微生物学报

KEGG pathway III	LSQ 3
Quorum sensing	ribA, secY, yajC, ahlD, secA, qseB, qseC, oprM, bapA, phzF, trpGkdpE, hfq, plc, ftsY, aroF, aphA, fadD, ddpD, crp, qsmR, ffh, secB, secG, secE, trpE, ribD, zur, solR, rhlI, yidC
Biofilm formation	acfC, envZ, ompR, tpbB, pgaB, pilG, pilH, pilI, pilJ, chpA, yegE, wecB, pgaC, fimX, fimW, aphB, trpG, mucR, gspL, gspM, fis, pgaA, pgaD, hfq, oxyR, aphA, wspR, gcvA, gspK, gspJ, gspI, gspG, crp, cysE, paaK, impJ, impA, vasG, impM, impL, impH, hcp, impC, impB, bifA, csrA, roeA, rpoN, barA, gspF, trpE, gspD, gspC, gspN, dksA, uvrY, rhlI, gfcE
Glycolysis/Gluconeogenesis	Ahr, aceE, Acs, pdhD, adh, pckA, Fbp, gapA, ppsA, aldB, yiaY, eno, frmA, fbaA, Pgk, galM, pmm-pgm, gapN, tpiA, gpmI, pgi

KEGG pathway III	LSQ 3
Quorum sensing	ribA, secY, yajC, ahlD, secA, qseB, qseC, oprM, bapA, phzF, trpGkdpE, hfq, plc, ftsY, aroF, aphA, fadD, ddpD, crp, qsmR, ffh, secB, secG, secE, trpE, ribD, zur, solR, rhlI, yidC
Biofilm formation	acfC, envZ, ompR, tpbB, pgaB, pilG, pilH, pilI, pilJ, chpA, yegE, wecB, pgaC, fimX, fimW, aphB, trpG, mucR, gspL, gspM, fis, pgaA, pgaD, hfq, oxyR, aphA, wspR, gcvA, gspK, gspJ, gspI, gspG, crp, cysE, paaK, impJ, impA, vasG, impM, impL, impH, hcp, impC, impB, bifA, csrA, roeA, rpoN, barA, gspF, trpE, gspD, gspC, gspN, dksA, uvrY, rhlI, gfcE
Glycolysis/Gluconeogenesis	Ahr, aceE, Acs, pdhD, adh, pckA, Fbp, gapA, ppsA, aldB, yiaY, eno, frmA, fbaA, Pgk, galM, pmm-pgm, gapN, tpiA, gpmI, pgi

VF category	Major virulence factors
Adherence	TFP, Paa, type IV pili, EF-Tu, PEB1, Hsp60, Lap, type 1 fimbriae
Biofilm	Alginate, AdeFGH efflux pump, Bap, VPS, alginate, intercellular adhesion proteins, PNAG, type 3 fimbriae, quorum sensing
Nutritional/Metabolic factor	Acinetobactin, allantion utilization, pyocyanin, pyoverdine, Chu, Sal, pyrimidine biosynthesis, FbpABC, purine biosynthesis, FbpABC, HitABC, allantion utilization, petrobactin, LipF, pyochelin, AnsP, biotin synthesis, Shu, HemO cluster
Effector delivery system	T4SS secreted effector, T6SS, Dot/Icm T4SS secreted effectors, Bsa T3SS, TTSS (SPI-2 encode), T2SS, T3SS, Xcp secretion system, exolysin, HSI-1 T6SS secreted effectors, HSI-1, type VII secretion system
Exotoxin	Phospholipase D, phospholipase C, colibactin, haemolysin/cytolysin
Immune modulation	LPS, PDIM, LOS, OmpA, capsule, Vi antigen, PbpG
Exoenzyme	CpaA, TlyC
Regulation	MprAB, LetA/S, RelA, BvrR-BvrS, SigA, Ler

VF category	Major virulence factors
Adherence	TFP, Paa, type IV pili, EF-Tu, PEB1, Hsp60, Lap, type 1 fimbriae
Biofilm	Alginate, AdeFGH efflux pump, Bap, VPS, alginate, intercellular adhesion proteins, PNAG, type 3 fimbriae, quorum sensing
Nutritional/Metabolic factor	Acinetobactin, allantion utilization, pyocyanin, pyoverdine, Chu, Sal, pyrimidine biosynthesis, FbpABC, purine biosynthesis, FbpABC, HitABC, allantion utilization, petrobactin, LipF, pyochelin, AnsP, biotin synthesis, Shu, HemO cluster
Effector delivery system	T4SS secreted effector, T6SS, Dot/Icm T4SS secreted effectors, Bsa T3SS, TTSS (SPI-2 encode), T2SS, T3SS, Xcp secretion system, exolysin, HSI-1 T6SS secreted effectors, HSI-1, type VII secretion system
Exotoxin	Phospholipase D, phospholipase C, colibactin, haemolysin/cytolysin
Immune modulation	LPS, PDIM, LOS, OmpA, capsule, Vi antigen, PbpG
Exoenzyme	CpaA, TlyC
Regulation	MprAB, LetA/S, RelA, BvrR-BvrS, SigA, Ler

皮氏不动杆菌LSQ 3对贝莱斯芽孢杆菌LSQ 19成膜能力的影响及其基因组特性分析

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杨小宇 ¹^,²^,³^,⁴ , 王志刚 ¹^,²^,³^,⁴ , 徐伟慧 ¹^,²^,³^,⁴ , 旦真阿旺 ¹

微生物学报 | 研究报告 2026,66(2): 753-769

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(2): 753-769

皮氏不动杆菌LSQ 3对贝莱斯芽孢杆菌LSQ 19成膜能力的影响及其基因组特性分析

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杨小宇¹^,²^,³^,⁴, 王志刚¹^,²^,³^,⁴, 徐伟慧¹^,²^,³^,⁴, 旦真阿旺¹

作者信息

^1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔

^2.黑龙江省农业微生物制剂产业化工程技术研究中心，黑龙江齐齐哈尔

^3.黑龙江省农用生物制剂产业化协同创新中心，黑龙江齐齐哈尔

^4.黑龙江省高浓度有机废液生物转化及产业化概念验证中心，黑龙江齐齐哈尔

Influence of Acinetobacter pittii LSQ 3 on the biofilm formation of Bacillus velezensis LSQ 19 and its genomic characteristics

Xiaoyu YANG¹^,²^,³^,⁴, Zhigang WANG¹^,²^,³^,⁴, Weihui XU¹^,²^,³^,⁴, Danzhen Awang¹

Affiliations

^1.College of Life Science and Agroforestry, Qiqihar University, Qiqihar, Heilongjiang, China

^2.Heilongjiang Provincial Engineering Technology Research Center of Agromicrobial Preparation Industrialization, Qiqihar, Heilongjiang, China

^3.Heilongjiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agrobiological Preparation Industrialization, Qiqihar, Heilongjiang, China

^4.Heilongjiang Provincial Concept Verification Center of High Concentration Organic Waste Liquid Biotransformation and Industrialization, Qiqihar, Heilongjiang, China

出版时间: 2026-02-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250635

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摘要

收起

【目的】 探究菌株皮氏不动杆菌(Acinetobacter pittii) LSQ 3对贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) LSQ 19成膜能力的影响，以及菌株LSQ 3的基因组特性。 【方法】 采用结晶紫染色法、细胞表面特性分析、苯酚硫酸法、XTT还原法和扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)观察等方法分析LSQ 3无细胞上清液(cell-free supernatant, CFS)对LSQ 19成膜能力的影响；采用全基因组学测序明确菌株LSQ 3的分类学地位，并通过全基因组数据预测其次级代谢产物基因簇。 【结果】 菌株LSQ 3的CFS显著抑制LSQ 19的生物膜形成，10 µL菌液/190 µL CFS混合确定为最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。与对照组相比，经菌株LSQ 3的CFS处理(MIC)后LSQ 19细胞的表面疏水性、黏附力、胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)产率和生物膜代谢活性均显著降低；自聚集能力与对照组相比显著升高。扫描电镜观察表明，在MIC条件下菌株LSQ 19在玻璃表面未形成生物膜。经全基因组学鉴定，菌株LSQ 3为Acinetobacter pittii，其基因组大小为3 939 365 bp，G+C含量为38.82%，含有3 601个DNA编码序列。其基因组中存在多个与生物膜合成相关的基因及毒力因子。通过antiSMASH分析发，菌株LSQ 3的基因组中含有7种次级代谢物的生物合成基因簇。 【结论】 A. pittii LSQ 3的无细胞上清液可抑制B. velezensis LSQ 19生物膜的形成，本研究从生物膜的角度为合成菌群的构建提供了理论依据和参考。

关键词

皮氏不动杆菌LSQ 3 / 贝莱斯芽孢杆菌LSQ 19 / 全基因组测序 / 无细胞上清液 / 生物膜形成

Abstract

收起

[Objective] To explore the influence of Acinetobacter pittii LSQ 3 on the biofilm formation of Bacillus velezensis LSQ 19 and analyze the genomic characteristics of strain LSQ 3. [Methods] The effect of the cell-free supernatant (CFS) of LSQ 3 on the biofilm formation of LSQ 19 was analyzed by crystal violet staining, cell surface property analysis, the phenol-sulfuric acid method, XTT reduction assay, and scanning electron microscopy (SEM). Whole-genome sequencing was employed to determine the taxonomic status of strain LSQ 3, and the biosynthetic gene clusters for secondary metabolites were predicted based on the whole-genome data. [Results] The CFS of strain LSQ 3 significantly inhibited the biofilm formation of strain LSQ 19, and the volume ratio of 10 µL bacterial suspension to 190 µL CFS was determined as the minimum inhibitory concentration (MIC). Compared with the control, the CFS of strain LSQ 3 at MIC significantly reduced the surface hydrophobicity, adhesion, extracellular polymeric substances (EPS) production rate, and biofilm metabolic activity, while significantly improving the self-aggregation ability of LSQ 19 cells. In the presence of the CFS at MIC, LSQ 19 failed to form a biofilm on the glass surface. Strain LSQ 3 was identified as A. pittii based on whole-genome sequencing data. Its genome size was 3 939 365 bp, with the G+C content of 38.82% and 3 601 DNA coding sequences. The genome contained multiple genes involved in biofilm formation and virulence factors. The antiSMASH analysis showed that the genome of strain LSQ 3 contained seven biosynthetic gene clusters for secondary metabolites. [Conclusion] The CFS of A. pittii LSQ 3 can inhibit the biofilm formation of B. velezensis LSQ 19. This study provides a theoretical basis and reference for the construction of synthetic bacterial communities from the perspective of biofilms.

Key words

Acinetobacter pittii LSQ 3 / Bacillus velezensis LSQ 19 / whole-genome sequencing / cell-free supernatant / biofilm formation

引用本文

杨小宇, 王志刚, 徐伟慧, 旦真阿旺. 皮氏不动杆菌LSQ 3对贝莱斯芽孢杆菌LSQ 19成膜能力的影响及其基因组特性分析. 微生物学报, 2026 , 66 (2) : 753 -769 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250635

Xiaoyu YANG, Zhigang WANG, Weihui XU, Danzhen Awang. Influence of Acinetobacter pittii LSQ 3 on the biofilm formation of Bacillus velezensis LSQ 19 and its genomic characteristics[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (2) : 753 -769 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250635

正文

收起

近年来，生物膜已成为多个领域的研究热点，在工业、医学、海洋等领域均有相关研究报道，但在土壤环境中的研究报道相对较少^[1]。生物膜是生防细菌占据生态位的重要存在形式，能够帮助其抵御不良环境，同时构筑一道防止植物病原微生物入侵的“屏障”^[2]。生防细菌还可通过营养竞争、分泌抗菌物质、诱导系统抗性等机制来抑制病原菌及病原生物膜的生长。有研究报道，Wickerhamomyces anomalus可通过营养和空间竞争来防治番茄灰霉病的发生^[3]。植物根际栖息着不同种类的微生物，不同物种间进行信息传递、代谢交叉喂养和营养竞争等，影响彼此生物膜的形成及在根际的定殖，进而对植物生长产生影响。混合物种生物膜是自然界中常见的形式，混合物种生物膜间的相互作用包括协同性、竞争性和中立性^[4]。因此，从生物膜角度研究菌间互作可为合成群落的构建或简化提供理论依据。

本课题组Luo等^[5]在前期研究中构建了能有效防治西瓜枯萎病的合成菌群Q，该菌群包含路氏肠杆菌(Enterobacterludwigii) LSQ 1、LSQ 3、森林土噬几丁质菌(Chitinophaga silvisoli) LSQ 14、三角农杆菌(Agrobacterium deltaense) LSQ 16、A. deltaense LSQ 19和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) WB。在研究合成菌群Q中单菌、双菌和多菌生物膜成膜能力时发现，LSQ 3与LSQ 19共培养时生物膜形成能力减弱，而加入菌株LSQ 14后抑制作用消失。因此，为探究合成菌群Q菌间的互作关系，本研究以LSQ 3和LSQ 19为材料，研究LSQ 3对LSQ 19成膜能力的影响，并从基因组学角度探究LSQ 3的特性，以期为研究LSQ 3抑制LSQ 19成膜的机制奠定基础，也为研究合成菌群Q的菌间互作提供理论依据。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株

贝莱斯芽孢杆菌(LSQ 19)和皮氏不动杆菌(LSQ 3)由齐齐哈尔大学微生物生态实验室提供。

1.2 LSQ 3无细胞上清液的制备

将新活化的LSQ 3接种至胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soy broth, TSB)^[6]中，30 ℃、150 r/min培养18 h，菌液10 000 r/min离心8 min，收集上清液，用0.22 µm无菌滤膜过滤后获得无细胞上清液(cell-free supernatant, CFS)，4 ℃贮藏备用。

1.3 不同浓度的 A.pittii LSQ 3无细胞上清液对 B. velezensis LSQ 19的生物膜抑制率检测

为测定LSQ 3 CFS对LSQ 19生物膜是否具有抑制作用^[7]，在96孔板中加入10 μL LSQ 19菌悬液(OD₆₀₀=0.8)和190 μL LSQ 3 CFS，对照组使用LBGM培养基^[8]。采用结晶紫染色法对其生物被膜形成能力进行实验。于30 ℃培养24 h后，从恒温培养箱中取出96孔板，缓慢移除培养24 h后的菌液。然后用无菌水清洗2-3次，洗去未黏附的菌体，室温干燥后加入200 μL 0.1%的结晶紫溶液染色20 min，再用无菌水清洗浮色3-5次(直至清洗液澄清为止)，以去除松散附着的细菌细胞。室温干燥后加入200 μL无水乙醇脱色15 min，采用酶标仪测定OD₅₄₀条件下的吸光值，以此衡量生物膜生物量。生物膜抑制率计算如公式(1)所示。

生物膜抑制率=(1-OD_treatment/OD_control)×100%(1)

1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定

为研究LSQ 3 CFS抑制菌株LSQ 19成膜的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)^[9]，将LSQ 19菌液(OD₆₀₀=0.8)与不同浓度的LSQ 3的无细胞上清液分别按照体积比10/190、20/180、30/170、40/160、50/150、60/140、70/130、80/120、90/110、100/100、110/90、120/80、130/70、140/60、150/50、160/40、170/30、180/20、190/10混合，在96孔板上30 ℃培养24 h^[10]。本研究将LSQ 19培养物固定于所有孔中(每个孔10 µL)，并根据需要用新鲜且无菌的TSB稀释无细胞上清，以保持所需浓度。当LSQ 3 CFS浓度对LSQ 19生物膜的抑制率达到80%时定义为MIC。

1.5 细胞表面特性和胞外聚合物定量分析

1.5.1 疏水性

采用Wang等^[11]的方法测定LSQ 19经LSQ 3 CFS处理后的细胞表面疏水性。制备MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的CFS。每种CFS各取20 mL与等体积的LSQ 19菌液(约10⁷ CFU/mL)混合并涡流。对照组加入TSB培养基。30 ℃混合培养24 h后，将细胞12 000 r/min离心10 min，丢弃上清，将混合培养物重悬于磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中。在600 nm处测定吸光度(H₀)。然后，将悬浮菌与二甲苯以2:1的比例混合，涡旋60 s，再于室温下分层30 min。收集细菌溶液的相位，在600 nm处测量吸光度(H₁)。疏水性百分比计算如公式(2)所示。

疏水性=(H₀-H₁)/H₀×100%(2)

1.5.2 自聚集能力

采用Lee等^[12]的方法测定细菌的自动聚集能力。按1.5.1节方法培养，30 ℃混合培养24 h后，将细胞12 000 r/min离心10 min，丢弃上清，将混合培养物用PBS冲洗2次，在4 mL PBS中，600 nm (OD_initial)处调节吸光度为0.40±0.05。30 ℃下孵育24 h，在600 nm (OD_treatment)处测定上层水层的吸光度值。自动聚集能力计算如公式(3)所示。

自聚集=(1-OD_treatment/OD_initial)×100%(3)

1.5.3 黏附力

使用Kim等^[7]描述的方法研究了细胞黏附在玻璃表面的能力。将LSQ 19的5 mL菌液(约10⁷ CFU/mL)和等量MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的LSQ 3 CFS混合于无菌玻璃管中，对照组用TSB培养基。然后将玻璃管倾斜30°，30 ℃培养24 h。轻轻去除浮游细胞，用PBS冲洗玻璃管。接着，在每根管中加入5 mL PBS，并旋转，获得贴壁细胞。将黏附的细胞4 ℃、14 240×g离心5 min，弃上清。将收集的细胞重悬于1 mL PBS中，在600 nm处测定吸光度值(OD_{adhered cell})。将贴壁细胞与浮游细胞混合并按前面描述的方法冲洗。将总细胞重悬于1 mL PBS中，在600 nm处测定吸光度值(OD_{total cell})。细胞黏附能力计算如公式(4)所示。

黏附力=(OD_{adhered cell}/OD_{total cell})×100%(4)

1.5.4 胞外多糖(EPS)的产率分析

LSQ 19 EPS产率的测定采用Lee等^[12]的方法，并进行了一些修改。分别制备MIC、1/2 MIC、1/4 MIC的LSQ 3 CFS。每种CFS各取4 mL与等体积LSQ 19的细菌培养物(约10⁷ CFU/mL)混合。对照组用TSB培养基。30 ℃培养24 h后，细胞在8 000×g下离心10 min，弃上清，将剩余的沉淀用1 mL的1.5 mol/L NaCl重悬。然后在5 000×g下重新离心10 min。取60 µL上清液，加入等量5%苯酚和4 mL硫酸，于30 ℃水浴中涡流培养10 min，在490 nm处测定吸光度值。EPS产率计算如公式(5)所示。

EPS产率=OD_treatment/OD_control×100%(5)

1.6 XTT法检测生物膜中细胞的代谢活性

采用XTT还原法测定生物膜中细胞的代谢活性^[13]。用PBS配制1 mg/mL XTT溶液和0.4 mmol/L的萘醌溶液。用0.1 mol/L PBS清洗生物膜2次，以去除悬浮细胞。在24孔板的每孔中加入10 µL的萘醌溶液、200 µL的XTT溶液和790 µL的PBS溶液，37 ℃避光孵育3 h。将每孔中的200 µL混合液转移到一个新的96孔板上，利用酶标仪在OD₄₉₂测量每个样品的代谢活性变化。

1.7 扫描电镜观察LSQ 3 CFS对LSQ 19生物被膜的影响

采用扫描电镜观察1/4 MIC、1/2 MIC和MIC的LSQ 3 CFS对LSQ 19生物被膜的形态学变化。根据Park等^[9]描述的方法并进行了轻微的修改。为了评估LSQ 3 CFS对LSQ 19生物膜的抑制能力，观察不同抑制浓度下在细胞爬片上形成的生物膜形态，参考1.3节的方法培养生物膜，起始接种量为1 mL。将LSQ 19菌液(OD₆₀₀=0.8)与不同浓度的LSQ 3 CFS在30 ℃的细胞爬片上处理24 h，对照组用LBGM培养基培养。将浮游细胞用PBS冲洗2次，将附着在片上的生物膜用2.5%的戊二醛在4 ℃下固定过夜，吸出固定液，用PBS浸洗3-5次，每次15 min。用系列梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水，每种浓度乙醇脱水1次，每次10-20 min，再用100%乙醇彻底脱水1-2次，在室温下干燥。在生物膜样品表面镀金，用扫描电镜观察生物膜的结构。

1.8 菌株LSQ 3的全基因组学分析

将菌株接种于TSB液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养过夜，12 000 r/min离心8 min后获得菌沉淀。使用Wizard^®基因组DNA纯化试剂盒(Promega公司)提取菌株LSQ 3的基因组DNA。纯化的基因组DNA使用荧光计(Turner BioSystems Inc公司)进行定量。提取的DNA在Illumina HiSeq和PacBio RS II单分子实时平台(SMRT)上测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。原始读数通过Fastp v0.23.0 (https://github.com/OpenGene/fastp)进行质量过滤，剔除低质量数据以获得干净的数据。过滤后的数据由Unicycler v0.4.8 (https://github.com/rrwick/Unicycler)组装，用Pilon v1.22软件进行短序列比对和碱基质量校正。为对菌株LSQ 3进行准确分类，基于MASH算法(https://github.com/marbl/mash)和基因组爆炸距离系统发育方法(GBDP) (http://ggdc.dsmz.de)，利用类型菌株基因组服务器(https://tygs.dsmz.de/)建立其系统发育树。菌株LSQ 3基因组的DNA编码序列由软件Glimmer v3.02 (http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml)预测，使用Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)软件进行串联重复序列预测。Barrnap v.0.8 (https://github.com/tseemann/barrnap)和tRNAscan-SE v.2.0 (http://trna.ucsc.edu/software/)分别用于预测rRNA和tRNA基因。利用BLAST和HMMER对3个数据库进行功能注释和分配，包括蛋白直系同源簇数据库(COGs, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、基因本体数据库(GO, http://www.geneontology.org/)和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG, http://www.genome.jp/kegg/)。来源于微生物，且对微生物自身侵染和引起特定宿主疾病具有促进作用的物质称为毒力因子(virulent factor)，主要包括细菌毒素、调节细菌黏附作用的细胞表面蛋白、对细菌本身具有保护作用的蛋白、细胞表面碳水化合物以及具有细菌致病性的水解酶等^[14]。采用毒力因子数据库VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)预测LSQ 3所拥有的毒力因子。采用antiSMASH 8.0.2 rcl (https://dl.secondarymetabolites.org/releases/8.0.2/)软件和BLAST预测菌株的次级代谢产物基因簇及数量。

1.9 数据分析

采用Excel 2021和SPSS Statistics 26软件对数据进行整理和统计分析，数据表示为3个生物学重复的平均值±标准误差(mean±SEM)。图中不同小写字母表示在单因素ANOVA检验中差异达到显著水平P<0.05。使用GraphPad Prism 8.0.2绘图。

2 结果与分析

收起

2.1 LSQ 3无细胞上清液对LSQ 19生物膜抑制率的检测

如图1A所示，随着LSQ 3无细胞上清液浓度的升高，其对菌株LSQ 19生物膜的抑制能力也增强。190 µL LSQ 3无细胞上清液对LSQ 19生物膜的抑制率为85.59% (图1B)，表明高浓度的LSQ 3无细胞上清液能够抑制菌株LSQ 19的生物膜形成。

2.2 不同浓度LSQ 3无细胞上清液对LSQ 19生物膜抑制率的检测

将LSQ 3 CFS浓度对LSQ 19生物膜的抑制率达到80%时定义为MIC。通过测定LSQ 3无细胞上清液(CFS)对LSQ 19生物膜的抑制率，研究发现，当10 µL LSQ 19的菌液与190 µL LSQ 3无细胞上清液(10/190)混合培养时，对菌株LSQ 19生物膜的抑制率达到80%以上(图1)。因此，将LSQ 19菌液与LSQ 3无细胞上清液的体积比为10/190定义为MIC。如图2所示，在1/2 MIC条件(10 µL LSQ 19菌液/95 µL LSQ 3 CFS+95 µL培养基)下，LSQ 3的CFS对LSQ 19生物膜的抑制率为20%。

2.3 LSQ 3 CFS不同抑制浓度对LSQ 19细胞表面特性和EPS的影响

图3显示了LSQ 19在LSQ 3 CFS不同抑制浓度下细胞表面特性和EPS产率的变化。与对照相比，当CFS浓度为MIC-1/4 MIC时LSQ 19细胞表面的疏水性为31.85%-57.62%，显著低于对照(60.89%) (P<0.05) (图3A)；自聚集能力为58.08%-74.17%，显著低于对照组(81.58%) (P<0.05) (图3B)；黏附能力为31.25%-50.19%，显著低于对照(56.65%) (P<0.05) (图3C)；与对照相比，当CFS浓度为MIC-1/2 MIC时LSQ 19的EPS产率均显著低于TSB处理的对照组(P<0.05) (图3D)。

2.4 LSQ 19生物膜中细胞的代谢活性分析

比较了LSQ 3 CFS处理下LSQ 19与对照组生物膜中细胞的代谢活性。如图4所示，当LSQ 3 CFS的浓度为MIC-1/4 MIC时，处理组形成的生物膜中细胞的代谢活性显著低于对照(P<0.05)。这表明LSQ 3 CFS处理影响了LSQ 19生物膜中细胞的代谢活性。

2.5 扫描电镜分析

通过扫描电子显微镜(SEM)评估了LSQ 3的CFS对LSQ 19在玻璃膜上形成生物膜的影响(图5)。在对照组中，LSQ 19在玻璃膜上形成了致密的生物膜层(图5)。然而，当LSQ 3 CFS浓度为MIC时，LSQ 19未形成生物膜，因此在扫描电子显微镜观察下未发现细胞。这证明高浓度LSQ 3无细胞上清液可抑制LSQ 19生物膜的生成。

2.6 菌株LSQ 3的基因组特征和系统发育

上述结果表明，LSQ 3菌株对LSQ 19的生物膜形成具有显著抑制效果。为从遗传基础探究其潜在的抑菌作用机制，推测LSQ 3基因组中可能携带多种功能基因，如编码抗菌代谢产物(如抗生素、细菌素、铁载体等)合成、群体感应(quorum sensing, QS)系统干扰以及竞争性定殖相关因子的基因。为验证这一推测并解析其分子机制，对LSQ 3菌株进行了全基因组测序与分析。

对样品测序结果进行组装和注释，得到LSQ 3的全基因组图谱(图6A)。该菌株的全基因组由一条3 939 365 bp的环状染色体组成，G+C含量为38.82%。据预测，该基因组包含3 601个DNA编码序列(coding DNA sequences, CDSs)、18个rRNA基因和73个tRNA基因。根据COG、GO和KEGG功能注释，鉴定的基因分别为2 916、2 226和2 695个。在基因组中鉴定出7个假定的次级代谢物生物合成基因簇和11个基因组岛。系统发育分析表明，菌株LSQ 3与皮氏不动杆菌(Acinetobacter pittii) CIP 70.29的亲缘关系最密切(图6B)。因此，菌株LSQ 3最终被鉴定为Acinetobacter pittii LSQ 3。将其基因组序列上传至NCBI，获得序列登录号为SAMN53665772。

2.7 菌株LSQ 3的功能注释

将菌株LSQ 3基因组中的编码基因进行COG注释，共有2 916个基因得到注释，占所有基因的80.98% (图7A)。其中，氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism)的占比最高，共有304个(10.42%)。除此之外，含有基因数量较多的功能分类依次为转录(296个，占比10.15%)，一般功能预测(268个，占比9.19%)，脂质转运和代谢(259个，占比8.88%)，翻译、核糖体结构和生物发生(228个，占比7.82%)，细胞壁/膜/包膜生物发生(206个，占比7.06%)。在KEGG途径的6个分类中(图7B)，与代谢相关的蛋白质最多，其中，有918种蛋白质与全局和总览图谱(global and overview maps)相关，278种蛋白质与氨基酸代谢(amino acid metabolism)相关，203种蛋白质与碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)相关，197种蛋白质与辅助因子和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)相关，156种蛋白质与能量代谢(energy metabolism)相关。GO功能注释显示(图7C)，分别有1 119、1 085和1 820个基因注释到生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)。其中，在细胞组分上与膜(membrane)相关的基因含量最高，有429个，占总体CDSs的11.91%。

2.8 菌株LSQ 3与生物膜合成相关基因及毒力因子预测

A. pittii LSQ 3基因组中与群体感应(QS)及生物膜形成相关的基因如表1所示。qseB和qseC作为QS系统的一部分，可调控细菌毒力、宿主适应性和体内生存。rhlI基因编码AHL合成酶，是RhlRI QS系统的核心组件，能产生信号分子，调控毒力因子(如外毒素和弹性蛋白酶)的表达和分泌。bapA可能编码生物膜相关蛋白，在QS表型(生物膜)中发挥下游作用。envZ/ompR在沙门氏菌中调控渗透压响应，影响生物膜基质形成，其突变会导致生物膜能力下降。bfmR/bfmS在鲍曼不动杆菌中调控Csu菌毛组装系统，直接影响生物膜形成。这些基因共同调控生物膜的形成、稳定性和功能，影响细菌的附着、基质合成和信号传递等过程。

为探究LSQ 3中是否含有可抑制生物膜形成的毒力因子，将LSQ 3菌株的基因组与VFDB核心数据库数据进行对比分析，在LSQ 3菌株的基因组中发现427个毒力因子，菌株LSQ 3的主要毒力因子见表2。

LSQ 3基因组中的主要毒力因子与黏附相关的物质有TFP (IV型菌毛)，该物质对抽搐运动和自然感受态不可或缺，并能促进宿主细胞黏附。与生物膜相关的毒力因子有：AdeFGH外排泵，其在生物膜形成过程中自诱导分子的合成和转运中发挥潜在作用；Bap (生物膜相关蛋白)，有助于生物膜的形成和与真核宿主细胞的黏附；PNAG，对生物膜形成至关重要，与其相关的抗毒力化合物抑制细胞外多糖的合成或基质网络的形成；Quorum sensing，在生物膜形成中起重要作用，QS调控的表型包括OmpA、AdeFGH排污泵、PNAG、I型菌毛等和生物膜形成相关的因素。与营养/代谢因子相关的毒力因子有acinetobactin，它是一种铁载体，可与宿主细胞竞争铁；HemO cluster，可利用血红素。Effector delivery system中的主要毒力因子有T6SS系统，T6SS可将蛋白质效应子递送至宿主细胞或竞争细菌中，是不动杆菌中重要的毒力系统。

2.9 菌株LSQ 3抗菌次级代谢产物分析

为探究LSQ 3菌株抑制LSQ 19生物膜形成的分子遗传机制，利用antiSMASH 8.0.2 rc1软件对菌株LSQ 3基因组的次级代谢产物合成基因簇进行了预测及分析，发现菌株LSQ 3具有7个次级代谢产物合成相关的基因簇(图8)。其中，有4个已知的基因簇，包括以非核糖体肽金属基团(NRP-metallophore)途径合成的不动杆菌素(acinetobactin)；以铁载体(NI-siderophore)途径合成的葡萄铁蛋白B (staphyloferrin B)；以及通过芳基多烯(arylpolyene)途径合成的伯尼那霉素K/J/A/B (berninamycin K/J/A/B)及APE Vf，这些代谢产物与抗菌及螯合铁离子等功能密切相关(图8)。

编码acinetobactin的NRP-metallophore簇与BGC0000294.5有87%的相似性。Acinetobactin是一种铁载体，负责铁的获取与吸收。在基因组中发现了核心生物合成相关基因vibF和编码acinetobactin生物合成异胆碱合酶BasJ的基因entC。编码staphyloferrin B的铁载体与BGC0000943.5有51%的相似性，由2个核心生物合成基因sbnF、sbnC，编码铁载体合成酶lucA/lucC/SbnC。编码berninamycin K/J/A/B的arylpolyene簇与BGC0002363.3有40%的相似性。同时，在染色体其他位置通过arylpolyene簇预测到了APE Vf，与BGC0000837.4有47%的相似性。此外，在LSQ 3基因组中还预测到了3个未知的次级代谢产物合成基因簇，为进一步探索新抗菌物质提供了基础。

3 讨论与结论

收起

生物膜是细菌为适应生存环境而分泌的三维凝胶状胞外聚合物，由多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等物质包裹的微生物群体构成^[15]。生防菌形成生物膜并附着在土壤粒子或植物根系表面实现定殖，以群聚形式占据保护根系的有利生态位，发挥生防作用，抵抗病原菌入侵^[16]。

在研究防治西瓜枯萎病合成菌群Q菌间互作时发现，LSQ 3的无细胞上清液能有效抑制LSQ 19成膜。表面疏水性和自聚集性是影响生物膜形成的关键因素。表面疏水性可促进细菌黏附到疏水表面，这是生物膜形成的第一步^[17]。同样地，自聚集直接有助于生物膜结构的发育和稳定，使细菌能够在特定环境中形成保护性的三维基质，增强细菌在不利条件下的存活能力。此外，一些研究也支持表面疏水性和自聚集是生物膜形成的关键因素^[18-20]。本研究发现，LSQ 3 CFS显著抑制了LSQ 19的表面疏水性、自聚集和黏附力，进而抑制了LSQ 19生物膜的形成，这表明LSQ 3 CFS中的活性成分可能作用于菌株LSQ 19的细胞表面，干扰其生物膜的附着，与Silva-Dias等^[21]研究结果相似。

生物膜由胞外聚合物(EPS)和多糖蛋白复合物组成^[15]，细菌通过分泌大量EPS构建和维持生物膜的三维结构^[22]。EPS的减少会直接削弱生物膜的物理结构基础^[23-24]，使其难以发展为成熟的菌膜。本研究发现，经LSQ 3 CFS处理后LSQ 19的EPS产量下降，说明LSQ 3 CFS通过降低EPS产量影响LSQ 19生物膜的形成。

除了从物理结构上干预，CFS还可能直接影响LSQ 19的细胞生理状态。XTT还原法检测显示，经CFS处理后LSQ 19生物膜的代谢活性显著降低^[25]。代谢活性的抑制可能源于2个方面：(1) CFS中的抗菌成分直接损伤细胞呼吸链^[26]；(2) 生物膜结构的解体导致微环境变化(如营养物质扩散受阻)，引发局部营养匮乏和代谢废物累积^[27]。扫描电镜结果证实：LSQ 3上清液处理组(MIC)的生物膜结构完全消失，无生物被膜形成，这与Staphylococcus aureus接触茶树精油后生物膜崩解的现象一致^[28]。

通过对菌株LSQ 3的全基因组测序分析发现，LSQ 3基因组中含有多种毒力因子，包括TFP^[29]、T6SS^[30]和acinetobactin^[31]等。值得注意的是，其中存在一个与铁载体acinetobactin高度同源的次级代谢产物合成基因簇^[32]。Acinetobactin是一种能够高效螯合环境中铁离子的铁载体。热力学模型表明，这类铁载体可快速耗尽微环境中的游离铁，使得缺乏相应摄取系统的竞争对手因“铁饥饿”而生长受阻、生物膜形成能力显著下降^[33-34]。因此，推测LSQ 3 CFS抑制LSQ 19成膜的原因之一是其分泌acinetobactin或其他活性分子创造了局部的铁限制环境，从而干扰了LSQ 19的正常生理功能及其生物被膜的发育过程。当然，CFS中具体是哪种或哪几种代谢产物起主要作用，仍需通过后续的分离纯化与验证实验来确定。

综上所述，LSQ 3无细胞上清液通过抑制LSQ 19细胞表面疏水性、自聚集能力、黏附力和EPS产率抑制其生物膜的形成。菌株LSQ 3经基因组学鉴定为Acinetobacter pittii LSQ 3，其基因组中有多个生物膜合成相关基因及毒力因子，还含有7个次级代谢产物基因簇。本研究为防治西瓜枯萎病合成菌群Q的菌间互作及其应用提供理论依据和参考。

基金

收起

黑龙江省重点研发计划(GA23B018)
齐齐哈尔大学研究生创新项目(QUZLTS_CX2024019)

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2026年第66卷第2期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250635

接收时间：2025-08-17
首发时间：2026-02-05
出版时间：2026-02-04

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收稿日期：2025-08-17
录用日期：2025-11-06

基金

the Key Research and Development Program of Heilongjiang Province(GA23B018)

黑龙江省重点研发计划(GA23B018)

the Qiqihar University of Graduate Student Innovation Program(QUZLTS_CX2024019)

齐齐哈尔大学研究生创新项目(QUZLTS_CX2024019)

作者信息

^1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔

^2.黑龙江省农业微生物制剂产业化工程技术研究中心，黑龙江齐齐哈尔

^3.黑龙江省农用生物制剂产业化协同创新中心，黑龙江齐齐哈尔

^4.黑龙江省高浓度有机废液生物转化及产业化概念验证中心，黑龙江齐齐哈尔

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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KEGG pathway III	LSQ 3
Quorum sensing	ribA, secY, yajC, ahlD, secA, qseB, qseC, oprM, bapA, phzF, trpGkdpE, hfq, plc, ftsY, aroF, aphA, fadD, ddpD, crp, qsmR, ffh, secB, secG, secE, trpE, ribD, zur, solR, rhlI, yidC
Biofilm formation	acfC, envZ, ompR, tpbB, pgaB, pilG, pilH, pilI, pilJ, chpA, yegE, wecB, pgaC, fimX, fimW, aphB, trpG, mucR, gspL, gspM, fis, pgaA, pgaD, hfq, oxyR, aphA, wspR, gcvA, gspK, gspJ, gspI, gspG, crp, cysE, paaK, impJ, impA, vasG, impM, impL, impH, hcp, impC, impB, bifA, csrA, roeA, rpoN, barA, gspF, trpE, gspD, gspC, gspN, dksA, uvrY, rhlI, gfcE
Glycolysis/Gluconeogenesis	Ahr, aceE, Acs, pdhD, adh, pckA, Fbp, gapA, ppsA, aldB, yiaY, eno, frmA, fbaA, Pgk, galM, pmm-pgm, gapN, tpiA, gpmI, pgi

KEGG pathway III

LSQ 3

Quorum sensing

ribA, secY, yajC, ahlD, secA, qseB, qseC, oprM, bapA, phzF, trpGkdpE, hfq, plc, ftsY, aroF, aphA, fadD, ddpD, crp, qsmR, ffh, secB, secG, secE, trpE, ribD, zur, solR, rhlI, yidC

Biofilm formation

acfC, envZ, ompR, tpbB, pgaB, pilG, pilH, pilI, pilJ, chpA, yegE, wecB, pgaC, fimX, fimW, aphB, trpG, mucR, gspL, gspM, fis, pgaA, pgaD, hfq, oxyR, aphA, wspR, gcvA, gspK, gspJ, gspI, gspG, crp, cysE, paaK, impJ, impA, vasG, impM, impL, impH, hcp, impC, impB, bifA, csrA, roeA, rpoN, barA, gspF, trpE, gspD, gspC, gspN, dksA, uvrY, rhlI, gfcE

Glycolysis/Gluconeogenesis

Ahr, aceE, Acs, pdhD, adh, pckA, Fbp, gapA, ppsA, aldB, yiaY, eno, frmA, fbaA, Pgk, galM, pmm-pgm, gapN, tpiA, gpmI, pgi

VF category	Major virulence factors
Adherence	TFP, Paa, type IV pili, EF-Tu, PEB1, Hsp60, Lap, type 1 fimbriae
Biofilm	Alginate, AdeFGH efflux pump, Bap, VPS, alginate, intercellular adhesion proteins, PNAG, type 3 fimbriae, quorum sensing
Nutritional/Metabolic factor	Acinetobactin, allantion utilization, pyocyanin, pyoverdine, Chu, Sal, pyrimidine biosynthesis, FbpABC, purine biosynthesis, FbpABC, HitABC, allantion utilization, petrobactin, LipF, pyochelin, AnsP, biotin synthesis, Shu, HemO cluster
Effector delivery system	T4SS secreted effector, T6SS, Dot/Icm T4SS secreted effectors, Bsa T3SS, TTSS (SPI-2 encode), T2SS, T3SS, Xcp secretion system, exolysin, HSI-1 T6SS secreted effectors, HSI-1, type VII secretion system
Exotoxin	Phospholipase D, phospholipase C, colibactin, haemolysin/cytolysin
Immune modulation	LPS, PDIM, LOS, OmpA, capsule, Vi antigen, PbpG
Exoenzyme	CpaA, TlyC
Regulation	MprAB, LetA/S, RelA, BvrR-BvrS, SigA, Ler

VF category

Major virulence factors

Adherence

TFP, Paa, type IV pili, EF-Tu, PEB1, Hsp60, Lap, type 1 fimbriae

Biofilm

Alginate, AdeFGH efflux pump, Bap, VPS, alginate, intercellular adhesion proteins, PNAG, type 3 fimbriae, quorum sensing

Nutritional/Metabolic factor

Acinetobactin, allantion utilization, pyocyanin, pyoverdine, Chu, Sal, pyrimidine biosynthesis, FbpABC, purine biosynthesis, FbpABC, HitABC, allantion utilization, petrobactin, LipF, pyochelin, AnsP, biotin synthesis, Shu, HemO cluster

Effector delivery system

T4SS secreted effector, T6SS, Dot/Icm T4SS secreted effectors, Bsa T3SS, TTSS (SPI-2 encode), T2SS, T3SS, Xcp secretion system, exolysin, HSI-1 T6SS secreted effectors, HSI-1, type VII secretion system

Exotoxin

Phospholipase D, phospholipase C, colibactin, haemolysin/cytolysin

Immune modulation

LPS, PDIM, LOS, OmpA, capsule, Vi antigen, PbpG

Exoenzyme

CpaA, TlyC

Regulation

MprAB, LetA/S, RelA, BvrR-BvrS, SigA, Ler