微生物学报

Strains and plasmids	Description	Sources
Strains
Escherichia coli
TG1	Host for cloning	Laboratory collection
S17-1	λ-pir lysogen of S17-1, F^-thiprohsdR [RP4-2 Tc::Mu Km::Tn7 (Tp Sm)]	Laboratory collection
BL21(DE3)	F^-ompT hsdS (r_B^-, m_B^-) gal dcm (DE3)	Laboratory collection
LuxS^- BL21(DE3)	ΔluxS deletion mutant in E. coli BL21(DE3)	Laboratory collection
Vibrio harveyi
V. harveyi MM32	luxN::cat luxS::Tn5kan	[22]
Halomonas elongata
Halomonas elongata DSM 2581	Wild-type	GDMCC
Δtar1	tar1 deletion mutant derived from H. elongata	This study
Plasmids
pK18mobsacB	sacB-based suicide vector for gene knockout, Kan^r	Laboratory collection
pK18mobsacB-Δtar1	Containing tar1 knockout fragment	This study
pBBR1MCS-1	Broad-host-range vector, Chl^r	Laboratory collection
pBBR1MCS-1-tar1	Tar1 was cloned into pBBR1MCS-1	This study
pET-28a	Bacterial vector for expression of N-terminally His₆-tagged proteins, Kan^r	Laboratory collection
pET-28a-tar1-LBD	pET-28a expressing tar1-LBD	This study
pET-28a-tar1-LBD_R88A	pET-28a expressing tar1-LBD_R88A	This study
pET-28a-tar1-LBD_W90A	pET-28a expressing tar1-LBD_W90A	This study
pET-28a-tar1-LBD_Y106A	pET-28a expressing tar1-LBD_Y106A	This study
pET-28a-tar1-LBD_D108A	pET-28a expressing tar1-LBD_D108A	This study

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Strains
Escherichia coli
TG1	Host for cloning	Laboratory collection
S17-1	λ-pir lysogen of S17-1, F^-thiprohsdR [RP4-2 Tc::Mu Km::Tn7 (Tp Sm)]	Laboratory collection
BL21(DE3)	F^-ompT hsdS (r_B^-, m_B^-) gal dcm (DE3)	Laboratory collection
LuxS^- BL21(DE3)	ΔluxS deletion mutant in E. coli BL21(DE3)	Laboratory collection
Vibrio harveyi
V. harveyi MM32	luxN::cat luxS::Tn5kan	[22]
Halomonas elongata
Halomonas elongata DSM 2581	Wild-type	GDMCC
Δtar1	tar1 deletion mutant derived from H. elongata	This study
Plasmids
pK18mobsacB	sacB-based suicide vector for gene knockout, Kan^r	Laboratory collection
pK18mobsacB-Δtar1	Containing tar1 knockout fragment	This study
pBBR1MCS-1	Broad-host-range vector, Chl^r	Laboratory collection
pBBR1MCS-1-tar1	Tar1 was cloned into pBBR1MCS-1	This study
pET-28a	Bacterial vector for expression of N-terminally His₆-tagged proteins, Kan^r	Laboratory collection
pET-28a-tar1-LBD	pET-28a expressing tar1-LBD	This study
pET-28a-tar1-LBD_R88A	pET-28a expressing tar1-LBD_R88A	This study
pET-28a-tar1-LBD_W90A	pET-28a expressing tar1-LBD_W90A	This study
pET-28a-tar1-LBD_Y106A	pET-28a expressing tar1-LBD_Y106A	This study
pET-28a-tar1-LBD_D108A	pET-28a expressing tar1-LBD_D108A	This study

Primers name	Primer sequences (5′→3′)	Purpose
tar1-UP-F	CCGGAATTCCAATACGCTCAAGCAGGAAG	To generate pK18mobsacB-Δtar1
tar1-UP-R	GCTCGGCATCTCGCAATGAGGTCAACAT
tar1-DOWN-F	CTCATTGCGAGATGCCGAGCCAGCGTGAGG
tar1-DOWN-R	CCCAAGCTTGTTGGTGGAACTGGTGATGG
tar1-F	CGGGGTACCATGTTGACCTCATTGCGACT	To generate pBBR1MCS-1-tar1
tar1-R	CCCAAGCTTTCACGCTGGCTCGGCATCTT
tar1LBD-HF	CGCGGATCCATGGAATCCCACAACGAA	To generate pET-28a-tar1-LBD
tar1LBD-HR	ACGCGTCGACTCAGGAGGCGCTCATCAC
tar1LBD_R88A -HF	GGGGTATGACCCGCGCGAGGCCCCCTGGTATCGCCAGGCCGTGGA	To generate pET-28a-tar1-LBD_R88A
tar1LBD_R88A -HR	TCCACGGCCTGGCGATACCAGGGGGCCTCGCGCGGGTCATACCCC
tar1LBD_W90A -HF	GTATGACCCGCGCGAGCGCCCCGCGTATCGCCAGGCCGTGGAGGC	To generate pET-28a-tar1-LBD_W90A
tar1LBD_W90A -HR	GCCTCCACGGCCTGGCGATACGCGGGGCGCTCGCGCGGGTCATAC
tar1LBD_Y106A -HF	GTCCACCGTGGTCACCGCGCCCGCTGAGGACGCCACGTCCGACAA	To generate pET-28a-tar1-LBD_Y106A
tar1LBD_Y106A -HR	TTGTCGGACGTGGCGTCCTCAGCGGGCGCGGTGACCACGGTGGAC
tar1LBD_D108A -HF	GGTCACCGCGCCCTATGAGGCCGCCACGTCCGACAAGCTGGTGGT	To generate pET-28a-tar1-LBD_D108A
tar1LBD_D108A -HR	ACCACCAGCTTGTCGGACGTGGCGGCCTCATAGGGCGCGGTGACC

Primers name	Primer sequences (5′→3′)	Purpose
tar1-UP-F	CCGGAATTCCAATACGCTCAAGCAGGAAG	To generate pK18mobsacB-Δtar1
tar1-UP-R	GCTCGGCATCTCGCAATGAGGTCAACAT
tar1-DOWN-F	CTCATTGCGAGATGCCGAGCCAGCGTGAGG
tar1-DOWN-R	CCCAAGCTTGTTGGTGGAACTGGTGATGG
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信号分子自诱导物-2 (AI-2)通过Tar1调节伸长盐单胞菌的趋化运动和生物膜形成

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王卓 ¹ , 魏嘉倓 ² , 杨艳艳 ² , 郭欣 ² , 王传旭 ¹ , 杨静 ¹ , 牛亚洁 ¹ , 李新 ¹^,³

微生物学报 | 研究报告 2026,66(2): 770-782

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(2): 770-782

信号分子自诱导物-2 (AI-2)通过Tar1调节伸长盐单胞菌的趋化运动和生物膜形成

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王卓¹, 魏嘉倓², 杨艳艳², 郭欣², 王传旭¹, 杨静¹, 牛亚洁¹, 李新¹^,³

作者信息

^1.运城学院生命科学系，运城盐湖生态保护与资源利用厅市共建山西省重点实验室，山西运城

^2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷

^3.忻州师范学院生物系，山西忻州

The signaling molecule autoinducer-2 regulates the chemotaxis and biofilm formation of Halomonas elongata via Tar1

Zhuo WANG¹, Jiatan WEI², Yanyan YANG², Xin GUO², Chuanxu WANG¹, Jing YANG¹, Yajie NIU¹, Xin LI¹^,³

Affiliations

^1.Shanxi Key Laboratory of Yuncheng Salt Lake Ecological Protection and Resource Utilization, Life Sciences Department, Yuncheng University, Yuncheng, Shanxi, China

^2.College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi, China

^3.Department of Biology, Xinzhou Normal University, Xinzhou, Shanxi, China

出版时间: 2026-02-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250647

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摘要

收起

自诱导物-2 (autoinducer-2, AI-2)是一种广泛存在于细菌中的种间群体感应信号分子，参与调解生物发光、趋化运动以及生物膜形成等许多重要的生理过程。然而，AI-2对伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的影响及其作用机制尚未见报道。 【目的】 揭示伸长盐单胞菌中信号分子AI-2的受体蛋白，并检测AI-2通过受体蛋白对伸长盐单胞菌趋化运动和生物膜形成能力产生的影响。 【方法】 采用毛细管定量分析法检测伸长盐单胞菌对AI-2的趋化响应；通过对甲基趋化受体蛋白进行结构域分析、序列比对和分子对接找到AI-2的潜在受体蛋白Tar1及其关键氨基酸位点；表达并纯化Tar1的配体结合结构域(ligand-binding domain, LBD)蛋白及其点突蛋白，通过哈维氏弧菌发光试验检测Tar1-LBD是否结合信号分子AI-2；运用同源重组技术构建tar1基因缺失突变体，并通过毛细管定量分析和生物膜形成试验检测AI-2对伸长盐单胞菌趋化运动和生物膜形成的影响。 【结果】 毛细管定量分析法显示伸长盐单胞菌对信号分子AI-2表现出趋向性。在伸长盐单胞菌中共找到4个甲基受体趋化蛋白，结构域分析、序列比对、分子对接以及哈维氏弧菌发光试验表明Tar1-LBD能够结合信号分子AI-2。利用同源重组技术成功构建了伸长盐单胞菌tar1基因缺失突变体，tar1基因的缺失会抑制伸长盐单胞菌对AI-2的趋化响应，而互补菌株的趋化响应可恢复到接近野生型的水平。此外，生物膜形成试验检测显示，AI-2能够通过Tar1促进伸长盐单胞菌的生物膜形成。 【结论】 伸长盐单胞菌对信号分子AI-2具有趋化性，AI-2通过结合甲基趋化受体蛋白Tar1的配体结合结构域来调控伸长盐单胞菌的趋化运动和生物膜形成。

关键词

伸长盐单胞菌 / 自诱导物-2 (AI-2) / 受体蛋白 / 趋化性 / 生物膜形成

Abstract

收起

As a widely conserved interspecies quorum sensing signaling molecule, autoinducer-2 (AI-2) is involved in regulating various crucial physiological processes such as bioluminescence, chemotaxis, and biofilm formation. However, the effects of AI-2 on Halomonas elongata and its underlying mechanisms remain unreported. [Objective] To reveal the receptor that regulates the chemotaxis and biofilm formation of H. elongata in response to AI-2. [Methods] The quantitative capillary assay was employed to examine the chemotactic response of H. elongata to AI-2. We conducted protein domain identification, sequence alignment, and molecular docking of methyl-accepting chemotaxis proteins to identify the key amino acid sites in Tar1, the potential AI-2 receptor. The ligand-binding domain (LBD) of Tar1 and single-point mutants were expressed and purified, and the binding between Tar1-LBD and AI-2 was measured by the Vibrio harveyi MM32 bioluminescence assay. tar1 was deleted by homologous recombination, and the effects of AI-2 on the chemotaxis and biofilm formation of H. elongata were evaluated by quantitative capillary and biofilm formation assays. [Results] The quantitative capillary assay revealed that H. elongata exhibited chemotaxis to AI-2. Four methyl-accepting chemotaxis proteins were identified in H. elongata. Protein domain identification, sequence alignment, molecular docking, and V. harveyi MM32 bioluminescence assay demonstrated that Tar1-LBD bound to AI-2. The tar1-deleted mutant of H. elongata was successfully constructed by homologous recombination. The deletion of tar1 impaired the chemotaxis of H. elongata to AI-2, whereas the complementation of this gene restored the chemotaxis to level comparable to that in the wild-type. Furthermore, biofilm formation assay revealed that AI-2 enhanced the biofilm formation in H. elongatavia Tar1. [Conclusion] H. elongata exhibits chemotaxis to AI-2, and this signal molecule binds to the LBD of Tar1, thereby modulating chemotaxis and biofilm formation.

Key words

Halomonas elongata / autoinducer-2 (AI-2) / receptor / chemotaxis / biofilm formation

引用本文

王卓, 魏嘉倓, 杨艳艳, 郭欣, 王传旭, 杨静, 牛亚洁, 李新. 信号分子自诱导物-2 (AI-2)通过Tar1调节伸长盐单胞菌的趋化运动和生物膜形成. 微生物学报, 2026 , 66 (2) : 770 -782 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250647

Zhuo WANG, Jiatan WEI, Yanyan YANG, Xin GUO, Chuanxu WANG, Jing YANG, Yajie NIU, Xin LI. The signaling molecule autoinducer-2 regulates the chemotaxis and biofilm formation of Halomonas elongata via Tar1[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (2) : 770 -782 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250647

正文

收起

群体感应(quorum sensing, QS)系统是细胞间的一种信息交流机制，广泛存在于微生物中^[1]。微生物在生长过程中会产生并分泌信号分子，随着微生物种群密度的增加，信号分子不断累积，达到阈值后与受体蛋白结合，触发细胞内的相关信号转导途径，进而调控微生物的群体行为^[2]。S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶(S-ribosylhomocysteine lyase, LuxS)催化合成的4,5-二羟基-2,3-戊二酮经自发环化后形成的自诱导物-2 (autoinducer-2, AI-2)，是一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的信号分子，参与调控生物发光、毒素分泌、运动性以及生物膜形成等多种重要生理过程^[1-3]。

目前鉴定的AI-2受体蛋白有4类，分别为LuxP、LsrB、YeaJ以及具有dCACHE结构域的受体蛋白^[4-7]。LuxP是弧菌属(Vibrio)特有的受体蛋白，负责调控其生物发光等群体行为^[8]；LsrB受体蛋白主要分布于大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)等肠道菌中，负责感受AI-2，并激活转运系统将其转运至胞内降解^[9]；在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str.)中AI-2可通过YeaJ蛋白(c-di-GMP合成酶)调控胞内c-di-GMP水平，从而影响其生物膜形成和毒力^[4]；dCACHE结构域家族中最大的亚家族dCache_1结构域可与多种信号输出结构域(如甲基接受趋化蛋白结构域)串联在一起，dCache_1结构域在感受到AI-2后通过别构调节改变信号输出结构域的活性，从而促进或抑制下游信号通路^[4-5,10-11]。

在自然界中，细菌面对有利于自身生长的物质会定向移动至该区域，而遇到有害物质则会主动远离，这种趋利避害的行为被称为趋化性^[12-13]。甲基趋化受体蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein, MCP)是细菌识别外界化学信号的化学感受器，参与调控细菌趋化性、生物膜形成以及致病性等多种重要生理过程^[14-16]。

伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)是一株革兰氏阴性细菌，常见于自然界中的盐碱地、盐湖、海水等高盐环境，能够耐受5%-25% (NaCl)的盐浓度^[17]。为适应如此宽泛的盐浓度，伸长盐单胞菌能够合成四氢嘧啶和甜菜碱等多种小分子相容性溶质来稳定渗透压，从而维持自身正常代谢^[17-19]。这种独特的高盐环境生存优势使得伸长盐单胞菌可在开放和非无菌的条件下进行发酵，而不用担心染菌，同时可以节约灭菌过程所需的能源，因此在生物技术开发领域具有良好的应用前景^[19-21]。本研究通过毛细管定量分析法检测伸长盐单胞菌对信号分子AI-2的趋化响应，通过序列比对、分子对接和哈维氏弧菌生物发光等试验筛选伸长盐单胞菌中信号分子AI-2的潜在受体蛋白，并检测AI-2对伸长盐单胞菌生物膜形成能力的影响，以期为伸长盐单胞菌的环境适应机制研究和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株、质粒及引物

本研究所使用的菌株和质粒如表1所示，所用引物信息如表2所示。

1.2 主要试剂和仪器

氯化钠、葡萄糖、硫酸镁、氯化钙、甘油、无水乙醇等常规试剂，西陇科学股份有限公司；琼脂糖、结晶紫、卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素等，北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨和酵母提取物，Oxoid公司；细菌基因组提取试剂盒、胶回收和质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；AI-2信号分子标准品，上海赛可锐生物科技有限公司；DNA聚合酶和限制性内切酶，宝日医生物技术(北京)有限公司；T4 DNA连接酶和基因定点突变试剂盒，上海碧云天生物技术股份有限公司。

多功能酶标仪，BioTek公司；核酸电泳仪、凝胶成像仪，上海天能科技有限公司；高速冷冻离心机和超微量分光光度计，ThermoFisher Scientific公司。

1.3 培养基和培养条件

以大肠杆菌为基础构建的各种菌株使用LB培养基培养^[5]，培养条件为37 ℃、220 r/min；以伸长盐单胞菌为基础构建的各种菌株使用LB1M液体培养基(LB培养基补加1 mol/L氯化钠)培养，培养条件为30 ℃、220 r/min。培养时抗生素终浓度为：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素20 μg/mL。

1.4 趋化性检测

参照文献[5]使用毛细管定量分析法进行趋化性检测。伸长盐单胞菌培养至对数后期(OD₆₀₀为1.3)时取2 mL菌液，4 500 r/min离心5 min，菌体用2 mL M91M基础培养基(M9基础培养基^[5]补加1 mol/L氯化钠)重悬。重悬后的菌体按每孔200 μL的体积加入96孔板中。用酒精灯外焰封闭微量毛细管一端后，将另一端浸入AI-2信号分子溶液。随后取出用M91M基础培养基清洗外壁，将微量毛细管穿过硅胶垫垂直浸入96孔板，静置1 h后取出，再用M91M基础培养基清洗外壁，折断后将内部液体吹入装有1 mL M91M基础培养基的1.5 mL离心管中，取100 μL涂布在LB1M平板上，30 ℃倒置培养32 h后进行平板菌落计数。

1.5 Tar1-LBD序列比对和分子对接

使用ClustalX 2.1软件对伸长盐单胞菌Tar1的配体结合结构域(ligand-binding domain, LBD) Tar1-LBD和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PctA-LBD的氨基酸序列进行比对分析，结果通过ESPript 2 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)在线工具导出^[23]。信号分子AI-2和Tar1-LBD的分子对接参照文献[4]并加以修改。采用SWISS-MODEL构建Tar1-LBD三维构象(https://swissmodel.expasy.org/)^[24]。从R-THMF-LsrB (PDB ID：1TJY)中提取信号分子AI-2结构^[25]。使用AutoDock Vina 1.1.2 (https://vina.scripps.edu)进行分子对接^[26]，对接结果使用PyMOL (http://www.pymol.org)软件进行可视化展示。

1.6 蛋白的异源表达和纯化

以伸长盐单胞菌基因组DNA为模板(使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取)，使用引物tar1LBD-HF和tar1LBD-HR扩增tar1-LBD基因片段。PCR反应体系(50 μL)：LATaq (5 U/μL) 0.5 µL (TaKaRa公司)，2×GC Buffer Ⅰ 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 22 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸5 min。使用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ对tar1-LBD基因片段进行双酶切，纯化后将其连接至pET-28a，获得Tar1-LBD表达质粒pET-28a-tar1-LBD。Tar1-LBD_R88A、Tar1-LBD_W90A、Tar1-LBD_Y106A和Tar1-LBD_D108A的表达质粒以pET-28a-tar1-LBD为模板使用基因定点突变试剂盒构建。将所有表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)或敲除了luxS基因的BL21(DE3)中。在37 ℃、180 r/min的条件下，将表达菌株用LB培养基培养至OD₆₀₀为0.5时加入0.3 mmol/L IPTG，22 ℃、160 r/min培养8 h，之后8 000 r/min离心5 min收集菌体，超声破碎后使用Ni²⁺-NTA亲和树脂纯化目的蛋白。Tar1-LBD点突蛋白采用类似的方法纯化得到。所有目的蛋白使用Sephadex-G25葡聚糖凝胶脱盐柱去除多余的咪唑，经SDS-PAGE检测后保存在-80 ℃超低温冰箱待用。用于哈维氏弧菌生物发光实验时将目的蛋白超滤浓缩至10 mg/mL以上，70 ℃水浴加热10 min后，8 000 r/min离心5 min收集上清液。

1.7 AI-2活性检测

参照文献[27]采用哈维氏弧菌生物发光试验进行AI-2活性检测。取过夜培养的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) MM32菌液，使用新鲜的AB培养基^[5]倍比稀释到5×10^-3；稀释后的菌液按每孔90 μL的体积加入黑色96孔板中。随后分别取10 μL待测样品、1 μmol/L AI-2信号分子(阳性对照)以及AB培养基(阴性对照)加入至相应位置。30 ℃、150 r/min振荡培养5 h后，使用多功能酶标仪检测发光强度，AI-2活性用相对发光强度表示。

1.8 tar1 敲除菌株和回补菌株的构建

伸长盐单胞菌突变体构建方法参照文献[28]进行。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取伸长盐单胞菌基因组，以提取的基因组作为模板，使用tar1-UP-F和tar1-UP-R扩增上游片段tar1-UP，使用tar1-DOWN-F和tar1-DOWN-R扩增下游片段tar1-DOWN，通过重叠PCR将上、下游片段连接，得到敲除片段Δtar1。PCR反应体系(50 μL)：LA Taq (5 U/μL) 0.5 µL (TaKaRa公司)，2×GC Buffer Ⅰ 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 22 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃终延伸5 min。使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对敲除片段Δtar1进行双酶切，纯化后将其连接至pK18mobsacB，获得敲除质粒pK18mobsacB-Δtar1并转入大肠杆菌S17-1后与野生型伸长盐单胞菌在LB1M平板上接合24 h。随后用LB1M液体培养基适当稀释后涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的LB1M平板上，30 ℃倒置培养。PCR验证正确的单菌落接种于无抗生素的LB1M液体培养基中培养过夜，菌液适当稀释后涂布于含有20%蔗糖的LB1M平板上，30 ℃倒置培养。长出的单菌落经卡那霉素抗性检测、PCR验证和测序后即得到tar1缺失突变体。以伸长盐单胞菌基因组作为模板，使用引物tar1-F和tar1-R扩增tar1片段。使用Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ对tar1片段进行双酶切，纯化后将其连接至pBBR1MCS-1，获得回补质粒pBBR1MCS-1-tar1。将构建好的回补质粒pBBR1MCS-1-tar1转化至大肠杆菌S17-1后通过接合转移转入伸长盐单胞菌tar1突变体中，经PCR验证后即得到回补菌株Δtar1 (tar1)。此外，将pBBR1MCS-1质粒转入野生型伸长盐单胞菌和tar1突变体中作为对照。

1.9 生长曲线的测定

将测试菌株伸长盐单胞菌分别接种于LB1M液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养过夜至稳定期(OD₆₀₀为3.2)后转接于5 mL的LB1M液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养，每2 h间隔取样测OD₆₀₀，绘制生长曲线。

1.10 生物膜形成能力的检测

测试菌株接种于LB1M液体培养基，培养至稳定期后转接至新的含有3 mL LB1M液体培养基的试管中，培养至对数后期(OD₆₀₀为2.6)时取各菌株菌液20 μL，加入含有180 μL LB1M液体培养基的无菌96孔板中，30 ℃静置培养48 h，弃去菌液，用无菌水缓慢清洗3次。自然风干后加入0.1%结晶紫染液染色15 min，染色结束后用无菌水清洗去除多余的染液，风干后加入200 μL 95%乙醇，振荡15 min，溶解结合的结晶紫染料，使用多功能酶标仪测定OD₅₉₅值。

1.11 数据统计分析

所有试验至少设置3个生物学重复，试验数据用平均值±标准偏差表示。使用GraphPad Prism 10软件分析结果，采用双尾非配对Student’s t-test进行显著性分析，使用Adobe Illustrator 2022软件排版绘图。

2 结果与分析

收起

2.1 伸长盐单胞菌对信号分子AI-2具有趋化性

为探究AI-2对伸长盐单胞菌趋化运动的影响，通过毛细管定量分析法检测了伸长盐单胞菌对不同浓度AI-2的趋化性。如图1A所示，在AI-2浓度为0.1-1 000 μmol/L的范围内伸长盐单胞菌均对其表现出趋化性，且呈现出先上升后下降的趋势。当AI-2浓度为100 μmol/L时伸长盐单胞菌表现出最显著的趋化性(P<0.001)。

2.2 伸长盐单胞菌甲基受体趋化蛋白结构域分布特征

甲基趋化受体蛋白是细菌感知外界化学信号并调节自身趋化运动的关键感受器。根据KEGG数据库提供的基因组信息，伸长盐单胞菌共编码4个甲基受体趋化蛋白。本研究利用HMMER (http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)和TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)在线软件对其结构域和跨膜区进行分析(图2A)，结果显示4个甲基受体趋化蛋白均含有2个跨膜区和1个配体结合结构域(ligand binding domain, LBD)，其中LBD有3种类型(TarH、sCache_2和dCache_1结构域)。此外，HELO_4338在其氨基端还含有一个PAS_3结构域，推测该结构域可能用于感知胞内化学信号。为进一步挖掘伸长盐单胞菌中AI-2的受体蛋白，将已知的AI-2受体PctA^[5]的LBD氨基酸序列与伸长盐单胞菌的4个甲基受体趋化蛋白LBD氨基酸序列进行BLAST比对，结果显示PctA-LBD与Tar1-LBD的序列一致性最高(31%)。此外，PctA-LBD中参与AI-2结合的5个关键氨基酸残基位点(R126、W128、Y144、D146和D173)在Tar1-LBD中均可找到对应位点(R88、W90、Y106、D108和D135) (图2B)，这暗示着Tar1-LBD具有结合AI-2的能力。

2.3 Tar1是伸长盐单胞菌中信号分子AI-2的受体

为检测Tar1-LBD是否能结合信号分子AI-2，本研究首先使用AutoDockVina 1.1.2进行Tar1-LBD与AI-2的分子对接，对接后的最佳构象如图3A所示，结合能为-5.5 kcal/mol。此外，PyMOL所展示的构象图表明，共有7个氨基酸残基(Y63、E78、R88、W90、Y106、D108和A109)参与Tar1-LBD与AI-2的相互作用(图3A)。通过US-align对Tar1-LBD和PctA-LBD (PDB ID：5T65)的三维结构进行比对，结果显示2个结构之间的RMSD值为0.84，TM-core值为0.95，说明2个结构之间的折叠方式高度相似(图3B)。基于Tar1-LBD和PctA-LBD序列比对结果以及分子对接的最佳构象图，本研究将Tar1-LBD的R88、W90、Y106和D108位点分别突变为丙氨酸，并分别纯化了Tar1-LBD蛋白和4种点突变蛋白，之后将纯化好的蛋白浓缩热变性，并取上清液进行哈维氏弧菌生物发光试验。结果显示，从BL21(DE3)表达菌株中纯化的Tar1-LBD蛋白热变性后释放到上清液中的配体能够诱导哈维氏弧菌发光，且与4种点突变蛋白变性上清液诱导的发光强度存在显著性差异(P<0.01)，而从luxS基因缺失后无法合成AI-2的表达菌株中纯化的Tar1-LBD蛋白变性上清液则无法诱导哈维氏弧菌发光(图3C)，这些结果证明Tar1-LBD能够结合AI-2，也表明Tar1是伸长盐单胞菌中信号分子AI-2的受体。

2.4 Tar1介导伸长盐单胞菌对信号分子AI-2的趋化反应

为进一步探讨tar1在伸长盐单胞菌响应AI-2趋化运动中的影响，本研究通过同源重组技术构建了tar1的缺失突变体。分别用引物tar1-UP-F/tar1-DOWN-R和tar1-F/tar1-R对野生型伸长盐单胞菌和Δtar1进行PCR鉴定，并经过测序验证确认获得了伸长盐单胞菌的tar1缺失突变体(图4A、4B)。通过毛细管定量分析法分别检测野生型伸长盐单胞菌[WT (vector)]、tar1缺失突变体[Δtar1(vector)]和tar1回补菌株[Δtar1(tar1)]对信号分子AI-2的趋化性。如图4C所示，野生型伸长盐单胞菌对AI-2表现出趋化性，tar1缺失突变体则未表现出趋化性，而在tar1缺失突变体回补tar1后又能够恢复其对AI-2的趋化响应，说明tar1介导了伸长盐单胞菌对信号分子AI-2的趋化响应。

2.5 信号分子AI-2通过Tar1增强伸长盐单胞菌的生物膜形成能力

为探究信号分子AI-2对伸长盐单胞菌生物膜形成能力的影响，本研究进行了生物膜定量检测。如图5所示，加入信号分子AI-2后，野生型伸长盐单胞菌的生物膜形成量显著提高(P<0.001)。然而，AI-2对于tar1缺失突变体的生物膜形成则无明显影响，回补菌株则表现出与野生型相同的表型。为排除野生型、突变体以及回补菌株之间的生长差异，以及AI-2对生长速度的影响导致的生物膜形成能力差异，本研究检测了AI-2对野生型、tar1缺失突变体以及回补菌株生长情况的影响。结果表明，AI-2不影响野生型、突变体和回补菌株的生长(图5B)。上述结果表明，信号分子AI-2可以通过Tar1增强伸长盐单胞菌的生物膜形成能力。

3 讨论与结论

收起

AI-2作为一种广泛存在于细菌中的种间群体感应信号分子，参与调节细菌生物发光、趋化运动、抗生素合成、生物膜形成等许多重要的生理过程^[29]。细菌通过何种受体来感知AI-2进而调节自身的生理行为，仅在哈维氏弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等细菌中有相关报道^[4-6,9,30]。在嗜盐微生物领域尚无AI-2受体蛋白的相关研究报道。本研究通过毛细管定量分析法、序列比对、分子对接和哈维氏弧菌生物发光试验等方法在伸长盐单胞菌中发现一个甲基受体趋化蛋白Tar1是信号分子AI-2的受体蛋白，进一步发现AI-2可以通过Tar1调节伸长盐单胞菌的趋化响应和生物膜形成能力。

甲基受体趋化蛋白是细菌感受外界化学物质浓度变化，实现趋利避害行为的化学感受器^[31]。经典的甲基受体趋化蛋白包含配体结合结构域、组氨酸激酶结构域和甲基接受趋化蛋白结构域等，多种类型的配体结合结构域是细菌识别不同化学物质的关键所在^[32-33]。本研究在伸长盐单胞菌中共找到4个甲基受体趋化蛋白，其中HELO_4338、HELO_4339和HELO_4340在基因组上成簇排列且转录方向一致，推测其有可能在一类化学感应途径中发挥协同作用。通过毛细管定量分析法发现伸长盐单胞菌对信号分子AI-2具有趋化性。结构域分析和序列比对表明，在伸长盐单胞菌的4个甲基受体趋化蛋白中Tar1的配体结合结构域与铜绿假单胞菌中已知AI-2受体蛋白PctA的配体结合结构域序列一致性最高，并且PctA中参与AI-2结合的5个关键氨基酸残基在Tar1中均可找到。分子对接显示Tar1-LBD与AI-2的最佳构象结合能为-5.5 kcal/mol，与已报道的AI-2-TlpQ-LBD^[5]复合物的结合能(-5.7 kcal/mol)基本一致。哈维氏弧菌生物发光试验检测Tar1-LBD蛋白和关键氨基酸残基点突变蛋白的变性上清液，结果表明Tar1-LBD能够结合AI-2，而且tar1基因的缺失会抑制伸长盐单胞菌对AI-2的趋化响应，这充分证明Tar1是伸长盐单胞菌中AI-2的受体蛋白，也表明伸长盐单胞菌可以通过感知信号分子AI-2，从而参与细菌间的信息交流。

具有dCACHE结构域的AI-2受体蛋白最早发现于铜绿假单胞菌，在26个甲基受体趋化蛋白中PctA和TlpQ分别通过各自的dCACHE结构域来感受AI-2，生物信息学分析表明dCACHE结构域通过5个关键的氨基酸残基(R/W/Y/D/D)来结合AI-2^[5]。在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440中，McpU作为甲基受体趋化蛋白同样是通过dCACHE结构域来感知AI-2^[34]。在类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)中AI-2通过dCACHE结构域来别构调节c-di-GMP代谢酶DosC的酶活，改变其胞内c-di-GMP水平，进而调节运动性和生物膜^[10]。此外，在弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)中AI-2通过调节双组分系统中具有dCACHE结构域的膜激酶AsrK的活性来调节其响应调节蛋白AsrR的c-di-GMP水解酶活性，进而促进弗尼斯弧菌抵抗氧胁迫和DNA损伤的能力^[11]。DosC具有与AI-2结合的5个关键残基，本研究的Tar1同样具有这5个关键残基，这也进一步证明了dCACHE结构域能够结合AI-2。值得注意的是，TlpQ和McpU含有与AI-2结合的4个关键残基(W/Y/D/D)，而在AsrK中则仅有3个(Y/D/D)，推测有可能存在尚未被识别的AI-2结合模式。此外，大多数报道表明dCACHE结构域的配体主要为氨基酸、组胺、多胺、季胺以及有机酸等^[35]，Tar1能否感知这些配体还有待进一步研究探讨。

细菌在自然界中有2种生活状态，一种是能够自由运动的浮游态，另一种是许多细菌堆叠在一起被多糖、蛋白质、脂质等多种复杂成分的胞外基质包裹在一起组成生物膜的固着态^[36-37]。生物膜是细菌为了抵抗不良生存环境而形成的一种生存方式，胞外基质作为一道天然的屏障赋予细菌许多抗性，从而使其免受不良环境的影响^[38-40]。细菌由浮游态向固着态转变形成生物膜的过程中涉及群体协同行为，群体感应系统在此过程中发挥了重要作用^[41-42]。本研究发现AI-2能够通过Tar1促进伸长盐单胞菌的生物膜形成。得益于独特的盐适应性，能够在开放和非无菌的条件下进行发酵，使得包括伸长盐单胞菌在内的许多盐单胞菌被认为是下一代工业中生物制造的重要载体^[21,43]。通过信号分子AI-2来调节伸长盐单胞菌生物膜形成能力，以进一步增强其在恶劣环境下的生存能力可以作为一种新的策略，为伸长盐单胞菌的环境适应机制研究和深度开发利用提供新的思路。

基金

收起

国家自然科学基金(32300111)
山西省基础研究计划(202303021212258)
山西省高等学校青年教师科研创新能力支持项目(2025Q035)
运城市科技计划(YCKJ-2024022)
运城市科技计划(YCKJ-2023030)
博士来晋科研专项(QZX-2023006)
运城学院博士科研启动项目(YQ-2023005)

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文献

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2026年第66卷第2期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250647

接收时间：2025-08-21
首发时间：2026-02-05
出版时间：2026-02-04

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收稿日期：2025-08-21
录用日期：2025-09-20

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the Doctoral Scientific Startup Fund of Yuncheng University(YQ-2023005)

运城学院博士科研启动项目(YQ-2023005)

作者信息

^1.运城学院生命科学系，运城盐湖生态保护与资源利用厅市共建山西省重点实验室，山西运城

^2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷

^3.忻州师范学院生物系，山西忻州

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Strains and plasmids	Description	Sources
Strains
Escherichia coli
TG1	Host for cloning	Laboratory collection
S17-1	λ-pir lysogen of S17-1, F^-thiprohsdR [RP4-2 Tc::Mu Km::Tn7 (Tp Sm)]	Laboratory collection
BL21(DE3)	F^-ompT hsdS (r_B^-, m_B^-) gal dcm (DE3)	Laboratory collection
LuxS^- BL21(DE3)	ΔluxS deletion mutant in E. coli BL21(DE3)	Laboratory collection
Vibrio harveyi
V. harveyi MM32	luxN::cat luxS::Tn5kan	[22]
Halomonas elongata
Halomonas elongata DSM 2581	Wild-type	GDMCC
Δtar1	tar1 deletion mutant derived from H. elongata	This study
Plasmids
pK18mobsacB	sacB-based suicide vector for gene knockout, Kan^r	Laboratory collection
pK18mobsacB-Δtar1	Containing tar1 knockout fragment	This study
pBBR1MCS-1	Broad-host-range vector, Chl^r	Laboratory collection
pBBR1MCS-1-tar1	Tar1 was cloned into pBBR1MCS-1	This study
pET-28a	Bacterial vector for expression of N-terminally His₆-tagged proteins, Kan^r	Laboratory collection
pET-28a-tar1-LBD	pET-28a expressing tar1-LBD	This study
pET-28a-tar1-LBD_R88A	pET-28a expressing tar1-LBD_R88A	This study
pET-28a-tar1-LBD_W90A	pET-28a expressing tar1-LBD_W90A	This study
pET-28a-tar1-LBD_Y106A	pET-28a expressing tar1-LBD_Y106A	This study
pET-28a-tar1-LBD_D108A	pET-28a expressing tar1-LBD_D108A	This study

Strains and plasmids

Description

Sources

Strains

Escherichia coli

TG1

Host for cloning

Laboratory collection

S17-1

λ-pir lysogen of S17-1, F^-thiprohsdR [RP4-2 Tc::Mu Km::Tn7 (Tp Sm)]

Laboratory collection

BL21(DE3)

F^-ompT hsdS (r_B^-, m_B^-) gal dcm (DE3)

Laboratory collection

LuxS^- BL21(DE3)

ΔluxS deletion mutant in E. coli BL21(DE3)

Laboratory collection

Vibrio harveyi

V. harveyi MM32

luxN::cat luxS::Tn5kan

[22]

Halomonas elongata

Halomonas elongata DSM 2581

Wild-type

GDMCC

Δtar1

tar1 deletion mutant derived from H. elongata

This study

Plasmids

pK18mobsacB

sacB-based suicide vector for gene knockout, Kan^r

Laboratory collection

pK18mobsacB-Δtar1

Containing tar1 knockout fragment

This study

pBBR1MCS-1

Broad-host-range vector, Chl^r

Laboratory collection

pBBR1MCS-1-tar1

Tar1 was cloned into pBBR1MCS-1

This study

pET-28a

Bacterial vector for expression of N-terminally His₆-tagged proteins, Kan^r

Laboratory collection

pET-28a-tar1-LBD

pET-28a expressing tar1-LBD

This study

pET-28a-tar1-LBD_R88A

pET-28a expressing tar1-LBD_R88A

This study

pET-28a-tar1-LBD_W90A

pET-28a expressing tar1-LBD_W90A

This study

pET-28a-tar1-LBD_Y106A

pET-28a expressing tar1-LBD_Y106A

This study

pET-28a-tar1-LBD_D108A

pET-28a expressing tar1-LBD_D108A

This study

Primers name	Primer sequences (5′→3′)	Purpose
tar1-UP-F	CCGGAATTCCAATACGCTCAAGCAGGAAG	To generate pK18mobsacB-Δtar1
tar1-UP-R	GCTCGGCATCTCGCAATGAGGTCAACAT
tar1-DOWN-F	CTCATTGCGAGATGCCGAGCCAGCGTGAGG
tar1-DOWN-R	CCCAAGCTTGTTGGTGGAACTGGTGATGG
tar1-F	CGGGGTACCATGTTGACCTCATTGCGACT	To generate pBBR1MCS-1-tar1
tar1-R	CCCAAGCTTTCACGCTGGCTCGGCATCTT
tar1LBD-HF	CGCGGATCCATGGAATCCCACAACGAA	To generate pET-28a-tar1-LBD
tar1LBD-HR	ACGCGTCGACTCAGGAGGCGCTCATCAC
tar1LBD_R88A -HF	GGGGTATGACCCGCGCGAGGCCCCCTGGTATCGCCAGGCCGTGGA	To generate pET-28a-tar1-LBD_R88A
tar1LBD_R88A -HR	TCCACGGCCTGGCGATACCAGGGGGCCTCGCGCGGGTCATACCCC
tar1LBD_W90A -HF	GTATGACCCGCGCGAGCGCCCCGCGTATCGCCAGGCCGTGGAGGC	To generate pET-28a-tar1-LBD_W90A
tar1LBD_W90A -HR	GCCTCCACGGCCTGGCGATACGCGGGGCGCTCGCGCGGGTCATAC
tar1LBD_Y106A -HF	GTCCACCGTGGTCACCGCGCCCGCTGAGGACGCCACGTCCGACAA	To generate pET-28a-tar1-LBD_Y106A
tar1LBD_Y106A -HR	TTGTCGGACGTGGCGTCCTCAGCGGGCGCGGTGACCACGGTGGAC
tar1LBD_D108A -HF	GGTCACCGCGCCCTATGAGGCCGCCACGTCCGACAAGCTGGTGGT	To generate pET-28a-tar1-LBD_D108A
tar1LBD_D108A -HR	ACCACCAGCTTGTCGGACGTGGCGGCCTCATAGGGCGCGGTGACC

Primers name

Primer sequences (5′→3′)

Purpose

tar1-UP-F

CCGGAATTCCAATACGCTCAAGCAGGAAG

To generate pK18mobsacB-Δtar1

tar1-UP-R

GCTCGGCATCTCGCAATGAGGTCAACAT

tar1-DOWN-F

CTCATTGCGAGATGCCGAGCCAGCGTGAGG

tar1-DOWN-R

CCCAAGCTTGTTGGTGGAACTGGTGATGG

tar1-F

CGGGGTACCATGTTGACCTCATTGCGACT

To generate pBBR1MCS-1-tar1

tar1-R

CCCAAGCTTTCACGCTGGCTCGGCATCTT

tar1LBD-HF

CGCGGATCCATGGAATCCCACAACGAA

To generate pET-28a-tar1-LBD

tar1LBD-HR

ACGCGTCGACTCAGGAGGCGCTCATCAC

tar1LBD_R88A -HF

GGGGTATGACCCGCGCGAGGCCCCCTGGTATCGCCAGGCCGTGGA

To generate pET-28a-tar1-LBD_R88A

tar1LBD_R88A -HR

TCCACGGCCTGGCGATACCAGGGGGCCTCGCGCGGGTCATACCCC

tar1LBD_W90A -HF

GTATGACCCGCGCGAGCGCCCCGCGTATCGCCAGGCCGTGGAGGC

To generate pET-28a-tar1-LBD_W90A

tar1LBD_W90A -HR

GCCTCCACGGCCTGGCGATACGCGGGGCGCTCGCGCGGGTCATAC

tar1LBD_Y106A -HF

GTCCACCGTGGTCACCGCGCCCGCTGAGGACGCCACGTCCGACAA

To generate pET-28a-tar1-LBD_Y106A

tar1LBD_Y106A -HR

TTGTCGGACGTGGCGTCCTCAGCGGGCGCGGTGACCACGGTGGAC

tar1LBD_D108A -HF

GGTCACCGCGCCCTATGAGGCCGCCACGTCCGACAAGCTGGTGGT

To generate pET-28a-tar1-LBD_D108A

tar1LBD_D108A -HR

ACCACCAGCTTGTCGGACGTGGCGGCCTCATAGGGCGCGGTGACC