respiratory disease in healthy calves[J]. Viruses, 2023, 15(3): 669.

[2]

GAUDINO

, NAGAMINE

, DUCATEZ

, MEYER

. Understanding the mechanisms of viral and bacterial coinfections in bovine respiratory disease: a comprehensive literature review of experimental evidence[J]. Veterinary Research, 2022, 53(1): 70.

[3]

PANSRI

, KATHOLM

, KROGH

, AAGAARD

, SCHMIDT

, KUDIRKIENE

, LARSEN

, OLSEN

. Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of pathogens associated with the bovine respiratory disease complex[J]. Veterinary Journal, 2020, 256: 105425.

[4]

刘志鹏, 董秀梅, 师东方, 王宇. 牛呼吸道疾病综合征的主要病原[J]. 畜牧兽医科技信息, 2012(12): 9-11.

LIU

, DONG

, SHI

, WANG

. The main pathogen of bovine respiratory disease syndrome[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2012(12): 9-11 (in Chinese).

[5]

闵聪聪, 候强强, 于凡淞, 项志杰, 陈颖钰, 胡长敏, 郭爱珍. 牛呼吸疾病综合征诊断方法的研究进展[J]. 华中农业大学学报, 2023, 42(2): 17-23.

MIN

, HOU

, YU

, XIANG

, CHEN

, HU

, GUO

. Research progress on diagnostic methods of bovine respiratory disease complex[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2023, 42(2): 17-23 (in Chinese).

[6]

TRIEBEL

, SACHSE

, WEBER

, HELLER

, DIEZEL

, HÖLZER

, SCHNEE

, MARZ

. De novo genome assembly resolving repetitive structures enables genomic analysis of 35 European Mycoplasmopsis bovis strains[J]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 548.

[7]

AMBROSET

, PETICCA

, TRICOT

, TARDY

. Genomic features of Mycoplasma bovis subtypes currently circulating in France[J]. BMC Genomics, 2022, 23(1): 603.

[8]

YAIR

, BOROVOK

, MIKULA

, FALK

, FOX LK, GOPHNA

, LYSNYANSKY

. Genomics-based epidemiology of bovine Mycoplasma bovis strains in Israel[J]. BMC Genomics, 2020, 21(1): 70.

[9]

LAM J

HET

, DERKMAN

THJ

, van GARDEREN

, DIJKMAN

, van ENGELEN

. Distinct Mannheimia haemolytica serotypes isolated from fatal infections in veal calves and dairy cows[J]. The Veterinary Journal, 2023, 292: 105940.

[10]

KAYAL

, NAHAR

, BARKER

, TRAN

, WILLIAMS

, BLACKALL

, TURNI

, OMALEKI

. Molecular identification and characterisation of Mannheimia haemolytica [J]. Veterinary Microbiology, 2024, 288: 109930.

[11]

CL, COOK

, ZAHEER

, LAING

, GANNON

, XU

, RASMUSSEN

, POTTER

, HENDRICK

, ALEXANDER

, McALLISTER

. Comparative genomic analysis of Mannheimia haemolytica from bovine sources[J]. PLoS One, 2016, 11(2): e0149520.

[12]

, ALT DP, FALKENBERG

, BRIGGS

, TATUM

, CLAWSON

, CASAS

, DASSANAYAKE

. Transcriptomic profiles of Mannheimia haemolytica planktonic and biofilm associated cells[J]. PLoS One, 2024, 19(2): e0297692.

[13]

JACKSON

, TUCKER

, FRITZ

, BROSS

, ADAMS

, SILVA

, LORENZ

, MARSHALL

. Antimicrobial susceptibility profiles among commensal Mannheimia haemolytica and Pasteurella multocida isolated from apparently healthy sheep processed in California: results from a cross-sectional pilot study[J]. Preventive Veterinary Medicine, 2024, 233: 106360.

[14]

彭忠, 梁婉, 吴斌. 多杀性巴氏杆菌分子分型方法简述[J]. 微生物学报, 2016, 56(10): 1521-1529.

PENG

, LIANG

, WU

. Molecular typing methods for Pasteurella multocida: a review[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(10): 1521-1529 (in Chinese).

[15]

林立山, 黄秦, 才灵杰, 马家乐, 姚火春, 潘子豪. 牛源多杀性巴氏杆菌的分离与初步鉴定[J]. 微生物学报, 2018, 58(12): 2240-2248.

LIN

, HUANG

, CAI

, MA

, YAO

, PAN

. Isolation and diversity analysis of bovine Pasteurella multocida [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2018, 58(12): 2240-2248 (in Chinese).

[16]

HODZIC

, GLAVINIC

, WADEMAN

. A novel approach for simultaneous detection of the most common food-borne pathogens by multiplex qPCR[J]. BiomolBiomed, 2023, 23(4): 640-648.

[17]

KAMEL

, DAVIDSON

, VERMA

. Strategies for bovine respiratory disease (BRD) diagnosis and prognosis: a comprehensive overview[J]. Animals, 2024, 14(4): 627.

[18]

CHANG

, YUE

, TANG

. Prevalence and molecular characteristics of bovine respiratory syncytial virus in beef cattle in China[J]. Animals, 2022, 12(24): 3511.

[19]

ROSSETTI

, FREY

, PILO

. Direct detection of Mycoplasma bovis in milk and tissue samples by real-time PCR[J]. Molecular and Cellular Probes, 2010, 24(5): 321-323.

[20]

许腾林, 邢桂玲, 刘家森, 刘大飞, 李志杰, 姜骞, 康洪涛, 田进, 郭东春, 曲连东. 多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国预防兽医学报, 2018, 40(8): 706-710.

, XING

, LIU

, LI

, JIANG

, KANG

, TIAN

, GUO

, QU

. Development and application of TaqMan real-time PCR assay for the detection of Pasteurella multocida [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2018, 40(8): 706-710 (in Chinese).

[21]

KLIMA

, ZAHEER

, BRIGGS

, McALLISTER

. A multiplex PCR assay for molecular capsular serotyping of Mannheimia haemolytica serotypes 1, 2, and 6[J]. Journal of Microbiological Methods, 2017, 139: 155-160.

[22]

VĚTROVSKÝ

, BALDRIAN

. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e57923.

[23]

EISSA

, HASHEM

, ABO-SHAMA

, SHAKER

. Sequence analysis of three genes of Mycoplasma bovis isolates from Egyptian cattle and buffaloes[J]. British Microbiology Research Journal, 2016, 14(3): 1-10.

[24]

NAIKARE

, BRUNO

, MAHAPATRA

, REINISCH

, RALEIGH

, SPROWLS

. Development and evaluation of a novel Taqman real-time PCR assay for rapid detection of Mycoplasma bovis: comparison of assay performance with a conventional PCR assay and another Taqman real-time PCR assay[J]. Veterinary Sciences, 2015, 2(1): 32-42.

[25]

CHAUHAN

, ALY SS, LEHENBAUER

, TONOOKA

, GLENN

, ROSSITTO

, MARCO

. Development of a multiplex qPCR assay for the simultaneous detection of Mycoplasma bovis, Mycoplasma species, and Acholeplasma laidlawii in milk[J]. PeerJ, 2021, 9: e11881.

[26]

POUSSARD

, PANT

, HUANG

, SCOTT

, GHORASHI

. Comparative evaluation of PCR and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for detecting Pasteurella multocida in poultry[J]. New Zealand Veterinary Journal, 2025, 73(2): 134-142.

[27]

AVALOS-GÓMEZ

, REYES-LÓPEZ

, RAMÍREZ-RICO

, DÍAZ-APARICIO

, ZENTENO

, GONZÁLEZ-RUIZ

, deLa GARZA

. Effect of apo-lactoferrin on leukotoxin and outer membrane vesicles of Mannheimia haemolytica A2[J]. Veterinary Research, 2020, 51(1): 36.

[28]

SINGH

, RITCHEY

, CONFER

. Mannheimia haemolytica: bacterial-host interactions in Bovine Pneumonia[J]. Veterinary Pathology, 2010, 48(2): 338-348.

[29]

SCHOONBROODT

, ICHANTÉ

, BOFFÉ

, DEVOS

, DEVASTER

, TADDEI

, RONDINI

, ARORA

, PASCAL

, MALVAUX

. Real-time PCR has advantages over culture-based methods in identifying major airway bacterial pathogens in chronic obstructive pulmonary disease: results from three clinical studies in Europe and North America[J]. Frontiers in Microbiology, 2023, 13: 1098133.

[30]

MAUNSELL

, CHASE

. Mycoplasma bovis: interactions with the immune system and failure to generate an effective immune response[J]. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice, 2019, 35(3): 471-483.

[31]

CALDERÓN BERNAL

, FERNÁNDEZ

, ARNAL

, SANZ TEJERO

, FERNÁNDEZ-GARAYZÁBAL

, VELA

, CID D. Molecular epidemiology of Pasteurella multocida associated with bovine respiratory disease outbreaks[J]. Animals, 2022, 13(1): 75.

[32]

ABED

, EL-SEEDY

, HASSAN

, NABIH

, KHALIFA

, SALEM

, WARETH

, MENSHAWY

AMS

. Serotyping, genotyping and virulence genes characterization of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica isolates recovered from pneumonic cattle calves in north upper Egypt[J]. Veterinary Sciences, 2020, 7(4): 174.

[33]

VALERIS-CHACIN

, POWLEDGE

, McATEE

, MORLEY

, RICHESON

. Mycoplasma bovis is associated with Mannheimia haemolytica during acute bovine respiratory disease in feedlot cattle[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 946792.

[34]

, TONG

, FU

, MÜLLER

, WELDEAREGAY

, BECHER

, VALENTIN-WEIGAND

, MEENS

, HERRLER

. Infection of bovine well-differentiated airway epithelial cells by Pasteurella multocida: actions and counteractions in the bacteria-host interactions[J]. Veterinary Research, 2020, 51(1): 140.

[35]

RUIZ-MAZÓN

, RAMÍREZ-RICO

, deLa GARZA

. Lactoferrin affects the viability of bacteria in a biofilm and the formation of a new biofilm cycle of Mannheimia haemolytica A2[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2024, 25(16): 8718.

[36]

SETTYPALLI

TBK

, LAMIEN

, SPERGSER

, LELENTA

, WADE

, GELAYE

, LOITSCH

, MINOUNGOU

, THIAUCOURT

, DIALLO

. One-step multiplex RT-qPCR assay for the detection of Peste des petits ruminants virus, Capripoxvirus, Pasteurella multocida and Mycoplasma capricolum subspecies (ssp.) capripneumoniae [J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153688.

[37]

Van CAMP

, HASLAM

, POROLLO

. Prediction of antimicrobial resistance in gram-negative bacteria from whole-genome sequencing data[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 1013.

[38]

WOODS

, BARBOSA

, KOEPPING

, RAYGOZA

, MWANGI

, READ

. The evolution of antibiotic resistance in an incurable and ultimately fatal infection: a retrospective case study[J]. Evolution, Medicine, and Public Health, 2023, 11(1): 163-173.

2025年第65卷第9期

PDF下载

183

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250147

接收时间：2025-02-26
首发时间：2026-02-07
出版时间：2025-09-04

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2025-02-26
录用日期：2025-03-30

基金

Qingdao Lijian Diagnostic Technology Development Center, Enterprise Horizontal Projects(HMSY21001)

青岛立见诊断技术发展中心企业横向课题(HMSY21001)

作者信息

1 南京农业大学动物医学院，猪链球菌病WOAH参考实验室，江苏南京

2 青岛立见生物科技有限公司，山东青岛

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250147

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

Primers and probes (100 μmol/L)	Combinations of primer probes at different concentrations (μL)
M. bovis-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M. bovis-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6
P.m-F	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-R	2.0	2.0	2.0	4.0	6.0	4.0	6.0	4.0	6.0
P.m-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.4	1.8
M.h-F	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-R	2.0	2.0	2.0	4.0	4.0	4.0	6.0	6.0	6.0
M.h-P	1.0	1.3	1.6	1.0	1.3	1.6	1.0	1.8	1.0

Primers and probes

(100 μmol/L)

Combinations of primer probes at different concentrations (μL)

Group 1

Group 2

Group 3

Group 4

Group 5

Group 6

Group 7

Group 8

Group 9

M. bovis-F

2.0

4.0

6.0

M. bovis-R

2.0

4.0

6.0

M. bovis-P

1.0

1.3

1.6

1.0

1.3

1.6

1.0

1.3

1.6

P.m-F

2.0

4.0

6.0

4.0

6.0

4.0

6.0

P.m-R

2.0

4.0

6.0

4.0

6.0

4.0

6.0

P.m-P

1.0

1.3

1.6

1.0

1.3

1.6

1.0

1.4

1.8

M.h-F

2.0

4.0

6.0

M.h-R

2.0

4.0

6.0

M.h-P

1.0

1.3

1.6

1.0

1.3

1.6

1.0

1.8

1.0

Dilution	P.m average C_t value	M.h average C_t value	M. bovis average C_t value
Bacteria liquid	19.67	20.60	26.65
10^-1	23.06	23.91	29.04
10^-2	26.50	26.35	32.76
10^-3	29.91	30.83	34.51
10^-4	33.69	34.42	N/A
10^-5	36.88	38.29	N/A
10^-6	39.51	N/A	N/A
Blank control	N/A	N/A	N/A

Dilution

P.m average C_t value

M.h average C_t value

M. bovis average C_t value

Bacteria liquid

19.67

20.60

26.65

10^-1

23.06

23.91

29.04

10^-2

26.50

26.35

32.76

10^-3

29.91

30.83

34.51

10^-4

33.69

34.42

N/A

10^-5

36.88

38.29

N/A

10^-6

39.51

N/A

Blank control

N/A

Number	Primers name	Primer sequences (5′→3′)
1	MB/F1	CAGTGCTGATGTTGAATA
MB/R1	GCTTCATTAACTTGTTGTA
MB/P1	FAM-ACCGCCATCAGCTATAACTAAGTCAT-BHQ1
2	MB/F2	GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA
MB/R2	GCAATGCCTCTTTATTTGTTTTACAG
MB/P2	FAM-TGACGGCGCTATTAA-MGB
3	MB/F4	AAACCAAAGCCTTAATTGACCT
MB/R4	TCCATATTTGGACCTAGTCCTT
MB/P4	FAM-ACCGGTTTGCAAAGTCGCACT-BHQ1
4	PM/5F	GGAGTTTGGTGTGTTGAG
PM/5R	CAGACTGACAAGGAAATATAAAC
PM/5P	VIC-AATCTGCTTCCTTGACAACGGC-BHQ1
5	PM/6F	CCTTGTCAGTCTGATTTATC
PM/6R	GACCAAAATAGGTAACCAATA
PM/6P	VIC-CCGCTCTGTCGTTAATGGCTTC-BHQ1
6	PM/7F	GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT
PM/7R	GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT
PM/7P	VIC-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1
7	MH/8F	GATCGAATTATTGTGATG
MH/8R	GGTGTAAGTAGGAATAAAGTC
MH/8P	Cy5-CAAGGCAAGCACCACGAATTACT-BHQ2
8	MH/9F	TATTAGCAACCATTGGGCAACA
MH/9R	CAATCACTTGCCCTGATAGCAT
MH/9P	Cy5-ACCTTTGGCTAGGGGCACACT-BHQ2
9	MH/F1	TGTTAGAGGCCACCGCTCTG
MH/R1	CGCATCCGGGCTAATATGTTT
MH/P1	Cy5-CACCTCCTGCCCTGCTGCAACAA-BHQ2

Number

Primers name

Primer sequences (5′→3′)

MB/F1

CAGTGCTGATGTTGAATA

MB/R1

GCTTCATTAACTTGTTGTA

MB/P1

FAM-ACCGCCATCAGCTATAACTAAGTCAT-BHQ1

MB/F2

GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA

MB/R2

GCAATGCCTCTTTATTTGTTTTACAG

MB/P2

FAM-TGACGGCGCTATTAA-MGB

MB/F4

AAACCAAAGCCTTAATTGACCT

MB/R4

TCCATATTTGGACCTAGTCCTT

MB/P4

FAM-ACCGGTTTGCAAAGTCGCACT-BHQ1

PM/5F

GGAGTTTGGTGTGTTGAG

PM/5R

CAGACTGACAAGGAAATATAAAC

PM/5P

VIC-AATCTGCTTCCTTGACAACGGC-BHQ1

PM/6F

CCTTGTCAGTCTGATTTATC

PM/6R

GACCAAAATAGGTAACCAATA

PM/6P

VIC-CCGCTCTGTCGTTAATGGCTTC-BHQ1

PM/7F

GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT

PM/7R

GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT

PM/7P

VIC-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1

MH/8F

GATCGAATTATTGTGATG

MH/8R

GGTGTAAGTAGGAATAAAGTC

MH/8P

Cy5-CAAGGCAAGCACCACGAATTACT-BHQ2

MH/9F

TATTAGCAACCATTGGGCAACA

MH/9R

CAATCACTTGCCCTGATAGCAT

MH/9P

Cy5-ACCTTTGGCTAGGGGCACACT-BHQ2

MH/F1

TGTTAGAGGCCACCGCTCTG

MH/R1

CGCATCCGGGCTAATATGTTT

MH/P1

Cy5-CACCTCCTGCCCTGCTGCAACAA-BHQ2

Triple primer probe combination	Primer probe number
Group 1	1	4	7
Group 2	1	5	7
Group 3	2	6	9
Group 4	2	4	8
Group 5	3	4	9
Group 6	2	4	9

Triple primer probe combination

Primer probe number

Group 1

Group 2

Group 3

Group 4

Group 5

Group 6

Pathogen	Bacterial isolation result	Triple qPCR result	Kappa coefficient
M. bovis	Negative	116	0	1.000 0
Positive	0	9
P.m	Negative	115	1	0.984 0
Positive	1	8
M.h	Negative	109	2	0.976 0
Positive	1	13

Pathogen

Bacterial isolation result

Triple qPCR result

Kappa coefficient

Negative

Positive

M. bovis

Negative

116

1.000 0

Positive

P.m

Negative

115

0.984 0

Positive

M.h

Negative

109

0.976 0

Positive

Pathogen	Number of positive samples	Positivity rate (%, 95% CI)
P.m	412	32.9 (30.3-35.6)
M. bovis	328	26.2 (23.8-28.7)
M.h	267	21.3 (19.1-23.7)

Pathogen

Number of positive samples

Positivity rate (%, 95% CI)

P.m

412

32.9 (30.3-35.6)

M. bovis

328

26.2 (23.8-28.7)

M.h

267

21.3 (19.1-23.7)

Region	M.bovis positive rate (%, 95% CI)	P.m positive rate (%, 95% CI)	M.h positive rate (%, 95% CI)	Province/city/Autonomous region with high incidence
Northeast China	40.7 (33.1-48.8)	48.5 (40.8-56.3)	28.1 (21.7-35.6)	Hulunbuir, Tongliao, Chifeng
North China	41.1 (34.7-47.8)	46.8 (40.2-53.5)	23.4 (18.1-29.5)	Hohhot, Baotou, Ulanqab
Northwest	37.3 (29.6-45.7)	44.4 (36.3-52.7)	23.9 (17.5-31.7)	Bayannur, Ningxia Hui Autonomous Region, Xinjiang Uygur Autonomous Region
East China	15.7 (10.9-22.0)	20.2 (14.7-27.0)	11.8 (7.6-17.7)	Shandong, Anhui, Jiangsu
Central China	14.6 (8.4-23.6)	19.1 (11.9-28.8)	10.1 (5.1-18.3)	Henan, Hubei, Hunan
Southwest China	8.9 (2.9-21.3)	15.6 (6.9-29.8)	6.7 (1.8-18.5)	Yunnan

Region

M.bovis positive rate (%, 95% CI)

P.m positive rate (%, 95% CI)

M.h positive rate (%, 95% CI)

Province/city/Autonomous region with high incidence

Northeast China

40.7 (33.1-48.8)

48.5 (40.8-56.3)

28.1 (21.7-35.6)

Hulunbuir, Tongliao, Chifeng

North China

41.1 (34.7-47.8)

46.8 (40.2-53.5)

23.4 (18.1-29.5)

Hohhot, Baotou, Ulanqab

Northwest

37.3 (29.6-45.7)

44.4 (36.3-52.7)

23.9 (17.5-31.7)

Bayannur, Ningxia Hui Autonomous Region, Xinjiang Uygur Autonomous Region

East China

15.7 (10.9-22.0)

20.2 (14.7-27.0)

11.8 (7.6-17.7)

Shandong, Anhui, Jiangsu

Central China

14.6 (8.4-23.6)

19.1 (11.9-28.8)

10.1 (5.1-18.3)

Henan, Hubei, Hunan

Southwest China

8.9 (2.9-21.3)

15.6 (6.9-29.8)

6.7 (1.8-18.5)

Yunnan