微生物学报

Strains	ANI	dDDH
Bacillus velezensis CR-502^T	98.3	84.5
Bacillus siamensis KCTC 13613^T	94.3	56.5
Bacillus nakamurai NRRL B-41091^T	86.3	30.7
Bacillus tequilensis KCTC 13622^T	77.7	20.7
Bacillus cabrialesii TE3^T	77.2	20.5
Bacillus inaquosorum KCTC 13429^T	77.5	20.9
Bacillus stercoris D7XPN1^T	77.0	20.4
Bacillus atrophaeus NRRL NRS 213^T	77.3	20.6
Bacillus amyloliquefaciens DSM 7^T	93.1	55.1

Strains	ANI	dDDH
Bacillus velezensis CR-502^T	98.3	84.5
Bacillus siamensis KCTC 13613^T	94.3	56.5
Bacillus nakamurai NRRL B-41091^T	86.3	30.7
Bacillus tequilensis KCTC 13622^T	77.7	20.7
Bacillus cabrialesii TE3^T	77.2	20.5
Bacillus inaquosorum KCTC 13429^T	77.5	20.9
Bacillus stercoris D7XPN1^T	77.0	20.4
Bacillus atrophaeus NRRL NRS 213^T	77.3	20.6
Bacillus amyloliquefaciens DSM 7^T	93.1	55.1

Characteristic	Results
Oxidase	-
Catalase	-
Temperature range (℃)	10-50
Maxium NaCl (%, W/V)	10.0
pH value	5.0-9.0
NA	+
R2A	+
MCA	+
TSA	+
Methyl red	-
Indole	+
Citric acid	+
VP	+

Characteristic	Results
Oxidase	-
Catalase	-
Temperature range (℃)	10-50
Maxium NaCl (%, W/V)	10.0
pH value	5.0-9.0
NA	+
R2A	+
MCA	+
TSA	+
Methyl red	-
Indole	+
Citric acid	+
VP	+

Genomic features	Results
Accession number	JBHEPW000000000
Size (Mb)	3.8
Number of contigs	31
G+C content (%)	46.4
Number of genes	3 984
L50 (bp)	3
N50 (bp)	393 092
Number of RNAs	52

Genomic features	Results
Accession number	JBHEPW000000000
Size (Mb)	3.8
Number of contigs	31
G+C content (%)	46.4
Number of genes	3 984
L50 (bp)	3
N50 (bp)	393 092
Number of RNAs	52

Region	Types	Most similar known clusters	Similarity (%)
1.1	NRP-metallophore, NRPS, RiPP-like	Bacillibactin	100
1.2	Other	Bacilysin	100
2.1	NRPS, betalactone, transAT-PKS	Fengycin	80
2.2	TransAT-PKS, NRPS, T3PKS	Bacillaene	100
2.3	TransAT-PKS	Macrolactin H	100
3.1	NRPS	Surfactin	82
4.1	TransAT-PKS	Difficidin	46
6.1	Terpene	-	-
6.2	PKS-like	Butirosin A/butirosin B	7
7.1	TransAT-PKS-like	Difficidin	53
7.2	T3PKS	-	-
10.1	Terpene	-	-
11.1	Lanthipetide-class-ii	-	-
17.1	NRPS	Plipastatin	30
18.1	TransAT-PKS-like	Difficidin	26
21.1	NRPS	Fengycin	20
22.1	NRPS	Fengycin	13

Region	Types	Most similar known clusters	Similarity (%)
1.1	NRP-metallophore, NRPS, RiPP-like	Bacillibactin	100
1.2	Other	Bacilysin	100
2.1	NRPS, betalactone, transAT-PKS	Fengycin	80
2.2	TransAT-PKS, NRPS, T3PKS	Bacillaene	100
2.3	TransAT-PKS	Macrolactin H	100
3.1	NRPS	Surfactin	82
4.1	TransAT-PKS	Difficidin	46
6.1	Terpene	-	-
6.2	PKS-like	Butirosin A/butirosin B	7
7.1	TransAT-PKS-like	Difficidin	53
7.2	T3PKS	-	-
10.1	Terpene	-	-
11.1	Lanthipetide-class-ii	-	-
17.1	NRPS	Plipastatin	30
18.1	TransAT-PKS-like	Difficidin	26
21.1	NRPS	Fengycin	20
22.1	NRPS	Fengycin	13

一株贝莱斯芽孢杆菌鉴定、全基因组学分析及其抗病促生特性

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王春玲 , 黄钰婷 , 刘星 , 徐良雄 , 王艳君 , 肖海霞 , 朱柏诗 , 毛露甜 ^*

微生物学报 | 研究报告 2025,65(2): 745-757

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(2): 745-757

一株贝莱斯芽孢杆菌鉴定、全基因组学分析及其抗病促生特性

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王春玲, 黄钰婷, 刘星, 徐良雄, 王艳君, 肖海霞, 朱柏诗, 毛露甜^*

作者信息

惠州学院生命科学学院，广东惠州

Identification, genomic analysis, and disease-resistant and plant growth-promoting characterization of a Bacillus velezensis

Chunling WANG, Yuting HUANG, Xing LIU, Liangxiong XU, Yanjun WANG, Haixia XIAO, Boshi ZHU, Lutian MAO^*

Affiliations

College of Life Sciences, Huizhou University, Huizhou, Guangdong, China

出版时间: 2025-02-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240546

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摘要

收起

植物病原菌侵染引起的作物病害给全球农业带来了巨大危害，而生物防治因其有效性和环境友好性等特点，已成为防控植物病害的研究热点。 【目的】 从实验室保藏的菌种库中筛选拮抗植物病原菌的目标菌株，对其进行鉴定、全基因组学分析，并评价其抗病促生效果。 【方法】 采用平板对峙法筛选拮抗菌；利用形态学观察、16S rRNA基因测序、基因组系统发育分析、基因组平均核苷酸相似性(average nucleotide identity, ANI)和数字DNA杂交(digital DNA-DNA hybridization, dDDH)值比较分析，以及生理生化特征等方法进行菌种分类学鉴定；对目标菌株进行全基因组序列分析，挖掘功能基因；通过测定溶磷、产铁载体、产蛋白酶和产纤维素酶活力来评价目标菌株的促生特性；采用二分隔培养皿检测目标菌株产生的挥发性气体对植物病原真菌抑制情况；通过盆栽试验探究目标菌株对番茄的促生防病效果。 【结果】 获得1株对茄科罗尔斯通氏菌(简称青枯菌)及3种植物病原真菌具有明显抑菌活性的菌株MB1019，经鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。生理生化特征显示，菌株MB1019的耐受温度为15-50 ℃，最大耐受NaCl浓度为10.0%，耐受pH值为5.0-9.0。全基因组分析显示，菌株MB1019基因组大小为3.8 Mb，G+C含量为46.4%，antiSMASH预测显示，菌株MB1019基因组含有17个次级代谢产物基因簇。dbCAN2预测显示，菌株MB1019含有52种、共108个CAZy家族基因，其中糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)家族种类和数量最多。菌株MB1019产生的挥发性气体能够显著抑制植物病原真菌的生长。盆栽试验结果显示，菌株MB1019对番茄具有明显促生防病效果。 【结论】 贝莱斯芽孢杆菌MB1019具有拮抗青枯菌和植物病原真菌的能力，展现出耐高温、耐盐碱以及促生功能，其基因组中含有大量抑菌基因，并能产生挥发性气体有效抑制病原真菌的生长，MB1019菌液对番茄具有促生防病效果。综上所述，菌株MB1019作为微生物肥料和农药研发的优良菌种资源，展现出良好的开发和应用潜力。

关键词

贝莱斯芽孢杆菌 / 植物病原菌 / 全基因组学分析 / 抗病促生特性

Abstract

收起

Crop diseases caused by phytopathogens result in great harm to global agriculture. Biocontrol has garnered increasing attention in plant disease prevention and control because of its effectiveness and environmental friendliness. [Objective] To identify, analyze the genome, and evaluate the disease-resistant and plant growth-promoting effects of the strains with antagonistic activities that were screened from the culture collection. [Methods] Antagonistic strains were screened by plate confrontation method. and identified by morphological observation, phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene and genome, comparative analysis of average nucleotide identity (ANI) and digital DNA-DNA hybridization (dDDH) values, and physiological and biochemical tests. The whole genome sequence of the target strain was analyzed for the mining of functional genes. The plant growth-promoting effect of the target strain was characterized in terms of the phosphorus-solubilizing, siderophore-producing, and proteinase- and cellulose-producing properties. The inhibition of volatile gas produced by the target strain on phytopathogenic fungi was examined in petri dishes with a septum. The effects of the target strain on tomato growth and diseases were studied by pot experiments. [Results] Strain MB1019 with obvious inhibitory effects on Ralstonia solanacearum and three phytopathogenic fungal strains was screened out and identified as Bacillus velezensis. The physiological and biochemical tests showed that strain MB1019 tolerated the temperature of 15-50 ℃, 10.0% NaCl, and pH 5.0-9.0. The genome of strain MB1019 was 3.8 Mb in length, with the G+C content of 46.4%. The prediction on antiSMASH suggested that the MB1019 genome had 17 synthetic gene clusters for secondary metabolites. The prediction on dbCAN2 suggested that MB1019 carried 108 genes belonging to 52 types of the CAZy family, among which glycoside hydrolases (GHs) were the richest and most abundant. The volatile gas produced by MB1019 significantly inhibited the growth of phytopathogenic fungi. The results of pot experiments showed that MB1019 promoted the growth and inhibited the diseases of tomato seedlings. [Conclusion] B. velezensis MB1019 capable of antagonizing R. solanacearum and phytopathogenic fungi has tolerance to high temperatures and saline-alkali and demonstrates plant growth-promoting effects. Its genome contains a large number of functional genes, and the volatile gas produced by this strain can inhibit the growth of pathogenic fungi. The fermentation broth of MB1019 has the effects of promoting the growth and preventing the diseases of tomato seedlings. In summary, B. velezensis MB1019 can be used as an elite strain in the research and development of microbial fertilizers and pesticides, demonstrating promising development and application prospects.

Key words

Bacillus velezensis / phytopathogen / genomic analysis / disease-resistant and plant growth-promoting properties

引用本文

王春玲, 黄钰婷, 刘星, 徐良雄, 王艳君, 肖海霞, 朱柏诗, 毛露甜. 一株贝莱斯芽孢杆菌鉴定、全基因组学分析及其抗病促生特性. 微生物学报, 2025 , 65 (2) : 745 -757 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240546

Chunling WANG, Yuting HUANG, Xing LIU, Liangxiong XU, Yanjun WANG, Haixia XIAO, Boshi ZHU, Lutian MAO. Identification, genomic analysis, and disease-resistant and plant growth-promoting characterization of a Bacillus velezensis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (2) : 745 -757 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240546

正文

收起

植物病原细菌及病原真菌引起的番茄青枯病^[1]、香蕉枯萎病^[2]、油茶炭疽病^[3]等植物病害，给全球作物造成了巨大危害。由于缺乏有效的抗性育种手段，应用化学杀菌剂成为控制植物病原菌的主要方法。然而，部分植物病害缺乏对应的商业化学品，且长期使用化学杀菌剂后，农田病原菌产生了耐药性，几种亚致死浓度的化学杀菌剂的使用会引发真菌毒素的生物合成^[4]。生物防治因其有效性及环境友好性等成为防治植物病虫害研究的热点。由于田间环境复杂多变，生防菌难以在土壤中稳定定殖，且缺乏有效的生防效应因子，生物防治面临很大挑战^[5]。

植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是生长在植物根际的有益细菌，它们不仅能够促进植物的生长发育，还能增强植物的抗病和抗逆性，主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)等^[6]。芽孢杆菌广泛存在于自然界，具有繁殖快、代谢快、定殖能力强等特点，其能够产生芽孢以抵抗不良环境，因此成为当前生物农药研究的热点和产业化开发的主要来源。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)是芽孢杆菌中最重要的代表性生防菌，被广泛应用于农业生产中^[7-8]。贝莱斯芽胞杆菌通过产生多种次级代谢产物，如苯甲醛(benzaldehyde)、表面活性素(surfactin)和杆菌霉素D (bacillomycin D)等抑制病原体和害虫；通过改善宿主植物微生物群落结构，促进宿主对营养的吸收；激发宿主防御机制，诱导产生系统抗性^[9-10]。Tahir等^[11]从贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)模式菌株FZB42中鉴定出了抑制茄科罗尔斯通氏菌(简称青枯菌，Ralstonia solanacearum)的挥发性代谢产物，包括苯甲醛、1,2-苯并异噻唑-3-酮[1,2‑benzisothiazol‑3(2 H)‑one]和1,3-丁二烯(1,3‑butadiene)；此外，B. velezensis FZB42产生的表面活性素对多种病原微生物具有抑菌活性^[11]。Im等^[12]研究发现，B. velezensis DR‑08的丁醇提取物含有difficidin和oxydifficidin，对青枯菌有抗菌活性。

本研究从实验室保藏的菌种资源库中筛选拮抗青枯菌和3种植物病原真菌的生防菌株，随后对其进行菌种鉴定、全基因组学分析、促生功能检测、产挥发性气体的抑菌活性检测以及番茄促生防病效果评价。本研究旨在为微生物肥料和农药的研发提供优质的菌种资源，并为深入挖掘菌种的抑菌机理奠定理论基础。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株和培养基

所用菌株MB1019、青枯菌RSH、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea) TSF05、柑橘白地霉病菌(Citrus trichoderma) TSF19和烟曲霉(Aspergillus fumigatus) TSF44均来自实验室保藏菌种。所用番茄种子为‘长合新金丰1号'。

营养琼脂(nutrient agar, NA)培养基、营养肉汤(nutrient broth, NB)培养基、R2A琼脂培养基、麦康凯琼脂(MacConkey agar, MCA)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(trypsin soy agar, TSA)培养基、1/2MS培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。

解无机磷培养基(g/L)：Ca₃(PO₄)₂ 5.0，葡萄糖10.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，MnSO₄ 0.03，FeSO₄·7H₂O 0.03，酵母浸粉0.5，琼脂17.0，pH 7.2。

羧甲基纤维素钠琼脂培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠10.0，酵母粉1.0，琼脂17.0，pH 7.2。

上述培养基均于121 ℃灭菌20 min后备用。

CAS培养基(g/L)：葡萄糖2.0，干酪素3.0，CaCl₂ 0.1，MgSO₄ 4.9，琼脂17.0，121 ℃灭菌20 min。CAS染液(g/L)：刃天青0.3，FeCl₃ 0.1，十六烷基三甲基溴化铵1.5，115 ℃灭菌20 min。待冷却至60 ℃时后，向CAS培养基中缓慢加入0.l mol/L磷酸盐缓冲液和体积分数为5%的CAS染液各5 mL，即为CAS检测培养基。

脱脂牛奶培养基(g/L)：脱脂奶粉20.0于锥形瓶中；琼脂30.0于另一锥形瓶中，分开灭菌，115 ℃灭菌20 min。待冷却至60 ℃左右时，将两锥形瓶混合后倒平板。

1.2 番茄青枯病拮抗菌株筛选及其拮抗植物病原真菌

取100 µL青枯菌菌悬液均匀涂布到NA平板上，待吹干后，用无菌牙签点接筛选的菌株到平板上，30 ℃培养2-3 d后观察是否有抑菌圈形成。此外，用直径5 mm的打孔器，取培养5 d的番茄灰霉病TSF05、柑橘白地霉病TSF19和烟曲霉TSF44的菌饼，接种于6 cm的NA培养基中央，在距离中心1 cm处间隔90°设置4个点，将筛选到具有拮抗青枯菌的菌株接种于4个点位置处，以单独接种病原真菌作为对照，每个处理重复3次，30 ℃培养3-4 d，观察菌株对3种病原真菌的抑菌活性。

1.3 菌株MB1019鉴定

挑取MB1019菌体置于装有50 µL无菌水的离心管中，100 ℃加热10 min后吹打混匀，作为PCR扩增的模板。利用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)：2×rTaq Mix 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.5 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 8.5 µL。PCR反应条件：95 °C预变性5 min；95 °C变性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，30个循环；72 °C终延伸5 min。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将获得的16S rRNA基因序列上传到EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/identify)进行序列比对，利用MEGA 7.0软件Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter model) 1 000次自展值构建16S rRNA基因的最大似然法(maximum likelihood method)系统发育树。将获得的16S rRNA基因序列上传到NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得GenBank登录号为PQ268866。

将菌株MB1019采用四分法划线于NA平板上，30 ℃培养24 h后进行拍照，观察菌体形态特征；此外，采用扫描电子显微镜观察菌株个体形态特征。

还原酶活性：取少量菌体溶于3%的H₂O₂溶液中，观察有气泡产生则为阳性，无气泡则为阴性。氧化酶活性：使用氧化酶试剂(广东环凯微生物科技有限公司)进行检测。将菌株接种到NA培养基上，分别置于10、15、30、35、40、45、50、55 ℃培养箱进行培养，检测菌株在不同温度下的生长情况。将菌株接种到NaCl体积分数为0-11.0%的液体培养基中，每个梯度间隔1.0%，30 ℃、180 r/min 培养2-3 d，检测菌株在不同NaCl浓度下的生长情况。将菌株接种至pH值为4.0-12.0的NA液体培养基中，每个梯度间隔1.0，30 ℃、180 r/min培养2-3 d，检测菌株在不同pH值下的生长情况。将菌株接种至NA、R2A、MCA和TSA这4种培养基上，检测菌株在不同培养基上的生长情况。使用大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒(北京陆桥技术有限责任公司)进行IMViC生化系统鉴定(I：吲哚；M：甲基红；V：VP试验；C：柠檬酸盐)。

1.4 菌株MB1019促生特性

将MB1019分别点接在无机磷培养基、CAS检测培养基及脱脂牛奶培养基上，30 ℃培养2-3 d后，观察是否有透明圈或培养基颜色变化，进行溶解无机磷、产铁载体和产蛋白酶活性测定。将MB1019点接于纤维素培养基上，用1 mg/mL的刚果红对平板染色15 min，之后用1 mol/L NaCl固定15 min，最后用清水轻轻冲洗掉多余的刚果红染料，并观察是否产生透明圈。溶无机磷能力的定量测定参考刘晔等^[13]的方法。产铁载体能力的测定参照王平等^[14]的方法。蛋白酶活力测定参照国家标准GB/T 23527.1—202 X福林酚法^[15]。纤维素酶活力测定参照宋朝霞等^[16]的方法。

1.5 菌株MB1019全基因组测序及分析

挑取MB1019单菌落转接至NA液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养2 d，8 000 r/min离心10 min收集菌体，于-80 ℃冰箱冻存后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序。将测得的草图基因组序列使用SPAdes v3.11.1软件组装成contigs和scaffolds，并将基因组序列上传到NCBI数据库，获得GenBank登录号为JBHEPW000000000。

使用在线网站RAST ( )进行MB1019全基因组注释，基因组平均核苷酸相似性(average nucleotide identity, ANI)通过EzBioCloud平台上的在线工具ANI calculator (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)进行计算。基因组数字DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization, dDDH)通过DSMZ公司开发的在线工具Genome-to-Genome Calculator GGDC (http://ggdc.dsmz.de/home.php)进行计算。使用UBCG软件构建MB1019全基因组系统发育树。使用antiSMASH v6.1.1在线网站预测MB1019的次级代谢产物基因簇，使用在线网站dbCAN2 (E值>1e-15，coverage>0.35)进行CAZymes基因注释。

1.6 菌株MB1019产生挥发性气体抑制病原真菌

将NA培养基倒入二分隔培养皿中，冷却后培养皿一侧分别接种番茄灰霉病TSF05和柑橘白地霉病TSF19，另一侧接种MB1019。以仅一侧接种病原真菌的培养皿作为对照，实验设置3个重复，在30 ℃培养箱培养4 d后，观察真菌的生长情况，测量真菌的菌落直径。

1.7 番茄盆栽试验

将‘新金丰1号'番茄种子用2.0%次氯酸钠清洗8 min后，用无菌水清洗5-6次，然后将种子置于铺有浸湿灭菌滤纸的培养皿上进行催芽。将发芽的种子移栽到装有灭菌基质土的育苗盘中，在28-30 ℃、60%-80%湿度下育苗20 d左右，将番茄苗移栽到直径11.8 cm的花盆中，每盆移栽1株。将菌株MB1019和R. solanacearum RSH按1%的接种量分别接种于NB培养基中，30 ℃、200 r/min培养2-3 d，调节菌液OD₆₀₀均为1×10⁸ CFU/mL。番茄苗移栽2-3 d后开始处理，CK组：每盆加入灭菌NB液体培养基10 mL作为对照；MB1019组：加入MB1019发酵液(每盆10 mL，浓度为10⁸ CFU/mL)；RSH组：加入R. solanacearum RSH发酵液(每盆10 mL，浓度为10⁸ CFU/mL)；MB1019+RSH组：加入MB1019和RSH发酵液各5 mL (浓度均为10⁸ CFU/mL)。间隔10 d处理一次，连续处理2次，每组处理4株苗。番茄苗生长至30 d后，统计株高、根长、鲜重、干重、鲜重-干重指标。

1.8 数据处理

所有测量数据使用SPSS软件进行方差分析和最小显著性差异法(least significant difference, LSD)多重比较(P<0.05)，采用Excel软件进行作图。

2 结果与分析

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2.1 番茄青枯病拮抗菌株筛选及其拮抗的植物病原真菌的效能分选

从实验室保藏的菌种库中筛选到1株对青枯菌RSH具有明显拮抗活性的菌株MB1019 (图1A)，采用模式图(图1B)的方法检测MB1019对3种病原真菌的抑菌活性，结果显示，与对照相比(图1C、1E、1G)，MB1019对番茄灰霉病菌TSF05 (图1D)、柑橘白地霉病菌TSF19 (图1F)和烟曲霉TSF44 (图1H)具有明显的抑菌活性。

2.2 菌株MB1019的鉴定

2.2.1 形态学观察

如图2A所示，MB1019在NA培养基上呈乳白色，不透明，分泌大量胞外黏液，边缘整齐。扫描电镜结果显示，MB1019呈短杆状，大小为(1.7-2.3) μm×(0.6-0.7) μm (图2B)。

2.2.2 系统发育分析

MB1019与暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis) KCTC 13613^T和贝莱斯芽孢杆菌CR-502^T序列的相似性最大，均为99.9%。基于16S rRNA基因构建的最大似然法系统发育树显示，MB1019与B. siamensis KCTC 13613^T聚在一个分支上(图2C)，进一步全基因组系统发育树显示MB1019与B. velezensis CR-502^T聚在一个分支上(图2D)，表明MB1019可能为一株贝莱斯芽孢杆菌。

2.2.3 基因组ANI和dDDH比较分析

MB1019与B. velezensis CR-502^T的ANI比值为98.3%，dDDH比值为84.5%，均大于区分物种界限值95.0%-96.0%和70.0%，而与其他菌株ANI比值在77.0%-94.3%之间，dDDH比值在20.4%-56.5%之间(表1)，表明MB1019是一株贝莱斯芽孢杆菌。

2.2.4 生理生化特征分析

菌株MB1019的生理生化特征见表2，其氧化酶和还原酶活性均为阴性，生长温度范围为15-50 ℃，最大耐受NaCl浓度为10.0%，耐受pH值范围为5.0-9.0。菌株MB1019在NA、R2A、MCA和TSA这4种培养基上均能生长。IMViC生化系统鉴定结果显示，菌株MB1019的甲基红试验为阴性，吲哚试验为阳性，柠檬酸盐利用试验为阳性，VP试验为阳性。

2.3 菌株MB1019全基因组学分析

菌株MB1019全基因组基本特征见表3，基因组大小为3.8 Mb，G+C含量为46.4%，草图基因组中含有31个contigs，包含3 984个基因。

antiSMASH在线数据库预测菌株MB1019基因组中含有17个次级代谢产物基因簇，其中有4个基因簇展示与bacillibactin、bacilysin、bacillaene和macrolactin H均有100%相似性，片段6.2编码一个PKS-like基因簇，与已知基因簇butirosin A/butirosin B相似性仅有7% (表4)，此外，4个片段6.1、7.2、10.1及11.1编码的terpene、T3PKS、terpene和lanthipetide-class-ii未检测出最相似基因簇(表4)。

菌株MB1019基因组中共含有52种、共108个CAZy家族基因，其中糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)家族种类和数量最多，分别为24种和42个(图3A)。图3B进一步展示了菌株MB1019基因组中含有的糖苷水解酶家族种类和数量，其中GH13和GH43含有的数量最多，分别为6个和4个。

2.4 菌株MB1019促生特性

菌株MB1019在溶无机磷、CAS检测、脱脂牛奶及羧甲基纤维素钠培养基上均能形成明显的水解圈(图4A-4D)，表明菌株MB1019具有溶无机磷、产铁载体、产蛋白酶和纤维素酶活性。

定量检测培养3 d的菌株MB1019发酵液中的溶无机磷、产铁载体、产蛋白酶和纤维素酶活力。结果显示，菌株MB1019的溶解无机磷能力为(51.440±0.001) mg/L，产铁载体能力为(55.70±0.19)%，产蛋白酶活力为(22.008±2.171) U/mL，产纤维素酶活力为(0.022 1±0.001 2) U/mL。

2.5 菌株MB1019产生挥发性气体抑制植物病原真菌

与单独培养2株植物病原真菌相比(图5A、5C)，在二分隔培养皿中，菌株MB1019的生长对番茄灰霉病菌TSF05和柑橘白地霉病菌TSF19具有显著的抑菌效果(图5B、5D、5E)，表明菌株MB1019产生的挥发性气体能够有效抑制这2种植物病原真菌。

2.6 菌株MB1019对番茄促生防病作用

将生长30 d的4个处理组的番茄苗的株高、根长、鲜重、干重以及鲜重-干重值进行统计，结果如图6所示，与灭菌的NB液体培养基(CK)相比，接种菌株MB1019发酵液后，番茄的株高、根长、鲜重和干重分别提高了32.4%、31.2%、50.9%和37.0% (MB1019)。此外，施加青枯菌RSH的番茄苗植株明显变矮，部分植株出现枯萎症状(RSH)。然而，与青枯菌RSH组相比，当同时施加菌株MB1019和RSH后，番茄苗植株恢复生长，且株高、根长、鲜重和干重分别提高了39.0%、58.6%、94.1%和74.1% (MB1019+RSH)。盆栽试验结果表明，菌株MB1019对番茄具有明显的促生作用，并且能够有效防治青枯病。

3 讨论与结论

收起

近年来，芽孢杆菌等PGPR在农业生产上被广泛应用，以防治植物病害并促进作物生长^[17]。然而，对于这些细菌促进生长及适应环境的分子机制仍有许多未知之处。本研究筛选到一株对植物病原细菌和真菌有明显抑菌作用的菌株MB1019 (图1)，经表型分析、系统发育分析、基因组ANI和dDDH比较分析以及生理生化特征等鉴定，确认该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(图2、表1、表2)，并且发现菌株MB1019具有溶磷和产铁载体等促生特征(图4A、4B)，表明MB1019是一株PGPR。此外，菌株MB1019展现出多种抗性特征，包括耐高温(50 ℃)、最高耐NaCl浓度为10.0%、耐酸碱性范围pH 5.0-9.0等(表2)。

多株贝莱斯芽孢杆菌已被报道有拮抗病原菌功能，包括FZB42、GS-1、BA-26、BS1等^[7,18]。它们可通过产生次级代谢产物抑制多种病原真菌和细菌。在本研究中，菌株MB1019的基因组被预测含有17个次级代谢产物基因簇(表4)，其中difficidin、macrolactin H和bacilysin主要抑制病原真菌，而bacillaene、fengycin和surfactin则能有效抑制病原细菌，bacillibactin能够抑制微生物的竞争对手^[19]。此外，有2个基因簇编码terpenes，1个基因簇编码T3PKS和1个基因簇编码lanthipetide (表4)。Lanthipetides是核糖体合成和翻译后修饰肽，具有抗细菌、抗真菌及其他活性^[20]。Terpene一般具有挥发性，包括a-pinene和氧化terpene，是挥发性的抗菌化合物，与本研究发现菌株MB1019产生挥发性气体以抑制病原真菌的结果相一致(图5)^[21-22]。

我们也发现菌株MB1019具有产生蛋白酶和纤维素酶活力(图4C、4D)，这些酶活性已被报道有助于拮抗病原菌及防治植物病害^[23]。PGPRs能够通过分泌蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶及几丁质酶来降解真菌细胞壁，如几丁质、葡聚糖和蛋白质，从而破坏细胞壁的完整性，进而降低病原菌的致病力^[24]。我们推测菌株MB1019的抗真菌活性与其分泌的这些胞外水解酶的分解能力密切相关。

青枯菌侵染引起的番茄青枯病素有 “植物癌症” 之称，是一种毁灭性的土传病害，也是番茄主要病害之一^[25-26]。盆栽结果显示，接种菌株MB1019发酵液对番茄青枯病有显著的抑菌效果，并且对番茄有明显的促生作用(图6)。综上所述，贝莱斯芽孢杆菌MB1019展示了广谱高效地拮抗病原细菌和真菌的活性，具有溶磷和产铁载体等促生特性，能够产生具有抑菌活性的多种次级代谢产物，以及蛋白酶和纤维素酶。因此，MB1019是一株有应用价值的安全有效的防治青枯病的生防细菌，在环境友好的农业生态中值得深入探索它的生防应用。

基金

收起

惠州市优秀青年科技人才项目(2023EQ050042)
惠州学院博士科研启动项目(2022JB087)
广东省教育厅重点领域专项(2023ZDZX2061)
广东省教育厅重点领域专项(2024ZX096)
广东省大学生创新训练项目(S202310577075)
广东省大学生创新训练项目(S202310577070)

参考文献

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文献

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2025年第65卷第2期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240546

接收时间：2024-09-03
首发时间：2026-02-05
出版时间：2025-02-04

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收稿日期：2024-09-03
录用日期：2024-11-08

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Huizhou Outstanding Youth Science and Technology Talent Project(2023EQ050042)

惠州市优秀青年科技人才项目(2023EQ050042)

Initial Funding for Doctoral Research of Huizhou University(2022JB087)

惠州学院博士科研启动项目(2022JB087)

Department of Education of Guangdong Province Project(2023ZDZX2061)

广东省教育厅重点领域专项(2023ZDZX2061)

Department of Education of Guangdong Province Project(2024ZX096)

广东省教育厅重点领域专项(2024ZX096)

Innovative Training Program for College Students of Guangdong Province(S202310577075)

广东省大学生创新训练项目(S202310577075)

Innovative Training Program for College Students of Guangdong Province(S202310577070)

广东省大学生创新训练项目(S202310577070)

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惠州学院生命科学学院，广东惠州

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Strains	ANI	dDDH
Bacillus velezensis CR-502^T	98.3	84.5
Bacillus siamensis KCTC 13613^T	94.3	56.5
Bacillus nakamurai NRRL B-41091^T	86.3	30.7
Bacillus tequilensis KCTC 13622^T	77.7	20.7
Bacillus cabrialesii TE3^T	77.2	20.5
Bacillus inaquosorum KCTC 13429^T	77.5	20.9
Bacillus stercoris D7XPN1^T	77.0	20.4
Bacillus atrophaeus NRRL NRS 213^T	77.3	20.6
Bacillus amyloliquefaciens DSM 7^T	93.1	55.1

Strains

ANI

dDDH

Bacillus velezensis CR-502^T

98.3

84.5

Bacillus siamensis KCTC 13613^T

94.3

56.5

Bacillus nakamurai NRRL B-41091^T

86.3

30.7

Bacillus tequilensis KCTC 13622^T

77.7

20.7

Bacillus cabrialesii TE3^T

77.2

20.5

Bacillus inaquosorum KCTC 13429^T

77.5

20.9

Bacillus stercoris D7XPN1^T

77.0

20.4

Bacillus atrophaeus NRRL NRS 213^T

77.3

20.6

Bacillus amyloliquefaciens DSM 7^T

93.1

55.1

Characteristic	Results
Oxidase	-
Catalase	-
Temperature range (℃)	10-50
Maxium NaCl (%, W/V)	10.0
pH value	5.0-9.0
NA	+
R2A	+
MCA	+
TSA	+
Methyl red	-
Indole	+
Citric acid	+
VP	+

Characteristic

Results

Oxidase

Catalase

Temperature range (℃)

10-50

Maxium NaCl (%, W/V)

10.0

pH value

5.0-9.0

R2A

MCA

TSA

Methyl red

Indole

Citric acid

Genomic features	Results
Accession number	JBHEPW000000000
Size (Mb)	3.8
Number of contigs	31
G+C content (%)	46.4
Number of genes	3 984
L50 (bp)	3
N50 (bp)	393 092
Number of RNAs	52

Genomic features

Results

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JBHEPW000000000

Size (Mb)

3.8

Number of contigs

G+C content (%)

46.4

Number of genes

3 984

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N50 (bp)

393 092

Number of RNAs

Region	Types	Most similar known clusters	Similarity (%)
1.1	NRP-metallophore, NRPS, RiPP-like	Bacillibactin	100
1.2	Other	Bacilysin	100
2.1	NRPS, betalactone, transAT-PKS	Fengycin	80
2.2	TransAT-PKS, NRPS, T3PKS	Bacillaene	100
2.3	TransAT-PKS	Macrolactin H	100
3.1	NRPS	Surfactin	82
4.1	TransAT-PKS	Difficidin	46
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Region

Types

Most similar known clusters

Similarity (%)

1.1

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100

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NRPS

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