微生物学报

Treatment group number	Experimental conditions
AFC	AOM culture+Ferrihydrite+CH₄
AF	AOM culture+Ferrihydrite
AC	AOM culture+CH₄
SFC	Inactivated AOM culture+Ferrihydrite+CH₄

Treatment group number	Experimental conditions
AFC	AOM culture+Ferrihydrite+CH₄
AF	AOM culture+Ferrihydrite
AC	AOM culture+CH₄
SFC	Inactivated AOM culture+Ferrihydrite+CH₄

甲烷氧化菌群介导的Fe(III)还原和生物固氮及其耦合机制

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李书安 , 余林鹏 ^* , 杨琳 , 沈彦汐 , 周顺桂

微生物学报 | 研究报告 2025,65(6): 2449-2462

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(6): 2449-2462

甲烷氧化菌群介导的Fe(III)还原和生物固氮及其耦合机制

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李书安, 余林鹏^*, 杨琳, 沈彦汐, 周顺桂

作者信息

福建农林大学资源与环境学院，福建福州

Fe(III) reduction and biological nitrogen fixation mediated by a methane-oxidizing consortium and their coupling mechanism

Shu’an LI, Linpeng YU^*, Lin YANG, Yanxi SHEN, Shungui ZHOU

Affiliations

College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian, China

出版时间: 2025-06-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240723

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摘要

收起

【目的】 铁还原依赖的甲烷厌氧氧化(Fe-AOM)是厌氧环境中甲烷减排的重要途径，然而在缺氮条件下甲烷氧化微生物如何进行Fe-AOM仍不清楚。【方法】 选取甲烷氧化培养物和水铁矿为研究对象，通过氮同位素示踪、三维荧光光谱分析、电化学分析和高通量测序等方法，探究缺氮条件下Fe-AOM的效率及其耦合生物固氮的可能性。【结果】 在缺氮条件下，甲烷氧化培养物能够催化Fe-AOM，将水铁矿还原转化为菱铁矿等矿物。当添加甲烷时，甲烷氧化培养物的固氮酶活性和¹⁵N同化量显著高于无甲烷组，证明甲烷氧化培养物能够耦合Fe-AOM和生物固氮过程。三维荧光光谱分析和电化学分析表明，Fe-AOM促进了溶解态蛋白质类物质的产生，增加了甲烷氧化培养物的氧化还原活性，并且以直接电子传递的方式进行水铁矿的还原。微生物群落结构分析显示，甲烷杆菌属(Methanobacterium，19.32%)，地杆菌属(Geobacter，6.14%)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio，17.52%)等铁还原菌及固氮弯曲菌属(Azoarcus，1.69%)、固氮螺菌属(Azospirillum，0.43%)等固氮菌在Fe-AOM过程中显著富集。DNA-SIP分析发现，Azoarcus在标记同位素组的重层显著富集，证实其固定了同位素氮。 【结论】 因此推测在该Fe-AOM耦合生物固氮过程主要由Methanobacterium进行甲烷氧化，而Geobacter、Desulfovibrio等铁还原菌负责水铁矿的还原，Azoarcus则催化了生物固氮。此外，甲烷氧化细菌[甲基胞囊菌属(Methylocystis)]与铁还原菌和固氮菌之间呈现正相关关系，暗示其可能对该过程具有一定的贡献。这些结果为理解厌氧环境中铁依赖型甲烷氧化耦合固氮过程提供了新视角。

关键词

厌氧甲烷氧化 / 铁还原 / 生物固氮 / 高通量测序

Abstract

收起

[Objective] Iron reduction-dependent anaerobic oxidation of methane (Fe-AOM) is an important pathway for methane emission reduction in anaerobic environments. However, it remains unclear how methane-oxidizing microbes perform Fe-AOM under nitrogen-limiting conditions. [Methods] Focusing on a methane-oxidizing consortium and ferrihydrite, this study employed nitrogen isotope tracing, three-dimensional fluorescence spectroscopy, electrochemical analysis, and high-throughput sequencing to investigate the Fe-AOM efficiency and the possibility of coupling Fe-AOM with biological nitrogen fixation under nitrogen-limiting conditions. [Results] The methane-oxidizing consortium was able to catalyze Fe-AOM under nitrogen-limiting conditions, reducing ferrihydrite to minerals such as siderite. The nitrogenase activity and ¹⁵N assimilation of the methane-oxidizing consortium in the presence of methane were significantly higher than those in the absence of methane, which demonstrated that the consortium could couple Fe-AOM with biological nitrogen fixation. Three-dimensional fluorescence spectroscopy and electrochemical analysis revealed that Fe-AOM promoted the production of dissolved protein-like substances, enhanced the redox activity of the methane-oxidizing consortium, and reduced ferrihydrite via direct electron transfer. Microbial community structure analysis showed significant enrichment of Methanobacterium (19.32%), iron-reducing bacteria such as Geobacter (6.14%) and Desulfovibrio (17.52%), as well as nitrogen-fixing bacteria like Azoarcus (1.69%) and Azospirillum (0.43%) during the Fe-AOM process. DNA-SIP analysis found that Azoarcus was significantly enriched in the heavy fraction of the labeled isotope group, confirming that it fixed isotope nitrogen. [Conclusion] It is thus hypothesized that the coupling of Fe-AOM with biological nitrogen fixation was primarily carried out by Methanobacterium which oxidized methane, Geobacter and Desulfovibrio responsible for the reduction of ferrihydrite, and Azoarcus catalyzing biological nitrogen fixation. Additionally, the positive correlations of the methane-oxidizing bacterium Methylocystis with iron-reducing bacteria and nitrogen-fixing bacteria suggested a certain contribution of Methylocystis to this process. These results provide new insights into understanding iron-dependent methane oxidation and nitrogen fixation in anaerobic environments.

Key words

anaerobic methane oxidation / iron reduction / biological nitrogen fixation / high-throughput sequencing

引用本文

李书安, 余林鹏, 杨琳, 沈彦汐, 周顺桂. 甲烷氧化菌群介导的Fe(III)还原和生物固氮及其耦合机制. 微生物学报, 2025 , 65 (6) : 2449 -2462 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240723

Shu’an LI, Linpeng YU, Lin YANG, Yanxi SHEN, Shungui ZHOU. Fe(III) reduction and biological nitrogen fixation mediated by a methane-oxidizing consortium and their coupling mechanism[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (6) : 2449 -2462 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240723

正文

收起

甲烷是一种重要的温室气体，其温室效应是二氧化碳的28-34倍^[1]。厌氧甲烷氧化(anaerobic oxidation of methane, AOM)作为厌氧环境中去除甲烷的主要途径，对全球碳循环起着至关重要的作用。在海洋沉积物中，由厌氧甲烷营养古菌(anaerobic methanotrophic archaea, ANME)和硫酸盐还原细菌(sulfate reducing bacteria, SRB)联合催化的硫酸盐型厌氧甲烷氧化(sulphate-dependent anaerobic methane oxidation, S-DAMO)，使得海洋沉积物产生的甲烷在进入大气之前削减了90%^[2-3]。除硫酸盐外，越来越多的电子受体被证实能与AOM耦合，包括硝酸盐^[4]、铁氧化物^[5-6]、腐殖酸等^[7]。与硫酸盐相比，AOM驱动的铁还原(Fe-AOM)是一个热力学更为有利的过程。因此，AOM与铁还原的耦合越来越受到人们的关注^[8]。作为深海沉积物中主要组分之一的氧化铁可能在AOM过程中发挥着重要的电子受体作用。Fe-AOM主要发生在硫酸盐-甲烷交界带以下，由甲烷氧化菌和铁还原菌共同介导^[9]。Sivan等^[10]证实在海洋渗漏沉积物中，硫酸盐还原、铁还原、AOM和产甲烷过程共存，并且铁还原作用促进了S-DAMO。在一些硫酸盐贫乏的淡水和海洋沉积环境中，Fe-AOM可能是重要的甲烷去除途径^[6,11-15]。除了降低甲烷排放量外，Fe-AOM产生的大量铁氧化物强烈影响沉积物的铁循环和相关的生物地球化学过程^[16]。

生物固氮(biological nitrogen fixation, BNF)是微生物利用固氮酶将氮气(N₂)还原为氨(NH₃)的过程，是生物可利用氮的重要来源。除了根瘤菌等传统的固氮微生物外，甲烷氧化菌也是进行BNF的一大类群。在厌氧环境中，AOM与BNF的耦合最早发现于S-DAMO过程。在该S-DAMO过程中，甲烷厌氧氧化古菌(ANME-2)和硫还原菌(SRB)共同驱动海洋沉积物的BNF，即S-DAMO与BNF的耦合发生^[17]。Dong等^[18]发现，在冷泉中甲烷厌氧氧化、铁/锰还原等代谢过程均可为BNF提供ATP能量，暗示着BNF并不总是与S-DAMO耦合。类似地，Liu等^[19]发现地下水中BNF与铁还原和甲烷氧化等过程紧密关联，固氮菌可能利用甲烷氧化的中间产物作为底物、Fe(Ⅲ)作为电子受体进行固氮反应。Yu等^[20]发现，在缺氧条件下好氧甲烷氧化菌可以还原水铁矿，并驱动BNF的发生。然而，当前研究未能提供Fe-AOM耦合BNF的直接证据，因此，Fe-AOM能否驱动BNF仍不清楚。

目前Fe-AOM研究大多聚焦于氮充足条件下AOM介导的铁转化过程，而缺氮条件下Fe-AOM的效率及机制仍缺乏研究。铁氧化物是水稻土、湖泊沉积物等环境中重要的电子受体，基于铁氧化物的Fe-AOM为众多生物学过程提供能量，但该能量是否足以驱动生物固氮过程、解除缺氮限制仍不清楚。土壤低丰度氮素通常是甲烷氧化的限制因素之一。氮素的缺乏可能会导致AOM过程产生的能量向固氮反应转移，从而改变AOM菌的生长速率和AOM速率^[21]。为此，本研究探究了在缺氮条件下AOM富集培养物的Fe-AOM效率及Fe-AOM驱动BNF的可能性，并初步揭示了Fe-AOM与BNF的耦合机制。本研究结果对于未来发展Fe-AOM环境生态技术(如土壤增氮保肥、作物增产等)具有参考价值。

1 材料与方法

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1.1 接种物和培养基

AOM活性菌群采集于甲烷微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)^[22]。将AOM活性菌群接种于单室MFC (图1A)中，在氮气作为氮源的条件下，富集具有固氮功能的AOM菌。单室MFC的工作电极由7 cm×7 cm的碳布叠加8 cm× 8 cm的透气布(gas diffusion cloth, GDC)包裹在铜管上组成。碳布/透气布复合电极中的透气布微孔用于分散和传输甲烷至电极外表面，供AOM培养物利用。铜管的另一端通过橡胶管连接装有50 mL甲烷(纯度99.99%)的注射器。单室MFC的对电极为2 cm×3 cm×1.5 mm石墨板，参比电极为甘汞电极。电解质溶液(g/L)：KHCO₃ 0.5，CaCl₂·2H₂O 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.2，Na₂HPO₄ 8.8，NaH₂PO₄·2H₂O 5.9，酸性微量元素溶液(1 mL/L)和碱性微量元素溶液(1 mL/L)^[23]，pH值为7.0±0.2。将单室MFC与多通道恒电位仪(上海辰华仪器有限公司)和计算机连接后，将工作电极的电位固定在0.3 V (vs. SHE)，于37 ℃水浴锅中富集甲烷氧化固氮菌。在富集的70 d期间，AOM富集培养物生长良好，并展现出较高的产电活性(图1B)。

1.2 甲烷氧化固氮试验

Fe-AOM固氮试验在厌氧瓶内进行，每个厌氧瓶含有60 mL培养基(与电解质溶液相同)和74 mL顶空。使用高纯氮气对厌氧瓶中的培养基吹扫45 min，以确保厌氧条件。采集20 mL AOM培养物，8 000 r/min离心10 min收集菌体，用厌氧培养基洗涤3次后，接入厌氧瓶内，然后用气密橡胶塞密封。试验设计了4个处理组，包括AFC、AF、AC和SFC (表1)。SFC组中的AOM培养物需要经过高温高压灭活(121 ℃、20 min)。所有处理组均置于37 ℃、150 r/min的摇床中避光运行。在添加水铁矿的处理组中，水铁矿浓度为10 mmol/L；在添加甲烷的处理组中，甲烷添加量为10 mL，即在顶空抽真空后加入10 mL CH₄，并用N₂平衡气压。每40 d将培养物8 000 r/min离心10 min去除上清液，沉淀转入新鲜的培养基，重新补充甲烷后继续运行。通过同位素氮标记来证实AOM培养物的固氮能力。同位素氮标记实验按照上述步骤进行，但将瓶子内的N₂全部置换为¹⁵N₂(纯度99.99%)。

1.3 分析方法

1.3.1 理化分析

采用菲啰嗪法测定亚铁浓度，采用靛酚蓝法测定氨氮浓度，均使用UV-2600分光光度计完成^[24-25]。通过气相色谱(岛津公司)进行测定甲烷和乙烯。利用X射线衍射仪(X-ray diffractometer, XRD) (岛津公司)分析铁矿结构。元素分析仪联用稳定同位素比值质谱(Elementar公司)用于测定菌体同化的¹⁵N丰度，并计算各样的¹⁵N原子百分超，如公式(1)所示。

¹⁵N% excess=样品¹⁵N原子百分数-背景¹⁵N原子百分数(1)

采用三维荧光光谱(安捷伦科技有限公司)分析溶解性有机物的成分和含量，乙炔还原法测量固氮生物体中的固氮酶活性^[26]。具体步骤如下：将培养结束时厌氧瓶内的顶空气体全部置换成氦气，加入甲醇作为碳源(最终浓度为50 mmol/L)，顶空乙炔的体积分数为2%，200 r/min振荡培养10 h，固氮酶将乙炔还原为乙烯，通过测定顶空乙烯含量评价固氮酶活性。

1.3.2 电化学分析

利用循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)和差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)分析AOM培养物的电化学活性^[22]。CV和DPV分析在电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)上进行，具体步骤如下：取30 mL菌悬液，经N₂ (99.99 %)吹扫20 min除氧后，以玻碳电极(有效直径5 mm)为工作电极，铂片电极(0.5 cm×0.5 cm)为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行CV和DPV扫描；CV扫描范围为-0.8-0.6 V (vs. SHE)，扫描速率为0.005 V/s；DPV扫描参数设置如下：初始电势为0.6 V (vs. SHE)，最终电势为-0.8 V (vs. SHE)，电位步增量为0.005 V，振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.25 s，样品间隔为0.02 s，脉冲周期为 0.5 s。上清液的CV和DPV扫描与菌悬液类似，但需先经0.22 μm滤头过滤处理后，再按上述方法测定。

1.3.3 稳定性同位素核酸探针

利用稳定性同位素核酸探针技术(DNA-based stable isotope probing, DNA-SIP)结合高通量测序，追踪同化吸收¹⁵N₂的关键功能微生物。DNA-SIP的具体步骤如下：在非标记同位素AFC组(AFC¹⁴N₂)和标记同位素AFC组(AFC¹⁵N₂)实验结束时，提取各组DNA，将5 μg DNA与氯化铯溶液混合形成初始浮力密度为1.714 g/mL的离心溶液，并转移至4.9 mL的超高速离心试管中。利用贝克曼VTi 90转子在20 ℃、60 000 r/min超高速密度梯度离心66 h，进行DNA分层。使用注射泵(保定雷弗流体科技有限公司)获取24个等体积(200 μL)的不同浮力密度的DNA-氯化铯溶液，并用数字折射仪(Reichert公司)检测每个分层的折光度。用糖原和2倍体积的PEG沉淀DNA，并用70%乙醇纯化，纯化的DNA溶解于30 μL TE缓冲液中。采用qPCR测定每层DNA溶液中nifH基因的丰度，qPCR方法与Yu等^[20]相同。最后高通量测序分析重层DNA和轻层DNA样品中的微生物组成。

1.3.4 微生物群落结构分析

为了分析微生物群落组成的变化，采用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals公司)提取基因组DNA。分别使用细菌和古菌通用16S rRNA基因引物341b4F (5′-CTAYGGRRBG CWGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNGGGTA TCTAAT-3′)，nifH引物PolF (5′-TGCGAYCCS AARGCBGACTC-3′)和PolR (5′-ATSGCCATCA TYTCRCCGGA-3′)，分别扩增16S rRNA基因和nifH基因，16S rRNA基因扩增产物在Illumina MiSeq平台(上海美吉生物医药科技有限公司)进行高通量测序。Illumina 测序得到的序列经序列质控和过滤、重叠拼接后用于微生物多样性分析。本研究测序获得的原始数据存储于NCBI的SRA数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，生物项目编号为PRJNA1081667，链接为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/1183654。利用R (v4.1.0)程序包psych计算操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)之间的Spearman相关系数，相关系数矩阵(|R|>0.6且P<0.05)通过Gephi软件(v0.9.2)可视化微生物共存网络。

2 结果与讨论

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2.1 AOM培养物介导的甲烷氧化和水铁矿还原

为了探究AOM培养物是否具备Fe-AOM功能，监测了各处理组中CH₄浓度的变化以及培养体系中Fe(II)浓度变化。如图2A所示，经过40 d的培养后，AFC组消耗了(0.59±0.04) mmol/L的CH₄，而AC和SFC组的CH₄浓度无明显变化。这表明在培养过程中，CH₄可以被AOM培养物所氧化利用。同时，AFC组和AF组体系中的Fe(II)浓度在第40天时分别增加到(0.25±0.01) mmol/L和(0.39±0.03) mmol/L，而无生物活性的SFC组Fe(II)浓度无明显变化(图2B)。这表明AOM培养物能够驱动水铁矿的还原。在无甲烷存在的情况下，AF组也表现出了一定的水铁矿还原能力，可能是由于在单室MFC富集过程中产生的胞外聚合物或细胞内积累的有机物充当了电子供体(图2C、2D)。随着这些电子供体的逐渐耗尽，甲烷作为电子供体驱动的铁还原过程逐渐占据主导地位(图2D)。因此，在第110天时，AFC组的Fe(II)浓度[(0.93±0.05) mmol/L]明显超过了AF组[(0.74±0.01) mmol/L]，证明甲烷在AOM培养物还原水铁矿的过程中充当了底物和电子来源，即AOM培养物在缺氮条件下能够驱动Fe-AOM反应。然而，甲烷的消耗量与亚铁的产生量之间的CH₄/Fe(II)化学计量比远高于理论值1:8。硫酸盐作为AOM过程中常见的电子受体^[3]，为了确定其是否增强了甲烷氧化从而导致CH₄/Fe(II)化学计量比偏高，对硫酸盐的浓度进行了分析。结果显示，4个处理组中的硫酸盐浓度均无明显变化(图3)。结合AC组中甲烷也未被消耗的情况，可以判断硫酸盐在Fe-AOM过程中并未充当电子受体。因此，较低的CH₄/Fe(II)化学计量比可能源于其他因素，例如AOM菌群中可能存在一些铁循环菌，如亚铁氧化菌，这些微生物可能导致生成的Fe(II)被重新氧化，从而降低了Fe(II)的积累量^[27-28]。

采用XRD技术鉴定了实验结束时(第110天)水铁矿的还原产物结构。如图4所示，AFC组和AF组中的水铁矿还原产物主要为菱铁矿(FeCO₃)。这与He等^[29]报道的水铁矿还原产物一致。同时，还原产物中还包括少量的磁铁矿(Fe₃O₄)和蓝铁矿[Fe₃(PO₄)₂(H₂O)₈]。菱铁矿可能是Fe(II)与甲烷氧化产生的碳酸根结合而形成^[30]。相比之下，SFC组的样品XRD图谱与初始的水铁矿基本一致，表明SFC组中的水铁矿并未被还原。这些结果充分证明AOM培养物具备还原转化水铁矿的功能。

2.2 Fe-AOM过程的固氮效果

第40天实验结束后，利用乙炔还原法检测了各处理组的乙烯和氨氮产量，以探讨AOM培养物在Fe-AOM过程中的固氮潜力。如图5A所示，AFC组的乙烯浓度达到了(1.34±0.03) μmol/L，而AF组仅有(0.08±0.08) μmol/L，SFC组未检测到乙烯的生成，表明Fe-AOM过程增强了AOM培养物的固氮酶活性。AFC组、AF组和SFC组的氨氮浓度分别为(0.58±0.05)、(0.41±0.02)和(0.10±0.04) mg/L，进一步证明了甲烷的添加促进了氨氮的生产。这表明AOM培养物的Fe-AOM过程可能驱动了生物固氮。尽管AF组也检测到较高的氨氮浓度，但其固氮酶活性较低。因此AF组的氨氮可能主要来源于含氮有机物(如蛋白质和核酸)的分解，而非生物固氮过程^[31]。

为了进一步验证AOM培养物在Fe-AOM过程中发挥的生物固氮功能，将样品顶空的普通N₂置换为同位素¹⁵N₂，进行同位素氮标记实验。如图5B所示，在培养了40 d后，AFC+¹⁵N₂组AOM培养物菌体同化的¹⁵N丰度[(0.68±0.09)%]显著高于自然环境¹⁵N同位素背景值(0.37%) (P<0.05)，其¹⁵N百分超达(0.32±0.09)%。AFC+¹⁴N₂组菌体同化的¹⁵N丰度与自然环境¹⁵N同位素背景值接近^[32]，因此排除了氮同位素分馏效应。相比之下，AF+¹⁵N₂组菌体同化的¹⁵N丰度仅比背景值高(0.07±0.02)%，与背景值无显著差异(P>0.05)，表明AF组的氨氮中只有少量来源于生物固氮。AFC组AOM培养物菌体同化的¹⁵N丰度显著高于AF组，证明AOM培养物在Fe-AOM过程中确实进行了生物固氮。

2.3 AOM铁还原途径和甲烷代谢产物

AOM培养物的水铁矿还原速率与其氧化还原活性紧密相关。借助循环伏安法和微分脉冲伏安法测定了AOM培养物的氧化还原活性，并解析了AOM微生物的铁还原途径。结果如图6A所示，第40天时AFC组在100 mV和-80 mV处观察到一对氧化还原峰(E_1/2=10 mV)，以及在-330 mV和370 mV处的氧化峰(图6A)。第80天时，AFC组在130 mV和-50 mV处观察到一对氧化还原峰(E_1/2=40 mV)。中点电位(10 mV和40 mV)与细胞色素c (cytochrome c, cyt c)的中点电位相近(-204 mV vs. SCE)^[33]，并与Geobacter soli中检测到的氧化还原蛋白接近(-200 mV vs. Ag/AgCl)^[34]，该氧化还原蛋白可能有助于提升胞外电子传递能力。位于-330 mV处的氧化峰与NAD⁺/NADH的电位接近(-320 mV vs. SHE)，因此推测电子的传递方向为NADH→cyt c→水铁矿。AF组培养物分别在180 mV和-60 mV (E_1/2=60 mV)处检测到氧化峰和还原峰，与AFC组在100 mV和-80 mV处的峰相近，说明可能是同种电化学活性物质，但由于缺乏甲烷，其活性较低。SFC组仅在260 mV处有一个氧化峰，说明高温灭菌处理破坏了菌体或氧化还原物质(如细胞色素等)的结构，导致该组的氧化还原活性受损。通过比较氧化还原峰电流的高度，发现添加甲烷的AFC组氧化还原活性明显高于无甲烷的AF组，证明甲烷有效增强了AOM培养物的氧化还原活性。第80 天时，AFC组的氧化还原峰位置变为130 mV和-60 mV，相对于第40天有所减弱。这可能是因为随着水铁矿的还原，新的铁矿产物不断吸附或包裹至菌体表面，从而阻碍了胞外电子的传递^[35]。与菌悬液相比，上清过滤液的CV扫描未检测到明显的氧化还原峰(图6B)，表明氧化还原活性物质主要分布于菌体或固体沉淀中。这证明AOM培养物并未分泌可溶性电子穿梭体，而是主要通过菌体-水铁矿的直接接触方式将电子转移给水铁矿。DPV测试也显示第40天和第80天时，AFC组的峰值电流均高于AF组(图6C)，再次证明了甲烷的存在有利于维持AOM培养物的氧化还原活性。在活性AOM培养物存在的条件下，AFC组[(-77±5) mV]、AF组[(-81±11) mV]和AC组[(-60±3) mV]的氧化还原电位(E_h)均呈负值，但组间差异不显著(图6D)。相反，无细胞活性的SFC的E_h为(172±3) mV，与含有水铁矿的初始培养基E_h[(184±7) mV]相近，表明活性AOM培养物降低了体系的氧化还原电位。这些较低的氧化还原电位为AOM菌的水铁矿还原提供了必要条件。

溶解性有机物三维荧光光谱的荧光信号通常可分为5个区域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，分别与酪氨酸蛋白类物质、色氨酸蛋白类物质、富里酸类物质、溶解性微生物代谢产物类物质和腐殖酸类物质相关^[36]。为了探究AOM培养物在Fe-AOM过程中生成的可溶性有机物类型和互营作用，采用三维荧光光谱分析第110天时体系上清液中的有机物。结果显示，AFC组和AF组的上清液中均鉴定出蛋白质类物质、富里酸和溶解性微生物代谢产物(图7)，并且AFC组中这些物质的含量均高于AF组。AFC组样品中蛋白类物质和微生物代谢产物的含量明显高于AF组，这是因为AFC组发生了甲烷厌氧氧化，相较于AF组有了更多的能量来源，从而分泌了更多的蛋白和代谢中间产物。这与He等^[37]发现甲烷氧化菌在甲烷氧化过程向生境中分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)相似。AOM微生物群落中的古菌经常与其他成员共享代谢物^[38]，例如SRB通过消耗ANME产生的乙酸进行硫酸盐还原^[39]。这些有机物的存在暗示Fe-AOM培养物成员之间发生了互营作用，即铁还原菌/固氮菌利用厌氧甲烷氧化古菌氧化甲烷过程中分泌的代谢中间产物作为电子供体进行铁还原/生物固氮。同时厌氧甲烷氧化古菌与铁还原菌竞争利用代谢中间产物或其他溶解性有机物，这可能是甲烷杆菌属(Methanobacterium)与有相互作用的属均呈负相关关系的原因(图8B)。

2.4 Fe-AOM耦合生物固氮机制分析

为了探究Fe-AOM耦合生物固氮的微生物作用机制，测定了AFC组和AF组在第110天时的微生物群落结构。如图8A所示，接种物的微生物群落主要由Methanobacterium (33.98%)、食氢产水菌属 (Hydrogenophaga，18.24%)、假拟杆状菌属(Pseudobacteroides，18.32%)、地杆菌属(Geobacter，1.39%)等组成。在AFC组中，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、慢长杆菌属(Ignavibacterium)、Geobacter和脱硫弓菌属(Desulfarculus)等表现出明显的富集现象。与AF组相比，AFC组中的Methanobacterium (19.32%)和Pseudomonas (19.70%)等微生物的丰度更高，暗示它们可能与Fe-AOM耦合生物固氮过程密切相关。研究表明，Methanobacterium在Fe-AOM过程中可以进行甲烷氧化^[40]。AFC组中Methanobacterium的丰度显著高于AF组，因此推测AFC组中的甲烷氧化主要由Methanobacterium完成。作为重要的电活性微生物，Geobacter和Desulfovibrio具备胞外电子转移能力，并被广泛认为是铁还原菌^[41]。与接种物相比，Geobacter (6.14%)和Desulfovibrio (17.52%)在AFC组中的显著富集表明它们可能参与了铁还原过程。AFC组中的甲基孢囊菌属(Methylocystis，0.25%)具备甲烷氧化和铁还原功能^[20]，它可能对Fe-AOM过程具有一定贡献。Pseudomonas在AFC组和AF组中的丰度均较高，该属包含了一些亚铁氧化菌，可能催化了Fe(II)产物的氧化^[42]。Ignavibacterium作为清道夫，能够以死亡的生物体或碳氢化合物降解的代谢物为食^[43]。Ignavibacterium在AF组的丰度明显高于AFC组(图8A)，表明AF组中的电子供体可能主要来源于死亡的生物质或碳氢化合物降解的代谢物。这可能是AF组铁还原的原因。此外，AFC组富集到了固氮弯曲菌属(Azoarcus，1.69%)和固氮螺菌属(Azospirillum，0.43%)。作为典型的固氮菌，Azoarcus能够在植物根部^[44]、地下水^[19]中发挥固氮功能。因此，推测Azoarcus可能在Fe-AOM体系中参与了固氮过程。

图8B展示了AOM培养物的共现网络。在AOM培养物中，Methanobacterium与其他属之间的相互作用均呈负相关(图8B)，表明Methanobacterium与这些共存细菌之间存在资源竞争(如氮源、代谢中间产物)。然而，Methanobacterium与Geobacter之间并未表现出直接关联，它们之间的相互作用机制仍有待进一步研究。甲烷氧化细菌Methylocystis与铁还原菌[如Geobacter、地生孢杆菌(Geosporobacter)]^[45]之间的正相关关系表明它们之间可能存在代谢协作，有利于甲烷氧化与铁还原的耦合。此外，Methylocystis还与众多微生物存在协同作用，包括铁还原菌(如Geobacter)和固氮菌[如固氮螺菌属(Azospirillum)]，这种关系可能有利于Fe-AOM和固氮过程。

为了明确固氮功能微生物的种类，将DNA-SIP实验中AFC¹⁵N₂和AFC¹⁴N₂处理组的轻层和重层进行16S rRNA基因的Illumina测序。DNA-SIP结果如图9A所示。在AFC¹⁵N₂和AFC¹⁴N₂处理组中，nifH基因的相对丰度在轻层(1.703 g/mL)达到最大值。然而，在重层(1.711 g/mL)中AFC¹⁵N₂组的nifH基因相对丰度(89.72%)显著高于AFC¹⁴N₂组(50.15%)，说明AFC¹⁵N₂组的重层nifH基因被同位素成功标记。Illumina测序的结果进一步揭示了微生物群落的组成(图9B)。在AFC¹⁵N₂的重层中，Methanobacterium的相对丰度为17.98%，与其在AFC¹⁴N₂重层中的相对丰度17.07%相近，表明Methanobacterium可能并未参与生物固氮过程，而主要起甲烷氧化的作用。在重层中，AFC¹⁵N₂组的Methylocystis相对丰度(11.84%)明显低于AFC¹⁴N₂组(18.14%)，未在AFC¹⁵N₂重层中得到富集，表明Methylocystis可能仅具备甲烷氧化的功能。尽管Geobacter被认为能够在铁氧化物的呼吸过程中进行固氮^[46]，但在本研究的重层中，AFC¹⁵N₂组的Geobacter相对丰度(4.79%)低于AFC¹⁴N₂组(6.28%)，表明Geobacter在实验中可能只发挥了铁还原功能，而并未进行固氮。Azoarcus在AFC¹⁵N₂重层中的相对丰度为3.79%，且显著高于AFC¹⁴N₂重层的2.39%，表明Azoarcus在反应过程中同化了¹⁵N₂，从而进行了生物固氮。

3 结论

收起

(1) AOM培养物利用甲烷作为底物驱动了水铁矿还原与生物固氮的同步进行。水铁矿还原的产物包括菱铁矿、磁铁矿等。Fe-AOM过程显著提升了AOM培养物的固氮酶活性和¹⁵N同化量，证明Fe-AOM可以为生物固氮提供能量，即Fe-AOM与生物固氮之间存在耦合关系。

(2) 在甲烷和水铁矿共存的条件下，AOM培养物产生了较多的水溶性蛋白类似物和微生物代谢产物，这可能有利于加强微生物之间的互营代谢；AOM培养物并未利用电子穿梭体，而是通过直接电子传递的方式进行水铁矿还原。Fe-AOM过程有效提升了AOM培养物的氧化还原活性。

(3) AOM培养物中以甲烷氧化古菌Methanobacterium、铁还原菌Geobacter和Desulfovibrio为优势菌。耦合机理分析表明，Methanobacterium、Geobacter和Desulfovibrio可能协同催化了Fe-AOM过程，其中后两者可能参与了水铁矿还原；而Azoarcus则利用Fe-AOM的代谢中间产物进行生物固氮。

作者利益冲突公开声明

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作者声明绝无任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

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国家自然科学基金(42477255)
国家自然科学基金(42077284)
福建农林大学科技创新专项基金(KFB23121)

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2025年第65卷第6期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240723

接收时间：2024-11-14
首发时间：2026-02-07
出版时间：2025-06-04

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收稿日期：2024-11-14
录用日期：2025-01-22

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National Natural Science Foundation of China(42077284)

国家自然科学基金(42077284)

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福建农林大学资源与环境学院，福建福州

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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