微生物学报

Strains	Description
Streptomyces rapamycinicus SIPI RP202	Mutated strain of S. rapamycinicus ATCC 29253 for BAC library construction
Escherichia coli DH10B	Donor strain carrying BAC plasmids for conjugative transfer
Escherichia coli ET12567/pUB307	Donor strain carrying the assisted plasmid pUB307 for conjugative transfer
Streptomyces albus Del14^[31]	Heterologous expression host
Streptomyces lividans SBT5	Heterologous expression host
Streptomyces coelicolor M1152	Heterologous expression host

Strains	Description
Streptomyces rapamycinicus SIPI RP202	Mutated strain of S. rapamycinicus ATCC 29253 for BAC library construction
Escherichia coli DH10B	Donor strain carrying BAC plasmids for conjugative transfer
Escherichia coli ET12567/pUB307	Donor strain carrying the assisted plasmid pUB307 for conjugative transfer
Streptomyces albus Del14^[31]	Heterologous expression host
Streptomyces lividans SBT5	Heterologous expression host
Streptomyces coelicolor M1152	Heterologous expression host

雷帕链霉菌未知天然产物合成基因簇异源表达与新结构混源萜rapamylic acids A-C鉴定

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虞旭昶 ¹^,² , 游蕤翔 ² , 吴雨洙 ² , 孙润泽 ² , 陈少欣 ³ , 吴辉 ¹ , 李雷 ²

微生物学报 | 研究报告 2025,65(5): 2214-2228

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(5): 2214-2228

雷帕链霉菌未知天然产物合成基因簇异源表达与新结构混源萜rapamylic acids A-C鉴定

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虞旭昶¹^,², 游蕤翔², 吴雨洙², 孙润泽², 陈少欣³, 吴辉¹, 李雷²

作者信息

^1.华东理工大学生物工程学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海

^2.上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海

^3.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，先导物成药性研究全国重点实验室，上海

Heterologous expression of unknown natural product biosynthetic gene clusters from Streptomyces rapamycinicus and identification of novel meroterpenoids rapamylic acids A-C

Xuchang YU¹^,², Ruixiang YOU², Yuzhu WU², Runze SUN², Shaoxin CHEN³, Hui WU¹, Lei LI²

Affiliations

^1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai, China

^2.State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China

^3.National Key Laboratory of Lead Druggability Research, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai, China

出版时间: 2025-05-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240802

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摘要

收起

【目的】雷帕链霉菌编码55个天然产物合成基因簇，蕴藏着丰富的生物合成潜力，但绝大部分基因簇尚未被鉴定。本研究旨在通过构建细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)文库，批量克隆雷帕链霉菌的新型基因簇，并将其导入模式链霉菌中进行异源表达，从而获得一系列新结构化合物。【方法】对雷帕链霉菌SIPI RP202编码的合成基因簇进行新颖性分析，挑选出11个编码非核糖体肽、聚酮或萜类的未知基因簇；构建BAC文库，并通过PCR筛选获得目标基因簇；利用接合转移将这些基因导入3种异源表达底盘菌株中，采用3种发酵培养基和2种发酵液萃取方法。利用LC-MS检测基因簇是否成功表达，最终对新结构化合物进行分离、纯化与结构解析。【结果】成功在一个未知的萜类合成基因簇中实现了异源表达，将其导入白色链霉菌Del14后，获得了3个新结构的芳香族混源萜化合物rapamylic acids A-C。结合化合物的结构特征与基因簇信息，推导了其潜在的生物合成途径。【结论】本研究基于批量基因簇高效克隆与异源表达策略，成功激活了一个雷帕链霉菌的沉默基因簇，为其他链霉菌沉默基因簇的表征提供了新思路。同时，rapamylic acids A-C作为全新结构的混源萜类化合物，也进一步拓展了细菌萜类化合物的多样性。

关键词

雷帕链霉菌 / 基因组挖掘 / 文库构建 / 异源表达 / 混源萜

Abstract

收起

[Objective] Streptomyces rapamycinicus has large biosynthetic potential with 55 natural product biosynthetic gene clusters (BGCs), most of which have not yet been identified. This study aims to obtain a series of novel compounds by Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library-based cloning of novel BGCs from S. rapamycinicus on a large scale and then heterologously expressing them in model Streptomyces strains. [Methods] The bioinformatics analysis of the novelty of BGCs screened out 11 unknown BGCs encoding non-ribosomal peptides, polyketides or terpenoids, from S. rapamycinicus SIPI RP202. Then, we cloned these BGCs by constructing a BAC library and screening via PCR, and then introduced them into three heterologous expression hosts by conjugative transfer. Finally, LC-MS was employed to detect whether these BGCs were successfully expressed after fermentation in three media and fermentation broth extraction with two approaches. Novel compounds were separated, purified, and structurally elucidated. [Results] An unknown terpenoid BGC was successfully expressed in Streptomyces albus Del14. Three novel aromatic meroterpenoids, rapamylic acids A-C, were identified. Then, the potential biosynthetic pathways of rapamylic acids A-C were proposed based on their structural features and BGC. [Conclusion] We successfully unlocked a silent BGC from S. rapamycinicus by large-scale BGC cloning and heterologous expression, providing an alternative strategy for the activation of silent BGCs from other Streptomyces strains. Meanwhile, the discovery of this kind of novel meroterpenoids expands the structural diversity of bacterial terpenoids.

Key words

Streptomyces rapamycinicus / genome mining / library construction / heterologous expression / meroterpenoid

引用本文

虞旭昶, 游蕤翔, 吴雨洙, 孙润泽, 陈少欣, 吴辉, 李雷. 雷帕链霉菌未知天然产物合成基因簇异源表达与新结构混源萜rapamylic acids A-C鉴定. 微生物学报, 2025 , 65 (5) : 2214 -2228 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240802

Xuchang YU, Ruixiang YOU, Yuzhu WU, Runze SUN, Shaoxin CHEN, Hui WU, Lei LI. Heterologous expression of unknown natural product biosynthetic gene clusters from Streptomyces rapamycinicus and identification of novel meroterpenoids rapamylic acids A-C[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (5) : 2214 -2228 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240802

正文

收起

链霉菌来源的天然产物是小分子药物的主要来源，在医学、农业与畜牧业等领域发挥着重要作用^[1]。近年来，随着低成本、高通量DNA测序技术的发展，大规模基因组测序揭示了链霉菌蕴藏着巨大的生物合成潜力，为新型天然产物的挖掘提供了丰富的资源^[2-4]。然而，研究表明超过90%的链霉菌天然产物生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster, BGC)在实验室条件下处于“沉默”状态。如何激活这些“沉默”基因簇，已成为目前获取新结构天然产物的重点与难点^[5-6]。过去10年间，多种合成生物学策略相继被开发用于链霉菌“沉默”基因簇的表征，包括启动子工程、调控网络优化以及文库构建与异源表达等^[7-13]。其中，(宏)基因组文库构建与基因簇异源表达的策略，因能够单次批量表征新型基因簇而受到广泛关注^[14-17]。基因组文库构建主要采用黏粒(cosmid)、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)与P1人工染色体(P1-derived artificial chromosome, PAC)等可以携载大片段DNA (40 kb以上)的载体，其中BAC文库可携载100-200 kb的大尺度基因簇，因此被广泛用于细菌基因组文库的构建^[13-18]。结合目标基因簇靶向筛选与异源表达，能够使天然产物合成途径与编码产物快速偶联，显著加速新结构天然产物的高效挖掘。例如，上海交通大学陶美凤课题组构建了娄彻氏链霉菌Sal35基因组BAC文库，利用高通量的文库表达筛选系统，实现了“点对点”的基因簇异源表达和产物抗菌活性筛选，成功鉴定了一种新型羊毛硫肽化合物lexapeptide^[16,19]。

雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus)是一种重要的工业微生物，用于生产被广泛使用的免疫抑制剂雷帕霉素^[20]。此外，大多数链霉菌基因组一般含有20-30个天然产物合成基因簇，但雷帕链霉菌基因组中却含有多达55个天然产物合成基因簇。其中，仅有6个基因簇的编码产物被鉴定^[21-26]，绝大部分仍处于“沉默”未表征状态，尤其是结构多样、成药性高的非核糖体肽(non-ribosomal peptides, NRPs)、聚酮(polyketides, PKs)与萜类(terpenoids)等合成基因簇，表明雷帕链霉菌仍具有巨大的挖掘潜力，有望获得更多新结构天然产物^[27-29]。本研究不再局限于雷帕链霉菌来源的基因簇原位非靶向激活，而是将克隆的基因簇导入不同的模式链霉菌底盘细胞^[30-31]，采用异源表达策略批量靶向表征感兴趣的基因簇。本研究所报道的新型混源萜类化合物，不仅拓展了细菌萜类化合物的结构多样性，而且其发现策略也为其他链霉菌沉默基因簇的激活提供了参考。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究中采用的基因簇克隆与表达菌株及其用途如表1所示，活性测试菌株与细胞信息的原始数据存储在国家微生物科学数据中心(http://nmdc.cn)，编号为NMDCX0002077。

1.1.2 培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，用于大肠杆菌培养；YPD培养基(g/L)：酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，用于真菌培养；TSBY培养基(g/L)：胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 30.0，蔗糖103.0，酵母提取物5.0，115 ℃灭菌30 min，灭菌后添加终浓度为0.5%的甘氨酸，用于文库构建时雷帕链霉菌培养；YENB培养基(g/L)：酵母提取物7.5，蛋白胨5.0，牛肉浸膏3.0，pH 7.0，用于制备高效大肠杆菌DH10B电转感受态；2×YT培养基(g/L)：胰蛋白胨16.0，酵母提取物10.0，NaCl 5.0，pH 7.2，用于异源表达底盘链霉菌的收集及接合转移；MS培养基(g/L)：黄豆饼粉20.0，甘露醇20.0，琼脂粉20.0，用于3种异源表达底盘链霉菌孢子培养及发酵；MISP4培养基(g/L)：黄豆饼粉5.0，甘露醇5.0，可溶性淀粉5.0，蛋白胨2.0，酵母粉1.0，NaCl 1.0，(NH₄)₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 1.0，CaCO₃ 2.0，琼脂粉20.0，微量元素溶液(ZnSO₄ 1.0，FeSO₄ 1.0，MnSO₄ 1.0) 1 mL，pH 7.0，灭菌后加入终浓度为10 mmol/L MgCl₂用于接合转移；TSB培养基(g/L)：胰蛋白胨大豆肉汤30.0，用于发酵时异源表达底盘链霉菌种子培养；A3M培养基(g/L)：葡萄糖5.0，甘油20.0，可溶性淀粉20.0，棉籽粉15.0，酵母提取物3.0，pH 7.0，用于发酵培养；R5a培养基(g/L)：蔗糖100.0，MOPS 21.0，葡萄糖10.0，MgCl₂·6H₂O 10.12，酵母提取物5.0，酪蛋白氨基酸0.1，NaOH 2.0，K₂SO₄ 0.25，CaCl₂ 0.005 88，ZnCl₂ 0.000 08，FeCl₃·6H₂O 0.000 4，MnCl₂ 0.000 02，CuCl₂ 0.000 02，Na₂B₄O₇·10H₂O 0.000 02，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.000 02，pH 6.9，用于发酵培养。

1.1.3 主要试剂和仪器

分析级甲醇、乙酸乙酯，上海泰坦科技股份有限公司；色谱级甲醇、乙腈，北京迪科马科技有限公司；限制性内切酶、FastAP去磷酸化酶，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；T4连接酶，纽英伦生物技术(北京)有限公司；2×PCR Mix，上海圣尔生物科技有限公司；Ultra GelRed Nucleic Acid Stain，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；HP20大孔吸附树脂，上海源叶生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒、小质粒提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；BAC/PAC DNA小量提取试剂盒，Omega Bio-Tek公司；Griess试剂盒，上海碧云天生物技术股份有限公司；PCR引物合成及产物测序由上海擎科生物科技有限公司完成，BAC末端测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

600 MHz核磁共振仪，布鲁克(北京)科技有限公司；1260系列高效液相色谱、6230系列TOF质谱联用仪(Agilent XBridge C18柱， 4.6 mm×150 mm，5 μm)以及1260系列半制备高效液相色谱仪(XBridge BEH C18 OBD Prep柱，10 mm×150 mm，5 µm)，安捷伦科技(中国)有限公司；PCR仪、脉冲场凝胶电泳仪和电洗脱仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；真空浓缩仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；振荡培养箱，上海旻泉仪器有限公司。

1.2 雷帕链霉菌天然产物合成基因簇分析

将测序完整的雷帕链霉菌ATCC 29253基因组序列上传至antiSMASH网站(https://antismash.secondarymetabolites.org/)进行天然产物合成基因簇分析，并结合NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对各基因簇中基因的功能进行分析注释。通过antiSMASH及MIBiG数据库对基因簇的新颖性进行分析，从中选择11个与已知基因簇相似度较低的、新颖的非核糖体肽、聚酮或萜类合成基因簇进行研究。

1.3 雷帕链霉菌基因组BAC文库构建与基因簇筛选鉴定

1.3.1 BAC载体制备

使用小质粒提取试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)提取pHZAUFXJ质粒(简称pHZ，由武汉八颗星生物科技有限公司提供)，用BamH I酶切质粒，并用FastAP去磷酸化酶进行载体去磷处理，通过胶回收纯化获得脱磷载体片段。

1.3.2 雷帕链霉菌大片段基因组DNA制备

采用低熔点琼脂糖包埋法提取雷帕链霉菌基因组DNA。首先，用TSBY培养基培养雷帕链霉菌SIPI RP202菌株48 h，收集5-10 g菌体；然后用1.5%低熔点琼脂糖包埋菌体，获得菌体包埋块。依次用2 mg/mL溶菌酶(1×TE)、1% SDS和1 mg/mL蛋白酶K (1×TE)预处理菌体包埋块，并用含1 mmol/L PMSF (10×TE)溶液处理后，获得雷帕链霉菌基因组DNA包埋块，悬浮于1×TE中4 ℃保存备用。

对DNA包埋块进行BamH I部分酶切，确定最佳酶切时间和酶切浓度，并通过脉冲场电泳确定电泳条件，确保酶切获得的片段大小在100-300 kb之间；通过大规模包埋块酶切与脉冲电泳，获得大量>100 kb的大片段基因组DNA片段。将100-300 kb范围内的DNA胶块切下，用电洗脱仪将DNA洗脱至1×TAE缓冲液中。

1.3.3 载体与大片段DNA连接以及文库构建

将载体与电洗脱回收的大片段DNA立即进行T4连接酶连接反应，16 ℃连接过夜。将连接产物在脱盐胶上冰浴静置1 h以实现脱盐；将脱盐后的连接产物与大肠杆菌DH10B感受态混匀，进行电转；37 ℃复苏1 h后，涂布于含有阿普拉霉素(50 μg/mL)、IPTG (100 μg/mL)和 X-gal (80 μg/mL)的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16-20 h。从LB平板上挑取30个白色克隆，提取对应BAC质粒，通过酶切与脉冲电泳验证BAC大小和文库质量。

从LB平板上挑取大量白色克隆转移至384孔板中，37 ℃培养20 h，待转化子长出后保存。BAC文库构建流程参照文献[13,19,32]中的方法。

1.3.4 目标基因簇筛选鉴定

从antiSMASH上下载对应基因簇序列，分别设计上、中、下3对引物。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取雷帕链霉菌SIPI RP202基因组，以此为模板验证引物的可用性(国家微生物科学数据中心编号为NMDCX0002077)。利用BAC/PAC DNA小量提取试剂盒提取BAC文库各行列池的混合质粒，以混合质粒为模板，在每个基因簇的上、中、下游位置分别设计引物，对每块384孔板的所有行列池进行PCR筛选，定位目标阳性克隆。PCR反应体系(25 μL)： 2×PCR Mix 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：95 °C预变性5 min；95 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，共35个循环；72 °C终延伸5 min。挑取定位的阳性克隆，提取BAC质粒，通过二次PCR鉴定与产物测序进行BAC鉴定。将BAC质粒进行末端测序，确定BAC所含基因簇的大小及基因组所在位置。

1.4 异源表达工程菌构建

1.4.1 异源宿主底盘链霉菌的选择与生孢

研究表明白色链霉菌、天蓝色链霉菌以及变铅青链霉菌系列底盘菌株具有遗传操作简便、生长快速、使用范围广且异源表达产量高等优势，已作为通用宿主广泛应用于外源基因簇的表达鉴定^[30,33-34]。此外，Myronovskyi等在白色链霉菌J1074基础上开发了Del14系列菌株，使其遗传背景更为干净，在天然产物表征方面具有显著优势^[31]。因此，本研究选用白色链霉菌Del14、天蓝色链霉菌M1152和变铅青链霉菌SBT5作为异源表达宿主，将3种异源表达菌株分别涂布于MS培养基上，30 ℃培养箱培养5-7 d获得孢子。

1.4.2 三亲接合转移获得异源表达工程菌

从BAC文库中筛选出含有目标基因簇的供体菌大肠杆菌DH10B/BACs (阿普拉霉素抗性)和辅助菌大肠杆菌ET12567/pUB307 (卡那霉素与氯霉素抗性)，划三线并挑取单菌落接种于6 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养过夜。按1%接种量接种于50 mL LB液体培养基中，继续培养2-3 h，至OD₆₀₀为0.4-0.6，4 ℃、4 500 r/min离心5 min后收集菌体，弃上清，用新鲜LB洗涤2遍以去除残留抗生素，并用LB重悬至100 μL，将2种大肠杆菌等体积混合。

从新鲜生孢的培养基上刮取各异源表达宿主链霉菌孢子，用2×YT洗涤孢子后重悬至100 μL，并与上述大肠杆菌混合，涂布于接合转移培养基MISP4 (含10 mmol/L Mg²⁺)上，30 ℃培养16-18 h后，覆盖萘啶酮酸和阿普拉霉素至接合转移平板上，30 ℃继续培养3-5 d获得接合子。

1.4.3 异源表达工程菌纯化与保菌

挑取阳性接合子，转接至含有萘啶酮酸和阿普拉霉素的生孢培养基上，经三代纯化后，待长出孢子菌落，通过PCR验证含有目标基因簇。用20%甘油收集异源表达工程菌孢子，-80 ℃保存备用。

1.5 异源宿主发酵检测

1.5.1 异源宿主工程菌种子与发酵培养

用灭菌牙签刮取所有异源底盘工程菌孢子，接种于TSB液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养48 h获得种子液；收集工程菌种子液，固定每一组实验组与对照组的菌体湿重，并以相同的种子湿重接种于发酵培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养7 d。

针对新型天然产物的挖掘，过去的研究已采用多种常规发酵培养基进行菌株发酵。例如，2018年，He等采用A3M培养基从印度异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustanus)中分离出4种新的邻苯二酚衍生物hinduchelins A-D^[35]。2022年，Libis等利用白色链霉菌J1074和变铅青链霉菌RedStrep 1.7进行异源表达，采用R5a培养基进行发酵，从中分离出prolinolexin、cinnamexin和conkatamycin 3种新化合物^[17]。Zhang等^[36]采用MS培养基对PPtase激活的菌株进行发酵测试，从中获得了多个新结构天然产物。鉴于此，本研究采用MS、A3M与R5a这3种发酵培养基进行后续的工程菌发酵。

1.5.2 发酵样品处理

培养结束后，收集发酵液35 mL，4 500 r/min离心10 min。取发酵液上清15 mL与质量体积分数为4%的HP20大孔吸附树脂在30 ℃、120 r/min条件下孵育3-5 h，用两层纱布过滤。将树脂洗涤后收集在50 mL离心管中，加12 mL甲醇超声20 min，使树脂吸附的化合物溶解于甲醇溶液中，收集甲醇溶液10 mL。将剩余20 mL发酵液用等体积乙酸乙酯萃取，4 500 r/min离心10 min，收集上层萃取液10 mL。将2种处理方式获得的样品进行真空浓缩，用200 μL甲醇溶解，12 000 r/min离心20 min，取上清进行LC-MS检测。

1.5.3 发酵处理液LC-MS检测

采用安捷伦Xbridge C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，在安捷伦1260系列高效液相色谱仪上采集并与6230系列TOF质谱仪连接，由MassHunter软件控制，进行发酵代谢物检测与分析。对于所有液相色谱分析，使用溶剂A：H₂O (含0.1%体积分数的甲酸)和溶剂B：CH₃CN (含0.1%体积分数的甲酸)。乙酸乙酯萃取液检测条件：t=0-1 min，5%溶剂B；t=1-2 min，5%-30%溶剂B；t=2-20 min，30%-95%溶剂B；t=20-25 min，95%溶剂B；t=25-26 min，95%-5%溶剂B；t=26-30 min，5%溶剂B；流速0.4 mL/min，25 °C。HP20提取物检测条件：t=0-1 min，5%溶剂B；t=1-15 min，5%-50%溶剂B；t=15-20 min，50%-95%溶剂B；t=20-25 min，95%溶剂B； t=25-26 min，95%-5%溶剂B；t=26-30 min，5%溶剂B；流速0.4 mL/min，25 °C。

1.6 放大发酵与目标化合物分离纯化

将白色链霉菌Del14/pHZ-1-7B工程菌的孢子悬浮液接种到50 mL TSB中，30 °C、200 r/min培养48 h。将10 mL种子培养物转移到500 mL R5a发酵液中，30 °C、200 r/min振荡7 d后，用乙酸乙酯萃取12 L发酵培养物，经旋蒸与真空浓缩得到2.78 g粗提取物。随后用Sephadex LH-20凝胶分离，甲醇洗脱后收集含有目标化合物的组分(0.84 g)。对合并的含目标化合物组分的样品采用安捷伦1260 系列高效液相色谱(Xbridge BEH Prep C18柱，10 mm×150 mm，5 μm，130 Å)进行二轮纯化。对于所有液相色谱分析，使用溶剂A：H₂O (含0.1%体积分数的甲酸)和溶剂B：CH₃CN (含0.1%体积分数的甲酸)。洗脱条件：t=0-2 min，35%溶剂B；t= 2-35 min，35%-65%溶剂B；t=35-36 min，65%-95%溶剂B；t=36-38 min，95%溶剂B；t=38-39 min，95%-35%溶剂B；t=39-40 min，35%溶剂B；流速2 mL/min，25 °C。馏分收集器收集对应目标化合物，通过LC-MS分析确定目标化合物的保留时间与纯度。

1.7 化合物活性测试

1.7.1 抗菌活性测试

所有抗菌实验均在96孔微量滴定板上使用培养基微量稀释法进行。对于Staphylococcus aureus Newman菌株，过夜培养后LB稀释 10 000倍；对于Enterococcus faecalis ATCC 51299菌株，过夜培养后LB稀释2 000倍；其余菌株过夜培养后用LB稀释5 000倍。过夜培养的真菌使用YPD培养基稀释5 000倍。将100 µL稀释菌液与100 μL 2倍连续稀释的化合物混合，终浓度范围为64-0.125 μg/mL。将96孔微量滴定板在37 °C下培养16 h后观察抑菌情况。抑制可见微生物生长的最低浓度被记录为最小抑制浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)，所有MIC测定均重复2次。

1.7.2 细胞毒性测试

采用CCK-8法测试3种化合物的细胞毒性，测试的人源细胞系为HEK293T和HeLa。在96孔板中每孔加入100 μL测试细胞，使细胞数约为5 000个。将细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养24 h，使细胞贴壁。每孔分别加入32、16、8、4、2、1、0.5、0.125 μg/mL的化合物(以2 µmol/L紫杉醇为阳性对照)，置于细胞培养箱中孵育。24 h后加入CCK-8溶液，用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。

1.7.3 抗炎活性测试

利用小鼠巨噬细胞RAW 264.7极化产生的NO含量来表征炎症程度。实验中，NO含量的减少表明化合物具有抑制炎症的活性。首先准备RAW 264.7细胞，将生长状态良好的RAW 264.7细胞接种于96孔板中，密度为5×10⁴/孔，每孔体积为200 μL。细胞培养20 h后，用不同浓度的化合物进行处理(以L-NMMA为阳性对照)，随后加入1 μg/mL LPS，放入培养箱中孵育过夜，12 h后取细胞上清液，利用Griess试剂盒测定570 nm处的吸光度，从而确定NO浓度。

2 结果与分析

收起

2.1 雷帕链霉菌来源的天然产物合成基因簇新颖性分析

antiSMASH 7.1.0预测结果表明，雷帕链霉菌SIPI RP202基因组中包含55个天然产物合成基因簇。其中，只有6个基因簇被鉴定，其产物包括雷帕霉素、放线菌酸、尼日利亚菌素、洋橄榄叶素、安莎类抗生素和六烯类抗生素^[21-26]。虽然剩余基因簇中15个被预测编码已知化合物，但仍有35个基因簇具有不同程度的新颖性，可能编码多种新结构天然产物。其中，编码非核糖体肽、聚酮或萜类的基因簇多达16个(图1A)。基于antiSMASH结果，系统分析了这16个基因簇的新颖性，并选择11个进行后续研究(图1B、1C)，包括3个萜类、4个聚酮类、3个非核糖体肽类和1个聚酮与非核糖体肽杂合类的合成基因簇。

2.2 高质量雷帕链霉菌基因组BAC文库构建与11个目标基因簇批量克隆

为了同时克隆所有11个目标基因簇，构建了雷帕链霉菌基因组BAC文库，包含2 304个克隆，分布在6块384孔板中(图2A)。随机挑取30个BACs进行文库质量鉴定，平均插入片段大小为150.5 kb，表明所构建的文库覆盖基因组倍数约为27.3倍，每块384孔板的基因组覆盖倍数为4.6倍(国家微生物科学数据中心编号为NMDCX0002077)。在获得高质量雷帕链霉菌基因组BAC文库后，针对11个基因簇分别设计了行列池PCR筛选引物，获得了包含目标基因簇的BACs，并通过BAC末端测序确定了克隆的基因簇大小(图2B)。

2.3 11个目标基因簇的异源表达

将筛选到的含有目标基因簇的BACs的克隆载体pHZ (作为阴性对照)通过三亲接合转移方式分别导入3种模式链霉菌进行异源表达，包括白色链霉菌(Streptomyces albus) Del14、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) M1152与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) SBT5 (表1)。通过抗性筛选获得接合子，并经菌落PCR鉴定，成功获得了所有11个基因簇的3种异源表达工程菌。采用R5a、MS、A3M等3种发酵培养基对上述所有工程菌在30 ℃、200 r/min条件下发酵7 d后，通过大孔吸附树脂HP20和乙酸乙酯分别处理发酵液，并基于液相色谱-质谱(LC-MS)分析检测目标化合物是否产生(图2C)。与导入空载体pHZ的白色链霉菌Del14 (S. albus Del14/pHZ)相比，导入1.7 BGC region对应的萜类合成基因簇的白色链霉菌Del14工程菌(S. albus Del14/pHZ-1-7B)在R5a培养基中鉴定到3个新的紫外吸收差异峰，保留时间分别为10.0、13.5和15.0 min (图2C)。特别地，这3个新峰在质谱负模式检测下显示出非常干净的[M-H]^-数据，分别为276.125 0、318.171 5和344.187 3，表明工程菌可能产生了3个潜在的新化合物(图2D)。同时，还能观察到这3个潜在化合物在质谱检测时对应的[2M-H]^-结果(图2D)。

2.4 异源宿主工程菌白色链霉菌Del14/pHZ-1-7B中潜在新化合物的分离纯化与结构鉴定

为了获得白色链霉菌Del14/pHZ-1-7B产生的潜在新化合物，对其进行了大规模发酵。采用R5a培养基发酵获得12 L发酵液后，通过乙酸乙酯萃取发酵液并旋蒸浓缩，待蒸发至恒重后称重，获得棕色油膏状粗样2.78 g。使用Sephadex LH-20凝胶柱进行潜在新化合物的第一轮纯化，从第31-60管的甲醇洗脱液中检测到目标化合物，合并后共收集浓缩获得粗样0.84 g。利用安捷伦半制备高效液相色谱进行纯化，最终分离出3个紫外吸收差异峰对应的目标化合物，其中Peak 1为36.1 mg、Peak 2为8.2 mg、Peak 3为1.8 mg。

紫外吸收图谱显示，Peak 1在204、222、244和280 nm处有最大吸收峰，Peak 2在204、222、244和284 nm处有最大吸收峰，Peak 3在204、244和286 nm处有最大吸收峰。Peak 1和Peak 2的紫外吸收图谱十分接近(国家微生物科学数据中心编号为NMDCX0002077)。通过高分辨质谱并结合氢谱和碳谱核磁数据，确定了3个目标化合物的分子式，分别为Peak 1：C₁₅H₁₉NO₄，[M-H]^-理论值为276.124 1，实际观察值为276.124 3；Peak 2：C₁₈H₂₅NO₄，[M-H]^-理论值为318.171 1，实际观察值为318.171 1；Peak 3：C₂₀H₂₇NO₄，[M-H]^-理论值为344.186 7，实际观察值为344.186 7。结合一维和二维核磁数据，分别归属了3个化合物的碳原子和氢原子，从而解析了它们对应的化学结构(图3A)。通过与SciFinder和微谱等已知数据库比对，确认Peaks 1-3对应的化合物均为新结构化合物。作为一类新型芳香族混源萜化合物，3个化合物的结构中均含有1个苯环骨架，并包含3个取代基：第1个是羟基，第2个是酰胺基，第3个是不同碳链长度并修饰的异戊烯基。结合该类化合物的来源与结构特征，将其分别命名为Rapamylic acids A、B和C (图3A)。

2.5 Rapamylic acids潜在的生物合成途径推测

通过对rapamylic acids合成基因簇的注释以及对不同编码蛋白功能的详细分析(图3B、3C)，进一步分析了该基因簇在其他链霉菌中的分布情况。结果表明，rapamylic acids合成基因簇并非雷帕链霉菌所独有，其高度同源基因簇在多种链霉菌中广泛分布，例如Streptomyces rhizosphaericus、Streptomyces sp. MK37H和Streptomyces sp. NPDC059455等，其中关键功能蛋白萜类合酶和异戊烯基转移酶的相似性均达到97%以上。

本研究所发现的rapamylic acids是一类含有典型异戊烯基侧链的芳香族混源萜类化合物。芳香族混源萜类化合物多为1,2,4-三取代苯基萜类化合物，其芳香族骨架主要来源于为莽草酸途径^[37]。萜类合成起始于异戊烯基焦磷酸(isoprenyl diphosphate, IPP)与二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)，在异戊烯基转移酶(prenyltransferase, PT)的催化下生成不同碳链长度的异戊烯基骨架。最后，在萜类合酶(terpene synthases, TS)的催化下，将异戊烯基加载至苯环上，形成芳香族混源萜^[38]。

本研究同时推测了这3个新化合物的潜在合成途径。首先，在由rmaB、rmaD和rmaE等基因组成的甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径催化下合成IPP和DMAPP，并通过rmaI编码的酶催化形成法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)^[38-39]。1,2,4-三取代的苯环骨架则通过rmaF、rmaH和rmaG等基因催化形成。Rapamylic acids合成基因簇缺乏编码3-羟基-4-氨基苯甲酸酰化酶、3-羟基-4-氨基苯甲酸脱羧酶和异戊烯基链羧化酶相关基因。推测这些功能可能由异源表达宿主白色链霉菌中的内源性酶替代，这或许也是在原始宿主雷帕链霉菌中未检测到rapamylic acids的原因之一^[40]。其次，在ramC编码的萜类合酶的催化下形成法尼基焦磷酸修饰的3-羟基-4-酰胺化的混源萜前体。最后，受脂肪酸β-氧化(peroxisomal β- oxidation)中“Cleavage Pathway”途径的启发^[41-42]，rapamylic acids中不同碳链长度的异戊烯基侧链的形成很可能通过β-氧化途径实现异戊烯基链的不同碳原子数目的丢失，最终形成结构多样的3类新型芳香族混源萜(图4)。

2.6 Rapamylic acids A-C化合物活性测试

本研究对rapamylic acids A-C的生物活性进行了测试，包括抗菌活性(涵盖4株革兰氏阳性菌、4株革兰氏阴性菌和2株真菌)、细胞毒性与抗炎活性。遗憾的是，这些化合物均未表现出明显的活性(国家微生物科学数据中心编号为NMDCX0002077)。

3 讨论与结论

收起

雷帕链霉菌中蕴藏着大量功能未知的天然产物合成基因簇，其中大多数在实验室条件下处于不表达或低表达的“沉默”状态，这使得从原始菌株中发现更多新结构化合物变得极具挑战性^[6]。为了充分挖掘雷帕链霉菌的生物合成潜力，本研究采用基于BAC文库的批量克隆策略，成功获得了11个新颖的目标基因簇。在此基础上，通过不同异源宿主对目标基因簇进行表达，并结合多种发酵检测条件的优化，成功激活了1个新型基因簇，并分离出一类新结构芳香族混源萜类化合物rapamylic acids。Rapamylic acids作为全新结构的混源萜类化合物，不仅拓展了细菌萜类化合物的多样性，而且本研究所采用的批量基因簇高效克隆与异源表达策略，也为链霉菌或其他微生物沉默基因簇的表征提供了新的思路。

通过对rapamylic acids潜在生物合成途径的分析，我们认为该基因簇在雷帕链霉菌原始菌株中不表达的原因，很可能是其合成过程涉及多个异源宿主中的内源性酶的参与。这恰恰表明，使用多种异源宿主底盘细胞在激活沉默基因簇方面具有明显优势。然而，本研究仅对该类化合物的生物合成途径进行了预测，后续需要通过基因敲除、前体喂养等策略进行验证，从而深入解析其生物合成途径^[43]。最后，本研究从雷帕链霉菌中筛选了11个未知基因簇，但通过多底盘异源表达与不同发酵检测条件的优化，仅成功激活了1个基因簇。未来，仍需采用更多的合成生物学策略，如前体工程与启动子工程等，进一步表征雷帕链霉菌其他新颖的基因簇^[44]。

基金

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国家重点研发计划(2023YFA0916200)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

NEWMAN

, CRAGG

. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019[J]. Journal of Natural Products, 2020, 83(3): 770-803.

[2]

HEMMERLING

, PIEL

. Strategies to access biosynthetic novelty in bacterial genomes for drug discovery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2022, 21(5): 359-378.

[3]

GAVRIILIDOU

, KAUTSAR

, ZABURANNYI

, KRUG

, MÜLLER

, MEDEMA

, ZIEMERT

. Compendium of specialized metabolite biosynthetic diversity encoded in bacterial genomes[J]. Nature Microbiology, 2022, 7: 726-735.

[4]

LACEY

, RUTLEDGE

. Recently discovered secondary metabolites from Streptomyces species[J]. Molecules, 2022, 27(3): 887.

[5]

侯路宽, 李花月, 李文利. 隐性次级代谢产物生物合成基因簇的激活及天然产物定向发现[J]. 微生物学报, 2017, 57(11): 1722-1734.

HOU

, LI

. Activation of cryptic microbial biosynthetic gene clusters and structure-guided natural product discovery[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(11): 1722-1734 (in Chinese).

[6]

RUTLEDGE

, CHALLIS

. Discovery of microbial natural products by activation of silent biosynthetic gene clusters[J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13(8): 509-523.

[7]

. Next-generation synthetic biology approaches for the accelerated discovery of microbial natural products[J]. Engineering Microbiology, 2022, 3(1): 100060.

[8]

, JIANG

, LU

. New strategies and approaches for engineering biosynthetic gene clusters of microbial natural products[J]. Biotechnology Advances, 2017, 35(8): 936-949.

[9]

WANG

, ZHOU

, CHEN

, JING

, ZHENG

, LI

, SUN

, LIU

, FU

, HUO

, LI

, SHEN

, DING

, MÜLLER

, BIAN

, ZHANG

. Discovery of recombinases enables genome mining of cryptic biosynthetic gene clusters in Burkholderiales species[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(18): E4255-E4263.

[10]

, LIU

, TANG

, WANG

, WU

, LIANG

. CRISETR: an efficient technology for multiplexed refactoring of biosynthetic gene clusters[J]. Nucleic Acids Research, 2024, 52(18): 11378-11393.

[11]

KWON

, STEINIGER

, CAIRNS

, WISECAVER

, LIND

, POHL

, REGNER

, ROKAS

, MEYER

. Beyond the biosynthetic gene cluster paradigm: genome-wide coexpression networks connect clustered and unclustered transcription factors to secondary metabolic pathways[J]. Microbiology Spectrum, 2021, 9(2): e0089821.

[12]

HUO

, HUG JJ, FU

, BIAN

, ZHANG

, MÜLLER

. Heterologous expression of bacterial natural product biosynthetic pathways[J]. Natural Product Reports, 2019, 36(10): 1412-1436.

[13]

DENG

, ZHOU

, LUO

, DENG

, ZHAO

. Heterologous expression of avermectins biosynthetic gene cluster by construction of a Bacterial Artificial Chromosome library of the producers[J]. Synthetic and Systems Biotechnology, 2017, 2(1): 59-64.

[14]

LIBIS

, ANTONOVSKY

, ZHANG

, SHANG

, MONTIEL

, MANIKO

, TERNEI

, CALLE

, LEMETRE

, OWEN

, BRADY

. Uncovering the biosynthetic potential of rare metagenomic DNA using co-occurrence network analysis of targeted sequences[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 3848.

[15]

BAUER

, KING

, BRADY

. Utahmycins A and B, azaquinones produced by an environmental DNA clone[J]. Journal of Natural Products, 2010, 73(5): 976-979.

[16]

, WANG

, ZHAO

, GAO

, HUANG

, KANG

, HE

, LIN

, PANG

, DENG

, TAO

. Functional genome mining for metabolites encoded by large gene clusters through heterologous expression of a whole-genome bacterial artificial chromosome library in Streptomyces spp.[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82(19): 5795-5805.

[17]

LIBIS

, MACINTYRE

, MEHMOOD

, GUERRERO

, TERNEI

, ANTONOVSKY

, BURIAN

, WANG

, BRADY

. Multiplexed mobilization and expression of biosynthetic gene clusters[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 5256.

[18]

高花花, 胡娟, 刘玲丽. 基因簇大片段克隆技术研究进展及挑战[J]. 微生物学通报, 2023, 50(1): 351-367.

GAO

, HU

, LIU

. Research progress and challenges in cloning large gene clusters[J]. Microbiology China, 2023, 50(1): 351-367 (in Chinese).

[19]

, ZHANG

, CHENG

, BASHIRI

, WANG

, HONG

, WANG

, XU

, CHEN

, HUANG

, LIN

, DENG

, TAO

. Functional genome mining reveals a class V lanthipeptide containing a d-amino acid introduced by an F₄₂₀H₂-dependent reductase[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2020, 59(41): 18029-18035.

[20]

, WANG

, MA

, ZHENG

, ZIMIN

, JIANG

, TIAN

, LU

. Crossregulation of rapamycin and elaiophylin biosynthesis by RapH in Streptomyces rapamycinicus [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2022, 106(5-6): 2147-2159.

[21]

VÉZINA

, KUDELSKI

, SEHGAL

. Rapamycin (AY-22, 989), a new antifungal antibiotic. I. taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle[J]. The Journal of Antibiotics, 1975, 28(10): 721-726.

[22]

MRAK

, KRASTEL

, LUKANČIČ

, TAO

, PISTORIUS

, MOORE

. Discovery of the actinoplanic acid pathway in Streptomyces rapamycinicus reveals a genetically conserved synergism with rapamycin[J]. Journal of Biological Chemistry, 2018, 293(52): 19982-19995.

[23]

STEINRAUF

, PINKERTON

, CHAMBERLIN

. The structure of nigericin[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1968, 33(1): 29-31.

[24]

FANG

, WONG

, DEMAIN

. Enhancement of the antifungal activity of rapamycin by the coproduced elaiophylin and nigericin[J]. The Journal of Antibiotics, 2000, 53(2): 158-162.

[25]

FURUMAI

, YAMAKAWA

, YOSHIDA

, IGARASHI

. Clethramycin, a new inhibitor of pollen tube growth with antifungal activity from Streptomyces hygroscopicus TP-A0623. I. screening, taxonomy, fermentation, isolation and biological properties[J]. The Journal of Antibiotics, 2003, 56(8): 700-704.

[26]

CAI

, KONG

, RUPPEN

, GLASIER

, CARTER

. Hygrocins A and B, naphthoquinone macrolides from Streptomyces hygroscopicus [J]. Journal of Natural Products, 2005, 68(12): 1736-1742.

[27]

BOZHÜYÜK

KAJ

, PRÄVE

, KEGLER

, SCHENK

, KAISER

, SCHELHAS

, SHI

, KUTTENLOCHNER

, SCHREIBER

, KANDLER

, ALANJARY

, MOHIUDDIN

, GROLL

, HOCHBERG

GKA

, BODE

. Evolution-inspired engineering of nonribosomal peptide synthetases[J]. Science, 2024, 383(6689): eadg4320.

[28]

GRININGER

. Enzymology of assembly line synthesis by modular polyketide synthases[J]. Nature Chemical Biology, 2023, 19(4): 401-415.

[29]

GOZARI

, ALBORZ

, EL-SEEDI

, JASSBI

. Chemistry, biosynthesis and biological activity of terpenoids and meroterpenoids in bacteria and fungi isolated from different marine habitats[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 210: 112957.

[30]

肖丽萍, 邓子新, 刘天罡. 链霉菌底盘细胞的开发现状及其应用[J]. 微生物学报, 2016, 56(3): 441-453.

XIAO

, DENG

, LIU

. Progress in developing and applying Streptomyces chassis-a review[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(3): 441-453 (in Chinese).

[31]

MYRONOVSKYI

, ROSENKRÄNZER

, NADMID

, PUJIC

, NORMAND

, LUZHETSKYY

. Generation of a cluster-free Streptomyces albus chassis strains for improved heterologous expression of secondary metabolite clusters[J]. Metabolic Engineering, 2018, 49: 316-324.

[32]

刘家栋, 王革娇, 罗美中. 阿维链霉菌BAC文库的构建及分析[J]. 华中农业大学学报, 2016, 35(5): 45-50.

LIU

, WANG

, LUO

. Construction and analysis of a BAC library of Streptomyces avermitilis genome[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2016, 35(5): 45-50 (in Chinese).

[33]

BALTZ

. Streptomyces and Saccharopolyspora hosts for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2010, 37(8): 759-772.

[34]

ZHANG

, TANG

, MOORE

. Genetic platforms for heterologous expression of microbial natural products[J]. Natural Product Reports, 2019, 36(9): 1313-1332.

[35]

, NAKAMURA

, HOSHINO

, FONG CHIN

, YANG

, ZHANG

, HAYASHI

, ABE I. Hinduchelins A-D, noncytotoxic catechol derivatives from Streptoalloteichus hindustanus [J]. Journal of Natural Products, 2018, 81(6): 1493-1496.

[36]

ZHANG

, TIAN

, WANG

, YAN

, JIA

, PIERENS

, CHEN

, MA

, DENG

, QU

. Activation of natural products biosynthetic pathways via a protein modification level regulation[J]. ACS Chemical Biology, 2017, 12(7): 1732-1736.

[37]

RUSSO

, MILELLA

. Recent Advances in Natural Products Analysis[M]. Amsterdam: Elsevier, 2020: 477-501.

[38]

RUDOLF

, ALSUP

, XU

, LI

. Bacterial terpenome[J]. Natural Product Reports, 2021, 38(5): 905-980.

[39]

FRANK

, GROLL

. The methylerythritol phosphate pathway to isoprenoids[J]. Chemical Reviews, 2017, 117(8): 5675-5703.

[40]

WANG

, YANG

, ABE I. Modifications of prenyl side chains in natural product biosynthesis[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(52): e202415279.

[41]

ZHANG

, DU

, QU

, ZHANG

, LI

, QI

, WANG

, JIANG

, MEN P, SUN

, CAO

, GENG

, QI

, WAN

, LIU

, LI

. Compartmentalized biosynthesis of mycophenolic acid[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2019, 116(27): 13305-13310.

[42]

, LEGAKO

, ESPINDOLA

APDM

, MACMILLAN

. Erythrolic acids A-E, meroterpenoids from a marine-derived Erythrobacter sp.[J]. The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77(7): 3401-3407.

[43]

PRÄVE

, SEYFERT

, BOZHÜYÜK

KAJ

, RACINE

, MÜLLER

, BODE

. Investigation of the odilorhabdin biosynthetic gene cluster using NRPS engineering[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(33): e202406389.

[44]

, WANG

, WAGLECHNER

, CULP

, GUITOR

, WRIGHT

. GPAHe_x-A synthetic biology platform for type IV-V glycopeptide antibiotic production and discovery[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 5232.

2025年第65卷第5期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240802

接收时间：2024-12-12
首发时间：2026-02-05
出版时间：2025-05-04

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收稿日期：2024-12-12
录用日期：2025-01-02

基金

National Key Research and Development Program of China(2023YFA0916200)

国家重点研发计划(2023YFA0916200)

作者信息

^1.华东理工大学生物工程学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海

^2.上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海

^3.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，先导物成药性研究全国重点实验室，上海

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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