微生物学报

KEGG ID	Name	Up DEGs	Down DEGs
map00220	Arginine biosynthesis	ectB, argE, argG	argD, gdhA
map00250	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	SSADH, ansA, argG, purB	gdhA
map00260	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	ectB, betB	ItaE, garK, ilvA, kb1
map00270	Cysteine and methionine metabolism	metH	metE, mdh, spE
map00280	Valine, leucine, and isoleucine degradation	None	bkdA/B, atoB, ECHS1, fabM, ivd, mmsA
map00340	Histidine metabolism	None	hutG, hisC
map00350	Tyrosine metabolism	None	hmgA, faaH, maiA, frmA
map00360	Phenylalanine metabolism	None	paaH, hisC
map00380	Tryptophan metabolism	None	atoB, ECHS1, GCDH, HADHA
map00910	Nitrogen metabolism	can, narK	gdhA
map00020	Citrate cycle (TCA cycle)	IDH3	mdh

KEGG ID	Name	Up DEGs	Down DEGs
map00220	Arginine biosynthesis	ectB, argE, argG	argD, gdhA
map00250	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	SSADH, ansA, argG, purB	gdhA
map00260	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	ectB, betB	ItaE, garK, ilvA, kb1
map00270	Cysteine and methionine metabolism	metH	metE, mdh, spE
map00280	Valine, leucine, and isoleucine degradation	None	bkdA/B, atoB, ECHS1, fabM, ivd, mmsA
map00340	Histidine metabolism	None	hutG, hisC
map00350	Tyrosine metabolism	None	hmgA, faaH, maiA, frmA
map00360	Phenylalanine metabolism	None	paaH, hisC
map00380	Tryptophan metabolism	None	atoB, ECHS1, GCDH, HADHA
map00910	Nitrogen metabolism	can, narK	gdhA
map00020	Citrate cycle (TCA cycle)	IDH3	mdh

KEGG ID	Name	Up DEPs	Down DEPs
map00220	Arginine biosynthesis	GlsA, ArgE	ArgD, AlaA
map00250	Alanine, aspartate and glutamate metabolism	GltD, GabD, GabT	CarA, AlaA
map00260	Alanine, aspartate and glutamate metabolism	EctB, BetB, BetA, Asd, DoeD, DoeC, GhrA, GpmB	HprA, SerA
map00280	Valine, leucine and isoleucine degradation	GabT	BkdA, BkdB, LiuC, Ivd, MmsA
map00330	Arginine and proline metabolism	AguB	AstA, AstD
map00350	Tyrosine metabolism	AdhP, FrmA, GabD	HPD, FaaH
map00360	Phenylalanine metabolism	None	HipO, PaaA/B/C/D/G/H/Z, DadA
map00380	Tryptophan metabolism	GabT	HAAO
map00910	Nitrogen metabolism	GltD, NarH, NarG	None
map00020	Citrate cycle (TCA cycle)	ACO	AcnB

KEGG ID	Name	Up DEPs	Down DEPs
map00220	Arginine biosynthesis	GlsA, ArgE	ArgD, AlaA
map00250	Alanine, aspartate and glutamate metabolism	GltD, GabD, GabT	CarA, AlaA
map00260	Alanine, aspartate and glutamate metabolism	EctB, BetB, BetA, Asd, DoeD, DoeC, GhrA, GpmB	HprA, SerA
map00280	Valine, leucine and isoleucine degradation	GabT	BkdA, BkdB, LiuC, Ivd, MmsA
map00330	Arginine and proline metabolism	AguB	AstA, AstD
map00350	Tyrosine metabolism	AdhP, FrmA, GabD	HPD, FaaH
map00360	Phenylalanine metabolism	None	HipO, PaaA/B/C/D/G/H/Z, DadA
map00380	Tryptophan metabolism	GabT	HAAO
map00910	Nitrogen metabolism	GltD, NarH, NarG	None
map00020	Citrate cycle (TCA cycle)	ACO	AcnB

WT(HS) vs. WT(NS)	UV(HS) vs. UV(NS) [ST]	UV(HS) vs. UV(NS) [OT]	UV(HS) vs. UV(NS) [NDEGs-DEPs]
[ST]	30	0	30
[OT]	0	4	14
[NDEGs-DEPs]	9	4	85

WT(HS) vs. WT(NS)	UV(HS) vs. UV(NS) [ST]	UV(HS) vs. UV(NS) [OT]	UV(HS) vs. UV(NS) [NDEGs-DEPs]
[ST]	30	0	30
[OT]	0	4	14
[NDEGs-DEPs]	9	4	85

Protein	Gene	Description	DEGs	Gene (fold change)	DEPs	Protein (fold change)
orf01883	ectB	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	Up	2.410	Up	2.229
orf02074	betB	Dependent betaine aldehyde dehydrogenase	Up	5.570	Up	1.753
orf02075	betA	Choline dehydrogenase	Up	4.456	Up	1.507
orf01624	asd	Aspartate-semialdehyde dehydrogenase	Up	0.521	Up	0.113
orf02975	doeD	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	Up	0.299	Up	1.264
orf02976	doeC	Aspartate-semialdehyde dehydrogenase	Up	1.124	Up	2.537
orf00898	ItaE	l-threonine aldolase	Down	1.970	Down	0.203
orf00776	gltD	Glutamate synthase	Down	0.534	Up	1.212
orf02005	gabD	Glutarate-semialdehyde dehydrogenase	Up	0.013	Up	0.909
orf02411	gdhA	Glutamate dehydrogenase	Down	1.875	Down	0.946
orf03515	gabT	4-aminobutyrate aminotransferase	Down	4.250	Down	3.539
orf00396	atoB	Acetyl-CoA acetyltransferase	Down	2.498	Up	0.944
orf00937	narK	Nitrite transporter	Up	2.383	None	None
orf02054	narG	Respiratory nitrate reductase	Down	1.945	Up	0.633
orf01682	acnB	Aconitate hydratase B	Down	1.097	Down	0.898

Protein	Gene	Description	DEGs	Gene (fold change)	DEPs	Protein (fold change)
orf01883	ectB	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	Up	2.410	Up	2.229
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orf03515	gabT	4-aminobutyrate aminotransferase	Down	4.250	Down	3.539
orf00396	atoB	Acetyl-CoA acetyltransferase	Down	2.498	Up	0.944
orf00937	narK	Nitrite transporter	Up	2.383	None	None
orf02054	narG	Respiratory nitrate reductase	Down	1.945	Up	0.633
orf01682	acnB	Aconitate hydratase B	Down	1.097	Down	0.898

转录-蛋白组学关联分析坎帕尼亚盐单胞菌野生型与紫外突变型菌株的差异表达基因与蛋白质

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崔金子 ¹ , 韩睿 ² , 乔丽娟 ¹ , 李永臻 ¹ , 邢江娃 ¹ , 王嵘 ¹ , 沈国平 ¹^,^* , 朱德锐 ¹

微生物学报 | 微生物资源新技术新方法 2025,65(4): 1601-1615

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微生物学报 | 微生物资源新技术新方法 2025, 65(4): 1601-1615

转录-蛋白组学关联分析坎帕尼亚盐单胞菌野生型与紫外突变型菌株的差异表达基因与蛋白质

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崔金子¹, 韩睿², 乔丽娟¹, 李永臻¹, 邢江娃¹, 王嵘¹, 沈国平¹^,^*, 朱德锐¹

作者信息

^1.青海大学医学院，基础医学研究中心，青海西宁

^2.青海大学农林科学院，蔬菜遗传与生理重点实验室，青海西宁

Transcriptomics-proteomics conjoint analysis of differentially expressed genes/proteins between wild type and ultraviolet radiation-mutated Halomonas campaniensis strains

Jinzi CUI¹, Rui HAN², Lijuan QIAO¹, Yongzhen LI¹, Jiangwa XING¹, Rong WANG¹, Guoping SHEN¹^,^*, Derui ZHU¹

Affiliations

^1.Research Center of Basic Medical Science, Medical College, Qinghai University, Xining, Qinghai, China

^2.Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology, Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Qinghai University, Xining, Qinghai, China

出版时间: 2025-04-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240477

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摘要

收起

野生型坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonas campaniensis)经9轮紫外循环诱变，获得1株高产四氢嘧啶(ectoine)的突变菌株G₉-72，关于菌株差异表达基因、蛋白质以及四氢嘧啶产量暴发的分子机制有待深入探讨。【目的】探讨野生菌株XH26和突变菌株G₉-72的差异表达基因或蛋白质(differential expression genes/proteins, DEGs/DEPs)，并关联分析四氢嘧啶高效积聚的分子响应机制。【方法】在无盐和1.5 mol/L NaCl条件下培养菌株XH26和G₉-72，利用Illumina HiSeq高通量测序和定量质谱蛋白组学技术分析菌株转录组-蛋白质组学的差异变化，并采用逆转录定量PCR对显著DEGs的表达进行验证。【结果】转录组学筛选出11条氨基酸代谢通路(涉及44个DEGs)与四氢嘧啶合成代谢相关；蛋白组学筛选出10条氨基酸代谢通路(涉及50个DEPs)与四氢嘧啶合成代谢相关。转录-蛋白关联分析筛选出15个显著DEGs，其中7个基因(ectB、betB、betA、asd、doeD、doeC、gabD)在2个组学中表达上调；4个基因(ItaE、gdhA、gabT、acnB)在2个组学中表达下调；3个基因(gltD、atoB、narG)在转录组学中下调，而在蛋白组学中表达上调；基因narK在转录组学中表达上调，但在蛋白组学中未检测到表达。RT-qPCR验证结果与RNA-seq测序分析一致。【结论】突变菌株四氢嘧啶的积聚量暴发与代谢通路的关键基因有关(合成基因asd和ectB，分解基因doeD和doeC)，与代谢通路上游的参与基因间接相关(betB、betA、ItaE、gltD、gadA和acnB)，以及四氢嘧啶的生物合成与Ala/Asp/Glu/His代谢途径(gabD、gdhA、gabT、atoB)和氮源代谢(narK和narG)高度关联。

关键词

坎帕尼亚盐单胞菌 / 四氢嘧啶 / 转录组学 / 蛋白质组学 / 差异表达基因

Abstract

收起

A mutant strain G₉-72 with a high yield of ectoine was obtained from wild type Halomonas campaniensis after nine rounds of ultraviolet mutagenesis. The differentially expressed genes/proteins (DEGs/DEPs) and the molecular mechanism underlying the excessive increase in the ectoine yield remain to be explored for the mutant strain. [Objective] To explore the DEGs/DEPs between the wild type strain XH26 and G₉-72 and decipher the molecular mechanism of efficient ectoine production by conjoint analysis. [Methods] A non-salt (NS, 0 mol/L NaCl) group and a high-salt (HS, 1.5 mol/L NaCl) group were designed for the culture of XH26 and G₉-72. Illumina HiSeq and quantitative mass spectrometry were employed to identify the DEGs/DEPs between the two strains by transcriptomics-proteomics conjoint analysis. Furthermore, RT-qPCR was carried out to verify the expression of significant DEGs. [Results] The transcriptomics analysis revealed 11 amino acid metabolic pathways (44 DEGs) associated with ectoine anabolism, and the proteomics analysis revealed ten amino acid metabolic pathways (50 DEPs) associated with ectoine anabolism. The transcriptomics-proteomics conjoint analysis identified 15 significant DEGs, including seven genes (ectB, betB, betA, asd, doeD, doeC, and gabD) with up-regulated mRNA and protein level, four genes (ItaE, gdhA, gabT, and acnB) with down-regulated mRNA and protein levels, three genes (gltD, atoB, and narG) with down-regulated mRNA levels and up-regulated protein levels, and one gene narK with up-regulated mRNA level and no protein level. Additionally, the RT-qPCR results were consistent with the transcriptomics analysis. [Conclusion] The excessive increase in the ectoine yield of the mutant strain was associated with key genes in the ectoine metabolic pathway (including the synthesis genes asd and ectB and the catabolism genes doeD and doeC) and indirectly associated with several genes (betB, betA, ItaE, gltD, gadA, and acnB) in the upstream metabolic pathway. Notably, ectoine biosynthesis was highly associated with the Ala/Asp/Glu/His metabolic pathway (gabD, gdhA, gabT, and atoB) and nitrogen source metabolism (narK and narG).

Key words

Halomonas campaniensis / ectoine / transcriptomics / proteomics / differentially expressed genes

引用本文

崔金子, 韩睿, 乔丽娟, 李永臻, 邢江娃, 王嵘, 沈国平, 朱德锐. 转录-蛋白组学关联分析坎帕尼亚盐单胞菌野生型与紫外突变型菌株的差异表达基因与蛋白质. 微生物学报, 2025 , 65 (4) : 1601 -1615 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240477

Jinzi CUI, Rui HAN, Lijuan QIAO, Yongzhen LI, Jiangwa XING, Rong WANG, Guoping SHEN, Derui ZHU. Transcriptomics-proteomics conjoint analysis of differentially expressed genes/proteins between wild type and ultraviolet radiation-mutated Halomonas campaniensis strains[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (4) : 1601 -1615 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240477

正文

收起

目前，转录组学(transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)及关联分析技术已成为关键的研究工具，广泛应用于基因差异表达、基因间互作关系以及影响基因表达的变量等多个领域。Chen等^[1]利用转录组学和Tn5转座子诱变分析北门盐单胞菌(Halomonas beimenensis)的盐适应机制，结果显示突变基因atpC、nadA、nqrA、gdhB和TrkA等与氧化磷酸化、吸K⁺排Na⁺和相容溶质合成等过程有关，而基因prkA、smpB、tatB、mtnN、spoT、acrR1、lacA、rsbV、lon、rfbP和rfbC等与细胞运动、群体感应、细胞信号传递和转录/翻译调控等途径有关。Kindzierski等^[2]运用LC-MS技术分析延长盐单胞菌(H. elongata)在不同盐度下的蛋白差异表达，表明在0.17 mol/L NaCl (1.0%)条件下，蛋白Hda (与蛋白DnaA同源)的表达受到抑制；当NaCl浓度升高至1.0 mol/L时，蔗糖孔蛋白ScrY的含量增加了335倍。Li等^[3]利用转录-蛋白组学整合分析揭示乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的生理调控，发现果糖和pH值显著影响乳酸乳球菌的糖代谢，而Ca²⁺离子和棕榈酸则影响脂肪酸的合成代谢。

盐单胞菌属(Halomonas)是四氢嘧啶(ectoine)工业化生产的重要模式菌株之一^[4]，其典型代表包括延长盐单胞菌(H. elongata) ATCC 2581^T和嗜盐盐单胞菌(H. halophila)^[5-6]。实验室前期以野生型坎帕尼亚盐单胞菌[(H. campaniensis) XH26，四氢嘧啶单批次摇瓶产量为(0.51±0.01) g/L]为研究材料，经过9轮紫外循环诱变，筛选获得1株四氢嘧啶产量为(1.92±0.01) g/L的高产突变菌株G₉-72。值得注意的是，与野生菌株相比，突变菌株G₉-72在菌落形态、生物量和四氢嘧啶积聚量等方面均存在显著差异。我们推测紫外诱变可能导致某些基因突变，进而影响基因的表达调控，最终导致四氢嘧啶的合成量显著增加。因此，本研究通过转录-蛋白组学技术关联分析野生菌株XH26和突变菌株G₉-72的基因转录和蛋白表达差异，以探究哪些关键基因参与四氢嘧啶合成代谢的启动应答或网络代谢调控，从而揭示四氢嘧啶产量暴发的分子响应机制，为突变菌株的后续工业应用提供理论参考。

1 材料与方法

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1.1 菌株来源和培养基

野生型坎帕尼亚盐单胞菌(H. campaniensis) XH26 (CCTCC 2019776^M)分离自柴达木盆地小柴旦湖，菌株XH26与突变菌株G₉-72现保存于青海大学基础医学研究中心。基础培养基(basal medium, BM) (g/L)：NaCl 87.8，MgSO₄·7H₂O 25.0，KCl 55.0，CaCl₂ 0.2，柠檬酸钠3.0，l-谷氨酸钠6.5，酶水解酪素19.7，pH 8.0，培养温度37 ℃。固体培养基中补加15.0 g/L琼脂^[7]。

1.2 主要试剂和仪器

分析纯NaCl、KCl、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸钠、酵母抽提物、l-谷氨酸钠、酶水解酪素和NaOH等，北京索莱宝科技有限公司；Invitrogen TRIzol试剂盒、细菌蛋白质提取试剂盒，ThermoFisher Scientific公司；细菌Ribo-Zero rRNA去除试剂盒，Illumina公司；DIA校正试剂盒，Biognosys公司。

Q-Exactive HF质谱仪、SDS-PAGE凝胶电泳仪，ThermoFisher Scientific公司；高通量测序平台，Illumina公司；实时荧光定量PCR仪，Roche公司。

1.3 菌株生长量测定与胞内四氢嘧啶的HPLC分析

基于BM培养基，设置6个NaCl梯度培养条件组(0.5-3.0 mol/L，浓度间隔0.5)，活化菌种XH26和G₉-72，按1%接种量分别接种于盐梯度培养基(50 mL)，35 ℃、120 r/min摇床培养48 h。诱导培养结束后，测定光密度值OD₆₀₀(n=3)，4 ℃、4 000×g离心5 min收集菌泥。按照文献[8]的方法进行菌泥四氢嘧啶的提取，并采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测胞内四氢嘧啶的积聚量。HPLC检测条件：流动相乙腈/纯水(80/20，体积比)，检测波长210 nm，流速1.0 mL/min，柱压3.48-4.76 MPa，柱温30 ℃，上样量10 μL^[8-9]。

1.4 转录组测序与数据分析

基于BM培养基，设置无盐组(no salt group, NS，0 mol/L NaCl)和高盐组(high salt group, HS，1.5 mol/L NaCl)，分别接种培养野生菌株XH26 (wild type, WT)和突变菌株G₉-72 (ultraviolet type, UV)，分组编号为WT(NS)、WT(HS)、UV(NS)和UV(HS)，每组设3个生物学重复。采用Invitrogen TRIzol试剂盒提取上述12个样品的总RNA (≥30 μL/样)，利用细菌Ribo-zero rRNA去除试剂盒去除rRNA，随后进行mRNA片段化和反转录^[10]。使用NanoDrop和Qubit 2.0检测RNA的纯度和浓度，采用Agilent 2100检测RNA样品的完整性，合格的mRNA样品RNA integrity number (RIN)数值≥8，用于RT-PCR扩增，构建cDNA扩增文库^[11]。基于Illumina HiSeq 300PE平台进行cDNA文库测序分析，由苏州金唯智生物科技有限公司完成。采用Bcl2fastq (v2.17.1.14)软件获取原始测序数据，使用Fast QC (v0.10.1)软件进行数据质量评估，碱基质量值(quality score, Q-score)以-lg P计算，错误概率P值为0.001 (Q₃₀)^[12]。利用Cutadapt (v1.9.1)软件进行原始数据预处理和过滤^[13]。以菌株XH26参考基因组为依据，采用Rockhopper (v2.0.3)软件进行转录本预测分析。

1.5 蛋白质组测序与数据分析

利用细菌蛋白质提取试剂盒提取样本的总蛋白质(12个样本/4组)，采用总蛋白比色法(bicinchoninic acid, BCA)测定蛋白浓度。合格样品进行12.5% SDS-PAGE定量、酶解和HPLC分离，具体方法参考文献[14-16]。采用Q-Exactive HF质谱仪进行样品分析，检测条件：进样量为3次/样，分析时长60 min，正离子模式/扫描范围(300-1 800 m/z)，质谱分辨率60 000 (200 m/z)，AGC target为3×10^-6，最大离子注入时间(maximum IT)为200 ms^[17]。将LC-MS/MS原始文件导入Spectronaut(v15)软件，构建data-independent acquisition (DIA)数据库，对肽段和蛋白质进行数据处理。检索参数设置：retention time prediction type为内标校正肽段(dynamic iRT)，interference on MS2 level correction为enabled。cross run normalization为enabled，设定过滤参数P值为0.01 [false discovery rate (FDR)<1%]。采用SIMCA-P (v14.11)软件分析各样本队列的主成分(principle component analysis, PCA)、组内变异系数(coefficient of variation, CV)和相关系数等^[18]。

1.6 转录-蛋白组学关联分析

转录组测序过滤处理获得mapped data后，采用HTSeq(v2.0.5)软件分析各样品的基因表达水平，明确差异表达基因(differential expression genes, DEGs)。使用fragments per kilobase of exon per million fragments mapped (FPKM)法进行比对分析，筛选参数为log₂fold change≥1且FDR<0.05，统计DEGs的差异显著性^[19]。基于KEGG数据库(http://www.kegg.jp)和KOBAS (v2.0)软件，采用超几何检验法，以KEGG pathway为单位，进行基因组背景关联和显著性pathway富集分析(P<0.05)^[20]。蛋白组测序获得DIA数据集，同样使用Spectronaut^TM (v15)软件，根据表达丰度和P值进行差异和定量分析^[21]。差异表达蛋白(differential expression proteins, DEPs)的表达丰度/倍数值>1.5 (P<0.05)，即为蛋白表达上调；如表达丰度/倍数值<0.67 (P<0.05)，即为蛋白表达下调。将DEPs对应的DEGs进行生物信息分析(分析工具和条件均与上述转录组学分析方法相同)。整合分析相同样本来源的转录组和蛋白质组数据，统计关联的显著DEPs/DEGs数量，运用SPSS (27.0)软件计算相关性系数(r)，比较蛋白质与关联转录本的表达趋势。基于KEGG数据库分析四氢嘧啶合成代谢相关的氨基酸通路和差异基因的显著性，筛选关键DEGs/DEPs并分析四氢嘧啶生物合成的分子机制^[22]。

1.7 逆转录定量PCR验证关键DEGs的表达

采用Invitrogen TRIzol试剂盒提取菌株XH26和菌株G₉-72的总RNA (NS与HS组/3个重复)，使用NanoDrop和Qubit 2.0检测RNA纯度和浓度。RNA样品符合OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.2，有效浓度>500 ng/mL。采用逆转录试剂盒进行cDNA定量检测，内参基因为磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)，扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反应体系参考文献[23]。使用SPSS (v27.0)统计软件进行数据分析。组内/组间比较分析采用差异倍数(fold change, FC)表示各基因或蛋白平均定量的比值。DEGs/DEPs的显著性分析采用相对定量值，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05具有统计学意义。采用Origin (v8.6)软件和微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)制图，采用SPSS (v27.0)软件进行组间差异ANOVA方差分析(P<0.05)。

2 结果与分析

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2.1 野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的理化性质与基因组差异分析

野生菌株XH26与突变菌株G₉-72均为革兰氏阳性菌。在相同温度、pH、培养基和培养时间下，菌株的电镜菌体形态均呈长杆状，略带弯曲，两端圆润，无鞭毛。菌株XH26的菌体大小为(1.64-5.98) μm×(0.54-0.85) μm (图1A)，菌株G₉-72的菌体大小为(1.87-5.27) μm×(0.63-0.88) μm (图1B)。比较分析发现野生菌株和突变菌株的生长量OD₆₀₀值与四氢嘧啶积聚量均存在明显差异。菌株XH26胞内的四氢嘧啶最大积聚量为(0.51±0.01) g/L，而菌株G₉-72的四氢嘧啶最大积聚量为(1.92±0.01) g/L (图1C)，且二者最适盐浓度均为1.5 mol/L NaCl。因此，后续的转录组学和蛋白组学研究设置为无盐(0 mol/L NaCl)和有盐(1.5 mol/L NaCl) 2个梯度条件。

菌株XH26和G₉-72的全基因序列分析显示：基因组DNA均以环状形式存在，分子量分别为4.11 Mb和4.06 Mb；G+C含量分别为52.62%和52.55%；预测的编码基因数分别为3 927个和3 882个；两者预测的tRNA (36个)和rRNA数量(18个)一致。菌株XH26和G₉-72的基因分别在COG数据库中注释到3 252个和3 217个基因；在KEGG数据库注释到2 305个和2 272个基因；在GO数据库(Gene Ontology)中分别注释到2 618个和2 592个基因。以野生菌株XH26为参考基因组，利用Mummer 4.0软件进行突变菌株基因组的比对分析，结果显示突变菌株G₉-72的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)数目为18个，小片段序列插入(insertion)或删除(deletion)数目为17个。突变蛋白/基因主要分布在细胞组分和细胞代谢过程，如细胞膜(membrane)、细胞组分(cellular part)、细胞膜组分(membrane part)等，主要涉及TonB家族转录调节因子(基因tonB编码)、30S核糖体蛋白(orf00550)、假定蛋白(orf01398、orf02033)、α脲酶亚基(ureC)、吲哚丙酮酸铁氧化还原酶家族蛋白(iorA)、ABC转运蛋白(mntA)、荚膜多糖蛋白(lipA)、GntR家族转录调节因子(phnR)等。可能涉及四氢嘧啶合成相关的上游代谢突变蛋白，如γ-氨基丁酸转移酶(基因davT编码)、琥珀酸半醛脱羧酶(基因gabD编码)以及谷氨酸脱羧酶(基因gadA编码)。

2.2 野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的比较转录组学与DEGs分析

利用Cutadapt (v4.0)软件去bwt污染和低质量序列后，将clean reads与参考基因组比对。结果显示样本的单一匹配率均≥83%，Q₃₀值>92.39%，表明测序数据可靠且无污染。研究数据与参考基因组比对结果良好，可满足后续实验和组学分析的要求。在WT(HS) vs. WT(NS)和UV(HS) vs. UV(NS)两组中分别统计到DEGs为1 141个和597个；两组共同上调的DEGs为117个，共同下调的DEGs为207个。此外16个基因表现出相反的表达趋势，包括在WT比较组中上调而在UV比较组中下调的基因5个，以及在UV比较组中上调而在WT比较组中下调的基因11个(图2A)。

DEGs的KEGG富集分析显示(图2C、2D)，WT比较组和UV比较组的上调/下调DEGs主要富集在75条KEGG通路中。显著富集的氨基酸代谢通路包括精氨酸(Arg)生物合成；丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)代谢；甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)的代谢；缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)降解；赖氨酸(Lys)生物合成与分解和脂肪酸降解通路等。将两组结果整合后，得到11条与四氢嘧啶代谢相关的氨基酸代谢通路及44个DEGs，其中包括上调表达的DEGs 13个和下调表达的DEGs 31个(表1)。

2.3 野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的比较蛋白组学与DEPs分析

蛋白组学测序数据显示，iRT保留时间整体较稳定。QC样本主成分分析(principal component analysis, PCA)显示组内样本聚集性高(图3A)，变异系数(CV)为12.9% (图3B)，相关系数R值>0.9，表明本研究的非标记定量结果可靠且数据体系稳定，可进行后续分析。4个样本组[WT(NS)、WT(HS)、UV(NS)、UV(HS)]分别鉴定到2 468、2 376、2 443和2 397个蛋白。在WT比较组和UV比较组中，共上调表达的DEPs为76个，共同下调表达的DEPs为97个；在WT比较组中上调，而在UV比较组中下调表达的DEPs为4个(图2B)。

WT和UV比较组的KEGG富集分析表明(图3C、3D)，两组共表达的DEPs多富集于双组分系统、Val/Leu/Ile分解、丙酸与苯丙烷代谢、细菌趋药性以及苯甲酸盐降解等通路；UV比较组显著表达的DEPs还存在于谷胱甘肽代谢和丁酸代谢通路。综合分析显示(表2)，四氢嘧啶代谢通路与10条氨基酸代谢或氮代谢通路相关，如Gly、Ser、Thr、Ala、Asp及Glu代谢和氮代谢等，共计涉及50个DEPs (包括23个上调DEPs)。

2.4 野生菌株XH26与突变菌株G₉-72转录-蛋白组学关联分析

通过转录-蛋白组学关联分析，明确基因转录水平(mRNA)与蛋白翻译水平上显著差异表达的一致性。结果呈现以下4种趋势：(1) mRNA与蛋白均有表达差异，且趋势相同(same trend, [ST]，r=0.84)；(2) mRNA与蛋白均有表达差异，但趋势相反(opposite trend, [OT], r=-0.71)；(3) mRNA表达无差异，但蛋白表达有差异([NDEGs-DEPs]，r=0.11)；(4) mRNA表达有差异，但蛋白表达无差异([DEGs-NDEPs]，r=0.09)，综合分析WT和UV比较组的结果显示(表3)，ST类的共表达基因共计30个；OT类的共表达基因4个；NDEGs-DEPs类的共表达基因85个；此外，还有59个基因在两组中分别呈现出mRNA与蛋白均有表达差异和mRNA转录无差异而蛋白表达有差异的2种情况。

根据上述4种趋势的相关系数，并结合四氢嘧啶生物合成途径，筛选出15个DEGs (表4)。在ST类别中，7个上调的DEGs分别为ectB、betB、betA、asd、doeD、doeC和gabD，依次编码l-二氨基丁酸转氨酶(EctB)、NAD⁺/NADP⁺依赖性甜菜碱醛脱氢酶(BetB)、胆碱脱氢酶(BetA)、天冬氨酸半缩醛脱氢酶(Asd)、l-2,4-二氨基丁酸转氨酶(DoeD)、天冬氨酸半缩醛脱氢酶(DoeC)和γ-氨基丁酸转移酶(GabD)；4个下调的DEGs分别为ItaE、gdhA、gabT和acnB，依次编码低特异性l-苏氨酸醛缩酶(ItaE)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、4-氨基丁酸氨基转移酶(GabT)和苹果酸水解酶(AcnB)。在OT类别中，筛选到3个在转录组下调但蛋白组学上调的DEGs (gltD、atoB和narG)，分别编码谷氨酸合成酶(GOGAT)、乙酰CoA酰基转移酶(AtoB)和硝酸还原酶(NarG)。在DEGs-NDEPs类别中，存在1个mRNA表达有差异但蛋白表达无差异的DEGs (narK)，编码硝酸铁氧还蛋白还原酶(NarK)。综合分析表明，直接涉及四氢嘧啶代谢通路的关键基因共计4个(合成基因asd和ectB，分解基因doeD和doeC)，与四氢嘧啶合成代谢通路间接相关的上游参与基因共计6个(betB、betA、ItaE、gltD、gadA和acnB)，以及四氢嘧啶的生物合成与Ala/Asp/Glu/His代谢(gabD、gdhA、gabT和atoB)和氮源代谢基因(narK和narG)高度关联。

2.5 关键DEGs的表达验证分析

对上述筛选的15个与四氢嘧啶合成代谢显著相关的DEGs进行荧光RT-qPCR表达差异验证(图4)。结果显示，15个DEGs的RT-qPCR统计结果与RNA-seq测序结果基本一致，即上调和下调表达的趋势一致，但具体的表达量差异可能因实验敏感度而有所不同。

3 讨论

收起

3.1 比较基因组学分析盐单胞菌野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的突变基因

目前，多组学分析技术已广泛应用于盐单胞菌的四氢嘧啶生物合成、代谢通路和网络调控研究，揭示盐梯度变化下盐单胞菌的分子适应机制和相容溶质的代谢积累机制。课题组前期对野生菌株XH26与突变菌株G₉-72基因组进行比较分析，发现突变菌株G₉-72的单核苷酸多态性数目为18个，小片段序列插入或删除数目为17个(结果未公开发表)这些突变涉及RNA结合途径(基因orf00034)、ABC转运(基因orf02141/mntA)、γ-氨基丁酸转移酶(基因davT编码)、琥珀酸半醛脱羧酶(基因gabD编码)以及谷氨酸脱羧酶(基因gadA编码)等^[24]。在本研究中，通过比较转录-蛋白组学分析各突变基因的表达差异，仅发现基因coaBC及其编码的磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(PPCDC)，在两两比较组中存在不同的表达趋势。例如，野生菌株XH26比较组中属于DEGs-NDEPs类别，而在突变菌株G₉-72比较组中属于NDEGs-DEPs类别。这种表达差异，可能是导致菌株G₉-72四氢嘧啶积聚量暴发的关键原因，有待代谢组学的进一步分析。

3.2 比较转录组学分析盐单胞菌野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的DEGs

研究表明，嗜盐菌胞内四氢嘧啶(或其衍生物5-HE)的生物合成途径为：草酰乙酸→天冬氨酸(Asp)→l-天冬氨酸磷酸→天冬氨酸半缩醛→醛氨酸→草酰乙二氨基丁酸→N-γ-乙酰二氨基丁酸→四氢嘧啶→5-HE^[25]。其中，前体底物草酰乙酸(或Asp/Asn)与四氢嘧啶的合成代谢通路直接相关，而碳/氮代谢、三羧酸循环(如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸)，以及上游Glu/Gln/Ala等氨基酸代谢网络与四氢嘧啶的合成代谢通路间接关联。Jadhav等^[26]在桑珀尔盐单胞菌(H. sambharensis)基因组中鉴定出多个耐盐适应相关基因，涉及氨基酸代谢基因(如gadA、argJ、argG、gdhA)和离子转运基因(如kdpA、trkA、nhaD)。

在不同的培养条件下(如盐度、温度、pH值等)，利用比较转录组学分析细菌生长过程中的基因表达变化、特定化合物的代谢途径和生理生化反应，可揭示细菌的环境适应和代谢反应机制^[27]。Hobmeier等^[28]利用RNA-seq技术分析延长盐单胞菌(H. elongata DSM 2581^T)在不同碳源(乙酸盐和葡萄糖)条件下的DEGs，结果显示，以葡萄糖为碳源时磷酸葡糖酸途径的相关基因(如zwf、pgl、edd、eda)优先表达，而葡萄糖氧化途径相关基因(如pgi1、pgi2、pykA1和adh2)上调表达。翟立公等^[29]采用转录组测序技术研究高渗胁迫条件下德尔卑沙门氏菌(Salmonella enterica)的DEGs，发现细胞膜蛋白和氨基酸代谢通路中有21个显著上调的DEGs，而糖转运系统(sugar transport system, STS)、糖酵解和抗氧化相关通路中有38个显著下调的DEGs，表明高渗环境下胞内需要储存大量糖类，同时抑制胞外脂多糖的合成。在本研究中，通过设置无盐(NS)和高盐(HS)条件，对野生菌株XH26和突变菌株G₉-72进行比较转录组学分析，明确了11条氨基酸代谢通路(44个DEGs)与四氢嘧啶的合成代谢相关，其中13个DEGs显著上调，31个DEGs显著下调。

3.3 比较蛋白组学分析盐单胞菌野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的DEPs

蛋白质组学是在全局水平上鉴定和分析蛋白质的特征，涉及蛋白质的表达水平、翻译的修饰、蛋白与蛋白的互作等，进而揭示细胞的环境应激、功能适应和细胞代谢等分子机制^[30]。Xing等^[31]采用定量蛋白质组学(tandem mass tag, TMT)分析盐湖碱球菌(Alkalicoccus halolimnae)在盐梯度条件下(4%、8%、12%、16% NaCl)的生长代谢和相容溶质积累，结果显示胞内四氢嘧啶的积聚量与盐适应密切相关。在中盐度(8% NaCl)时，基因ectA、ectB和ectC的表达量最为显著；胞内Gln和Glu的总量保持动态平衡，主要在低盐度(4% NaCl)诱导时发挥渗透适应作用。本研究利用LC-MS技术对野生菌株WT(HS) vs. WT(NS)和突变菌株UV(HS) vs. UV(NS)比较组进行分析，明确了10条氨基酸代谢通路(Gly/Ser/Thr/Ala/Asp/Glu/Val/Leu/Ile和氮代谢)与四氢嘧啶的合成代谢相关，涉及50个DEPs (包括23个上调DEPs和27个下调DEPs)。

3.4 转录-蛋白组学关联分析野生菌株XH26与突变菌株G₉-72的基因表达一致性

转录-蛋白组学关联分析是探讨转录组和蛋白质组数据的差异性和互补性，明确细胞中全部mRNA与蛋白质的表达水平和一致性，全方位评估关键基因的表达水平和调控模式。盐胁迫下，基于多组学并联分析细菌的四氢嘧啶生物合成启动、应答以及网络代谢调控的研究并不多见。Chen等^[32]通过转录组学关联分析嗜盐生地所球菌(Egicoccus halophilus) EGI 80432^T的盐适应机制，发现海藻糖、Glu、His、Thr、Pro和四氢嘧啶的含量随盐度增加而增加，且在中等盐度(9% NaCl)时最为显著。本研究设置无盐(0 mol/L NaCl)和有盐(1.5 mol/L NaCl)梯度条件，采用转录-蛋白组学技术关联分析野生菌株XH26和突变菌株G₉-72，发现15个关键的DEGs (ectB、betB、betA、asd、doeD、doeC、gabD、ItaE、gdhA、gabT、acnB、gltD、atoB、narG和narK)与四氢嘧啶生物合成密切相关(图5)。首先，与四氢嘧啶代谢通路直接相关的DEGs：基因asd编码的Asd酶催化l-天冬氨酸磷酸脱氢生成四氢嘧啶生物合成前体l-天冬氨酸-β-半缩醛(ASA)，基因ectB编码的EctB酶催化生成2-氧戊二酸和l-2,4-二氨基丁酸(DAB)，参与底物谷氨酸(Glu)与天冬氨酸-β-半缩醛间的转氨基反应，完成四氢嘧啶生物合成的第一步。同时，基因doeD/doeC编码的DoeD/DoeC酶将二氨基丁酸依次转化为l-天冬氨酸-4-半醛和天冬氨酸，参与四氢嘧啶的降解。其次，与四氢嘧啶合成代谢通路上游间接相关的DEGs：基因betB/A和ItaE参与编码Gly代谢生成甘氨酸甜菜碱；基因gltD通过编码GOGAT酶的小亚基，参与氮代谢与Glu生物合成；基因gadA编码GDH酶催化l-Glu氧化脱氨为2-氧代戊二酸，连接氨基酸代谢与TCA循环；基因acnB编码的AcnB酶是TCA循环的关键酶，不仅催化柠檬酸转化为异柠檬酸，还可感知活性氧(ROS)和细胞铁水平的变化。这些结果与我们先前的研究一致，即野生菌株四氢嘧啶的生物合成与Glu、Asp和氮代谢密切相关，且合成量受到代谢网络调控^[33]。最后，与旁路氨基酸代谢关高度关联的DEGs：基因gabT/D编码GabT/D酶将γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)转氨脱氢为琥珀酸，增加进入TCA循环的流量^[34]；在氮循环中基因narK和narG编码NarK酶催化氮/硝酸盐/亚硝酸盐还原为气态形式(反硝化反应)，如一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N₂O)/氮气(N₂)^[35]，具体作用机制尚不清楚。

值得注意的是，先前研究已证实基因gab的转录可能受到氮循环基因簇nar的调控影响^[36]。我们推测在紫外突变菌株中，源自GabCTDP基因簇的基因gabD和gabT的差异表达可能影响氨基酸代谢率。同时氮源代谢中的差异表达基因narK和narG可能与基因gabD和gabT存在某种表达关联，或许基因gabD的表达量及活性受到narK和narG的调控影响，尚需后续的基因敲除实验深入解析nar基因簇与基因gabD间的作用机制。利用硝酸盐、亚硝酸盐或氮代谢流模型探究硝酸盐的代谢去路机制，并关联分析四氢嘧啶的合成/降解途径，有望最大限度地减少氮的溢出代谢，优化四氢嘧啶的工业生产率。

基金

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国家自然科学基金(32260019)
青海中央引导地方科技发展资金(2024ZY015)

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2025年第65卷第4期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240477

接收时间：2024-08-01
首发时间：2026-02-06
出版时间：2025-04-04

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收稿日期：2024-08-01
录用日期：2024-10-15

基金

National Natural Science Foundation of China(32260019)

国家自然科学基金(32260019)

Qinghai Central Government Guide Local Science and Technology Development Fund(2024ZY015)

青海中央引导地方科技发展资金(2024ZY015)

作者信息

^1.青海大学医学院，基础医学研究中心，青海西宁

^2.青海大学农林科学院，蔬菜遗传与生理重点实验室，青海西宁

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20240477

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

KEGG ID	Name	Up DEGs	Down DEGs
map00220	Arginine biosynthesis	ectB, argE, argG	argD, gdhA
map00250	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	SSADH, ansA, argG, purB	gdhA
map00260	Alanine, aspartate, and glutamate metabolism	ectB, betB	ItaE, garK, ilvA, kb1
map00270	Cysteine and methionine metabolism	metH	metE, mdh, spE
map00280	Valine, leucine, and isoleucine degradation	None	bkdA/B, atoB, ECHS1, fabM, ivd, mmsA
map00340	Histidine metabolism	None	hutG, hisC
map00350	Tyrosine metabolism	None	hmgA, faaH, maiA, frmA
map00360	Phenylalanine metabolism	None	paaH, hisC
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Alanine, aspartate and glutamate metabolism

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HprA, SerA

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Valine, leucine and isoleucine degradation

GabT

BkdA, BkdB, LiuC, Ivd, MmsA

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Citrate cycle (TCA cycle)

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WT(HS) vs. WT(NS)

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[ST]

[OT]

[NDEGs-DEPs]

Protein	Gene	Description	DEGs	Gene (fold change)	DEPs	Protein (fold change)
orf01883	ectB	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	Up	2.410	Up	2.229
orf02074	betB	Dependent betaine aldehyde dehydrogenase	Up	5.570	Up	1.753
orf02075	betA	Choline dehydrogenase	Up	4.456	Up	1.507
orf01624	asd	Aspartate-semialdehyde dehydrogenase	Up	0.521	Up	0.113
orf02975	doeD	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	Up	0.299	Up	1.264
orf02976	doeC	Aspartate-semialdehyde dehydrogenase	Up	1.124	Up	2.537
orf00898	ItaE	l-threonine aldolase	Down	1.970	Down	0.203
orf00776	gltD	Glutamate synthase	Down	0.534	Up	1.212
orf02005	gabD	Glutarate-semialdehyde dehydrogenase	Up	0.013	Up	0.909
orf02411	gdhA	Glutamate dehydrogenase	Down	1.875	Down	0.946
orf03515	gabT	4-aminobutyrate aminotransferase	Down	4.250	Down	3.539
orf00396	atoB	Acetyl-CoA acetyltransferase	Down	2.498	Up	0.944
orf00937	narK	Nitrite transporter	Up	2.383	None	None
orf02054	narG	Respiratory nitrate reductase	Down	1.945	Up	0.633
orf01682	acnB	Aconitate hydratase B	Down	1.097	Down	0.898

Protein

Gene

Description

DEGs

Gene

(fold change)

DEPs

Protein

(fold change)

orf01883

ectB

Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase

2.410

2.229

orf02074

betB

Dependent betaine aldehyde dehydrogenase

5.570

1.753

orf02075

betA

Choline dehydrogenase

4.456

1.507

orf01624

asd

Aspartate-semialdehyde dehydrogenase

0.521

0.113

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doeD

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1.264

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doeC

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1.124

2.537

orf00898

ItaE

l-threonine aldolase

Down

1.970

Down

0.203

orf00776

gltD

Glutamate synthase

Down

0.534

1.212

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gabD

Glutarate-semialdehyde dehydrogenase

0.013

0.909

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gdhA

Glutamate dehydrogenase

Down

1.875

Down

0.946

orf03515

gabT

4-aminobutyrate aminotransferase

Down

4.250

Down

3.539

orf00396

atoB

Acetyl-CoA acetyltransferase

Down

2.498

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narK

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None

orf02054

narG

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Down

1.945

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