微生物学报

抗生素Antibiotic	抑菌圈Inhibition zone (mm)	耐药性折点Antibiotic resistance	药物敏感性Drug susceptibility
广谱青霉素Broad-spectrum penicillin
哌拉西林Piperacillin	0	18	0	0	≤17	R	S	R	R
磺胺类Sulphonamide antibiotics
磺胺异恶唑Sulfamethoxazole	27	25	0	0	≤12	S	S	R	R
多黏菌素类Polymyxin antibiotics
多黏菌素B Polymyxin B	18	17	17	18	≤14	S	S	S	S
碳青霉烯类 Carbapenem antibiotics
亚胺培南Imipenem	18	38	17	18	≤18	R	S	R	R
美罗培南Meropenem	11	29	12	11	≤14	R	S	R	R
四环素类Tetracycline antibiotics
四环素Tetracycline	26	26	0	0	≤11	S	S	R	R
多西环素Doxycycline	31	33	10	10	≤12	S	S	R	R
米诺环素Minocycline	34	38	23	29	≤12	S	S	S	S
氟喹诺酮Fluoroquinolone antibiotics
环丙沙星Ciprofloxacin	34	32	0	0	≤15	S	S	R	R
左氧氟沙星Levofloxacin	32	34	11	11	≤13	S	S	R	R
加替沙星Gatifloxacin	38	38	20	20	≤14	S	S	S	S
青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物Penicillin/β-lactamase inhibitor complexes
哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam	15	26	11	8	≤17	R	S	R	R
氨苄西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam	25	29	17	18	≤11	S	S	S	S
替卡西林/棒酸 Ticarcillin/Clavulanic acid	0	26	0	0	≤14	R	S	R	R
氨基糖苷类Aminoglycoside antibiotics
阿米卡星Amikacin	17	18	22	23	≤14	S	S	S	S
奈替米星Netilmicin	25	23	18	19	≤12	S	S	S	S
庆大霉素Gentamicin	21	20	11	12	≤12	S	S	R	R
妥布霉素Tobramycin	23	23	25	28	≤12	S	S	S	S
头孢菌素类 Cephalosporin antibiotics
头孢吡肟Cefepime	14	24	0	10	≤14	R	S	R	R
头孢噻肟Cefotaxime	21	18	0	0	≤14	S	S	R	R
头孢曲松Ceftriaxone	16	16	0	0	≤13	S	S	R	R
头孢他啶Ceftazidime	18	17	0	0	≤14	S	S	R	R

抗生素Antibiotic	抑菌圈Inhibition zone (mm)	耐药性折点Antibiotic resistance	药物敏感性Drug susceptibility
广谱青霉素Broad-spectrum penicillin
哌拉西林Piperacillin	0	18	0	0	≤17	R	S	R	R
磺胺类Sulphonamide antibiotics
磺胺异恶唑Sulfamethoxazole	27	25	0	0	≤12	S	S	R	R
多黏菌素类Polymyxin antibiotics
多黏菌素B Polymyxin B	18	17	17	18	≤14	S	S	S	S
碳青霉烯类 Carbapenem antibiotics
亚胺培南Imipenem	18	38	17	18	≤18	R	S	R	R
美罗培南Meropenem	11	29	12	11	≤14	R	S	R	R
四环素类Tetracycline antibiotics
四环素Tetracycline	26	26	0	0	≤11	S	S	R	R
多西环素Doxycycline	31	33	10	10	≤12	S	S	R	R
米诺环素Minocycline	34	38	23	29	≤12	S	S	S	S
氟喹诺酮Fluoroquinolone antibiotics
环丙沙星Ciprofloxacin	34	32	0	0	≤15	S	S	R	R
左氧氟沙星Levofloxacin	32	34	11	11	≤13	S	S	R	R
加替沙星Gatifloxacin	38	38	20	20	≤14	S	S	S	S
青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物Penicillin/β-lactamase inhibitor complexes
哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam	15	26	11	8	≤17	R	S	R	R
氨苄西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam	25	29	17	18	≤11	S	S	S	S
替卡西林/棒酸 Ticarcillin/Clavulanic acid	0	26	0	0	≤14	R	S	R	R
氨基糖苷类Aminoglycoside antibiotics
阿米卡星Amikacin	17	18	22	23	≤14	S	S	S	S
奈替米星Netilmicin	25	23	18	19	≤12	S	S	S	S
庆大霉素Gentamicin	21	20	11	12	≤12	S	S	R	R
妥布霉素Tobramycin	23	23	25	28	≤12	S	S	S	S
头孢菌素类 Cephalosporin antibiotics
头孢吡肟Cefepime	14	24	0	10	≤14	R	S	R	R
头孢噻肟Cefotaxime	21	18	0	0	≤14	S	S	R	R
头孢曲松Ceftriaxone	16	16	0	0	≤13	S	S	R	R
头孢他啶Ceftazidime	18	17	0	0	≤14	S	S	R	R

CRISPR-Cas1对鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的抑制作用

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张鹏宇 ¹ , 李金月 ² , 郭停停 ¹^,³ , 包广宇 ⁴ , 胡健 ⁵ , 李国才 ¹^,³^,⁴^,^*

微生物学报 | 研究报告 2025,65(2): 671-682

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(2): 671-682

CRISPR-Cas1对鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的抑制作用

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张鹏宇¹, 李金月², 郭停停¹^,³, 包广宇⁴, 胡健⁵, 李国才¹^,³^,⁴^,^*

作者信息

1 扬州大学医学院，江苏扬州

2 河南省疾病预防控制中心，河南郑州

3 核酸与细胞命运调控省高校重点实验室(扬州大学)，江苏扬州

4 扬州大学附属医院，江苏扬州

5 宜兴市中医医院，江苏无锡

CRISPR-Cas1 attenuates antibiotic resistance and virulence of Acinetobacter baumannii

Pengyu ZHANG¹, Jinyue LI², Tingting GUO¹^,³, Guangyu BAO⁴, Jian HU⁵, Guocai LI¹^,³^,⁴^,^*

Affiliations

1 School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China

2 Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou, Henan, China

3 The Key Laboratory of the Jiangsu Higher Education Institutions for Nucleic Acid & Cell Fate Regulation (Yangzhou University), Yangzhou, Jiangsu, China

4 Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China

5 Yixing Traditional Chinese Medicine Hospital, Wuxi, Jiangsu, China

出版时间: 2025-02-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240579

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摘要

收起

鲍曼不动杆菌的耐药性和毒力与日俱增。研究表明，鲍曼不动杆菌中CRISPR-Cas系统的存在可以降低细菌的耐药性并减弱细菌毒力。然而，CRISPR-Cas系统中各组分对鲍曼不动杆菌的具体影响尚不明晰。 【目的】 探究CRISPR-Cas系统的组分在鲍曼不动杆菌中对细菌耐药性和毒力的调控作用。 【方法】 通过构建cas1基因鲍曼不动杆菌过表达株，并与之对应检测相应过表达株与原始菌株的细菌生长情况、血清抗性、细菌耐药性、生物膜形成能力、细菌感染小鼠模型小鼠的存活率等变化。 【结果】 使用纸片扩散法对临床常用的22种抗生素的耐药性进行检测，结果显示，过表达株AB26::cas1对6种抗生素的耐药性由耐药变为敏感。使用结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力，AB26::cas1株生物膜形成能力较AB26株降低。腹腔注射感染小鼠模型显示，相较于AB26株体内感染组小鼠，AB26::cas1株体内感染组小鼠未发生死亡。荧光定量PCR检测结果显示，大部分耐药/毒力基因mRNA的表达量下降。人血清与灭活血清孵育后进行存活性检测，野生株与过表达株的血清抗性差异无统计学意义。 【结论】 来源于AB43株的cas1基因对鲍曼不动杆菌的耐药性及生物膜形成能力具有抑制作用，同时细菌对小鼠的致病性也有抑制效果。

关键词

鲍曼不动杆菌 / CRISPR相关蛋白1 / 耐药性 / 毒力

Abstract

收起

The antibiotic resistance and virulence of Acinetobacter baumannii are increasingly serious. Studies have shown that the CRISPR-Cas system in A. baumannii attenuates the antibiotic resistance and virulence, while the effects of CRISPR-Cas system components on A. baumannii remain unclear. [Objective] Investigation of the role of components of the CRISPR-Cas system in the modulation of bacterial drug resistance and virulence in A. baumannii. [Methods] The impact of cas1 overexpression on bacterial growth, serum resistance, bacterial drug resistance, biofilm formation ability, and survival rate of mice in a mouse model of bacterial infection was investigated by constructing cas1 overexpression strains and corresponding with them to detect the aforementioned changes. [Results] The resistance of the bacterial strain AB26::cas1 to 22 commonly used antibiotics was determined using the paper diffusion method. Of these antibiotics, six were found to have an effect on the strain, causing it to change from resistant to sensitive. The capacity of the bacterial strain AB26::cas1 to form biofilms was evaluated through the use of crystal violet staining, which revealed a reduction in biofilm formation ability when compared to the AB26 strain. The intraperitoneal injection of the infected mice model demonstrated that no mortality occurred in the AB26::cas1 strain in vivo infected group in comparison to the AB26 strain in vivo infected group. The fluorescence quantitative PCR assay demonstrated a reduction in mRNA expression of the majority of resistance and toxicity genes. The survival assay, which involved incubating normal human serum with inactivated serum, revealed no statistically significant difference in serum resistance between the wild strains and the overexpression strains. [Conclusion] The cas1 gene, derived from strain AB43, was observed to exert an inhibitory effect on the drug resistance and biofilm-forming ability of A. baumannii, as well as the pathogenicity of the bacteria in mice.

Key words

Acinetobacter baumannii / CRISPR-Cas1 / antibiotic resistance / virulence

引用本文

张鹏宇, 李金月, 郭停停, 包广宇, 胡健, 李国才. CRISPR-Cas1对鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的抑制作用. 微生物学报, 2025 , 65 (2) : 671 -682 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240579

Pengyu ZHANG, Jinyue LI, Tingting GUO, Guangyu BAO, Jian HU, Guocai LI. CRISPR-Cas1 attenuates antibiotic resistance and virulence of Acinetobacter baumannii[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (2) : 671 -682 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240579

正文

收起

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, AB)，也称鲍氏不动杆菌，是一种革兰阴性、非发酵型细菌，常引发医院获得性肺炎、泌尿系统感染乃至菌血症等严重疾病，尤其易感染重症监护病房(intensive care unit, ICU)内免疫力低下的危重病人，导致严重后果^[1-2]。近年来，鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药率逐年攀升，多重耐药乃至泛耐药鲍曼不动杆菌已成为全球性的公共卫生挑战，也被视为我国最重要的 “超级细菌” 之一^[3-4]。我们前期的研究揭示，鲍曼不动杆菌耐药性的提高伴随着其毒力的增强^[5]，但这一过程可显著受到其CRISPR-Cas系统的抑制^[6-7]。

CRISPR-Cas系统是细菌的一种获得性免疫系统，广泛存在于40%的真细菌和90%的古细菌中^[8-9]。该系统由成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR)簇(21-50 bp的重复序列R与17-84 bp的间隔序列S交替排列而成)、前导序列(leader, L)及一系列CRISPR相关基因 (CRISPR-associated gene, Cas gene)家族等3部分组成^[10-11]。CRISPR-Cas系统的经典功能是抵御质粒、噬菌体等外源核酸的再次入侵^[10-13]。越来越多的研究证明，CRISPR-Cas系统对细菌的生物学行为发挥着至关重要的作用，如调控细菌自身基因的转录、维护基因组的稳定性、促进DNA修复以及推动基因组进化等^[14-18]。此外，已有研究发现个别I型CRISPR-Cas系统具有抑制细菌毒力的现象^[15,18]。例如，铜绿假单胞菌I-F型CRISPR-Cas系统敲除株对小鼠的感染能力显著增强，细菌能够更广泛地播散至小鼠的肺、血液、肝和脾等器官^[19]。

鲍曼不动杆菌中主要存在的CRISPR-Cas系统是I型，其中I-Fb亚型分布最为广泛，该系统的特征蛋白为Cas1与Cas2-3^[20-22]。近年来，有研究发现某些细菌的Cas1蛋白能够作用于自身基因，从而影响细菌的生物学特性^[23]。在我们前期收集临床鲍曼不动杆菌分离株的过程中，仅发现一株临床分离株AB43含有完整的CRISPR-Cas系统，而在多药耐药及泛耐药菌株中，未能发现部分组分或完整的CRISPR-Cas系统。为了探究鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统是否参与细菌耐药性和毒力基因的表达调控，构建了AB43株的CRISPR-Cas系统敲除突变株。结果显示，突变株由抗生素敏感株转变为广泛耐药菌株，且生物膜形成能力增强，对大蜡螟的致死率也显著提高^[7]。对AB43株进行全基因组分析后发现，尽管CRISPR-Cas系统的存在并未导致毒力及耐药抗性基因的明显减少，但AB43株本身的耐药性和毒力均较低。我们推测，这可能是由于其CRISPR-Cas系统通过抑制耐药/毒力基因的表达所致^[6-7]。这些前期研究发现，鲍曼不动杆菌AB43株的CRISPR-Cas系统或组分可能对细菌的耐药性和毒力具有抑制作用^[24]。

为了探索AB43株CRISPR-Cas系统作为抑制剂在防控强耐药、高毒力菌株感染中的应用价值，本研究进一步探究其cas1基因过表达对同期收集的鲍曼不动杆菌多药耐药菌株及泛耐药菌株抗生素敏感性的影响,期望为鲍曼不动杆菌感染的精准防控提供新的靶点。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株和动物

鲍曼不动杆菌耐药株AB26、AB29均来自扬州大学临床医学院；BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。动物实验按照《实验动物护理和使用指南》提供的说明进行，扬州大学医学院动物管理委员会进行伦理审查(编号：YXYLL-2023-061)。

1.2 主要试剂和仪器

PCR引物合成及目的基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、相关限制性核酸内切酶、pET-30a质粒、PCR及电泳试剂等，宝生物工程(大连)有限公司；抗生素药敏纸片、MH液体培养基和MH固体培养基，杭州滨和微生物试剂有限公司。

生物安全柜，ThermoFisher Scientific公司；恒温摇床，NBS公司；全自动凝胶成像分析仪，Syngene公司；核酸蛋白检测仪，奥林巴斯公司；PCR仪、电转仪与0.2 mm电击杯，Bio-Rad公司。

1.3 构建 cas1 基因过表达菌株

使用前期研究结果中对鲍曼不动杆菌AB43株测序结果中的cas1基因序列^[6]设计cas1基因引物cas1-F (5′-CGCGAATTCTAAATGGAACAAC TTAACC-3′)和cas1-R (5′-CGCAAGCTTTCTTT CACTCTCCAAATT-3′)。上游添加EcoR I酶切位点GAATTC，下游添加Hind III酶切位点AAGCTT。细菌DNA提取试剂盒提取鲍曼不动杆菌AB43株基因组DNA，作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(25 µL)：10×PCR Buffer 2.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。凝胶电泳检测扩增产物，将符合预期的约1 000 bp的PCR产物进行DNA测序。通过序列分析确认扩增结果为cas1基因产物后，对扩增产物进行回收，回收后的产物进行EcoR I和Hind III双酶切，之后进行胶回收，回收后的酶切产物与经相同酶切回收的pET-30a载体，在16 ℃条件下使用T4 DNA连接酶连接过夜。连接产物涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37 ℃、200 r/min培养过夜，长出的单菌落用接种针挑取至无菌LB液体培养基中，在37 ℃、200 r/min培养过夜后，提取重组质粒pET-30a-cas1，通过电转化的方式将其导入鲍曼不动杆菌AB26株和AB29株的感受态细胞中。

1.4 抗生素敏感性试验

参照2016年临床实验室标准化协会^[24]中“不动杆菌属抑菌圈直径和最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)解释标准”，以临床常用的22种抗生素对鲍曼不动杆菌进行药物敏感性检测。细菌接种于5 mL MH液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养养至菌液OD₆₀₀为0.5。用无菌棉拭子充分浸取菌液，划线接种于MH固体培养基，旋转培养皿60°重复划线共3次。药敏纸片贴于培养基表面，37 ℃静置培养16 h后，测量培养基表面抑菌圈直径，以判读菌株对抗生素的敏感性，具体分为敏感(sensitivity, S)、中介(intermediate, I)或耐药(resistance, R) 3类。

1.5 生物膜形成实验

制备1×10⁶ CFU /mL的鲍曼不动杆菌悬液，并将其接种于无菌96孔聚苯乙烯板中，每板设置3个复孔，每孔200 μL悬液，37 ℃培养 48 h。吸出上清后每孔加入200 μL 1×PBS清洗2次，随后避光染色(0.5%结晶紫) 30 min。再次吸出染液后，每孔继续加入200 μL 1×PBS清洗2次。之后，向每孔加入200 μL 95%乙醇，待结晶紫完全溶解后，用酶标仪测OD₅₇₀处吸光度(A)，阴性对照为空白培养基的吸光度(A_c)。判定标准如下：弱阳性为A_c<A≤2A_c；阳性为2A_c<A≤4A_c；强阳性为A>4A_c。

1.6 血清抗性试验

参考文献[19]，取1×10⁴ CFU/mL鲍曼不动杆菌悬液10 μL与90 μL正常人血清充分混合，之后在37 ℃恒温培养箱中孵育。于0、1、2、3 h分别取10 μL混合液，无菌LB固体培养基上培养计数。每株菌每次试验3个复孔，进行3次试验，56 ℃、30 min热灭活血清组作为对照组。

1.7 小鼠感染

鲍曼不动杆菌菌血症模型造模，使用雄性6周龄BALB/c小鼠(约20 g)用于实验，每组小鼠数量为6只。小鼠腹腔注射7×10⁷ CFU/mL菌液，观察并记录小鼠死亡率，分析菌株与小鼠死亡率之间的关系。

1.8 耐药和毒力基因的差异表达检测

提取细菌总RNA，按照RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行操作，使用核酸蛋白检测仪检测浓度与质量，并通过凝胶电泳进行复核。利用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成单链cDNA，采用qPCR检测各耐药和毒力基因的差异表达。

1.9 数据分析

实验数据均以SPSS 20进行分析，使用t检验处理分析数据间差异性，其中P<0.05表示有统计学差异。

2 结果与分析

收起

2.1 cas1 基因抑制多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性

从前期实验研究中获得的鲍曼不动杆菌AB43菌株，具有完整的CRISPR-Cas系统。从AB43菌株中扩增出cas1基因，并将其与原核表达载体pET-30a进行连接，将构建好的重组载体分别导入多重耐药菌株AB26和广泛耐药菌株AB29中。PCR鉴定结果确认了重组菌的成功构建(图1)。针对22种临床常用抗生素的药敏试验结果显示，与野生株AB26相比，AB26::cas1重组株对广谱青霉素类抗生素哌拉西林、碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南、青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物类抗生素哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸，以及头孢菌素类抗生素头孢吡肟6种抗生素的耐药性发生了显著变化，由耐药转为敏感。相比之下，其余16种抗生素对AB26::cas1重组株的耐药性保持不变。另一方面，AB29::cas1重组株对这22种抗生素的耐药性并未发生改变。值得注意的是，四环素类抗生素米诺环素对AB26::cas1和AB29::cas1重组株的抑菌圈相较于其对应的野生株均有所增大，这表明cas1的过表达可能增强了细菌对米诺环素的敏感性。此外，头孢吡肟对AB29::cas1重组株的抑菌圈从0 mm增大到10 mm，抑菌圈直径的增大虽然未达到对头孢吡肟敏感的范围，但在较大程度上降低了广泛耐药菌株AB29对头孢吡肟的耐受水平(图2，表1)。

2.2 Cas1降低了鲍曼不动杆菌多重耐药株的生物膜形成水平

生物膜的形成与细菌的耐药性之间存在着紧密的联系。为了探究cas1过表达菌株耐药性下降是否与其生物膜形成能力的改变有关，采用了结晶紫染色法检测AB26和AB29野生株及其cas1重组株的生物膜形成能力。相较于野生株AB26，重组株AB26::cas1的生物膜形成能力显著降低(图3)。

2.3 重组株血清抗性无变化

血清中含有补体系统等具有杀菌作用的物质，而细菌的抗血清杀伤能力是其毒力因子之一。为了研究cas1过表达菌株的血清抗性变化，将细菌与血清以1:9 (体积比)充分混合后，在37 ℃条件下进行孵育，并在0、1、2、3 h时分别计算正常血清(N)组与热灭活血清(H-N)组中细菌的存活量。在0 h时，野生株AB26和AB29与其重组株在N组与H-N组中初始菌量一致，原始菌液细菌含量相同。1、2和3 h孵育后，野生株与重组株，在N组与H-N组中的细菌数量无显著差异(图4)。cas1基因的过表达并未能抑制鲍曼不动杆菌的血清抗性。

2.4 AB26::cas1 株小鼠致死率下降

与野生株相比，AB29::cas1并未表现出明显变化，但重组株AB26::cas1却展现出了对多种抗生素耐药性减低和生物膜形成能力下降。鉴于生物膜形成能力与细菌的体内侵袭力之间存在紧密的联系，进一步利用重组株AB26::cas1进行了小鼠感染实验。结果显示，在野生株AB26感染组中，小鼠在第12、14、16 h分别有1只死亡，到了第18 h则有2只死亡；然而，在重组株AB26::cas1感染组中，小鼠并未出现死亡情况(图5)。这表明重组株AB26::cas1在小鼠体内的致病性减弱。

2.5 AB26::cas1 株耐药/毒力基因转录mRNA的变化

为了进一步研究重组株耐药性减低以及毒力减弱可能的分子机制，进行了qRT-PCR检测，分别以AB26和AB26::cas1菌株的cDNA为模板进行实验。结果显示，与AB26株相比，AB26::cas1株中大部分耐药/毒力基因的表达水平均有所下降(图6)。表达差异较大的基因有soxR、adeB、adeC、adeG、adeF、basH、bauA、abaI。相较于cas1基因过表达菌株表达差异较大的基因，野生株基因表达量是cas1基因过表达菌株基因表达量的11.72、8.55、11.24、10.66、11.48、8.39、13.41、8.94倍。

3 讨论

收起

CRISPR-Cas系统对耐药性和毒力的调控展现出多样性和复杂性,不同种类的细菌，CRISPR-Cas系统对耐药性和毒力的影响存在差异。Shabbir等^[25]发现空肠弯曲菌的CRISPR-Cas9系统被发现能够调节多个基因的表达，从而增强细菌的耐药性。相比之下，弗朗西斯菌的CRISPR-Cas9复合物则通过抑制细菌膜脂蛋白抗原的表达，来逃避宿主的免疫应答，进而加重感染症状并提升细菌的耐药性^[26-27]。无乳链球菌的CRISPR-Cas系统则具有促进透明质酸酶过表达的能力，这使得细菌能够突破血脑屏障，引发脑膜炎^[28]。变异链球菌cas3对vicR、gtfC、smu0630、comDE等毒力基因的表达非常重要^[29]。脑膜炎奈瑟菌、嗜肺军团菌的Cas蛋白增强了细菌对宿主细胞的黏附感染^[30-31]。然而，铜绿假单胞菌I-F型CRISPR-Cas系统则抑制了细菌对小鼠的感染和体内播散水平^[19]，这与我们在鲍曼不动杆菌中的研究发现具有相似性。

为了深入探究cas1基因在鲍曼不动杆菌耐药株防控中的潜在价值，我们成功地将cas1基因在多重耐药株AB26和广泛耐药株AB29中进行了过表达，并对比了重组株与野生株在药物敏感性、生物膜形成能力、血清抗性以及小鼠感染后生存率等方面的差异。研究结果显示，重组株AB26::cas1对多种抗生素的敏感性显著提升，生物膜形成能力明显减弱，且在小鼠感染模型中，其致病性也显著降低。这些变化可能与cas1基因过表达后，抑制了多种耐药/毒力基因的表达有关。我们未对cas1基因的过表达程度进行定量研究，本研究中表达cas1基因的质粒是常规原核表达载体pET-30a，这个载体是多拷贝质粒，对目的基因的表达量相对稳定和丰富。在未来研究中开展目的基因过表达水平与作用效果相关性的考察，可能会为细菌耐药性防治研究提供更完整的实验数据。细菌对碳青霉烯类、β内酰胺类、青霉素类、头孢类抗生素的耐药机制主要包括产生各种水解酶[碳青霉烯酶、AmpC酶、超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum-β-lactamases, ESBL)]；改变青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)；细胞膜渗透性发生变化；通过外排泵将药物泵出胞外；外膜孔蛋白(outer membrane pore protein, Omp)缺失；产生氨基糖苷类钝化酶以及靶位点的改变等^[32-33]。研究发现，铜绿假单胞菌中CRISPR-Cas系统能够获取耐药基因且辅助重塑基因组分布^[34]。然而，CRISPR-Cas在农业粪肠球菌中则可有效防止含耐药基因质粒的转移^[35]。进一步的研究还揭示，细菌的CRISPR-Cas系统不仅可能具有阻碍抗生素耐药基因转移的能力，还可能影响细菌质粒的接合转移过程^[36]。因此，CRISPR-Cas系统有望成为抑制细菌耐药性和质粒传播的新型工具^[37]。

本研究中发现，重组株的生物膜形成能力显著降低，提示可能是其耐药性变弱的原因，也可能是重组株细菌体内致病性减弱的机制。因此，希望通过小鼠菌血症模型进行体内的验证，比较重组株AB26::cas1与野生株AB26的毒力差异。研究结果表明，野生株AB26较重组株AB26::cas1感染小鼠的死亡率高、毒力强，与体外生物膜形成的结果相呼应。同时，使用荧光定量PCR对基因表达量进行检测，发现野生株中大部分基因(如adeA、adeB)的mRNA表达量较重组株AB26::cas1呈现倍数降低，提示cas1基因过表达可抑制多种耐药/毒力基因的表达，进而抑制细菌的耐药性和毒力。

综上所述，本研究不仅揭示了cas1基因在鲍曼不动杆菌多重耐药株中的潜在应用价值，还为细菌耐药性防治提供了新的研究思路和方向。CRISPR-Cas基因组件在多重耐药鲍曼不动杆菌防治中具有较强的潜在应用价值^[6-9,38]，然而，对于广泛耐药菌株的防治，我们仍需继续探索更为有效的策略。未来的研究可以进一步深入探讨cas1基因过表达水平与作用效果之间的相关性，以及CRISPR-Cas系统在其他细菌种类中对耐药性和毒力的调控机制，从而为细菌耐药性防治提供更加全面和深入的实验数据和理论基础。

4 结论

收起

本研究中使用本团队前期收集分离到的含有完整CRISPR-Cas系统的鲍曼不动杆菌AB43菌株，扩增并重组质粒后成功构建多重耐药菌株AB26及广泛耐药菌株AB29 cas1基因过表达菌株。

cas1基因多重耐药菌株过表达株对6类抗生素由耐药变为敏感，分别为广谱青霉素类、碳青霉烯类、头孢菌素类、青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物类，以及生物膜形成能力减低，cas1基因对多重耐药菌株多种抗生素耐药性以及生物膜形成能力具有抑制作用。

cas1基因多重耐药菌株过表达株小鼠感染模型致死率下降，多种耐药/毒力基因的表达水平降低，cas1基因对多重耐药菌株通过抑制多种耐药/毒力基因的表达，从而抑制多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性和毒力。

基金

收起

国家自然科学基金(82373637)
国家自然科学基金(82073611)
国家自然科学基金(82002186)
江苏省自然科学基金(BK20231241)

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收起

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2025年第65卷第2期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240579

接收时间：2024-09-19
首发时间：2026-02-05
出版时间：2025-02-04

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收稿日期：2024-09-19
录用日期：2024-11-17

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National Natural Science Foundation of China(82373637)

国家自然科学基金(82373637)

National Natural Science Foundation of China(82073611)

国家自然科学基金(82073611)

National Natural Science Foundation of China(82002186)

国家自然科学基金(82002186)

Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20231241)

江苏省自然科学基金(BK20231241)

作者信息

1 扬州大学医学院，江苏扬州

2 河南省疾病预防控制中心，河南郑州

3 核酸与细胞命运调控省高校重点实验室(扬州大学)，江苏扬州

4 扬州大学附属医院，江苏扬州

5 宜兴市中医医院，江苏无锡

通讯作者:

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

抗生素Antibiotic	抑菌圈Inhibition zone (mm)	耐药性折点Antibiotic resistance	药物敏感性Drug susceptibility
广谱青霉素Broad-spectrum penicillin
哌拉西林Piperacillin	0	18	0	0	≤17	R	S	R	R
磺胺类Sulphonamide antibiotics
磺胺异恶唑Sulfamethoxazole	27	25	0	0	≤12	S	S	R	R
多黏菌素类Polymyxin antibiotics
多黏菌素B Polymyxin B	18	17	17	18	≤14	S	S	S	S
碳青霉烯类 Carbapenem antibiotics
亚胺培南Imipenem	18	38	17	18	≤18	R	S	R	R
美罗培南Meropenem	11	29	12	11	≤14	R	S	R	R
四环素类Tetracycline antibiotics
四环素Tetracycline	26	26	0	0	≤11	S	S	R	R
多西环素Doxycycline	31	33	10	10	≤12	S	S	R	R
米诺环素Minocycline	34	38	23	29	≤12	S	S	S	S
氟喹诺酮Fluoroquinolone antibiotics
环丙沙星Ciprofloxacin	34	32	0	0	≤15	S	S	R	R
左氧氟沙星Levofloxacin	32	34	11	11	≤13	S	S	R	R
加替沙星Gatifloxacin	38	38	20	20	≤14	S	S	S	S
青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物Penicillin/β-lactamase inhibitor complexes
哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam	15	26	11	8	≤17	R	S	R	R
氨苄西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam	25	29	17	18	≤11	S	S	S	S
替卡西林/棒酸 Ticarcillin/Clavulanic acid	0	26	0	0	≤14	R	S	R	R
氨基糖苷类Aminoglycoside antibiotics
阿米卡星Amikacin	17	18	22	23	≤14	S	S	S	S
奈替米星Netilmicin	25	23	18	19	≤12	S	S	S	S
庆大霉素Gentamicin	21	20	11	12	≤12	S	S	R	R
妥布霉素Tobramycin	23	23	25	28	≤12	S	S	S	S
头孢菌素类 Cephalosporin antibiotics
头孢吡肟Cefepime	14	24	0	10	≤14	R	S	R	R
头孢噻肟Cefotaxime	21	18	0	0	≤14	S	S	R	R
头孢曲松Ceftriaxone	16	16	0	0	≤13	S	S	R	R
头孢他啶Ceftazidime	18	17	0	0	≤14	S	S	R	R

抗生素Antibiotic

抑菌圈Inhibition zone (mm)

耐药性折点Antibiotic resistance

药物敏感性Drug susceptibility

AB26

AB26::cas1

AB29

AB29::cas1

AB26

AB26::cas1

AB29

AB29::cas1

广谱青霉素Broad-spectrum penicillin

哌拉西林Piperacillin

≤17

磺胺类Sulphonamide antibiotics

磺胺异恶唑Sulfamethoxazole

≤12

多黏菌素类Polymyxin antibiotics

多黏菌素B Polymyxin B

≤14

碳青霉烯类 Carbapenem antibiotics

亚胺培南Imipenem

≤18

美罗培南Meropenem

≤14

四环素类Tetracycline antibiotics

四环素Tetracycline

≤11

多西环素Doxycycline

≤12

米诺环素Minocycline

≤12

氟喹诺酮Fluoroquinolone antibiotics

环丙沙星Ciprofloxacin

≤15

左氧氟沙星Levofloxacin

≤13

加替沙星Gatifloxacin

≤14

青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物Penicillin/β-lactamase inhibitor complexes

哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam

≤17

氨苄西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam

≤11

替卡西林/棒酸 Ticarcillin/Clavulanic acid

≤14

氨基糖苷类Aminoglycoside antibiotics

阿米卡星Amikacin

≤14

奈替米星Netilmicin

≤12

庆大霉素Gentamicin

≤12

妥布霉素Tobramycin

≤12

头孢菌素类 Cephalosporin antibiotics

头孢吡肟Cefepime

≤14

头孢噻肟Cefotaxime

≤14

头孢曲松Ceftriaxone

≤13

头孢他啶Ceftazidime

≤14