微生物学报

Strains and plasmids	Characteristic	Source
Photobacterium damselae subsp. damselae	Wild-type strain, Amp^r	Lab stock
ΔflgK-PDD	flgK deletion mutant of Photobacterium damselae subsp. damselae, Amp^r	This study
Escherichia coli S17-1λpir	RP4-2 (Km::Tn7, Tc::Mu-1), pro-82, LAMpir, recA1, endA1, thiE1, hsdR17, creC510	Lab stock
pRE112	Suicide plasmid, sacB, Cm^r	Southwest University, Prf. R. H. Wu donated
pRE112-UDflgK	pRE112 carrying the recombinant fragment UDflgK	This study

Strains and plasmids	Characteristic	Source
Photobacterium damselae subsp. damselae	Wild-type strain, Amp^r	Lab stock
ΔflgK-PDD	flgK deletion mutant of Photobacterium damselae subsp. damselae, Amp^r	This study
Escherichia coli S17-1λpir	RP4-2 (Km::Tn7, Tc::Mu-1), pro-82, LAMpir, recA1, endA1, thiE1, hsdR17, creC510	Lab stock
pRE112	Suicide plasmid, sacB, Cm^r	Southwest University, Prf. R. H. Wu donated
pRE112-UDflgK	pRE112 carrying the recombinant fragment UDflgK	This study

Primer name	Sequence (5′→3′)	Product length (bp)	Target DNA
flgK-1F (Sac I)	CGTCTAGACCGATGTATCAACACGCTT	612	Up stream flgK
flgK-1R	AACCGCTCAGAGTGACCGAACTTGGTTACGACA
flgK-2F	AACCAAGTTCGGTCACTCTGAGCGGTTTGTTTC	555	Down stream flgK
flgK-2R (Xba I)	GCGAGCTCTGGCTATTAGCACCTGTTTT
pRE112-F	CGGGTTGAGAAGCGGTGTA	1 487 (pRE112-UDflgK)/378 (pRE112)	Target gene cloned to pRE112
pRE112-R	CAGCCAATCCCTGGGTGAG
in-flgK-F	AGCCACCGACATAATACGA	1 546 (WT-PDD)/449 (ΔflgK-PDD)	Internal region of flgK gene for identification
in-flgK-R	AGAACAAGCGAAACAAACC
27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	1 516	16S rDNA
1492R	TACGGCTACCTTGTTACGACTT

Primer name	Sequence (5′→3′)	Product length (bp)	Target DNA
flgK-1F (Sac I)	CGTCTAGACCGATGTATCAACACGCTT	612	Up stream flgK
flgK-1R	AACCGCTCAGAGTGACCGAACTTGGTTACGACA
flgK-2F	AACCAAGTTCGGTCACTCTGAGCGGTTTGTTTC	555	Down stream flgK
flgK-2R (Xba I)	GCGAGCTCTGGCTATTAGCACCTGTTTT
pRE112-F	CGGGTTGAGAAGCGGTGTA	1 487 (pRE112-UDflgK)/378 (pRE112)	Target gene cloned to pRE112
pRE112-R	CAGCCAATCCCTGGGTGAG
in-flgK-F	AGCCACCGACATAATACGA	1 546 (WT-PDD)/449 (ΔflgK-PDD)	Internal region of flgK gene for identification
in-flgK-R	AGAACAAGCGAAACAAACC
27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	1 516	16S rDNA
1492R	TACGGCTACCTTGTTACGACTT

Genes	ID	Sequences (5′→3′)	Product length (bp)
gyrB	NZ_CP073684.1	F:	GTGATACTGATCGTACAGGT	246
R:	CTTTCTGGTGAATTGGTGTT
gspC	NZ_CP073684.1	F:	ACTGAGTAGTTACAGGAGCCG	160
R:	AATGAAGCGATTAAAGGGA
gspD	NZ_CP073684.1	F:	CAGAAATGCCAGTTAGGGT	236
R:	TGAATCGTTAAATAAGAGTGC
gspE	NZ_CP073684.1	F:	CCAGAATAATGCCGTGAGG	169
R:	GCAGTGGATGTGCGTGTAT
gspF	NZ_CP073684.1	F:	ACTTCACCCCAAAGACCAC	215
R:	AGCGATGATTTATCCAACC
dly	NZ_CP073687.1	F:	ATGCGACAGCACAAGAACC	236
R:	GACCGCTCGTCCAAATAAG
plpV	NZ_CP073684.1	F:	AACGCTGCTGATATTACCTA	195
R:	GCCTAAGAACCAAGAGTTTG
hlyA_pl	NZ_CP073687.1	F:	AAAACTCGCATAACTAAGAGG	248
R:	GTAAAGATGGACCGAAAGC
hlyA_ch	NZ_CP073684.1	F:	GATAACCTTCCGACCATACA	186
R:	CGAGTCTTCAGGCTAATGC
fur	NZ_CP073684.1	F:	CACATTAGTGCGGAAGACC	197
R:	TTGCCACAATCTAAACAAACA
cheW	NZ_CP073684.1	F:	AGAGGCTAAATGGGTTGAC	139
R:	TCCTGATTCTAAGGGGTCTA
cheY	NZ_CP073684.1	F:	GTCGGTAATAACAAAGTCAAA	111
R:	GTGAAGAACTTACTGCGTGA
ompP	NZ_CP073684.1	F:	CACTGGTAACTTTGGTGGTC	174
R:	GGTGTAGTACCTTGCTGATTT
lapB	NZ_CP073684. 1	F:	ATGATTGAGTTAGGTGCCC	139
R:	TTGCCTGCTTGTATTCTTG
flhB	NZ_CP073684.1	F:	TCAGGCTTACCTTCTGTCTC	123
R:	CTGCTCGTTATTAGTGGTTG
flgK	NZ_CP073684. 1	F:	GAAAAGCCATCGACAGAG	194
R:	ATTAAGCCATTAGGCAGTAA
flgL	NZ_CP073684.1	F:	TAAGGGTAAGTTCAAAGTCAAG	297
R:	CAGGTAGTACGGCAGGAG
fliK	NZ_CP073684.1	F:	ACTCGGTCAGAAGAGGTCG	184
R:	GAATGCAGTTGGCTCAAAG
fliH	NZ_CP073684.1	F:	AACAGCAATAGGCGTAGCG	246
R:	CCATTAACAGCGGCAGATC

Genes	ID	Sequences (5′→3′)	Product length (bp)
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R:	GCAGTGGATGTGCGTGTAT
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R:	AGCGATGATTTATCCAACC
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fliK	NZ_CP073684.1	F:	ACTCGGTCAGAAGAGGTCG	184
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fliH	NZ_CP073684.1	F:	AACAGCAATAGGCGTAGCG	246
R:	CCATTAACAGCGGCAGATC

Antibiotic	Content (µg/disc)	Judgement	Antibacterial circle diameter (mm)	Result
Penicillin	10	≤11	≥15	0±0	0±0	R	R
Oxacillin	1	≤14	≥20	0±0	0±0	R	R
Ampicillin	10	≤13	≥17	0±0	0±0	R	R
Cephalexin	30	≤14	≥18	15.12±0.25	16.49±0.21	I	I
Cefazolin	30	≤14	≥18	18.75±0.26	20.39±0.19	S	S
Cefradine	30	≤14	≥18	18.94±0.26	19.77±0.19	S	S
Ceftazidime	30	≤17	≥21	23.26±0.28	24.19±0.18	S	S
Ceftriaxone	30	≤19	≥23	31.80±0.33	36.08±0.14	S	S
Cefotaxime/Clavulanic acid	30/10	≤22	≥26	33.21±0.33	36.49±0.14	S	S
Cefazoloxime	30	≤21	≥25	32.81±0.33	37.51±0.14	S	S
Cefoperazone/Sulbactam	75/75	≤15	≥21	32.61±0.33	35.36±0.15	S	S
Amikacin	30	≤13	≥18	12.72±0.24	12.49±0.23	R	R
Gentamicin	10	≤12	≥15	13.01±0.24	14.75±0.22	I	I
Kanamycin	30	≤13	≥18	13.51±0.24	14.14±0.22	I	I
Streptomycin	10	≤11	≥15	10.20±0.23	10.16±0.23	R	R
Neomycin	30	≤17	≥23	14.12±0.24	13.32±0.22	R	R
Tetracycline	39	≤11	≥15	25.47±0.29	26.85±0.17	S	S
Doxycycline (D×doxycycline)	30	≤10	≥14	22.87±0.28	24.29±0.18	S	S
Minocycline	30	≤12	≥16	28.8±0.31	26.75±0.18	S	S
Erythromycin	15	≤13	≥23	10.00±0.23	11.57±0.23	R	R
Acetylspiramycin	30	≤13	≥18	8.49±0.22	9.62±0.24	R	R
Clarithromycin	15	≤13	≥18	7.99±0.22	10.34±0.24	R	R
Azithromycin	15	≤13	≥18	14.83±0.24	15.67±0.21	I	I
Nalidixic acid	30	≤13	≥19	37.13±0.35	37.51±0.14	S	S
Piperic acid	30	≤22	≥28	29.29±0.31	31.16±0.16	S	S
Norfloxacin	10	≤12	≥17	27.48±0.30	34.03±0.15	S	S
Ofloxacin	5	≤12	≥16	35.82±0.35	38.95±0.14	S	S
Ciprofloxacin	5	≤15	≥21	36.53±0.35	40.49±0.14	S	S
Nomefloxacin	10	≤18	≥22	33.41±0.33	35.36±0.15	S	S
Flurofloxacin	5	≤15	≥19	32.31±0.33	37.01±0.14	S	S
Polymyxin B	300 IU	≤11	≥12	13.01±0.24	17.52±0.21	S	S
Neomycin	30	≤17	≥22	25.27±0.29	33.01±0.15	S	S
Sulfafurazole	300	≤10	≥16	28.09±0.30	29.11±0.16	S	S
Furazolidone	30	≤14	≥17	24.47±0.28	24.09±0.18	S	S
Rifampicin	5	≤16	≥20	26.48±0.29	27.77±0.17	S	S
Chloramphenicol	30	≤12	≥18	35.42±0.34	35.77±0.15	S	S
Enrofloxacin	10	≤15	≥19	31.91±0.33	37.72±0.14	S	S
Florfenicol	30	≤12	≥18	30.20±0.32	33.62±0.15	S	S

Antibiotic	Content (µg/disc)	Judgement	Antibacterial circle diameter (mm)	Result
Penicillin	10	≤11	≥15	0±0	0±0	R	R
Oxacillin	1	≤14	≥20	0±0	0±0	R	R
Ampicillin	10	≤13	≥17	0±0	0±0	R	R
Cephalexin	30	≤14	≥18	15.12±0.25	16.49±0.21	I	I
Cefazolin	30	≤14	≥18	18.75±0.26	20.39±0.19	S	S
Cefradine	30	≤14	≥18	18.94±0.26	19.77±0.19	S	S
Ceftazidime	30	≤17	≥21	23.26±0.28	24.19±0.18	S	S
Ceftriaxone	30	≤19	≥23	31.80±0.33	36.08±0.14	S	S
Cefotaxime/Clavulanic acid	30/10	≤22	≥26	33.21±0.33	36.49±0.14	S	S
Cefazoloxime	30	≤21	≥25	32.81±0.33	37.51±0.14	S	S
Cefoperazone/Sulbactam	75/75	≤15	≥21	32.61±0.33	35.36±0.15	S	S
Amikacin	30	≤13	≥18	12.72±0.24	12.49±0.23	R	R
Gentamicin	10	≤12	≥15	13.01±0.24	14.75±0.22	I	I
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Neomycin	30	≤17	≥23	14.12±0.24	13.32±0.22	R	R
Tetracycline	39	≤11	≥15	25.47±0.29	26.85±0.17	S	S
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Flurofloxacin	5	≤15	≥19	32.31±0.33	37.01±0.14	S	S
Polymyxin B	300 IU	≤11	≥12	13.01±0.24	17.52±0.21	S	S
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Sulfafurazole	300	≤10	≥16	28.09±0.30	29.11±0.16	S	S
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Chloramphenicol	30	≤12	≥18	35.42±0.34	35.77±0.15	S	S
Enrofloxacin	10	≤15	≥19	31.91±0.33	37.72±0.14	S	S
Florfenicol	30	≤12	≥18	30.20±0.32	33.62±0.15	S	S

flgK 对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种生理生化和分子调控机制

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刘浩哲 ¹^,² , 张志琪 ²^,³ , 于永翔 ²^,³ , 王春元 ²^,³ , 王印庚 ²^,³ , 荣小军 ²^,³ , 廖梅杰 ²^,³ , 罗璋 ¹ , 张正 ²^,³^,^*

微生物学报 | 研究报告 2025,65(8): 3583-3599

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(8): 3583-3599

flgK 对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种生理生化和分子调控机制

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刘浩哲¹^,², 张志琪²^,³, 于永翔²^,³, 王春元²^,³, 王印庚²^,³, 荣小军²^,³, 廖梅杰²^,³, 罗璋¹, 张正²^,³^,^*

作者信息

^1.天津农学院水产学院，天津

^2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东青岛

^3.青岛海洋科技中心，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛

Physio-biochemical and molecular regulation mechanism of flgK on Photobacterium damselae subsp. damselae

Haozhe LIU¹^,², Zhiqi ZHANG²^,³, Yongxiang YU²^,³, Chunyuan WANG²^,³, Yingeng WANG²^,³, Xiaojun RONG²^,³, Meijie LIAO²^,³, Zhang LUO¹, Zheng ZHANG²^,³^,^*

Affiliations

^1.College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin, China

^2.State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao, Shandong, China

^3.Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao, Shandong, China

出版时间: 2025-08-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250033

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摘要

收起

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是一种广泛存在于海水中的致病菌，能够感染多种经济鱼类，对全球水产养殖业造成巨大经济损失。鞭毛基因flgK可编码鞭毛钩蛋白FlgK，该蛋白对细菌鞭毛的正常形成至关重要。 【目的】 系统解析flgK基因对PDD感染宿主毒力作用的影响机制。 【方法】 采用高效自杀质粒介导的同源重组方法构建PDD的flgK基因缺失突变株(ΔflgK-PDD)，并通过基因测序证实突变成功。对ΔflgK-PDD在生物学特性、毒力基因表达及致病性等方面与野生株(WT-PDD)的差异进行比较分析。 【结果】 ΔflgK-PDD的生长能力、溶血活性、磷脂酶活性与WT-PDD无显著差异。然而，ΔflgK-PDD的运动能力和生物被膜形成能力较WT-PDD显著下降。透射电子显微镜观察显示，ΔflgK-PDD未能形成鞭毛结构。通过人工感染实验发现ΔflgK-PDD对许氏平鲉的LD₅₀为WT-PDD的557%，致病性显著降低。实时荧光定量PCR结果进一步表明，与WT-PDD株相比，ΔflgK-PDD的鞭毛相关基因fliK和flgL，II型分泌系统(type II secretion system, T2SS)相关基因gspC和gspD以及毒力基因hlyA_pl表达显著下调；而鞭毛相关基因fliH，T2SS相关基因gspE，外膜相关基因ompP、flhB和脂多糖相关基因lapB表达显著上调，其余基因未见显著变化。 【结论】 flgK基因的突变可导致ΔflgK-PDD无法形成完整的鞭毛结构，并显著改变鞭毛相关基因的相对表达水平，从而降低其运动性和定殖能力，最终导致其致病性显著下降。

关键词

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种 / flgK基因 / 致病性 / 分子机制

Abstract

收起

Photobacterium damselae subsp. damselae (PDD), a pathogenic bacterium widely found in seawater, can infect a variety of economic fish and cause huge economic losses to the global aquaculture industry. The flagellar gene flgK encodes the flagellar hook protein FlgK, which is essential for the normal formation of bacterial flagella. [Objective] To systematically analyze the influencing mechanism of flgK on the virulence of PDD. [Methods] The flgK-deleted mutant of PDD (ΔflgK-PDD) was constructed by homologous recombination mediated by a high-efficiency suicide plasmid, and the mutation was confirmed by gene sequencing. The biological characteristics, virulence gene expression, and pathogenicity were compared between ΔflgK-PDD and the wild-type strain (WT-PDD). [Results] There was no significant difference in the growth ability, hemolytic activity or phospholipase activity between ΔflgK-PDD and WT-PDD. However, the motility and biofilm formation of ΔflgK-PDD were significantly lower than those of WT-PDD. Transmission electron microscopy showed that ΔflgK-PDD failed to form a flagellar structure. The artificial infection experiments showed that the LD₅₀ of ΔflgK-PDD in Sebastes schlegelii was 557% that of WT-PDD, and the pathogenicity was significantly reduced. Real-time quantitative PCR results showed that compared with WT-PDD, ΔflgK-PDD demonstrated significantly down-regulated expression of the flagellar-related genes fliK and flgL, the type II secretion system (T2SS)-related genes gspC and gspD, and the virulence gene hlyA_pl. The expression levels of flagellar-related gene fliH, T2SS-related gene gspE, outer membrane-related genes ompP, lapB, and flhB were significantly up-regulated, and those of the remaining genes did not change significantly. [Conclusion] The mutation of flgK can lead to the failure of ΔflgK-PDD to form a complete flagellar structure and significantly change the relative expression levels of flagellar-related genes, thereby reducing the motility and colonization ability and ultimately weakening the pathogenicity of PDD.

Key words

Photobacterium damselae subsp. damselae / flgK / pathogenicity / molecular mechanism

引用本文

刘浩哲, 张志琪, 于永翔, 王春元, 王印庚, 荣小军, 廖梅杰, 罗璋, 张正. flgK 对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种生理生化和分子调控机制. 微生物学报, 2025 , 65 (8) : 3583 -3599 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250033

Haozhe LIU, Zhiqi ZHANG, Yongxiang YU, Chunyuan WANG, Yingeng WANG, Xiaojun RONG, Meijie LIAO, Zhang LUO, Zheng ZHANG. Physio-biochemical and molecular regulation mechanism of flgK on Photobacterium damselae subsp. damselae[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (8) : 3583 -3599 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250033

正文

收起

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是广泛分布于海洋环境中的革兰氏阴性细菌^[1]，是花鲈(Lateolabrax japonicus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、许氏平鲉(Sebastes schlegelii)等^[2]重要经济鱼类的病原体，同时对鲸类、小鼠以及人类等哺乳动物也具有致病性^[3]。感染后主要表现为败血性出血症状，包括皮肤溃疡及肝、肾、脾等内脏组织的局灶性坏死^[4]。此外，PDD还会引起人类的机会性感染，可能发展为坏血性筋膜炎^[5]，甚至导致死亡，对海洋食品安全和人类健康构成威胁^[6]。

PDD的致病性与其毒力因子和胞外产物密切相关，毒力因子是病原菌入侵宿主、产生病理损伤和逃避宿主防御的关键因素^[7]。PDD主要有4种不同的毒力因子^[8]：包括具有磷脂酶-d活性的Dly毒素^[9]和成孔毒素PhlyP^[10]，二者均由毒性质粒pPHDD1编码^[11]；还有磷脂酶PlpV^[3]和溶血素PhlyC^[12]。此外，PDD还具有铁离子摄取系统，与PDD的致病能力密切相关^[13]，在细菌致病过程中发挥关键作用。

鞭毛是细菌的重要结构，与细菌的运动和生存密切相关^[14]。研究表明，鞭毛对于细菌的定殖、侵袭和毒力表达也非常重要^[15]。鞭毛由基体、鞭毛钩、鞭毛丝和鞭毛帽四部分组成^[16]，其中鞭毛钩是一个弯曲的结构，连接基体和鞭毛丝，其灵活性允许细菌在运动中快速改变方向^[17]。在某些病原性细菌中，鞭毛的存在和功能与细菌的毒力直接相关。例如，鞭毛有助于细菌逃避宿主的免疫反应，或在感染过程中发挥特定的致病作用^[18]。

flgK基因编码的鞭毛钩蛋白FlgK是细菌鞭毛结构的关键组成部分，与细菌的运动性与致病性密切相关；FlgK蛋白对于维持细菌的运动能力、黏附性以及生物被膜形成等生物学功能具有显著作用^[19]。FlgK蛋白在鞭毛结构中靠近FlgE，对于鞭毛的轴向运动和传递鞭毛钩至鞭毛丝的过程至关重要^[20]。在沙门氏菌和嗜水气单胞菌中，FlgK蛋白的缺失会导致鞭毛组装异常和黏附能力减弱^[21]。在阪崎克罗诺杆菌中，FlgK不仅参与了细菌的运动和细胞入侵，还有助于抵抗环境压力^[22]。在变形假单胞菌中，FlgK的功能更为多样，它不仅调节细菌的运动和黏附，还参与生物被膜的形成，并影响炎症反应和免疫应答。通过RNA干扰技术抑制FlgK的表达后，斑点石斑鱼(Epinephelus coioides)在受到感染后的存活率比野生型提高了55%^[23]。尽管flgK基因在多种细菌中对鞭毛的形成和功能至关重要，并影响细菌的运动、黏附、侵袭和生物被膜形成等与致病性相关的性状^[24]，但其在PDD中的作用尚无明确报道。

本研究采用自杀质粒介导的二次同源重组的方法，将PDD强毒力菌株中编码FlgK蛋白的基因敲除，并对野生株(WT-PDD)和突变株(ΔflgK-PDD)分别进行生物学特性验证，比较二者的表型特征及毒力差异，以期揭示PDD强毒力菌株中flgK基因在毒力调控中的作用机制，进而明确该基因在PDD毒力侵染过程中的关键作用，为理解flgK在PDD的生物学特性和致病机制中的作用提供新的见解，并为开发新的抗菌策略提供潜在靶点。

1 材料与方法

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1.1 菌株和质粒

表1列出了本研究使用的菌株和质粒。实验选取的菌株WT-PDD (ID: PDD-1605)分离自海水网箱养殖患病许氏平鲉的体表溃疡处，现存于中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖病原菌株库内^[25]。PDD菌株在28 ℃下培养过夜，大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1λpir在37 ℃下培养过夜。阳性选择抗生素浓度为氨苄西林(ampicillin, Amp) 100 μg/mL，氯霉素(chloramphenicol, Cm) 30 μg/mL。第二次同源重组筛选蔗糖浓度为200 mg/mL。

1.2 ΔflgK-PDD的构建

使用细胞基因组DNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取WT-PDD基因组DNA。以PDD基因组为模板，使用两对引物flgK-1F (Sac I)/flgK-1R和flgK-2F/flgK-2R (Xba I)进行PCR扩增，以扩增flgK基因的上游和下游区域。使用引物flgK-1F (Sac I)/flgK-2R (Xba I)连接上下游，得到的片段称为UDflgK。将UDflgK和自杀质粒pRE112分别用Sac I和Xba I酶切并纯化后，用T4 DNA连接酶将UDflgK连接到pRE112的Sac I/Xba I位点，构建重组质粒pRE112-UDflgK。然后将测序成功的重组质粒转化到E. coli S17-1λpir中，用引物pRE112-F/R验证重组质粒是否转入大肠杆菌。将正确测序的大肠杆菌与WT-PDD进行接合转移，在其自我分裂增殖的过程中促进第1次同源重组。第1次同源重组获得的菌株在含20%蔗糖的TSB液体培养基中培养，以促进第2次同源重组，用引物in-flgK-F/in-flgK-R进行PCR验证突变。将获得的flgK基因突变株连续传代50次，用引物in-flgK-F/in-flgK-R验证突变株是否具有遗传稳定性。所有用于构建突变株的引物序列见表2。PCR反应体系(20 μL)：2×Rapid Taq Master Mix (P222-01) (南京诺唯赞生物科技股份有限公司) 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 7 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。

1.3 生长曲线测定

将培养过夜的WT-PDD和ΔflgK-PDD菌悬液按1:100的比例稀释接种于96孔板中，每孔200 μL，每株菌设3个平行，含1.5% NaCl的TSB液体培养基为空白对照。使用全自动生长曲线分析仪每隔2 h测定1次OD₆₀₀值，绘制生长曲线。实验重复3次。

1.4 溶血活性和磷脂酶活性测定

在含1.5% NaCl的TSB固体培养基中加入5%脱纤维绵羊血，制备打孔绵羊血平板。每孔加入200 μL菌液，28 ℃正置培养48 h，记录溶血现象。实验重复3次。在含1.5% NaCl的TSB培养基中加入3%卵黄乳液，制备打孔卵黄平板。每孔加入100 μL菌液，28 ℃正置培养48 h，记录磷脂酶活性。实验重复3次。

1.5 生物被膜形成能力实验

将WT-PDD和ΔflgK-PDD菌株在TSB液体培养基中28 ℃、180 r/min培养至OD₆₀₀值为0.5-0.6，然后倍比稀释至10^-2。取200 µL稀释菌液加入无菌96孔板，每株菌设5个平行孔，使用无菌TSB作为阴性对照，其余孔中加入200 µL无菌ddH₂O。密封96孔板后，28 ℃培养48 h。吸去菌液，用PBS清洗，风干后用甲醇固定15 min。晾干后结晶紫染色5 min，ddH₂O清洗3次，干燥后用100 µL 95%乙醇溶解生物被膜，使用酶标仪测定OD₅₉₅值。实验重复3次。

1.6 运动性实验

将WT-PDD和ΔflgK-PDD菌种活化于添加1.5% NaCl的TSB固体培养基上，然后用解剖针分别挑取单菌落接种于0.3%和0.6%琼脂的TSB固体培养基上，28 ℃培养24 h，观察并分析其运动能力。实验重复3次。

1.7 药物敏感性测试

采用K-B纸片扩散法进行WT-PDD和ΔflgK-PDD的抗生素药敏实验。用灭菌镊子夹取药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)贴于涂有菌液的TSB平板上，28 ℃倒置培养14 h，测量抑菌圈直径。实验结果与美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)的标准进行对比。实验重复3次。

1.8 透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察细胞形态

将纯化的WT-PDD和ΔflgK-PDD单菌落分别接种于含1.5% NaCl的TSB固体培养基上，参考文献[26]的方法，将单菌落以1%的比例接种到新的TSB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养至OD₆₀₀值为0.6左右。在载玻片上滴1滴菌液，将铜网放在菌液上吸附2 min，小心吸去多余菌液，用5%磷钨酸负染色液在铜网上染色1 min，吸去多余染料，用ddH₂O洗涤1次，晾干过夜。使用TEM观察WT-PDD和ΔflgK-PDD的细胞形态差异。

1.9 半数致死量(LD₅₀)测定

将WT-PDD和ΔflgK-PDD单菌落接种到TSB液体培养基中，28 °C、180 r/min培养12 h，然后将1%的菌液接种到新的液体培养基中，继续培养12 h。用浊度计调节细菌浓度至10⁸ CFU/mL。用TSB稀释菌液至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL这5个浓度梯度。以100 μL/尾的剂量腹腔注射许氏平鲉，每个浓度梯度注射20尾，对照组注射等量无菌TSB。观察1周并统计死鱼数量，根据寇氏法^[27]计算LD₅₀值，评估ΔflgK-PDD和WT-PDD对许氏平鲉的致病性。本研究严格遵守中国水产科学研究院黄海水产研究所动物实验伦理审查委员会的规定(编号为YSFRI-2024063)。

1.10 flgK 基因突变对毒力基因转录表达的影响(RT-qPCR)

根据通用RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的说明，提取WT-PDD和ΔflgK-PDD的总RNA，然后用逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)合成cDNA。RT-qPCR采用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (南京诺唯赞生物科技股份有限公司)作为荧光染料。PCR反应体系(20 μL)：Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix10 μL，模板(cDNA) 2 μL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.4 μL，RNase free水7.2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以gyrB为管家基因^[28]，检测的基因包括鞭毛相关基因(flgK、flgL、fliK、fliH)、毒力相关基因(dly、hlyA_ch、hlyA_pl、plpV)、II型分泌系统(type II secretion system, T2SS)相关基因(gspC、gspD、gspE、gspF)、铁摄取相关基因(fur)、外膜相关基因(ompP、flhB)、趋化蛋白相关基因(cheW、cheY)和脂多糖相关基因(lapB)。所有引物均根据WT-PDD基因组设计，每个基因的相对表达量采用2^-ΔΔ^C^t法^[29]计算。实验重复3次，引物信息见表3。

1.11 数据分析

采用Excel、Graphpad Prism 9.0分析软件对数据进行统计分析。结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示。直径、吸光度和菌落形成单位计数之间的统计差异采用独立样本t检验，以P<0.05为显著性标准。

2 结果与分析

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2.1 缺失株的构建

以WT-PDD基因组为模板，分别用引物flgK-1F (Sac I)/flgK-1R和flgK-2F/flgK-2R (Xba I)扩增flgK基因的上游和下游同源臂，上游长度为612 bp，下游长度为555 bp (图1A)。以上游和下游PCR产物为模板，使用flgK-1F (Sac I)/flgK-2R (Xba I)引物通过重叠延伸PCR进行扩增，得到大小为1 143 bp的片段(图1B)。将构建的重组质粒导入S17-1λpir后，用pRE112-F/pRE112-R引物进行验证，得到1 487 bp和378 bp的片段，其中378 bp片段为空质粒扩增的条带，重组质粒扩增出1 487 bp条带(图1C)。WT-PDD与含有重组质粒的S17-1λpir进行共培养，培养完成后将混合菌液涂布于含有Cm和Amp的TSB固体培养基上。使用in-flgK-F/in-flgK-R引物验证单菌落。成功接合的菌株获得了1 546 bp和449 bp的双条带，而接合失败的菌株为1 546 bp单条带(图1D)。选择扩增出双条带的单菌落，经过多次蔗糖筛选，并用in-flgK-F/in-flgK-R引物进行验证，直至全部扩增出449 bp缺失条带，对照WT-PDD扩增出1 546 bp条带(图1E)。最后将带有缺失条带的单菌落连续培养50代，然后用in-flgK-F/in-flgK-R引物再次扩增，WT-PDD得到大小为1 546 bp的片段，ΔflgK-PDD得到449 bp条带，表明ΔflgK-PDD可以稳定遗传，具有良好的遗传稳定性(图1F)。

2.2 生长曲线对比

为了研究flgK基因对PDD生长的影响，本研究对WT-PDD和ΔflgK-PDD的生长速率进行了测定。结果显示，ΔflgK-PDD的生长趋势与WT-PDD无显著差异(图2)。

2.3 半数致死量(LD₅₀)测定

用16S-F/16S-R引物对从死鱼中分离得到的细菌进行验证，PCR产物测序后与已知序列比对，确认该细菌为PDD。统计感染后许氏平鲉的死亡数并计算半致死剂量。如图3所示，WT-PDD和ΔflgK-PDD的LD₅₀分别为1.08×10⁵CFU/mL和6.02×10⁵CFU/mL。结果表明，突变菌株的LD₅₀为野生型菌株的557%，毒力显著降低(P<0.05)。

2.4 溶血活性和磷脂酶活性

WT-PDD和ΔflgK-PDD均表现出强β-溶血性和强磷脂酶活性。与WT-PDD相比，ΔflgK-PDD的溶血活性和磷脂酶活性并无显著变化(图4)。结果表明，鞭毛结构基因flgK的缺失对PDD的溶血活性和磷脂酶活性无显著影响。

2.5 运动性对比

通过测量不同琼脂浓度培养基上的菌落直径，发现WT-PDD的集群能力为(14.22±0.77) mm，ΔflgK-PDD为(10.61±0.33) mm；WT-PDD和ΔflgK-PDD的游动距离分别为(13.41±0.24) mm和(8.37±0.23) mm。统计分析显示，ΔflgK-PDD的运动能力较WT-PDD分别降低了25.4%和37.6% (P<0.05，图5)。

2.6 生物被膜形成能力

采用微孔板结晶紫染色法，结合在595 nm的吸光度测定，分析WT-PDD和ΔflgK-PDD的生物被膜形成能力。如图6所示，WT-PDD和ΔflgK-PDD的OD₅₉₅值分别为1.51±0.13和1.17±0.04。与WT-PDD相比，ΔflgK-PDD的生物被膜形成能力显著降低了23%。

2.7 药物敏感性对比

WT-PDD及ΔflgK-PDD对38种抗生素药物敏感性结果如表4所示。2种菌株对氯霉素、氟苯尼考等29种抗生素均表现出高度或中度敏感，而对其余9种抗生素表现出耐药性。flgK基因的缺失并未导致菌株对所检测抗生素的敏感性发生改变，这也间接证实该基因并非介导PDD耐药性的主要基因。

2.8 PDD缺失 flgK 时鞭毛形态学观察

TEM结果显示(图7)，WT-PDD染色后菌体具有一条完整的鞭毛结构(黑色箭头所示)，而ΔflgK-PDD染色后未观察到鞭毛结构的存在，表明flgK基因的缺失影响了PDD鞭毛结构的正常形成。

2.9 flgK 基因突变对毒力基因转录表达的影响

本研究通过RT-qPCR检测了PDD的毒力基因、T2SS相关基因和鞭毛相关基因在WT-PDD和ΔflgK-PDD中的相对表达量。如图8所示，在ΔflgK-PDD中，T2SS相关基因gspC、gspD，鞭毛相关基因flgL、fliK，趋化蛋白基因cheW，毒力基因hlyA_pl表达量显著下调；而T2SS相关基因gspE，外膜相关基因flhB、ompP，鞭毛相关基因fliH和脂多糖蛋白相关基因lapB表达量显著上调。本研究中选取的其余基因表达量基本无明显变化。

3 讨论

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鞭毛(flagellum)普遍存在于革兰氏阴性菌中，主要由蛋白质亚单位组成，具有高度的组织结构和功能多样性，是细菌用于运动的复杂细胞器^[30]。flgK基因编码的鞭毛钩蛋白(FlgK)位于鞭毛钩和鞭毛丝的连接处，对正常的鞭毛形成至关重要^[20]。鞭毛钩蛋白是鞭毛结构中的关键组成部分，它连接于鞭毛丝和基体，可改变鞭毛旋转的角度，在细菌运动过程中发挥着重要的作用^[31]。然而，目前关于flgK基因在PDD致病过程中具体机制尚不清楚，其对PDD的生物被膜形成能力、药物敏感性和毒力影响的分子机制也未见报道。因此，本研究采用自杀质粒介导的同源重组方法对PDD的鞭毛钩蛋白基因flgK进行突变，成功建立了一个遗传稳定的ΔflgK-PDD突变株，为探索flgK在PDD中的功能提供了理想的材料。

鞭毛可促进细菌在宿主体内的成功定殖和存活，并对宿主产生毒力作用^[32]。在对许氏平鲉的感染实验中发现，ΔflgK-PDD的LD₅₀为WT-PDD的557%，说明flgK基因的缺失导致PDD致病力降低。为了探究致病力下降的原因，本研究对ΔflgK-PDD和WT-PDD进行了多方面的测定。生长能力检测的结果显示，ΔflgK-PDD和WT-PDD的生长能力并无显著性差异，说明flgK并非PDD的关键代谢基因，这也为后续实验排除了因生长能力差异而造成致病力结果偏差的可能性。

细菌病原体可通过分泌具有生物活性的胞外产物促进其在宿主体内的成功定殖和存活，并对宿主产生毒力作用。已有研究表明，细菌性病原体的致病力与对宿主红细胞的溶血性紧密相关^[5,33-34]。PDD在生长过程中可释放溶血素溶解红细胞，同时释放磷脂酶溶解卵黄磷脂，二者可引起宿主组织的破坏和出血，协助病原菌感染宿主并引发多种病变，在PDD的发病机制中起到了至关重要的作用^[35]。因此，体外分析PDD的磷脂酶活性和溶血性是研究其毒力与鞭毛相关性的重要手段。本研究结果表明，flgK基因的缺失对PDD的溶血活性和磷脂酶活性未造成影响。与WT-PDD相比，ΔflgK-PDD的溶血活性和磷脂酶活性无显著变化。初步推测，flgK基因的缺失并不影响PDD中溶血素和磷脂酶的表达。

细菌的涌动性和运动性是指移动细菌从接种部位向培养基表面周围区域的大量移动，这种移动依赖于鞭毛和菌毛^[36]。它可以为细菌提供生态优势，使其能够快速迁移到营养丰富的环境中，并在宿主组织中吸附和定殖。运动性被认为是某些细菌的重要毒力因素，它允许病原体从最初的感染部位迅速传播到不同的组织，从而导致危及生命的感染^[37]。运动性是一种复杂的适应性行为，它与细菌的结构、基因表达水平、代谢水平等诸多方面密切相关。在运动能力测定中，发现flgK基因的突变导致PDD的运动能力显著降低，推测运动能力的下降可能与flgK基因缺失有关。TEM的结果证实了这一猜想，ΔflgK-PDD菌株中未见鞭毛结构，说明flgK缺失导致PDD无法形成完整的鞭毛结构，这与之前的研究结果一致^[21]。

细菌生物被膜是一类细菌在固体界面上定居并生长形成的复杂结构，是细菌在自然环境中常见的生存形式^[38]。生物被膜赋予细菌对外界环境的抵抗力，包括对抗生素的耐受性^[39]、对宿主免疫系统吞噬作用的抗性^[40]，以及强大的黏附能力^[19]，这些特性使得细菌生物被膜成为导致持续感染和慢性疾病的关键因素^[41]。在本研究中，对WT-PDD和ΔflgK-PDD的生物被膜形成能力和耐药性差异进行了分析，结果显示ΔflgK-PDD的生物被膜形成能力显著下降，这与之前的研究结果^[42]一致。相关研究表明，生物被膜可以影响细菌的耐药性，例如在铜绿假单胞菌中，flgL基因的缺失导致生物被膜形成能力和耐药性增强^[43]。然而，在本研究中ΔflgK-PDD与WT-PDD的耐药性无明显差异，这种差异可能与细菌种类有关。

为了进一步探讨flgK基因突变对PDD毒力和生物学特性影响的分子机制，本研究选择了PDD的部分毒力基因、T2SS相关基因、鞭毛相关基因和外膜蛋白相关基因，分析了flgK基因缺失对这些基因表达水平的影响。已有研究表明，T2SS参与植物病原菌鞭毛的分泌^[44]。在本研究中，ΔflgK-PDD中T2SS相关蛋白基因表达出现了不同程度的上调和下调，表明T2SS相关基因的表达与鞭毛基因存在相互作用，flgK基因的缺失对T2SS基因的表达具有调控作用。FlhB是膜蛋白的一部分，在革兰氏阴性菌中负责转运底物的识别，并参与特定底物的转运^[45]。FliK是鞭毛钩长度调节蛋白，通过其N端和C端结构域与膜蛋白FlhB协作，精确控制钩的长度^[46]。FliH是鞭毛组装蛋白^[47]，FlgL是鞭毛钩相关蛋白，FlgK和FlgL两种蛋白确保了鞭毛中钩和丝之间的平滑连接，与PDD鞭毛的正常形成密切相关^[20]。CheW和CheY是信号转导途径中的单域蛋白，在细菌趋化过程中将信息从跨膜受体传递到鞭毛马达。已有许多研究表明，趋化性可促进细菌生物被膜的形成^[48]。在本研究中，ΔflgK-PDD中cheY和cheW的相对表达水平下调，生物被膜形成能力也显著下降，与之前的研究结果一致^[49]。磷脂酶-D (Dly)由dly基因编码，是一种外毒素，与hlyA_pl编码的具有溶血活性的成孔毒素phobalysin P (PhlyP)在对宿主细胞损伤过程中起协同作用^[35]。plpV基因调控的磷脂酶PlpV与由hlyA_ch基因编码的溶血素PhlyC同样作为毒力因子影响PDD对宿主的致病力。PDD具有由fur基因编码的铁载体调控因子，当PDD处于铁源充足的环境中时，其对宿主的致病力增强^[50-52]。本研究表明，在ΔflgK-PDD中，生物学特性的改变和致病性的显著降低可能与鞭毛相关基因、毒力相关基因和T2SS相关基因相对表达水平的变化有关。结合实验结果，推测flgK基因的缺失导致PDD无法形成完整的鞭毛结构，降低了PDD的运动和侵染能力，进而使PDD的致病性下降。初步推断，ΔflgK-PDD毒力的下降是鞭毛结构缺失以及部分毒力基因表达下调共同作用的结果，但其背后的具体信号通路仍有待进一步研究。

4 结论

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本研究成功构建了一株可稳定遗传的PDD flgK基因缺失菌株ΔflgK-PDD，并比较了WT-PDD和ΔflgK-PDD在生物学特性、致病力和基因表达水平上的差异。结果显示，ΔflgK-PDD的生长能力、溶血活性、磷脂酶活性和药物敏感性与WT-PDD无显著差异。然而，与WT-PDD相比，ΔflgK-PDD无法形成鞭毛结构，其运动能力、生物被膜形成能力和致病力均显著下降，且ΔflgK-PDD的T2SS相关基因以及部分毒力基因表达水平均出现了不同程度的下调。因此，可以得出结论，ΔflgK-PDD致病力的降低与鞭毛结构缺失导致的运动能力减弱有关，并且鞭毛基因和部分毒力基因表达水平的下调进一步导致了ΔflgK-PDD致病力的降低。这些结果为探究flgK基因在PDD致病机制中的重要作用提供了理论依据。

基金

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国家重点研发计划(2023YFD2400704)
山东省自然科学基金(ZR2021MC027)
中国水产科学研究院基本科研业务费(2023TD29)

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2025年第65卷第8期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250033

接收时间：2025-01-14
首发时间：2026-02-06
出版时间：2025-08-04

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收稿日期：2025-01-14
录用日期：2025-03-14

基金

National Key Research and Development Program of China(2023YFD2400704)

国家重点研发计划(2023YFD2400704)

Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2021MC027)

山东省自然科学基金(ZR2021MC027)

Fundamental Research Funds of the Chinese Academy of Fishery Sciences(2023TD29)

中国水产科学研究院基本科研业务费(2023TD29)

作者信息

^1.天津农学院水产学院，天津

^2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东青岛

^3.青岛海洋科技中心，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250033

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Strains and plasmids	Characteristic	Source
Photobacterium damselae subsp. damselae	Wild-type strain, Amp^r	Lab stock
ΔflgK-PDD	flgK deletion mutant of Photobacterium damselae subsp. damselae, Amp^r	This study
Escherichia coli S17-1λpir	RP4-2 (Km::Tn7, Tc::Mu-1), pro-82, LAMpir, recA1, endA1, thiE1, hsdR17, creC510	Lab stock
pRE112	Suicide plasmid, sacB, Cm^r	Southwest University, Prf. R. H. Wu donated
pRE112-UDflgK	pRE112 carrying the recombinant fragment UDflgK	This study

Strains and plasmids

Characteristic

Source

Photobacterium damselae subsp. damselae

Wild-type strain, Amp^r

Lab stock

ΔflgK-PDD

flgK deletion mutant of Photobacterium damselae subsp. damselae, Amp^r

This study

Escherichia coli S17-1λpir

RP4-2 (Km::Tn7, Tc::Mu-1), pro-82, LAMpir, recA1, endA1, thiE1, hsdR17, creC510

Lab stock

pRE112

Suicide plasmid, sacB, Cm^r

Southwest University, Prf. R. H. Wu donated

pRE112-UDflgK

pRE112 carrying the recombinant fragment UDflgK

This study

Primer name	Sequence (5′→3′)	Product length (bp)	Target DNA
flgK-1F (Sac I)	CGTCTAGACCGATGTATCAACACGCTT	612	Up stream flgK
flgK-1R	AACCGCTCAGAGTGACCGAACTTGGTTACGACA
flgK-2F	AACCAAGTTCGGTCACTCTGAGCGGTTTGTTTC	555	Down stream flgK
flgK-2R (Xba I)	GCGAGCTCTGGCTATTAGCACCTGTTTT
pRE112-F	CGGGTTGAGAAGCGGTGTA	1 487 (pRE112-UDflgK)/378 (pRE112)	Target gene cloned to pRE112
pRE112-R	CAGCCAATCCCTGGGTGAG
in-flgK-F	AGCCACCGACATAATACGA	1 546 (WT-PDD)/449 (ΔflgK-PDD)	Internal region of flgK gene for identification
in-flgK-R	AGAACAAGCGAAACAAACC
27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	1 516	16S rDNA
1492R	TACGGCTACCTTGTTACGACTT

Primer name

Sequence (5′→3′)

Product length (bp)

Target DNA

flgK-1F (Sac I)

CGTCTAGACCGATGTATCAACACGCTT

612

Up stream flgK

flgK-1R

AACCGCTCAGAGTGACCGAACTTGGTTACGACA

flgK-2F

AACCAAGTTCGGTCACTCTGAGCGGTTTGTTTC

555

Down stream flgK

flgK-2R (Xba I)

GCGAGCTCTGGCTATTAGCACCTGTTTT

pRE112-F

CGGGTTGAGAAGCGGTGTA

1 487 (pRE112-UDflgK)/378 (pRE112)

Target gene cloned to pRE112

pRE112-R

CAGCCAATCCCTGGGTGAG

in-flgK-F

AGCCACCGACATAATACGA

1 546 (WT-PDD)/449 (ΔflgK-PDD)

Internal region of flgK gene for identification

in-flgK-R

AGAACAAGCGAAACAAACC

27F

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1 516

16S rDNA

1492R

TACGGCTACCTTGTTACGACTT

Genes	ID	Sequences (5′→3′)	Product length (bp)
gyrB	NZ_CP073684.1	F:	GTGATACTGATCGTACAGGT	246
R:	CTTTCTGGTGAATTGGTGTT
gspC	NZ_CP073684.1	F:	ACTGAGTAGTTACAGGAGCCG	160
R:	AATGAAGCGATTAAAGGGA
gspD	NZ_CP073684.1	F:	CAGAAATGCCAGTTAGGGT	236
R:	TGAATCGTTAAATAAGAGTGC
gspE	NZ_CP073684.1	F:	CCAGAATAATGCCGTGAGG	169
R:	GCAGTGGATGTGCGTGTAT
gspF	NZ_CP073684.1	F:	ACTTCACCCCAAAGACCAC	215
R:	AGCGATGATTTATCCAACC
dly	NZ_CP073687.1	F:	ATGCGACAGCACAAGAACC	236
R:	GACCGCTCGTCCAAATAAG
plpV	NZ_CP073684.1	F:	AACGCTGCTGATATTACCTA	195
R:	GCCTAAGAACCAAGAGTTTG
hlyA_pl	NZ_CP073687.1	F:	AAAACTCGCATAACTAAGAGG	248
R:	GTAAAGATGGACCGAAAGC
hlyA_ch	NZ_CP073684.1	F:	GATAACCTTCCGACCATACA	186
R:	CGAGTCTTCAGGCTAATGC
fur	NZ_CP073684.1	F:	CACATTAGTGCGGAAGACC	197
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cheW	NZ_CP073684.1	F:	AGAGGCTAAATGGGTTGAC	139
R:	TCCTGATTCTAAGGGGTCTA
cheY	NZ_CP073684.1	F:	GTCGGTAATAACAAAGTCAAA	111
R:	GTGAAGAACTTACTGCGTGA
ompP	NZ_CP073684.1	F:	CACTGGTAACTTTGGTGGTC	174
R:	GGTGTAGTACCTTGCTGATTT
lapB	NZ_CP073684. 1	F:	ATGATTGAGTTAGGTGCCC	139
R:	TTGCCTGCTTGTATTCTTG
flhB	NZ_CP073684.1	F:	TCAGGCTTACCTTCTGTCTC	123
R:	CTGCTCGTTATTAGTGGTTG
flgK	NZ_CP073684. 1	F:	GAAAAGCCATCGACAGAG	194
R:	ATTAAGCCATTAGGCAGTAA
flgL	NZ_CP073684.1	F:	TAAGGGTAAGTTCAAAGTCAAG	297
R:	CAGGTAGTACGGCAGGAG
fliK	NZ_CP073684.1	F:	ACTCGGTCAGAAGAGGTCG	184
R:	GAATGCAGTTGGCTCAAAG
fliH	NZ_CP073684.1	F:	AACAGCAATAGGCGTAGCG	246
R:	CCATTAACAGCGGCAGATC

Genes

Sequences (5′→3′)

Product length (bp)

gyrB

NZ_CP073684.1

GTGATACTGATCGTACAGGT

246

CTTTCTGGTGAATTGGTGTT

gspC

NZ_CP073684.1

ACTGAGTAGTTACAGGAGCCG

160

AATGAAGCGATTAAAGGGA

gspD

NZ_CP073684.1

CAGAAATGCCAGTTAGGGT

236

TGAATCGTTAAATAAGAGTGC

gspE

NZ_CP073684.1

CCAGAATAATGCCGTGAGG

169

GCAGTGGATGTGCGTGTAT

gspF

NZ_CP073684.1

ACTTCACCCCAAAGACCAC

215

AGCGATGATTTATCCAACC

dly

NZ_CP073687.1

ATGCGACAGCACAAGAACC

236

GACCGCTCGTCCAAATAAG

plpV

NZ_CP073684.1

AACGCTGCTGATATTACCTA

195

GCCTAAGAACCAAGAGTTTG

hlyA_pl

NZ_CP073687.1

AAAACTCGCATAACTAAGAGG

248

GTAAAGATGGACCGAAAGC

hlyA_ch

NZ_CP073684.1

GATAACCTTCCGACCATACA

186

CGAGTCTTCAGGCTAATGC

fur

NZ_CP073684.1

CACATTAGTGCGGAAGACC

197

TTGCCACAATCTAAACAAACA

cheW

NZ_CP073684.1

AGAGGCTAAATGGGTTGAC

139

TCCTGATTCTAAGGGGTCTA

cheY

NZ_CP073684.1

GTCGGTAATAACAAAGTCAAA

111

GTGAAGAACTTACTGCGTGA

ompP

NZ_CP073684.1

CACTGGTAACTTTGGTGGTC

174

GGTGTAGTACCTTGCTGATTT

lapB

NZ_CP073684. 1

ATGATTGAGTTAGGTGCCC

139

TTGCCTGCTTGTATTCTTG

flhB

NZ_CP073684.1

TCAGGCTTACCTTCTGTCTC

123

CTGCTCGTTATTAGTGGTTG

flgK

NZ_CP073684. 1

GAAAAGCCATCGACAGAG

194

ATTAAGCCATTAGGCAGTAA

flgL

NZ_CP073684.1

TAAGGGTAAGTTCAAAGTCAAG

297

CAGGTAGTACGGCAGGAG

fliK

NZ_CP073684.1

ACTCGGTCAGAAGAGGTCG

184

GAATGCAGTTGGCTCAAAG

fliH

NZ_CP073684.1

AACAGCAATAGGCGTAGCG

246

CCATTAACAGCGGCAGATC

Antibiotic	Content (µg/disc)	Judgement	Antibacterial circle diameter (mm)	Result
Penicillin	10	≤11	≥15	0±0	0±0	R	R
Oxacillin	1	≤14	≥20	0±0	0±0	R	R
Ampicillin	10	≤13	≥17	0±0	0±0	R	R
Cephalexin	30	≤14	≥18	15.12±0.25	16.49±0.21	I	I
Cefazolin	30	≤14	≥18	18.75±0.26	20.39±0.19	S	S
Cefradine	30	≤14	≥18	18.94±0.26	19.77±0.19	S	S
Ceftazidime	30	≤17	≥21	23.26±0.28	24.19±0.18	S	S
Ceftriaxone	30	≤19	≥23	31.80±0.33	36.08±0.14	S	S
Cefotaxime/Clavulanic acid	30/10	≤22	≥26	33.21±0.33	36.49±0.14	S	S
Cefazoloxime	30	≤21	≥25	32.81±0.33	37.51±0.14	S	S
Cefoperazone/Sulbactam	75/75	≤15	≥21	32.61±0.33	35.36±0.15	S	S
Amikacin	30	≤13	≥18	12.72±0.24	12.49±0.23	R	R
Gentamicin	10	≤12	≥15	13.01±0.24	14.75±0.22	I	I
Kanamycin	30	≤13	≥18	13.51±0.24	14.14±0.22	I	I
Streptomycin	10	≤11	≥15	10.20±0.23	10.16±0.23	R	R
Neomycin	30	≤17	≥23	14.12±0.24	13.32±0.22	R	R
Tetracycline	39	≤11	≥15	25.47±0.29	26.85±0.17	S	S
Doxycycline (D×doxycycline)	30	≤10	≥14	22.87±0.28	24.29±0.18	S	S
Minocycline	30	≤12	≥16	28.8±0.31	26.75±0.18	S	S
Erythromycin	15	≤13	≥23	10.00±0.23	11.57±0.23	R	R
Acetylspiramycin	30	≤13	≥18	8.49±0.22	9.62±0.24	R	R
Clarithromycin	15	≤13	≥18	7.99±0.22	10.34±0.24	R	R
Azithromycin	15	≤13	≥18	14.83±0.24	15.67±0.21	I	I
Nalidixic acid	30	≤13	≥19	37.13±0.35	37.51±0.14	S	S
Piperic acid	30	≤22	≥28	29.29±0.31	31.16±0.16	S	S
Norfloxacin	10	≤12	≥17	27.48±0.30	34.03±0.15	S	S
Ofloxacin	5	≤12	≥16	35.82±0.35	38.95±0.14	S	S
Ciprofloxacin	5	≤15	≥21	36.53±0.35	40.49±0.14	S	S
Nomefloxacin	10	≤18	≥22	33.41±0.33	35.36±0.15	S	S
Flurofloxacin	5	≤15	≥19	32.31±0.33	37.01±0.14	S	S
Polymyxin B	300 IU	≤11	≥12	13.01±0.24	17.52±0.21	S	S
Neomycin	30	≤17	≥22	25.27±0.29	33.01±0.15	S	S
Sulfafurazole	300	≤10	≥16	28.09±0.30	29.11±0.16	S	S
Furazolidone	30	≤14	≥17	24.47±0.28	24.09±0.18	S	S
Rifampicin	5	≤16	≥20	26.48±0.29	27.77±0.17	S	S
Chloramphenicol	30	≤12	≥18	35.42±0.34	35.77±0.15	S	S
Enrofloxacin	10	≤15	≥19	31.91±0.33	37.72±0.14	S	S
Florfenicol	30	≤12	≥18	30.20±0.32	33.62±0.15	S	S

Antibiotic

Content (µg/disc)

Judgement

Antibacterial circle diameter (mm)

Result

WT-PDD

ΔflgK-PDD

WT-PDD

ΔflgK-PDD

Penicillin

≤11

≥15

0±0

Oxacillin

≤14

≥20

0±0

Ampicillin

≤13

≥17

0±0

Cephalexin

≤14

≥18

15.12±0.25

16.49±0.21

Cefazolin

≤14

≥18

18.75±0.26

20.39±0.19

Cefradine

≤14

≥18

18.94±0.26

19.77±0.19

Ceftazidime

≤17

≥21

23.26±0.28

24.19±0.18

Ceftriaxone

≤19

≥23

31.80±0.33

36.08±0.14

Cefotaxime/Clavulanic acid

30/10

≤22

≥26

33.21±0.33

36.49±0.14

Cefazoloxime

≤21

≥25

32.81±0.33

37.51±0.14

Cefoperazone/Sulbactam

75/75

≤15

≥21

32.61±0.33

35.36±0.15

Amikacin

≤13

≥18

12.72±0.24

12.49±0.23

Gentamicin

≤12

≥15

13.01±0.24

14.75±0.22

Kanamycin

≤13

≥18

13.51±0.24

14.14±0.22

Streptomycin

≤11

≥15

10.20±0.23

10.16±0.23

Neomycin

≤17

≥23

14.12±0.24

13.32±0.22

Tetracycline

≤11

≥15

25.47±0.29

26.85±0.17

Doxycycline (D×doxycycline)

≤10

≥14

22.87±0.28

24.29±0.18

Minocycline

≤12

≥16

28.8±0.31

26.75±0.18

Erythromycin

≤13

≥23

10.00±0.23

11.57±0.23

Acetylspiramycin

≤13

≥18

8.49±0.22

9.62±0.24

Clarithromycin

≤13

≥18

7.99±0.22

10.34±0.24

Azithromycin

≤13

≥18

14.83±0.24

15.67±0.21

Nalidixic acid

≤13

≥19

37.13±0.35

37.51±0.14

Piperic acid

≤22

≥28

29.29±0.31

31.16±0.16

Norfloxacin

≤12

≥17

27.48±0.30

34.03±0.15

Ofloxacin

≤12

≥16

35.82±0.35

38.95±0.14

Ciprofloxacin

≤15

≥21

36.53±0.35

40.49±0.14

Nomefloxacin

≤18

≥22

33.41±0.33

35.36±0.15

Flurofloxacin

≤15

≥19

32.31±0.33

37.01±0.14

Polymyxin B

300 IU

≤11

≥12

13.01±0.24

17.52±0.21

Neomycin

≤17

≥22

25.27±0.29

33.01±0.15

Sulfafurazole

300

≤10

≥16

28.09±0.30

29.11±0.16

Furazolidone

≤14

≥17

24.47±0.28

24.09±0.18

Rifampicin

≤16

≥20

26.48±0.29

27.77±0.17

Chloramphenicol

≤12

≥18

35.42±0.34

35.77±0.15

Enrofloxacin

≤15

≥19

31.91±0.33

37.72±0.14

Florfenicol

≤12

≥18

30.20±0.32

33.62±0.15