微生物学报

菌株和质粒 Strain and plasmid	相关特征 Relevant characteristics	来源 Source
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633^Sm	Streptomycin resistance	Laboratory collection
ΔmfpA	mfpA deletion of WT; streptomycin resistance	This study
CΔmfpA	ΔmfpA complementary strain; streptomycin resistance; chloramphenicol resistance	This study
ΔmfpC	mfpC deletion of WT; streptomycin resistance	This study
ΔmfpB	mfpB deletion of WT; streptomycin resistance	This study
Escherichia coli DH5α λpir	No resistance	Laboratory collection
E. coli HB101-pRK2013	Kanamycin resistance	Laboratory collection
E. coli pDS132	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection
E. coli pBAD24	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection

菌株和质粒 Strain and plasmid	相关特征 Relevant characteristics	来源 Source
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633^Sm	Streptomycin resistance	Laboratory collection
ΔmfpA	mfpA deletion of WT; streptomycin resistance	This study
CΔmfpA	ΔmfpA complementary strain; streptomycin resistance; chloramphenicol resistance	This study
ΔmfpC	mfpC deletion of WT; streptomycin resistance	This study
ΔmfpB	mfpB deletion of WT; streptomycin resistance	This study
Escherichia coli DH5α λpir	No resistance	Laboratory collection
E. coli HB101-pRK2013	Kanamycin resistance	Laboratory collection
E. coli pDS132	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection
E. coli pBAD24	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence (5′→3′)	NCBI基因号 NCBI ID	备注 Note
mfpC-up-F	ATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGATGCCGTTACCTAAACCGAAAG	VP_RS22070(vpa1443)	Upstream mutant primers of mfpC, the fragment length was 776 bp
mfpC-up-R	CAGTGGCTTACGACTGGCTGCTGATTGCTC
mfpC-down-F	CAGCCAGTCGTAAGCCACTGACAGAAAGCA	Downstream mutant primers of mfpC, the fragment length was 995 bp
mfpC-down-R	TCGCATGCGGTACCTCTAGAAGCAGAGGTAAATAAGGCAACTAA
mfpB-up-F	ATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGAGTGAAAAATAGGACGCAAGCCACA	VP_RS22075(vpa1444)	Upstream mutant primers of mfpB, the fragment length was 972 bp
mfpB-up-R	CCATCAAACGAAACCTGCAAGCGTGCATAG
mfpB-down-F	TTGCAGGTTTCGTTTGATGGGTGAGGACAG	Downstream mutant primers of mfpB, the fragment length was 946 bp
mfpB-down-R	TCGCATGCGGTACCTCTAGAAGAGCCACCACATCTTGAGCAG
mfpA-up-F	ATGTGATGGGTTAAAAAGGATCGAAAGCCTGAAATCCTAATGCTC	VP_RS22080(vpa1445)	Upstream mutant primers of mfpA, the fragment length was 890 bp
mfpA-up-R	GTCGCCGAGATTTGCGCCTGCATCGCCTAG
mfpA-down-F	CAGGCGCAAATCTCGGCGACAATAAACTGA	Downstream mutant primers of mfpA, the fragment length was 993 bp
mfpA-down-R	TCGCATGCGGTACCTCTAGAAGGTGTCGCTAACTCTGCACTA
mfpAHB-1	GGCTAGCAGGAGGAATTCACCATGGCTGCATGTAATTAAAAGAAAAC		Back primers of mfpA, the fragment length was 779 bp
mfpAHB-2	CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTAACAAATAAATCGGCAC
mfpA-IF	ATGAGCACAAGTGACAATGACA		Identification primer of mfpA, the fragment length was 1 659 bp
mfpA-IR	TTCTGCACGATTACTTCCAC
pDS132-F	CTTCTAGAGGTACCGCATGCGA		PCR primers of mutant plasmid
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引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence (5′→3′)	NCBI基因号 NCBI ID	备注 Note
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mfpA突变对副溶血性弧菌运动性和生物被膜形成的影响

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朱黄琛之 ¹ , 韩周愈 ¹ , 孙宇 ¹ , 莫秋芬 ¹ , 陈刚 ¹ , 杨梦华 ² , 许光治 ¹

微生物学报 | 研究报告 2025,65(7): 3075-3088

收起

微生物学报 | 研究报告 2025, 65(7): 3075-3088

mfpA突变对副溶血性弧菌运动性和生物被膜形成的影响

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朱黄琛之¹, 韩周愈¹, 孙宇¹, 莫秋芬¹, 陈刚¹, 杨梦华², 许光治¹

作者信息

^1.浙江农林大学食品与健康学院，浙江杭州

^2.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江杭州

Influences of mfpA mutation on the motility and biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus

Huangchenzhi ZHU¹, Zhouyu HAN¹, Yu SUN¹, Qiufen MO¹, Gang CHEN¹, Menghua YANG², Guangzhi XU¹

Affiliations

^1.College of Food and Health, Zhejiang A&F University, Hangzhou, Zhejiang, China

^2.College of Animal Science and Technology, College of Veterinary Medicine, Zhejiang A&F University, Hangzhou, Zhejiang, China

出版时间: 2025-07-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240847

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摘要

收起

膜融合蛋白(membrane fusion protein, MFP) vpa1443-vpa1445基因簇(mfpABC)推测可能参与副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)生物被膜的形成，其中mfpA (vpa1445)编码一种含RTX毒素样结构域的Ca²⁺结合膜外蛋白，但其功能尚未明确。 【目的】 探究mfpA突变对Vp生物被膜形成和运动性的影响。 【方法】 分别构建mfpABC基因簇中3个基因的单突变菌株，比较3个突变株运动性的变化；在此基础上，重点分析mfpA对细菌运动能力和生物被膜形成能力的影响，通过RT-qPCR分析相关基因的表达，并探究其对HeLa细胞毒性的影响。 【结果】 mfpA突变可显著降低Vp的浮游(swimming)和群聚(swarming)运动能力；结晶紫染色和扫描电镜试验表明，ΔmfpA突变可提高菌株生物被膜的形成能力，并增加突变株胞外多糖和胞外蛋白的含量；RT-qPCR证实，ΔmfpA突变株中鞭毛相关基因的表达量下降，而胞外多糖合成相关基因的表达量上升；此外，ΔmfpA突变株可显著减弱Vp的细胞毒性。 【结论】 mfpA突变可通过影响鞭毛和胞外多糖相关基因的表达，降低Vp的运动能力，提高生物被膜的形成能力，削弱其细胞毒性。

关键词

mfpA / 浮游运动 / 群聚运动 / 生物被膜形成 / 细胞毒性

Abstract

收起

The vpa1443-vpa1445 gene cluster (mfpABC) encoding the membrane fusion protein (MFP) is hypothesized to be involved in the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus (Vp). The gene mfpA (vpa1445) encodes a Ca²⁺-binding extracellular protein containing a repeats-in-toxin (RTX) domain, while its function is still under exploration. [Objective] To study the influences of mfpA mutation on the biofilm formation and motility of Vp. [Methods] The single mutants of three genes in the mfpABC gene cluster were constructed, and the Vp motility was compared between the three mutants and the wild type. Furthermore, the influences of mfpA mutation on bacterial motility and biofilm formation were analyzed in detail, and the expression of related genes was analyzed by RT-qPCR. Moreover, the cytotoxicity of ΔmfpA to HeLa cells was investigated. [Results] The mutation of mfpA significantly reduced the swimming and swarming motility of Vp. Crystal violet staining and scanning electron microscopy results showed that the mutation of mfpA enhanced the biofilm formation and increased the content of extracellular polysaccharides and proteins. RT-qPCR confirmed that the expression levels of flagellar genes were downregulated, while those of extracellular polysaccharide synthesis-related genes were upregulated in ΔmfpA. The cytotoxicity of ΔmfpA significantly decreased compared with that of wild type. [Conclusion] The mutation of mfpA can affect the expression of genes associated with flagella and extracellular polysaccharides to reduce the motility, enhance the biofilm formation, and attenuate the cytotoxicity of Vp.

Key words

mfpA / swimming motility / swarming motility / biofilm formation / cytotoxicity

引用本文

朱黄琛之, 韩周愈, 孙宇, 莫秋芬, 陈刚, 杨梦华, 许光治. mfpA突变对副溶血性弧菌运动性和生物被膜形成的影响. 微生物学报, 2025 , 65 (7) : 3075 -3088 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240847

Huangchenzhi ZHU, Zhouyu HAN, Yu SUN, Qiufen MO, Gang CHEN, Menghua YANG, Guangzhi XU. Influences of mfpA mutation on the motility and biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (7) : 3075 -3088 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240847

正文

收起

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性食源性致病菌，主要分布于海水中，极易污染海产品，食用生的或未煮熟的海产品会引起疾病^[1]或食物中毒^[2]。副溶血性弧菌引起的食源性疾病最早在日本发现^[3]。随着食品供应链的延伸和全球气候变暖，由其引起的食物中毒案例不断增加。国家食源性疾病暴发监测系统显示，2010-2020年共上报副溶血性弧菌引起的食源性疾病暴发事件1 772起，累计发病27 212人^[4]，该菌已成为我国引发食源性疾病的重要病原菌之一。

在自然界中，副溶血性弧菌会遇到营养不足、低温、高压、紫外线等多种恶劣环境^[5]。当其受到胁迫时，生物被膜和运动性是其适应环境的重要手段^[6-7]。生物被膜(biofilm)是一种由细胞外聚合物质形成的结构复杂的生物群落^[8]，可直接影响病原菌与宿主细胞的黏附、定殖和侵入^[5]。生物被膜通常在抑菌剂、营养缺乏等不利环境中形成^[9]，是许多持续性细菌感染的根本原因^[10]。浮游运动(swimming)和群聚运动(swarming)是细菌依靠鞭毛运动的2种主要表现形式^[11]，与病原菌的抗逆性和致病性密切相关^[7]。研究表明，副溶血性弧菌“运动”和“定殖”的转换主要通过黏附蛋白、鞭毛等细胞膜外蛋白感应化学或物理信号^[12]。膜外蛋白可以直接参与生物被膜形成或驱动其在固体表面的运动^[13]，但大多数膜外蛋白在副溶血性弧菌“运动”和“定殖”转换中的作用还有待鉴定。

副溶血性弧菌的mfpABC (vpa1443-vpa1445)基因簇推测编码膜融合蛋白(membrane fusion protein, MFP)，组成一个操纵子^[14]。其中，mfpA (vpa1445)编码一种含RTX (repeats in toxin)毒素样^[15]结构域的Ca²⁺结合膜外蛋白，而mfpB (vpa1444)和mfpC (vpa1443)分别编码ABC转运蛋白和膜融合蛋白，组成Ⅰ型蛋白分泌系统，推测其负责将MfpA蛋白运输到胞外^[16]。虽然已有报道显示，mfpC突变可显著降低副溶血性弧菌的生物被膜形成能力^[14]，但mfpA的功能尚未见报道。Moreira等^[17]研究发现，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的mfpABC基因簇由expE1、expD1和expD2编码组成一个操纵子，其中expE1编码RTX结构域Ca²⁺结合分泌蛋白，expE1突变会导致苜蓿中华根瘤菌抑制胞外多糖合成，影响生物被膜形成。

为全面分析副溶血性弧菌mfpABC的功能，本研究构建了mfpA、mfpB和mfpC缺失突变株，比较了各突变株对群聚运动的影响，发现mfpA是影响副溶血性弧菌群聚运动的关键基因，在此基础上进一步探究了mfpA影响副溶血性弧菌运动性和生物被膜形成能力的机制。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株、质粒和培养条件

本研究所用菌株和质粒见表1。大肠杆菌和副溶血性弧菌菌株分别培养于LB培养基和含有2% NaCl的LB培养基(LBS)或脑心浸液肉汤培养基(brain-heart infusion broth, BHI)中。菌株筛选所使用的各种抗生素终浓度为：链霉素(streptomycin, Sm) 20 μg/mL；卡那霉素(kanamycin, Km) 20 μg/mL；氯霉素(chloramphenicol, Cm) 20 μg/mL。

1.2 mfpA序列多重比对

使用BLAST工具在NCBI蛋白质数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对mfpA蛋白氨基酸序列进行检索和同源性分析，并将其与来自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的F0254_04995以及苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的ExpE1 (SM11_pD0707)等多个蛋白质序列用ClustalX进行多序列比对，再用ESPrit 3.0在线软件(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)进行作图。

1.3 基因突变株和补偿株的构建

以副溶血性弧菌野生型(WT)菌株V. parahaemolyticus RIMD 2210633^Sm基因组DNA为模板，PCR扩增目标基因上游和下游长度为500-1 000 bp的片段，通过Over-lap PCR拼接上下游片段(表2)。将拼接片段无缝克隆到质粒pDS132中，转化至大肠杆菌DH5α λpir，再在辅助质粒pRK2013的帮助下通过三亲接合转化到副溶血性弧菌野生型中^[18]。用双抗(Cm和Sm) LBS平板筛选后，在10%蔗糖LBS平板划线，以mfpC-up-F和mfpC-down-R引物鉴定突变体，突变株分别命名为ΔmfpA、ΔmfpB和ΔmfpC。

以野生型为模板，参考突变株的方法构建补偿株Pbad24::mfpA质粒，并通过三亲接合转移到ΔmfpA中。用双抗(Cm和Sm) LBS平板筛选，用引物mfpA-IF和mfpA-IR进行PCR验证回补，回补成功命名为CΔmfpA。

1.4 运动性测定

对mfpABC基因突变株进行运动能力初步测定。参照Zhang等^[19]的方法进行运动性测定，并进行略微修改。浮游运动在含有0.5%琼脂的BHI培养基上进行，群集运动在含有1.0%琼脂的BHI培养基上进行。3个突变株和野生型在LBS液体培养基37 ℃、150 r/min培养过夜，培养物用LBS稀释至OD₆₀₀值为0.5，用灭菌牙签点样相应的BHI平板，放置于30 ℃培养6 h和8 h后分别测量浮游运动和群集运动的菌落直径。

对mfpA基因突变株和补偿株进行运动能力测定。将WT、ΔmfpA和CΔmfpA的培养过夜物用LBS稀释至OD₆₀₀值为0.5，用灭菌牙签点样至相应的BHI平板，将平板在30 ℃下培养6 h和8 h分别测量菌落的直径。

1.5 生长曲线的测定

将培养过夜的WT、ΔmfpA及CΔmfpA菌株转接到LBS液体培养基中，稀释至OD₆₀₀值为0.1，于37 ℃、150 r/min振荡培养。每隔1 h测定1次OD₆₀₀值，连续测定12 h，绘制生长曲线。

1.6 结晶紫染色观察生物被膜

参照Fan等^[20]、Zhang等^[21]的方法进行结晶紫染色观察生物被膜。WT、ΔmfpA和CΔmfpA菌株于37 ℃、150 r/min培养12 h，培养物稀释至OD₆₀₀值为0.1，加入96孔板中，在30 ℃、80 r/min下孵育8 h。弃去培养物，用去离子水小心清洗附着在表面的细胞3次，于50 ℃烘箱中干燥30 min，用0.1%的结晶紫染色15 min，然后用去离子水小心清洗3次，自然干燥后，将结合在每个孔中的结晶紫溶解于33%乙酸中，用酶标仪测量OD₅₇₀。

1.7 扫描电镜观察生物被膜

参照Wang等^[22]的方法进行生物被膜的扫描电镜观察。WT、ΔmfpA和CΔmfpA菌株于37 ℃、150 r/min培养12 h，将培养物稀释至OD₆₀₀值为0.1，加入24孔板中(24孔板底部置入无菌爬片)，在30 ℃、80 r/min下孵育8 h。用2.5%戊二醛固定过夜，弃去培养物上清，依次用50%、70%、80%、90%乙醇溶液脱水，每次脱水15 min，再用100%乙醇溶液脱水2次，每次脱水30 min。最后将干燥的爬片喷金(Hitachi)处理，用扫描电镜(牛津)观察生物被膜。

1.8 胞外聚合物测定

胞外聚合物测定参照Zhu等^[23]的方法进行。WT、ΔmfpA和CΔmfpA菌株培养过夜后，将培养物稀释至OD₆₀₀值为0.1，取2 mL菌液加入含有无菌爬片(ϕ=14 mm)的24孔板中，在30 ℃下静置24 h形成生物膜。采用超声波法提取胞外聚合物：用0.1 mol/L PBS (pH 7.0)清洗2次，再用1 mL预冷的0.01 mol/L氯化钾溶液重悬，置于冰上低温保存，20 kHz间断超声5 min，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，收集上清液。

苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量。取2 mL上清液至离心管中，加入1 mL的5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸混匀，50 ℃水浴15 min后迅速置于冰上，用酶标仪测定OD₄₉₀，得到对应的胞外多糖含量。

考马斯亮蓝法测定胞外蛋白含量。取1 mL上清液与5 mL考马斯亮蓝染液混匀，用酶标仪测定OD₅₉₅，计算胞外蛋白含量。

1.9 mfpA鞭毛和生物被膜转录水平验证

通过RT-qPCR检测ΔmfpA基因突变对副溶血性弧菌生物被膜和鞭毛相关基因转录水平的影响。WT、ΔmfpA和CΔmfpA菌株于37 ℃、150 r/min培养12 h，取1 mL菌液用TRIzol法提取总RNA (Vazyme公司)。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme公司)进行cDNA合成。根据表3的引物，以gyrB为内参基因，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme公司)，在StepOnePlus Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific公司)中进行RT-qPCR检测目的基因mRNA水平。

1.10 细胞毒性试验

HeLa细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞毒性测定按照Chimalapati等^[24]、Marie等^[25]的方法进行。简而言之，将HeLa细胞接种于96孔板中，培养过夜至80%-90%覆盖率，然后将细菌加入预热的含有1%胎牛血清的无酚红DMEM中，制备成感染溶液。用PBS洗涤预培养的HeLa细胞，按照感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10加入感染溶液，将细胞板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中分别孵育2 h和4 h。感染后，用LDH (lactate dehydrogenase)细胞毒性检测试剂盒定量乳酸脱氢酶释放至培养基中的量。最后，用酶标仪读取OD₄₉₀，测量LDH浓度。实验重复6次，取其平均值。

1.11 数据分析

所有实验均至少重复3次，数据以平均值±标准差表示，星号表示P值，*：P≤0.05；**：P≤0.01；***：P≤0.001；****：P≤0.000 1。使用GraphPad Prism 9进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，分析WT、ΔmfpA和CΔmfpA菌株之间的差异。

2 结果与分析

收起

2.1 mfpA突变降低副溶血性弧菌浮游运动和群集运动能力

为分析mfpABC对副溶血性弧菌运动性的影响，构建了mfpABC基因单突变株。分别以mfpC-up-F/mfpC-down-R、mfpB-up-F/mfpB-down-R和mfpA-IF/mfpA-IR为引物(表2)，通过PCR鉴定突变株。如图1所示，野生型和突变株中扩增片段的大小与理论值基本一致，表明ΔmfpC、ΔmfpB和ΔmfpA突变株构建成功。

ΔmfpA、ΔmfpB和ΔmfpC突变株对运动性的影响如图2所示，与野生型相比，ΔmfpA突变株的浮游运动和群集运动能力均显著下降，而ΔmfpC和ΔmfpB则无明显变化，表明mfpA基因突变显著减弱了副溶血性弧菌的运动性。因此本研究重点围绕mfpA的功能展开了后续研究。

2.2 MfpA氨基酸序列分析

MfpA蛋白编码了196个氨基酸残基，其中包含多个GGXGXDXUX重复序列(其中U是任何疏水氨基酸) (RTX)^[15]，且重复的基序呈现出平行的β-折叠结构。将MfpA蛋白与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的F0254_04995以及苜蓿中华根瘤菌的ExpE1两个推定的Ca²⁺结合蛋白进行多重比对。如图3所示，MfpA蛋白与其他2个推定的Ca²⁺结合蛋白具有多个高度保守的GGXGXDXUX重复序列，这种特殊的序列结构被推测为Ca²⁺的特定结合区域^[26]。

2.3 mfpA突变株和补偿株运动能力测定

为进一步分析mfpA基因的功能，本研究构建了mfpA的补偿株。使用引物mfpA-IF/mfpA-IR，通过PCR鉴定补偿菌株(表2)。如图4A所示，补偿株片段大小恢复至野生型水平，表明CΔmfpA构建成功。

如图4B所示，突变株ΔmfpA和补偿株CΔmfpA的生长速度与野生株WT相比无显著性差异，表明mfpA基因的突变对副溶血性弧菌的生长并无影响。

mfpA基因的突变显著降低了浮游运动和群集运动能力。如图5所示，ΔmfpA的浮游运动直径和群集运动直径分别比WT下降了96.8%和86.1%，而CΔmfpA则分别回升了43.5%和33.3%，由此可知ΔmfpA的浮游运动和群集运动能力显著减弱，而CΔmfpA的浮游运动和群集运动能力虽未完全恢复至野生型水平，但也表现出明显的回补趋势。上述结果说明，mfpA突变株运动能力的减弱是由于mfpA基因突变所致。

2.4 mfpA突变增加生物被膜形成能力

采用结晶紫染色法研究mfpA基因是否影响副溶血性弧菌生物被膜的形成。如图6所示，ΔmfpA的结晶紫染色显著增强，而CΔmfpA的结晶紫染色恢复至WT水平。结果表明，mfpA基因的突变增加了副溶血性弧菌的生物被膜形成能力。

扫描电镜进一步观察生物被膜，以验证mfpA基因对副溶血性弧菌生物被膜的影响。如图6C所示，与WT相比，ΔmfpA突变株的细胞数量显著增加，而CΔmfpA的细胞数量则恢复至野生型水平。这进一步验证了mfpA基因的突变显著影响副溶血性弧菌生物被膜的形成。

2.5 mfpA基因突变增加EPS形成

通过鉴定副溶血性弧菌生物被膜中胞外多糖和胞外蛋白的含量，验证mfpA基因缺失是否影响胞外多糖(extracellular polymeric substances, EPS)的形成。如图7所示，与WT相比，ΔmfpA的胞外多糖和胞外蛋白成分含量分别增加了134.73%和219.56%，而CΔmfpA的胞外多糖和胞外蛋白成分含量则恢复至野生型水平。结果表明，mfpA基因缺失能够显著提高生物被膜中EPS的形成。

2.6 鞭毛和生物被膜转录水平验证

通过RT-qPCR检测WT、ΔmfpA、CΔmfpA 3个菌株的基因转录表达情况，结果如图8所示。与WT相比，ΔmfpA菌株中极性鞭毛相关基因^[27]vp0790、vp2224和vp2259的mRNA转录水平显著下调，而在CΔmfpA菌株中则恢复至野生型水平。相反，ΔmfpA菌株中EPS相关基因^[28]vpa1403、vpa1406、vp1468、vp1473的mRNA水平显著上调，其中vp1473上调最为显著，而在CΔmfpA菌株中则表现出明显的回补趋势。这些结果再次表明，mfpA基因影响副溶血性弧菌极性鞭毛合成和生物被膜形成相关基因的转录。

2.7 mfpA缺失降低了细胞毒性

通过测定宿主细胞LDH的释放，验证mfpA基因突变是否影响副溶血性弧菌对HeLa细胞的细胞毒性。结果如图9所示，与WT相比，ΔmfpA在2 h和4 h的细胞毒性分别降低了81.56%和87.93%。然而，CΔmfpA在2 h与野生型相比并无显著差异，在4 h时仅比野生型仅降低了27.59%。这表明mfpA基因突变显著降低了副溶血性弧菌对HeLa细胞的细胞毒性。

3 讨论与结论

收起

副溶血性弧菌可通过浮游运动、群集运动以及在固体表面形成生物被膜等^[7,29-30]多种方式释放多种毒力因子，从而导致细菌性食源性疾病，严重时可导致死亡^[31]。mfpA编码一种潜在的钙结合蛋白，含有Ca²⁺特定结合区域^[26,32]，可能在跨膜易位后的分子折叠中起作用^[26]，或导致蛋白质构象改变从而有利于细胞膜结合^[33]。因此，mfpA的突变可能导致细胞稳定性下降，进而影响其生物被膜的形成。与mfpA功能相似的基因expE1已被证实是中华根瘤菌生物被膜和胞外多糖合成所必需的^[17]，但mfpA的功能尚未深入研究。因此，研究mfpA对副溶血性弧菌生物被膜和运动性的影响可为研究其环境适应性提供新的思路。

研究表明，细菌的运动性可增加细菌细胞间的物质交换、环境适应性和抗生素耐药性^[34-35]，并与致病性密切相关^[36]。副溶血性弧菌的双鞭毛系统在其运动性和宿主定殖中起着至关重要的作用^[37-38]。本研究通过突变mfpABC基因簇来研究其对运动性的影响，结果表明，与野生型(WT)相比，ΔmfpC和ΔmfpB的运动能力并无显著差异，而ΔmfpA的浮游运动和群集运动能力显著下降(图2)。进一步构建mfpA基因补偿株后发现，CΔmfpA表现出明显的回补趋势(图5)。这表明mfpA基因突变显著影响副溶血性弧菌的运动性。RTX蛋白通过ABC转运蛋白和膜融合蛋白形成的组装体运送到胞外从而产生活性^[15]，因此推测ΔmfpC和ΔmfpB运动能力与WT无显著差异的原因可能是mfpA可通过其他Ⅰ型分泌系统运送到胞外。RT-qPCR分析显示，ΔmfpA中鞭毛相关基因vp0790、vp2259和vp2224的mRNA水平显著下调，而细菌运动性与鞭毛基因表达密切相关^[39]，这进一步证实了mfpA基因对副溶血性弧菌浮游运动和群集运动的显著影响。

生物被膜是一种黏附于介质表面的生物群落^[8]，可增强细菌对外界不利环境^[40]和宿主免疫系统的抵抗力^[41]。本研究对mfpA基因的生物被膜形成能力进行了研究。结晶紫定量分析表明，mfpA基因突变显著增强了副溶血性弧菌的生物被膜形成能力(图6)。扫描电镜观察也发现，mfpA基因突变使细胞数量显著增加，这进一步证实了mfpA对生物被膜形成的显著影响。EPS是成熟生物被膜的主要成分之一^[42]，可增强生物被膜的稳定性^[43]，在生物被膜形成中起关键作用^[16]。EPS含量测定结果显示，与野生型相比，ΔmfpA的胞外多糖和胞外蛋白成分含量显著增加(图7)。RT-qPCR分析也显示，EPS相关基因vpa1406、vpa1403、vp1473、vp1468的mRNA水平显著上调，说明mfpA基因突变增加了EPS含量，从而显著影响了生物被膜的形成。研究表明，副溶血性弧菌群集运动的减少会导致生物被膜形成增强^[44-45]，这与ΔmfpA的表型一致。因此，mfpA基因突变可能通过导致细胞稳定性下降、c-di-GMP和群体感应等信号失调，进而打破生物被膜形成与扩散的平衡，导致群集运动减少和生物被膜增强，其具体作用机制尚需进一步探究。

副溶血性弧菌作为一种食源性致病菌，其对宿主细胞的作用与其在宿主体内的定殖和侵袭能力密切相关^[46]。为探究mfpA基因是否影响副溶血性弧菌的定殖和侵袭能力，本研究进行了细胞毒性试验。结果表明，mfpA基因突变显著降低了副溶血性弧菌的细胞毒性(图9)，而CΔmfpA的细胞毒性则表现出明显的回补趋势。Isenberg等^[47]研究表明，细菌生物被膜的增加会减弱其扩散和定殖能力。因此mfpA可能通过影响生物被膜的形成，进而减弱了细胞毒性。

综上所述，本研究通过对mfpA基因的生物特性和细胞毒性分析发现，mfpA基因突变并不影响细菌的生长特性，但显著减弱了其运动能力和细胞毒性，同时显著增强了生物被膜形成能力和胞外多糖及胞外蛋白的含量，表明mfpA作为膜融合蛋白基因簇中的一个基因，可能通过影响生物被膜形成与扩散的平衡，进而影响细菌的运动性和细胞毒性，其具体作用机制和分子机制尚需要进一步研究。

作者利益冲突公开声明

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作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

基金

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浙江省自然科学基金(LY17C200019)

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2025年第65卷第7期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240847

接收时间：2024-12-28
首发时间：2026-02-06
出版时间：2025-07-04

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收稿日期：2024-12-28
录用日期：2025-02-12

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Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY17C200019)

浙江省自然科学基金(LY17C200019)

作者信息

^1.浙江农林大学食品与健康学院，浙江杭州

^2.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江杭州

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

菌株和质粒 Strain and plasmid	相关特征 Relevant characteristics	来源 Source
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633^Sm	Streptomycin resistance	Laboratory collection
ΔmfpA	mfpA deletion of WT; streptomycin resistance	This study
CΔmfpA	ΔmfpA complementary strain; streptomycin resistance; chloramphenicol resistance	This study
ΔmfpC	mfpC deletion of WT; streptomycin resistance	This study
ΔmfpB	mfpB deletion of WT; streptomycin resistance	This study
Escherichia coli DH5α λpir	No resistance	Laboratory collection
E. coli HB101-pRK2013	Kanamycin resistance	Laboratory collection
E. coli pDS132	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection
E. coli pBAD24	Chloramphenicol resistance	Laboratory collection

菌株和质粒

Strain and plasmid