微生物学报

四溴双酚A胁迫响应分子元件的功能

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白雪 ¹^,² , 许玫英 ² , 姚晖 ² , 郑晓丹 ² , 汪伦记 ¹ , 陈杏娟 ²

微生物学报 | 研究报告 2025,65(7): 3150-3164

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(7): 3150-3164

四溴双酚A胁迫响应分子元件的功能

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白雪¹^,², 许玫英², 姚晖², 郑晓丹², 汪伦记¹, 陈杏娟²

作者信息

^1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳

^2.广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州

Functional characteristics of the gene cluster in response to tetrabromobisphenol A stress

Xue BAI¹^,², Meiying XU², Hui YAO², Xiaodan ZHENG², Lunji WANG¹, Xingjuan CHEN²

Affiliations

^1.College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan, China

^2.State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong, China

出版时间: 2025-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250029

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摘要

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【目的】 为了解析四溴双酚A (tetrabromobisphenol A, TBBPA)胁迫响应显著上调的chr1_2605-chr1_2604基因簇的分子功能及应用潜力，分别研究了chr1_2605及chr1_2604分子元件在TBBPA特异性识别及降解中的作用。 【方法】 利用合成生物学方法构建传感细胞食异源物鞘氨醇菌(Sphingobiumxenophagum) C1 (pBBR-2605-HiBiT)和降解细胞大肠埃希氏菌(Escherichiacoli) BL21(DE3, pET30b-2604)。通过荧光素酶活性检测方法分析底盘细胞中chr1_2605元件对不同污染物的响应特征，并采用高效液相色谱法测定降解细胞中chr1_2604元件对TBBPA的降解效率。 【结果】 异生物质响应转录因子Chr1_2605仅对TBBPA表现出高度特异性的响应功能，基于其构建的传感细胞S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA具有良好的线性响应范围与灵敏度，最低检测限为0.010-0.050 μmol/L；α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604对TBBPA具有高效的降解功能，基于其构建的降解细胞E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)在3 d内对2.0 mg/L TBBPA的降解率可达44.415% [0.296 mg/(L·d)]，显著高于目前报道的大部分天然菌株在非共代谢条件下对TBBPA的降解率。 【结论】 本研究发现并证实了chr1_2605-chr1_2604分子元件可以特异性识别并高效降解TBBPA，其中异生物质响应转录因子Chr1_2605能够精准识别TBBPA，α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604可以高效降解TBBPA。

关键词

四溴双酚A / 异生物质响应转录因子 / α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶 / 特异性识别 / 高效降解

Abstract

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[Objective] To understand the molecular functions and potential applications of the significantly up-regulated gene cluster chr1_2605-chr1_2604 in response to tetrabromobisphenol A (TBBPA) stress, we investigated the roles of chr1_2605 and chr1_2604 in the specific recognition and efficient degradation of TBBPA. [Methods] Synthetic biology methods were employed to construct Sphingobiumxenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT) and Escherichiacoli BL21(DE3, pET30b-2604) as chassis cells for biosensing and degrading, respectively. The response characteristics of Chr1_2605 in the chassis cells to different pollutants were analyzed by the luciferase activity assay. Additionally, the degradation activity of TBBPA by Chr1_2604 in the chassis cells was determined by high-performance liquid chromatography. [Results] The xenobiotic-responsive element Chr1_2605 exhibited a highly specific response to TBBPA. The Chr1_2605-based chassis cell of S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT) demonstrated high responsivity and sensitivity to TBBPA, with a limit of detection ranging from 0.010 to 0.050 μmol/L. The 2-oxoglutarate/Fe-dependent dioxygenase Chr1_2604 in the chassis cell of E. coli BL21(DE3, pET30b-2604) displayed the degradation rate of 44.415% for 2.0 mg/L TBBPA within 3 d [0.296 mg/(L·d)], which was significantly higher than those of most reported microbial strains under non-co-metabolic conditions. [Conclusion] The chr1_2605-chr1_2604 gene cluster can accurately recognize and degrade TBBPA. Specifically, the xenobiotic-responsive element Chr1_2605 specifically recognizes TBBPA, whereas the 2-oxoglutarate/Fe-dependent dioxygenase Chr1_2604 efficiently degrades TBBPA.

Key words

tetrabromobisphenol A / xenobiotic-responsive element / 2-oxoglutarate/Fe-dependent dioxygenase / specific recognition / efficient degradation

引用本文

白雪, 许玫英, 姚晖, 郑晓丹, 汪伦记, 陈杏娟. 四溴双酚A胁迫响应分子元件的功能. 微生物学报, 2025 , 65 (7) : 3150 -3164 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250029

Xue BAI, Meiying XU, Hui YAO, Xiaodan ZHENG, Lunji WANG, Xingjuan CHEN. Functional characteristics of the gene cluster in response to tetrabromobisphenol A stress[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (7) : 3150 -3164 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250029

正文

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四溴双酚A (tetrabromobisphenol A, TBBPA)是一种重要的溴代阻燃剂，广泛应用于电子产品、塑料、泡沫材料以及纺织品中，以提高材料的防火性能^[1]。随着全球范围内对多溴二苯醚类阻燃剂禁用政策的实施，TBBPA的产量与使用率逐年上升^[2]。由于TBBPA结构稳定，难以被生物降解，且极难溶于水，属于疏水亲脂性物质，因此能够在环境中长期积累，并通过食物链在生物体内不断富集，对生态系统和人类健康构成潜在威胁。目前，TBBPA已被发现广泛分布于多种环境介质中^[3-4]，并在生物体内乃至母乳中积累^[5-6]。大量研究表明，TBBPA对生物体具有广泛的毒性效应，包括肝毒性、生殖毒性、神经毒性、细胞毒性以及内分泌干扰毒性等^[7-10]。然而，由于缺乏有效的管控措施，TBBPA在环境中的积累问题日益严重，正逐步成为威胁生态安全和人类健康的重要隐患之一。

生物法因其安全、经济且无二次污染等优势，在环境污染治理中占据重要地位。微生物作为生态系统中的分解者，在驱动TBBPA污染降解方面发挥重要作用。目前已有研究表明，微生物能够在好氧和厌氧条件下降解TBBPA，常见的降解菌包括假单胞菌^[11-13]、乳白耙齿菌^[14]、节杆菌属^[15]、苍白杆菌^[16]、土壤杆菌^[17]、希瓦氏菌^[18]等。然而，多数菌株对TBBPA的降解效率仍然较低。例如，假单胞菌属(Pseudomonas sp.) JDT菌株在好氧共代谢条件下40 d内对10.0 mg/L的TBBPA降解率仅为51.9% [0.129 mg/(L·d)]^[13]，希瓦氏菌属(Shewanella sp.) XB菌株在厌氧条件下7 d内对1.0 mg/L的TBBPA降解率为85% [0.121 mg/(L·d)]^[18]。微生物降解效率低的原因，一方面是由于其体内缺少高效的TBBPA降解酶元件，且TBBPA对细胞的毒性较高，导致微生物的降解性和抗逆性减弱；另一方面是由于微生物缺少TBBPA降解的完整代谢途径，往往需要共代谢过程才能实现TBBPA的高效降解。现有研究报道与TBBPA降解相关的酶类主要有锰过氧化物酶^[14]、细胞色素P450单加氧酶^[19]、O-甲基转移酶^[20]等，但这类分子元件仍然极其匮乏，相关的响应和调控机制更鲜有报道。

本课题组在前期研究中发现，TBBPA污染胁迫诱导了食异源物鞘氨醇菌(Sphingobiumxenophagum) C1的chr1_2605-chr1_2604基因簇显著上调表达。其中chr1_2604基因(NCBI登录号为ASY45240.1)编码α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶，可能对TBBPA具有降解作用；chr1_2605基因(NCBI登录号为ASY45241.1)编码异生物质响应转录因子，可能直接响应TBBPA并调控Chr1_2604蛋白的表达^[21]。为了解析chr1_2605-chr1_2604基因簇的分子功能及应用潜力，本研究通过构建基于异生物质响应转录因子Chr1_2605和萤光素酶小标签的传感细胞S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)，研究异生物质响应转录因子对TBBPA的特异性响应功能；同时通过在大肠埃希氏菌(Escherichiacoli) BL21(DE3, pET30b-2604)中诱导表达α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604，研究其对TBBPA的降解功能，旨在阐明chr1_2605-chr1_2604基因簇在TBBPA响应和降解中的核心功能，为深入理解微生物对TBBPA的降解代谢过程提供重要参考，同时也为基于TBBPA响应元件的污染治理绿色高效生物技术研发和应用提供理论支持。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 主要试剂

TBBPA (纯度≥98.0%)、双酚A (bisphenol A, BPA)(纯度≥99.0%)均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether, BDE-209)(纯度≥96.3%)、溴萘(bromonaphthalene, BrN)(纯度≥97.0%)、30%过氧化氢溶液(hydrogen peroxide solution, H₂O₂)、全氟辛酸(perfluorooctanoic acid, PFOA)(纯度≥98.0%)、全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonic acid, PFOS)(纯度≥71.7%)均购自广州文度科学仪器有限公司；全氟己基磺酸(perfluorohexane sulfonic acid, PFHxS)(纯度≥82.1%)、五氯苯酚(pentachlorophenol, PCP)(纯度≥98.0%)、十氯联苯(decachlorobiphenyl, PCB-209)(纯度≥96.0%)、六氯-1,3-丁二烯(hexachlorobutadiene, HCBD)(纯度≥97.6%)、三氯杀螨醇(dicofol)(纯度≥87.1%)、丙基苯酚(n-propylphenol, n-PMP)(纯度≥98.0%)、异丙基苯酚(isopropylphenol, i-PMP)(纯度≥98.5%)均购自上海安谱实验科技股份有限公司。

Nano-Glo^® HiBiT裂解检测试剂盒购自广州致邦生物科技有限公司；蛋白marker、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)、卡那霉素(kanamycin, Kan)、庆大霉素(gentamicin, GM)、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG，纯度≥99.0%)、三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris，纯度≥99.0%]、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT，纯度≥99.0%)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS，纯度≥99.5%)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 菌株和培养条件

S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)：通过基因合成方法在chr1_2605基因3′端加入萤火虫萤光素酶小亚基编码序列(5′-GTGAGCGG CTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC-3′)，合成包括chr1_2605基因上游启动子序列(5′-TTC CCGCGATTGCGATTTTTCGCAAATGTAAATT-3′)在内的融合基因片段，并在融合基因片段两端分别设计BamH I和Xho I酶切位点。提取广宿主载体pBBR1MCS-5的DNA，使用BamH I和Xho I限制性内切酶在37 ℃条件下处理融合基因片段以及pBBR1MCS-5质粒DNA并纯化回收。利用重组酶进行融合基因片段与线性化载体的连接，并热击转化至E. coli DH5α感受态细胞中。挑取阳性克隆子提取重组质粒pBBR-2605-HiBiT并电击转化至S. xenophagum C1感受态细胞中；E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)：对α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶基因chr1_2604进行匹配E. coli密码子使用频率的优化，通过基因合成方法对密码子优化的chr1_2604基因进行合成，并在优化基因片段两端分别设计Nde I和Xho I酶切位点。提取E. coli表达载体pET30b的DNA，使用Nde I和Xho I限制性内切酶在37 ℃条件下处理基因片段以及pET30b质粒DNA并纯化回收。利用重组酶进行基因片段与线性化载体的连接，并热击转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。E. coli BL21(DE3, pET30b)：提取E. coli表达载体pET30b质粒，并热击转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。

S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)生长无机盐培养基详见文献[22]；E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)生长无机盐培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 0.5，NaCl 0.5，KH₂PO₄ 1.0，NH₄NO₃ 0.1，Na₂HPO₄ 3.0，CaCl₂ 0.01，MgSO₄ 0.5，维生素母液1 mL/L，无机微量元素母液(上海源叶生物科技有限公司) 1 mL/L。维生素母液(mg/L)：生物素2.0，叶酸2.0，维生素B₆ 10.0，核黄素5.0，维生素B₁ 5.0，烟酸5.0，维生素B₃ 5.0，泛酸5.0，维生素B₅ 5.0，维生素B₁₂ 50.0，对氨基苯甲酸5.0，硫辛酸5.0。

1.2 S. xenophagumC1 (pBBR-2605-HiBiT)对不同卤代有机物的响应分析

将S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)接种到含有50 μg/mL GM的LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养过夜，直至菌体OD₆₀₀值约为1.0。菌体培养液10 000×g离心10 min后弃上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体 2次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体。按照2%的接种量将菌体接种至无机盐培养基中。在8 mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入50 μL不同浓度的TBBPA、PFOA、PFOS、PFHxS、PCP、HCBD、Dicofol、PCB-209、2-BrNP、BDE-209母液(溶于有机溶剂中)，置黑暗中挥发干有机溶剂后，加入200 μL无机盐培养基，30 ℃、200 r/min避光培养14 h，直至菌体OD₆₀₀值达到0.4。取50 μL菌体培养液添加50 μL的Nano-Glo^® HiBiT裂解检测试剂，在化学发光仪上进行荧光素酶活性分析，同时取150 μL培养液样品测定OD₆₀₀值以校准相对荧光值。

1.3 S. xenophagumC1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA代谢产物的响应分析

将S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)接种到含有50 μg/mL GM的LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养过夜，直至菌体OD₆₀₀值约为1.0。菌体培养液10 000×g离心10 min后弃上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体 2次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体。将菌体按2%的接种量接种至无机盐培养基中。在8 mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入50 μL不同浓度的H₂O₂、BPA、i-PMP、n-PMP母液，挥发干有机溶剂后，加入200 μL无机盐培养基，30 ℃、200 r/min避光培养14 h，直至菌体OD₆₀₀值达到0.4。取50 μL培养液样品添加50 μL的Nano-Glo^® HiBiT裂解检测试剂，在化学发光仪上进行荧光素酶活性分析，同时取150 μL培养液样品测定OD₆₀₀值以校准相对荧光值。

1.4 S. xenophagumC1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA的响应性能分析

将S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)接种到含50 μg/mL GM的LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养过夜至OD₆₀₀值约为1.0。10 000×g离心10 min，弃上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体2次后重悬于相同培养基中，再按2%的接种量接种至新无机盐培养基中。在8 mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入50 μL的TBBPA母液(0.00、0.04、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、12.00、20.00、28.00、32.00、40.00 μmol/L，溶解于二氯甲烷中)，于黑暗中挥发干二氯甲烷溶剂后，加入200 μL无机盐培养基，使TBBPA的终浓度分别为0.000、0.010、0.050、0.125、0.250、0.500、1.250、3.000、5.000、7.000、8.000、10.000 μmol/L。所有样品均置于200 r/min的摇床中，30 ℃避光培养14 h，直至菌体细胞OD₆₀₀值达到0.4。此外，还通过改变培养时间和接种量进一步研究菌体对TBBPA的荧光响应：在接种量为2%的条件下，在8 mL体积的棕色玻璃瓶中加入50 μL的TBBPA母液(0 μmol/L和28 μmol/L，溶解于二氯甲烷中)，30 ℃、200 r/min分别培养8、11、14、17、20 h；在8 mL体积的棕色玻璃瓶中加入50 μL的TBBPA母液(0 μmol/L和28 μmol/L，溶解于二氯甲烷中)，使接种量分别为1%、2%、3%、5%、7%，30 ℃、200 r/min培养14 h。最后取50 μL培养液样品添加50 μL的Nano-Glo^® HiBiT裂解检测试剂，在化学发光仪上进行荧光素酶活性分析，另取150 μL培养液样品测定OD₆₀₀值以校准相对荧光值。

1.5 α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604蛋白的表达优化

在E. coli中表达外源蛋白通常受到温度、IPTG浓度及菌体浓度的影响^[23]。为实现α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604的最大积累，需探究其最优的表达条件。首先确定最佳诱导温度及菌体浓度，将E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)过夜培养物按0.5%的接种比例接种至新鲜LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀分别为0.4、0.6和0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在20 ℃ (20 h)、30 ℃ (10 h)、37 ℃ (3 h)条件下进行诱导表达。其次确定最佳的IPTG诱导浓度，在不同菌体浓度下分别加入终浓度为0.25、0.5、1 mmol/L的IPTG，将OD₆₀₀为0.4的菌液置于20 ℃、200 r/min下诱导20 h；OD₆₀₀为0.6的菌液置于30 ℃、200 r/min下诱导10 h；OD₆₀₀为0.8的菌液置于37 ℃、200 r/min下诱导3 h。诱导结束后，室温、5 000 r/min离心3 min收集细胞，使用裂解缓冲液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris)洗涤细胞沉淀，后加入上样缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L DTT、2% SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油)重悬菌体，置于100 ℃下煮沸10 min，10 000 r/min离心3 min后取上清液进行SDS-PAGE分析，电泳条件：150 V，50 min，上样量20 μL。

1.6 E. coliBL21(DE3, pET30b-2604)对TBBPA的降解性能分析

将E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)接种至含有50 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜。次日按0.5%的接种量将过夜培养物接种至新鲜LB培养基，37 ℃、200 r/min培养至菌体OD₆₀₀值约为0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在37 ℃、200 r/min条件下诱导培养3 h。诱导结束后，室温5 000 r/min离心3 min收集菌体，并用无机盐缓冲液洗涤2次，再以相同体积的无机盐缓冲液重悬菌体。在实验组培养基中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG、0.06 mg/L的α-酮戊二酸、0.05 mg/L的FeSO₄以及2.0 mg/L的TBBPA，于37 ℃、200 r/min培养3 d，设置不同对照组[无底盘细胞E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)、无IPTG诱导、有IPTG诱导但无FeSO₄、有IPTG诱导但无α-酮戊二酸]。在特定时间点(0、1、3 d)分别取出样品均置于-80 ℃冷冻保存，随后在冷冻干燥机中进行培养液的冻干处理。在冻干样品中加入0.5 mg/L的内标物[2,2′-二(4-羟基苯基)-六氟丙烷]，使用等体积甲醇进行冻融提取后，用0.22 μm滤膜过滤样品。最终，利用高效液相色谱(HPLC)法测定TBBPA的浓度。其色谱条件如下，柱温：40 ℃；流动相：0.05%磷酸/乙腈(D/B)；梯度0 min，70% B→4 min，95% B→4.5 min，95% B→5 min，70% B→8 min，70% B；流速1 mL/min；进样量15 μL；检测波长208 nm。

2 结果与分析

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2.1 S. xenophagumC1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA的响应特征

2.1.1 对不同卤代有机物的响应特征

利用BPROM (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb)和MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)对chr1_2605-chr1_2604基因簇进行生物信息学分析，以全面了解该基因簇的结构特征及其潜在的调控机制。首先，通过BPROM网站预测基因簇中每个基因的启动子序列，随后利用MEME网站对启动子区域的保守性进行分析。结果显示，在chr1_2605基因与chr1_2604基因的启动子区域均发现了一个保守基序(TTGCGAT) (图1)。启动子区域存在共同的保守基序，提示这些基因具有相同的转录调控模式及功能相关性^[24]。这表明chr1_2605和chr1_2604的转录调控至少受一个相同的转录因子调控，很可能受异生物质响应转录因子Chr1_2605的自身调控，且Chr1_2605蛋白的响应配体可能同时激活chr1_2605和chr1_2604的表达。

卤代有机物已被证实能够作为响应配体被多种转录因子识别并调控基因表达^[22,25-27]。作为一种卤代有机物，TBBPA很可能被异生物质响应转录因子Chr1_2605识别，并调控chr1_2605-chr1_2604基因簇的表达。为了探究Chr1_2605蛋白的识别配体及其特异性，本研究选择了10种卤代有机化合物作为测试对象。除目标化合物TBBPA外，还包括氟代化合物(PFHxS、PFOA、PFOS)、氯代化合物(Dicofol、PCP、HCBD、PCB-209)以及溴代化合物(BDE-209、BrN)。对不同浓度卤代有机物胁迫下S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞的荧光素酶活性进行分析，结果表明传感细胞仅对不同浓度的溴代化合物TBBPA表现出显著增强的相对荧光信号(图2A)，而其他卤代有机物中的氟代物、氯代物以及溴代物中的BDE-209、BrN处理组相较于对照组，均未观察到明显的荧光信号强度增加(图2B、2C)。这表明TBBPA是Chr1_2605转录因子的特异性识别配体，S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞能够有效区分TBBPA与其他卤代化合物，展现出对TBBPA显著的特异性识别能力。

2.1.2 对TBBPA代谢产物的响应特征

Chr1_2605转录因子表现出对TBBPA的特异性响应，其机制可能有2种：一是Chr1_2605蛋白直接识别TBBPA；二是Chr1_2605蛋白直接识别TBBPA的代谢产物，从而表现出对TBBPA的特异性响应。因此，本研究选取了TBBPA的3种主要降解产物：BPA、n-PMP和i-PMP^[28]，以进一步验证Chr1_2605的响应配体。结果显示，在不同浓度的降解产物实验组中，荧光信号强度与对照组相比无显著差异(图3A)。这表明BPA、n-PMP和i-PMP并非Chr1_2605蛋白的识别配体。由此可知，Chr1_2605蛋白对TBBPA的特异性响应是由于其直接识别TBBPA。

此外，细菌在异生物质胁迫下通常会诱导胞内活性氧水平的增加^[29-30]。Feng等^[31]研究表明，TBBPA会导致菌体内产生活性氧。与此同时，许多与异生物质应答相关的转录因子在氧化应激条件下，尤其是H₂O₂存在的情况下，会产生非特异性响应^[32-33]。为验证此类非特异性响应是否会对Chr1_2605识别配体产生干扰，本研究还设计了Chr1_2605对H₂O₂的响应活性分析。如图3B所示，当H₂O₂浓度为0.001%时，处理组与对照组的响应荧光信号无显著差异；当H₂O₂浓度增加至0.010%后，相对荧光信号强度显著下降，表明0.010% H₂O₂对底盘细胞产生了生物毒性。当H₂O₂浓度进一步增加至0.100%时菌体死亡，未测得萤光素酶信号。这说明H₂O₂不会诱导S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞产生与TBBPA相同程度的高强度荧光信号，也证实了Chr1_2605蛋白对TBBPA的响应并非由于TBBPA诱导的细胞氧化应激所致。

2.2 S. xenophagumC1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA的响应性能

S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA的响应特征实验结果表明，TBBPA是异生物质响应转录因子Chr1_2605的特异性识别配体。为进一步明确S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞对TBBPA的响应范围，本研究设计并分析了不同浓度梯度的TBBPA、不同接种量以及不同培养时间条件下的传感细胞响应性能。结果表明，在TBBPA浓度范围为0.125-7.000 μmol/L时，底盘细胞表现出良好的线性响应，并在7.000 μmol/L的TBBPA时达到最高响应值(图4A、4B)。随着TBBPA浓度增加到7.000 μmol/L以上，萤光素酶信号缓慢下降，但并非急剧下降，说明高浓度的TBBPA对传感细胞活性产生了影响，但非致死性影响。在此基础上，目标物浓度为7.000 μmol/L、接种量为2%的条件下，研究了不同培养时间对传感细胞响应的影响。实验结果显示，培养时间为14 h时，传感细胞的响应强度达到最大(图4C)。随后，在目标浓度为7.000 μmol/L、培养时间14 h的条件下，研究了不同接种量对传感细胞检测性能的影响。结果表明，接种量为2%时，响应灵敏度达到最佳水平且显著高于其他组(图4D)。在接种量为1%时，菌体密度增长缓慢且未达到荧光素酶诱导表达的有效水平；而在高接种量(3%、5%、7%)条件下，菌体密度较高，菌体间可能存在对营养物的竞争，影响胞内酶的合成。在接种量为2%、培养时间为14 h的最优条件下，传感细胞对TBBPA的最低检测限介于0.010-0.050 μmol/L (图4A)，为5.439-27.195 µg/L。

2.3 α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604蛋白的表达优化

S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)对TBBPA的响应特征实验结果表明Chr1-2605可以特异性识别TBBPA，且通过生物信息学分析初步确定基因簇chr1_2605-chr1_2604的功能与TBBPA密切相关。chr1_2604编码的Chr1_2604蛋白属于α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶，很可能具有重要的TBBPA降解功能。为探究α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604蛋白的功能，将chr1_2604基因元件插入高拷贝表达质粒pET30b载体中，并导入E. coli BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达。同时将空载体pET30b导入E. coli BL21(DE3)中，用于观察质粒背景下的蛋白表达情况。如图5所示，在泳道3中显示出明显的蛋白诱导表达条带，位于蛋白分子量标记的约25 kDa处。Chr1_2604蛋白长度为238个氨基酸，预测单体分子量为26 kDa，与泳道3表达的蛋白大小一致。相比之下，阴性对照泳道2在对应位置无明显蛋白条带，且该条带的强度较大，表明该条件下蛋白表达量较高。

为优化α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604的表达条件，本研究设计了在不同诱导条件(温度、IPTG浓度、菌株OD₆₀₀值)下进行蛋白表达分析。结果显示：在37 ℃条件下，蛋白表达量高于30 ℃和20 ℃条件下的蛋白表达量(图6A)；在20 ℃条件下，OD₆₀₀为0.4的实验组的蛋白表达量高于同温度下OD₆₀₀分别为0.6和0.8的实验组；在30 ℃条件下，不同实验组的蛋白表达量基本一致。此外不同IPTG浓度对Chr1_2604蛋白表达的影响结果显示，在37 ℃、1 mmol/L的IPTG诱导条件下蛋白表达量最高(图6B)。因此，本研究最终选择处于对数生长期后期(即OD₆₀₀为0.8)的菌体，将其置于37 ℃、1 mmol/L的IPTG诱导条件下培养3 h，以实现Chr1_2604双加氧酶的最大积累。

2.4 E. coliBL21(DE3, pET30b-2604)底盘细胞对TBBPA的降解性能

依据上述最佳条件诱导表达Chr1_2604双加氧酶，并在无机盐培养基中进行降解实验。尽管E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)底盘细胞在接种至无机盐培养基前已积累了一定量的Chr1_2604双加氧酶，为确保在较长实验周期内维持较高的蛋白表达量，实验组中仍加入了IPTG进行诱导表达。结果显示，底盘细胞E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)对TBBPA表现出显著的降解效果(图7)，在3 d内对初始浓度为2.0 mg/L的TBBPA的降解率达到44.415%。在不同对照组中，TBBPA的损失率分别为：无底盘细胞组3.970%、无IPTG诱导组9.882%、有IPTG诱导但无FeSO₄组14.286%、有IPTG诱导但无α-酮戊二酸组17.927%，均远低于实验组的降解率。在未添加菌体的空白对照组中，TBBPA的3.970%减少率可能与操作过程中的光降解有关；而无IPTG诱导组的9.882%降解率可能是由于底盘细胞在接种前已在LB培养基中积累了一定量的Chr1_2604双加氧酶活性。进一步分析表明，α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶的功能依赖于α-酮戊二酸和Fe(II)的协同作用。在2种辅因子同时存在的条件下，TBBPA降解率(44.415%)显著高于单一辅因子存在时的降解率(14.286%和17.927%)。这表明2种辅因子在酶催化机制中分别发挥关键作用，缺失任何一个都会显著限制α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604对TBBPA的降解活性。

3 讨论与结论

收起

微生物驱动的TBBPA高效降解是治理TBBPA环境污染问题的重要方法。微生物体内含有多种酶系统和调控网络，能够高效响应外界污染物，从而对污染物进行有效地摄入、外排、代谢或转化。深入挖掘并研究微生物响应或降解TBBPA的分子元件，将有利于TBBPA污染治理绿色高效生物技术的研发与应用。

目前，关于TBBPA生物降解的研究大多集中于天然菌株的筛选，并且主要关注培养条件对降解效果的影响，例如pH、温度、初始TBBPA浓度及共代谢基质种类等条件^[11,14,34]，而关于TBBPA降解酶元件的研究则极其匮乏。在为数不多的相关文献中，TBBPA降解酶多为非特异性酶类。例如，陈捷等^[14]发现乳白耙齿菌(Irpexlacteus) F17对TBBPA的降解率及脱溴率与锰过氧化物酶的活力密切相关；Liang等^[35]发现基于溴苯酚脱卤酶构建的底盘细胞在4 d内对6.0 mg/L TBBPA的降解率可达78% [1.170 mg/(L·d)]；Feng等^[36]发现不同浓度的木质素过氧化物酶及辣根过氧化物酶(0.005-0.100 U/mL)在体外对10.0 nmol/L TBBPA的酶促降解率可达6.5%-65.0% [0.177-1.770 mg/(L·h)]。然而，这类非特异性酶在完整细胞体内对TBBPA的底物特异性相对较差，降解效果有限，严重限制了这些酶类在TBBPA污染治理中的实际应用。在本研究中，通过在E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)中诱导表达α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶元件Chr1_2604并研究其对TBBPA的降解功能，发现并证实了一种新的TBBPA降解酶Chr1_2604。在培养基中补充降解酶作用所需的辅因子α-酮戊二酸和Fe(II)后，E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)底盘细胞在3 d内对2.0 mg/L的TBBPA降解率可达44.415% [0.296 mg/(L·d)] (图7)，与目前筛选的天然菌株在共代谢条件下的平均降解率相当甚至更高。当在培养基中加入共代谢基质葡萄糖后，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)在7 d内对2.0 mg/L TBBPA的降解率为50% [0.142 mg/(L·d)]^[11]，I. lacteus F17菌株在12 d内对5.0 mg/L的TBBPA的降解率为78.4% [0.326 mg/(L·d)]^[14]。在非共代谢条件下，微生物菌株对TBBPA的降解率会更低，例如丛毛单胞菌属(Comamonas sp.) JXS-2-02菌株在10 d内对0.5 mg/L的TBBPA降解率仅为86% [0.043 mg/(L·d)]^[37]，Shewanella sp. XB菌株在7 d内对1.0 mg/L的TBBPA降解率仅为85% [0.121 mg/(L·d)]^[18]。少数高效降解菌株如苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.) T，在3 d内对3.0 mg/L的TBBPA的降解率可达91.8% [0.918 mg/(L·d)]^[34]。相较于上述天然降解菌株，本研究中构建的降解底盘细胞在实现对TBBPA高效降解的同时，不需要额外补充高浓度碳源共代谢物，在实际应用中表现出更强的环境适应性和降解稳定性。此外，通过进一步优化α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604的表达条件，还可能通过增大降解酶的积累量进一步提高底盘细胞对TBBPA的降解效果。

α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶基因chr1_2604的上游基因chr1_2605编码异生物质响应转录因子。对这2个基因的启动子区域进行保守性分析发现，两者的启动子区域均含有1个保守基序TTGCGAT (图1)，提示这2个基因具有相同的转录调控模式及功能相关性。事实上，在本研究中基于chr1_2605分子元件构建的S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞仅对TBBPA表现出高度特异性的荧光响应，而对其他卤代有机物均无明显响应(图2)。这与chr1_2604基因编码TBBPA降解酶具有明显的功能相关性。此外，TBBPA的3种主要降解产物BPA、n-PMP和i-PMP均无法诱导S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞的荧光响应(图3)，说明异生物质响应转录因子Chr1_2605蛋白对TBBPA的特异性响应并非由降解产物引起，而是通过直接识别TBBPA分子而产生。异生物质响应转录因子能够在识别自身配体后与特定的DNA序列结合，进而调控相关基因的表达^[38-40]，从而实现外源有毒物质的脱毒与降解。其中，部分异生物质响应转录因子具有底物特异性。例如，XylR能够特异性识别并响应环境中的二甲苯^[41]，从而调控菌体实现二甲苯的降解；AhR能够特异性结合二噁英，可用于环境中二噁英的检测^[42]。然而，目前尚未见TBBPA作为配体的异生物质响应转录因子的研究报道。本研究发现的异生物质响应转录因子Chr1_2605蛋白在特异性识别TBBPA后，很可能同时激活chr1_2605和chr1_2604基因的表达。这为研究TBBPA降解酶的调控机制提供了一个良好的突破口。

此外，异生物质响应转录因子元件还可用于污染物的环境监测^[41,43]。本研究基于异生物质响应转录因子chr1_2605元件构建的S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞在TBBPA浓度范围为0.125-7.000 μmol/L时表现出良好的线性响应，并在7.000 µmol/L的TBBPA污染胁迫下诱导出最高的荧光响应信号。在实验受试浓度中，S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞的最低检测限介于 0.010-0.050 μmol/L，为5.439-27.195 µg/L (图4)。目前，TBBPA环境浓度的监测多依赖高精度仪器分析方法，如气相色谱-质谱法(GC-MS)^[44-45]、超高效液相色谱法(UPLC)^[46]、液相色谱-串联质谱法(LC/MS-MS)^[47]等。这些方法在TBBPA的定性和定量方面具有高灵敏度的优点。例如，HPLC-MS/MS对厌氧污泥中TBBPA的检测限为2 ng/g^[44]；HPLC-MS检测商品牛奶中的TBBPA含量的检测限为0.02 µg/L^[48]。然而，这些检测技术的检测限受限于复杂繁琐的前处理技术，而且仅局限于实验室分析，不支持现场监测。相比之下，尽管S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)传感细胞不适用于痕量TBBPA的检测，但其具备快速、便携、现场实时监测的显著优势，展现了在环境监测领域实际应用中的潜力。

综上所述，本研究发现并证实了对TBBPA具有特异性响应功能的异生物质响应转录因子Chr1_2605以及对TBBPA具有高效降解功能的α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604分子元件。利用这2个新型基因簇元件，分别构建了降解底盘细胞E. coli BL21(DE3, pET30b-2604)和传感底盘细胞S. xenophagum C1 (pBBR-2605-HiBiT)，实现了TBBPA的高效降解与高灵敏度监测。其中，降解底盘细胞通过高效表达α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604，显著提升了TBBPA的降解效率，在3 d内对2.0 mg/L的TBBPA降解率达到44.415% [0.296 mg/(L·d)]。传感底盘细胞能够精准识别并响应TBBPA，表现出较高的灵敏度，其最低检测限达到0.010-0.050 μmol/L。

本研究明确了chr1_2605-chr1_2604基因簇在TBBPA响应与降解中的核心功能：异生物质响应转录因子Chr1_2605能够特异性识别TBBPA，而α-酮戊二酸/Fe依赖性双加氧酶Chr1_2604可以高效降解TBBPA。这不仅为深入理解微生物对TBBPA的降解代谢过程提供了重要参考，同时也为基于TBBPA响应元件的污染治理绿色高效生物技术研发与应用提供了理论支持。

作者利益冲突公开声明

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作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

基金

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文献

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2025年第65卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250029

接收时间：2025-01-13
首发时间：2026-02-06
出版时间：2025-07-04

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作者

出版历史

收稿日期：2025-01-13
录用日期：2025-01-24

基金

the Special Project for Marine Economic Development of Guangdong Province (Six Major Marine Industries)(GDNRC[2024]38)

作者信息

^1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳

^2.广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250029

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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