微生物学报

Strains	Descriptions	Sources
E. coli C2	E. coli CICC 23846	CICC
E. coli KA00	E. coli C2	This study
E. coli KA01	E. coli C2ΔygaY::RoPYC	This study
E. coli KA02	E. coli KA01ΔilvG::EcCS	This study
E. coli KA03	E. coli KA02ΔlafU::EcACN	This study
E. coli KA04	E. coli KA03Δrph::EcIDH	This study
E. coli KA24	E. coli KA04, ARTP mutagenesis	This study
E. coli KA25	E. coli KA04, ARTP mutagenesis	This study
E. coli KA26	E. coli KA25ΔldhA	This study
E. coli KA27	E. coli KA26ΔpoxBΔpta-ackA	This study
E. coli KA28	E. coli KA27ΔpflB	This study
E. coli KA29	E. coli KA28ΔfrdBCΔfumABC	This study

Strains	Descriptions	Sources
E. coli C2	E. coli CICC 23846	CICC
E. coli KA00	E. coli C2	This study
E. coli KA01	E. coli C2ΔygaY::RoPYC	This study
E. coli KA02	E. coli KA01ΔilvG::EcCS	This study
E. coli KA03	E. coli KA02ΔlafU::EcACN	This study
E. coli KA04	E. coli KA03Δrph::EcIDH	This study
E. coli KA24	E. coli KA04, ARTP mutagenesis	This study
E. coli KA25	E. coli KA04, ARTP mutagenesis	This study
E. coli KA26	E. coli KA25ΔldhA	This study
E. coli KA27	E. coli KA26ΔpoxBΔpta-ackA	This study
E. coli KA28	E. coli KA27ΔpflB	This study
E. coli KA29	E. coli KA28ΔfrdBCΔfumABC	This study

代谢工程改造大肠杆菌生产α-酮戊二酸

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朱攀 ^* , 孙馨怿 , 李雨菲 , 陈佳颖 , 方雨婷

微生物学报 | 研究报告 2026,66(1): 364-376

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微生物学报 | 研究报告 2026, 66(1): 364-376

代谢工程改造大肠杆菌生产α-酮戊二酸

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朱攀^*, 孙馨怿, 李雨菲, 陈佳颖, 方雨婷

作者信息

江南大学生命科学与健康工程学院，江苏无锡

Metabolic engineering of Escherichia coli for α-ketoglutarate production

Pan ZHU^*, Xinyi SUN, Yufei LI, Jiaying CHEN, Yuting FANG

Affiliations

School of Life Sciences and Health Engineering, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu, China

出版时间: 2026-01-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250545

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摘要

收起

α-酮戊二酸是一种重要的短链有机酸，广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料等领域。然而，生物发酵法生产α-酮戊二酸的效率有待进一步提高，主要受限于微生物内源代谢途径的合成能力。 【目的】 开发能高效生产α-酮戊二酸的大肠杆菌，为未来大规模生产α-酮戊二酸提供理论支撑。 【方法】 采用理性代谢工程改造α-酮戊二酸合成途径与非理性常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma mutagenesis, ARTP)相结合的方法解除内源代谢途径的限制，提高α-酮戊二酸的合成效率。 【结果】 通过表达丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶重构了α-酮戊二酸合成的氧化TCA途径，有效提升了α-酮戊二酸产量。借助ARTP技术，非理性优化并强化了α-酮戊二酸合成的代谢网络，进一步提高了其合成能力。通过敲除乳酸、乙酸和甲酸代谢途径的相关基因有效减少了碳代谢流的损耗，提高了α-酮戊二酸合成前体——丙酮酸的供给效率。在此基础上，进一步敲除α-酮戊二酸降解途径的相关基因，使碳代谢流在α-酮戊二酸节点滞留，提高了α-酮戊二酸产量。通过优化发酵条件，在5 L发酵罐中工程菌株Escherichia coli KA29的α-酮戊二酸产量、得率和生产强度分别达到28.7 g/L、0.29 g/g和0.48 g/(L‧h)。 【结论】 本研究策略为α-酮戊二酸高产菌株的开发与应用奠定了基础，同时也为代谢工程改造生产其他有机酸提供了参考。

关键词

大肠杆菌 / α-酮戊二酸 / 丙酮酸 / 常压室温等离子体诱变 / 代谢工程 / 发酵优化

Abstract

收起

α-ketoglutarate is an important short-chain organic acid that is widely used in various fields such as food, medicine, cosmetics, and animal feed. However, the efficiency of producing α-ketoglutarate through biological fermentation remains to be improved, primarily due to the limitations in the synthetic capacity of microbial metabolic pathways. [Objective] To address the above issues, we developed an engineered Escherichia coli that can efficiently produce α-ketoglutarate, thereby providing theoretical support for the large-scale production of α-ketoglutarate in the future. [Methods] We employed an efficient approach combining rational and irrational modifications to overcome the constraints of endogenous metabolic pathways and enhance the biosynthesis efficiency of α-ketoglutarate. [Results] The oxidative TCA pathway was reconstructed to improve α-ketoglutarate production through expressing pyruvate carboxylase, citrate synthase, aconitase, and isocitrate dehydrogenase. The metabolic network for α-ketoglutarate biosynthesis was irrationally optimized and strengthened to enhance its biosynthesis capability by atmospheric pressure room temperature plasma mutagenesis. To improve the supply efficiency of the precursor for α-ketoglutarate biosynthesis, we reduced the dissipation of carbon flux in the pyruvate node by knocking out genes related to the accumulation of lactate, acetate, and formate. Furthermore, we knocked out the genes related to the degradation pathway of α-ketoglutarate to achieve the retention of carbon flux at α-ketoglutarate node and improve its production. Through the optimization of fermentation conditions, the fermentation in a 5 L fermenter with the engineered strain E. coli KA29 achieved the α-ketoglutarate titer, yield, and productivity of 28.7 g/L, 0.29 g/g, and 0.48 g/(L·h), respectively. [Conclusion] The research strategies mentioned above lay a foundation for the development and application of strains with high production of α-ketoglutarate and provide a reference for metabolic engineering to produce other organic acids.

Key words

Escherichia coli / α-ketoglutarate / pyruvate / atmospheric and room temperature plasma mutagenesis / metabolic engineering / optimization of fermentation conditions

引用本文

朱攀, 孙馨怿, 李雨菲, 陈佳颖, 方雨婷. 代谢工程改造大肠杆菌生产α-酮戊二酸. 微生物学报, 2026 , 66 (1) : 364 -376 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250545

Pan ZHU, Xinyi SUN, Yufei LI, Jiaying CHEN, Yuting FANG. Metabolic engineering of Escherichia coli for α-ketoglutarate production[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2026 , 66 (1) : 364 -376 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250545

正文

收起

α-酮戊二酸是一种重要的短链羧酸分子，广泛应用于食品、医药、化妆品和动物饲料等领域^[1]。此外，α-酮戊二酸作为三羧酸循环和氨基酸代谢中的关键二元酸，在氨基酸形成和氮转运过程中发挥着重要作用^[2]。α-酮戊二酸的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化法。由于化学合成法易引发环境污染等问题，因此α-酮戊二酸生产方法的研究主要聚焦于微生物发酵法和酶催化法。研究表明，微生物发酵法生产α-酮戊二酸所涉及的微生物主要有大肠杆菌(Escherichia coli)、球拟假丝酵母(Candida glabrata)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等^[3-4]。

为实现发酵法生产α-酮戊二酸，发酵优化和代谢工程策略已被广泛用于提高酵母生产α-酮戊二酸的效率。一方面，采用发酵优化策略调节胞内α-酮戊二酸的合成途径、增强细胞的α-酮戊二酸合成能力，是提高α-酮戊二酸产量的有效方法。通过调节生物素和Ca²⁺浓度实现了C. glabrata胞内碳流在丙酮酸和α-酮戊二酸之间的重新分配，分批发酵64 h时α-酮戊二酸产量提高至43.7 g/L^[5]。此外，以Y. lipolytica WSH-Z06为出发菌株，通过两阶段pH控制策略和甘油补加策略，α-酮戊二酸产量达到了66.2 g/L^[6]。虽然通过优化发酵条件能够提高菌株生产α-酮戊二酸的能力，但该策略存在对发酵条件要求较高、发酵过程不易控制、菌株生产性能易波动等问题。另一方面，采用代谢工程策略改造和优化α-酮戊二酸的合成途径，以期实现高效、稳定生产α-酮戊二酸的目标。通过在C. glabrata中强化内源乙酰CoA合成酶(ACS2)的表达水平，有效增加了胞内乙酰CoA的积累量，进而使α-酮戊二酸产量提高了2.47倍^[7]；通过在C. glabrata中适当提高丙酮酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶和丙酮酸脱羧酶的活性，并降低α-酮戊二酸脱氢酶的活性，最终使α-酮戊二酸产量提高至37.7 g/L^[8-9]。在Y. lipolytica WSH-Z06中分别过表达来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和米根霉(Rhizopus oryzae)的丙酮酸羧化酶，α-酮戊二酸产量分别提高了24.5%和35.4%^[10]；通过在Y. lipolytica WSH-Z06中表达来自小鼠(Mus musculus)的柠檬酸裂合酶，调节辅因子代谢以改变碳代谢流分布，从而使α-酮戊二酸产量提高至56.5 g/L^[11]。虽然通过对酵母进行改造能够提高α-酮戊二酸产量，但α-酮戊二酸的发酵周期仍然较长。

与酵母相比，E. coli具有更快的生长速度和更强的代谢能力。因此，通过代谢工程改造E. coli能够在缩短发酵周期的同时提高α-酮戊二酸产量。通过在E. coli中构建与优化α-酮戊二酸合成的氧化TCA途径、消除丙酮酸下游代谢副产物和α-酮戊二酸降解代谢途径、优化乙酰CoA供给等策略，使α-酮戊二酸产量达到了32.2 g/L^[12]。然而，目前关于代谢工程改造E. coli生产α-酮戊二酸的研究较少，因此E. coli生产α-酮戊二酸的潜力有待进一步挖掘。本研究以E. coli为出发菌株，采用理性代谢工程改造策略，包括强化氧化TCA途径、消除丙酮酸节点的副产物途径、阻断α-酮戊二酸分解代谢途径等，以及非理性代谢工程改造策略——常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma mutagenesis, ARTP)，有效改善了α-酮戊二酸生产(图1)。最终，工程菌株E. coli KA29的α-酮戊二酸产量达到28.7 g/L，该研究为利用E. coli生产α-酮戊二酸奠定了实践基础。

1 材料与方法

收起

1.1 材料

1.1.1 菌株

以E. coli CICC 23846作为底盘菌株进行代谢工程改造以生产α-酮戊二酸。E. coli JM109主要用于重组质粒构建。本研究所使用的菌株信息见表1。

1.1.2 主要试剂和仪器

限制性内切酶、PrimeSTAR高保真酶、Taq DNA聚合酶等分子生物学基因操作相关酶，宝生物工程(大连)有限公司；一步同源重组酶，南京巨匠生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、产物纯化试剂盒等分子生物学基因操作相关试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌与酵母基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；α-酮戊二酸，Sigma-Aldrich公司；其他试剂，国药集团化学试剂有限公司。PCR引物由亦欣生物科技(上海)有限公司合成。

PCR扩增仪、凝胶成像仪、电转仪、电泳仪、高速离心机，艾本德股份公司；SBA生物传感仪，山东科学院生物研究所；高效液相色谱仪，ThermoFisher Scientific公司；分析天平、精密pH计，梅特勒-托利多公司；5 L发酵罐，迪必尔生物工程(上海)有限公司。

1.2 分子操作方法

采用CRISPR-Cas9技术^[13]，在底盘菌株E. coli CICC 23846基因组的中性位点ygaY、ilvG、lafU和rph处分别插入RoPYC、EcCS、EcACN和EcIDH基因，依次获得菌株E. coli KA01、E. coli KA02、E. coli KA03和E. coli KA04。以E. coli KA01的构建过程为例，采用融合PCR方法将ygaY上下游同源臂和带有Trc启动子的基因RoPYC进行连接，获得RoPYC整合框，将其与质粒pTargetF和pCas共同转入菌株E. coli CICC 23846中筛选获得阳性克隆，消除质粒后获得RoPYC基因整合的菌株E. coli KA01。采用相同的方法构建EcCS、EcACN和EcIDH基因过表达的菌株E. coli KA02、E. coli KA03和E. coli KA04。此外，采用上述方法分别获得ldhA、poxB、pflB、pta-ackA、frdBC和fumABC基因敲除盒，将其与质粒pCas和pTargetF共同转入菌株E. coli KA25中，依次获得菌株E. coli KA26、E. coli KA27、E. coli KA28和E. coli KA29。

1.3 培养基及培养条件

1.3.1 种子培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0。

1.3.2 发酵培养基

M9无机盐培养基(g/L)：葡萄糖50.0，NH₄Cl 1.0，Na₂HPO₄·12H₂O 15.1，KH₂PO₄ 3.0，NaCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.3，微量元素液1 mL。微量元素液(g/L)：FeCl₃·6H₂O 2.4，CoCl₂·6H₂O 0.3，CuCl₂0.2，ZnCl₂·4H₂O 0.3，NaMnO₄ 0.3，H₃BO₃ 0.1，MnCl₂·4H₂O 0.5，溶于0.1 mol/L HCl中配制。

NBS无机盐培养基(g/L)：葡萄糖50.0，(NH₄)₂HPO₄ 3.5，KH₂PO₄ 3.5，K₂HPO₄ 5.0，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCl₂·2H₂O 15.0 mg/L，维生素B1 0.5 mg/L，1 mL微量元素液。微量元素液(g/L)：FeCl₃·6H₂O 2.4，CoCl₂·6H₂O 0.3，CuCl₂0.2，ZnCl₂·4H₂O 0.3，NaMnO₄0.3，H₃BO₃ 0.1，MnCl₂·4H₂O 0.5，溶于0.1 mol/L HCl中配制。

AM1无机盐培养基(g/L)：葡萄糖50.0，(NH₄)₂HPO₄·12H₂O 2.6，NH₄H₂PO₄0.9，KCl 0.2，MgSO₄·7H₂O 0.4，微量元素液1 mL。微量元素液(g/L)：FeCl₃·6H₂0 2.4，CoCl₂·6H₂O 0.3，CuCl₂ 0.2，ZnCl₂·4H₂O 0.3，NaMnO₄ 0.3，H₃BO₃ 0.1，MnCl₂·4H₂O 0.5，溶于0.1 mol/L HCl中配制。

MR无机盐培养基(g/L)：葡萄糖50.0，(NH₄)₂HPO₄ 4.0，KH₂PO₄ 6.7，MgSO₄·7H₂O 0.8 g/L，柠檬酸0.8 g/L，微量元素液1 mL。微量元素液(g/L)：FeSO₄·7H₂O 10.0，CaCl₂·2H₂O 2.0，ZnSO₄·7H₂O 2.2，MnS0₄·4H₂O 0.5，CuSO₄·5H₂O 1.0，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1，Na₂B₄O₇·10H₂O 0.1，溶于5 mol/L HCl配制。

mAM1培养基：在AM1无机盐培养基中添加4.0 g/L酵母提取物。

1.3.3 种子培养

从甘油管中蘸取菌液划线于LB平板，置于37 ℃培养箱中培养24 h，挑取新鲜的单菌落接种至50 mL/250 mL的LB培养基中，37 ℃、200 r/min条件下培养10 h。

1.3.4 摇瓶发酵

以起始OD₆₀₀=0.5的接种量，将菌液接种至50 mL/250 mL的M9无机盐培养基中，并加入30 g/L灭菌CaCO₃，于37 ℃、200 r/min条件下培养60 h。在发酵24 h时补加葡萄糖50 g/L。

1.3.5 5 L罐发酵

重组菌经平板活化后，挑取单菌落接入装液量为50 mL/250 mL的mAM1培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养10-12 h后作为种子液，以起始OD₆₀₀=0.5的接种量，接种于5 L罐发酵(含2.5 L mAM1培养基)中，通气量1 vvm、转速300 r/min，37 ℃培养60 h。发酵过程中采用4 mol/L NaOH控制pH为7.0。当初始葡萄糖消耗完毕后开始持续流加葡萄糖至发酵结束，控制葡萄糖浓度在1-5 g/L。

1.4 ARTP诱变

1.4.1 菌悬液制备

从甘油管中蘸取菌液划线于LB平板，置于37 ℃培养箱中培养24 h，挑取新鲜的单菌落接种50 mL/250 mL的LB培养基中，37 ℃、200 r/min条件下培养10 h。将菌液4 ℃、6 000 r/min离心5 min，弃去培养基，菌体用PBS溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约10⁸个/mL，备用。

1.4.2 ARTP诱变

取10 μL上述菌悬液滴在灭菌后的金属载片中央(ARTP仪专用配件)，并置于ARTP诱变育种仪中进行诱变。以氮气为工作气体，设定功率为120 W，处理温度为室温，通气量为10 SLPM (standard liters per minute)，等离子体发射源与样品间的距离为5 mm，处理时间设置为30 s。将诱变处理后的载片放入装有990 μL种子培养基的1.5 mL离心管中振荡100 s，之后转入装有50 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，37 ℃、200 r/min培养12 h，适当稀释后取100 μL涂布于固体培养基，置于37 ℃恒温培养24 h。

1.5 生物量测定

菌体浓度利用可见分光光度计进行测定，测定波长为600 nm，并根据1 OD₆₀₀=0.3 g/L细胞干重(dry cell weight, DCW)的比例关系来计算菌体生物量。

1.6 葡萄糖含量测定

发酵液中葡萄糖浓度稀释100倍后使用生物传感分析仪进行检测。

1.7 有机酸含量测定

发酵液中有机酸含量使用高效液相色谱仪进行测定，分析条件如下：色谱柱为Atlantis^®dC18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为0.1 mol/L KH₂PO₄ (采用H₃PO₄调节至pH 2.8)，进样量10 μL，检测波长215 nm，柱温20 ℃，流速0.6 mL/min。

1.8 统计学分析

统计分析结果均以mean±SD表示，每组实验至少进行3次生物学重复。使用GraphPad Prism 8.0进行t检验分析，对数据均值之间的统计差异进行分析，其中：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

2 结果与分析

收起

2.1 α-酮戊二酸合成途径的构建

在E. coli合成α-酮戊二酸的过程中葡萄糖首先通过糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸再经TCA循环生成α-酮戊二酸。为提高α-酮戊二酸的合成能力，通过基因过表达强化了从丙酮酸到α-酮戊二酸的代谢途径，主要涉及4个关键酶：源自R. oryzae的丙酮酸羧化酶(RoPYC)、E. coli本源的柠檬酸合成酶(EcCS)、顺乌头酸酶(EcACN)和异柠檬酸脱氢酶(EcIDH) (图2A)。结果表明，工程菌株E. coli KA04的α-酮戊二酸产量达到5.5 g/L，较对照菌株E. coli KA00 (1.2 g/L)提高了358.3% (图2B)。与此同时，工程菌株E. coli KA04的生物量(dry cell weight, DCW)较对照菌株E. coli KA00提高了35.4% (图2B)。此外，工程菌株E. coli KA04也能积累一定量的副产物，如含有6.2 g/L丙酮酸、5.4 g/L乳酸、4.3 g/L乙酸和2.4 g/L甲酸。上述结果表明，菌株E. coli KA04可用于生产α-酮戊二酸，但α-酮戊二酸的生产水平仍较低，需进一步提高其产量。

2.2 ARTP诱变增强α-酮戊二酸生产

以E. coli KA04为出发菌株进行ARTP诱变，根据α-酮戊二酸产量，对筛选平板上长出的200株ARTP突变菌株进行初步筛选，获得32株α-酮戊二酸产量高于E. coli KA04的突变菌株，正突变率达16.0% (图3A)。在此基础上，对上述初筛获得的突变菌株进行复筛，其中25株突变株的α-酮戊二酸产量高于出发菌株E. coli KA04 (图3B)。突变株E. coli KA24和E. coli KA25的α-酮戊二酸产量分别达到了9.8 g/L和10.2 g/L，较对照菌株E. coli KA04分别提高了78.2%和85.5% (图3B)。将上述复筛获得的2株突变株进行传代发酵验证，并分析其遗传稳定性。以摇瓶发酵获得的α-酮戊二酸产量为指标，突变株E. coli KA25的α-酮戊二酸产量不仅高于出发菌株E. coli KA04且产量变化幅度小(图3C)。上述结果表明，突变株E. coli KA25具有良好的遗传稳定性，适合进一步进行代谢工程改造生产α-酮戊二酸。

2.3 α-酮戊二酸合成前体供给优化

通过ARTP诱变获得的突变株E. coli KA25在改善α-酮戊二酸积累的同时也增加了副产物的积累，如含有8.8 g/L丙酮酸、7.4 g/L乳酸、5.5 g/L乙酸和2.7 g/L甲酸(图4B)。为减少碳代谢流的损耗，敲除了副产物乳酸、乙酸和甲酸代谢途径涉及的相关基因(图4A)。为降低乳酸积累，敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)；为降低乙酸积累，敲除了丙酮酸氧化酶基因(poxB)、磷酸转乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)；为降低甲酸积累，敲除了丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)。结果表明，工程菌株E. coli KA28的α-酮戊二酸产量达到15.4 g/L，较出发菌株E. coli KA25提高了51.0% (图4B)。与此同时，工程菌株E. coli KA28的丙酮酸(3.3 g/L)、乳酸(2.1 g/L)、乙酸(1.5 g/L)和甲酸(0.6 g/L)含量较出发菌株E. coli KA25分别降低了62.5%、71.6%、72.7%和77.8% (图4B)。此外，工程菌株E. coli KA28的生物量(DCW)较出发菌株E. coli KA25降低了34.7% (图4B)。上述结果表明，通过敲除副产物积累相关代谢途径有利于增加α-酮戊二酸合成前体的供给，从而提高α-酮戊二酸的产量。

2.4 α-酮戊二酸合成降解途径阻断

通过敲除副产物代谢途径相关基因有效降低了副产物的积累，使更多碳代谢流用于α-酮戊二酸生产。然而，在工程菌株E. coli KA28生产α-酮戊二酸的过程中仍积累了0.4 g/L琥珀酸、4.6 g/L苹果酸和3.8 g/L富马酸(图5B)。为阻断α-酮戊二酸降解途径，降低其下游副产物的积累，在E. coli KA28中进一步敲除富马酸还原酶基因(frdBC)和富马酸酶基因(fumABC)，获得了工程菌株E. coli KA29 (图5A)。结果表明，工程菌株E. coli KA29的α-酮戊二酸产量达18.6 g/L，较出发菌株E. coli KA28提高了20.8% (图5B)。与此同时，工程菌株E. coli KA29的苹果酸(2.3 g/L)和富马酸(1.5 g/L)较出发菌株E. coli KA28分别降低了50.0%和60.5%，而琥珀酸积累量无明显变化(图5B)。此外，工程菌株E. coli KA29的生物量(DCW)较E. coli KA28降低了15.4%。上述结果表明，敲除α-酮戊二酸下游副产物积累相关基因有利于将碳代谢流滞留于α-酮戊二酸节点，从而提高α-酮戊二酸产量。

2.5 发酵优化生产α-酮戊二酸

菌株、培养基成分以及发酵条件是决定微生物发酵产酸性能的3个关键因素。为考察工程菌E. coli KA29的α-酮戊二酸生产性能，分别优化了发酵培养基和发酵条件。培养基M9^[14-16]、NBS^[17-18]、AM1^[12]、mAM1^[19]和MR^[20]已广泛应用于E. coli发酵生产乳酸、富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸、苯甲酸等有机酸。因此，测定了工程菌E. coli KA29在M9、NBS、mAM1、AM1和MR等5种发酵培养基中的产酸情况(图6A)。在5种培养基中，mAM1培养基效果最优，既有利于菌株E. coli KA29生长，又最适合生产α-酮戊二酸，生物量(DCW)和α-酮戊二酸产量分别达到5.5 g/L和20.5 g/L。上述结果表明，mAM1培养基更有利于α-酮戊二酸的积累，因此选择mAM1培养基用于后续研究。

溶氧水平对细胞生长和碳代谢流分布起着关键作用。因此，考察了50、100、200和300 r/min转速条件下工程菌E. coli KA29的产酸情况(图6B)。随着转速提高，工程菌E. coli KA29的α-酮戊二酸产量呈逐渐增加趋势。当转速从200 r/min提高到300 r/min时工程菌E. coli KA29的α-酮戊二酸产量进一步增加至24.5 g/L。上述结果表明，溶氧水平可能会影响工程菌E. coli KA29在α-酮戊二酸节点的碳代谢流分布，进而在一定程度上增加α-酮戊二酸产量。

在5 L发酵罐上进一步验证了上述培养基和溶氧水平对工程菌E. coli KA29生产α-酮戊二酸的影响。经过60 h的补料分批发酵，生物量(DCW)最大达7.5 g/L，α-酮戊二酸产量、得率和生产强度分别达28.7 g/L、0.29 g/g和0.48 g/(L‧h) (图6C)。此外，发酵副产物丙酮酸、琥珀酸和苹果酸积累量分别为5、6.3、4.3 g/L，而乳酸、乙酸、甲酸和富马酸积累量均在1.0 g/L以下(图6D)。上述结果表明，工程菌E. coli KA29对于高效生产α-酮戊二酸具有较大潜力。

3 讨论与结论

收起

本研究以E. coli为出发菌株，采用理性与非理性代谢工程改造相结合的策略，重构并强化了α-酮戊二酸合成的氧化TCA途径，显著提高了α-酮戊二酸产量。通过发酵条件优化，在5 L发酵罐上工程菌株E. coli KA29的α-酮戊二酸产量、得率和生产强度分别达到了28.7 g/L、0.29 g/g和0.48 g/(L‧h)。本研究为微生物发酵法生产α-酮戊二酸提供了新的研究思路，同时也为利用代谢工程改造E. coli生产其他有机酸提供了参考。

代谢工程策略已广泛应用于改造工业微生物以生产α-酮戊二酸。目前采用的主要策略有5种：构建α-酮戊二酸合成途径、强化α-酮戊二酸前体供给途径、消除α-酮戊二酸竞争性代谢途径、优化α-酮戊二酸合成过程中的辅因子平衡以及提高α-酮戊二酸外转运能力。一方面，在E. coli中构建了α-酮戊二酸合成的氧化TCA途径，敲除了丙酮酸节点的副产物途径以及α-酮戊二酸下游降解途径，优化了氧化TCA途径表达水平和乙酰CoA供给，最终α-酮戊二酸产量达到了32.2 g/L^[12]。上述研究与本研究的区别主要体现在以下3个方面。(1) 出发菌株不同，上述研究使用的出发菌株为野生型E. coli W3110，而本研究采用能够积累一定富马酸的E. coli CICC 23846。(2) 理性代谢工程改造的侧重点不同，上述研究虽然对α-酮戊二酸合成途径以及竞争性代谢途径进行了改造，但更侧重于α-酮戊二酸合成途径的优化和前体乙酰CoA供给的强化。由于本研究采用了富马酸积累型底盘菌株E. coli CICC 23846，因此更注重α-酮戊二酸合成途径的改造。(3) 发酵条件不同，上述研究采用的发酵培养基中含有20.0 g/L蛋白胨和10.0 g/L酵母提取物，发酵条件为搅拌速度200 r/min和通气量1 vvm；而在本研究中发酵培养基中含有4.0 g/L酵母提取物，发酵条件为搅拌速度300 r/min和通气量1 vvm。本研究的发酵培养基成分相对更简单，更便于下游提取，有利于降低成本。综上所述，未来的研究可能侧重于以下2个方面：(1) 深入分析α-酮戊二酸合成途径的限制性瓶颈，以及解除瓶颈的代谢工程与合成生物学策略；(2) 由于副产物途径以及降解途径的敲除在一定程度上阻碍了细胞生长，因此可以采用提高乙酰CoA供给、弱化降解途径等策略改善细胞生长。

另一方面，在Y. lipolytica中通过过量表达异柠檬酸脱氢酶(IPD1)和丙酮酸羧化酶(PYC1)，有效改善了氧化TCA途径的碳流通量，使α-酮戊二酸产量达到了186 g/L^[4]。此外，在C. glabrata中通过调节丙酮酸节点关键酶的辅因子供给实现了碳流从丙酮酸到α-酮戊二酸的重新分配，最终α-酮戊二酸产量达到了43.7 g/L^[5]。上述研究主要侧重于代谢工程改造酵母生产α-酮戊二酸，显著提高了α-酮戊二酸的产量。然而，酵母发酵生产α-酮戊二酸也存在一些缺点。(1) 对于Y. lipolytica而言，发酵周期(120 h以上)相对较长，增加了发酵过程染菌风险；发酵碳源多为精甘油、部分为粗甘油，总体而言发酵成本相对较高；发酵过程需要添加碳酸钙作为中和剂，这也增加了下游分离纯化成本。(2) 对于C. glabrata而言，菌株为条件致病菌，存在生物安全风险；发酵过程需要添加碳酸钙作为中和剂，增加了下游分离纯化成本；发酵过程中产生的杂酸较多(如丙酮酸)，这也不利于下游分离纯化。综上所述，未来的研究可能侧重于以下3个方面：(1) 针对E. coli KA29继续进行代谢工程改造，提高α-酮戊二酸合成效率；(2) 继续简化发酵培养基并缩短发酵周期，降低成本与染菌风险；(3) 继续降低发酵过程中的杂酸积累量，缓解下游分离纯化压力。

溶氧水平在控制E. coli胞内代谢流分布中起着重要作用，通过代谢流的重新分布可提高α-酮戊二酸产量。细菌处于高溶氧水平下会导致胞内氧自由基含量升高，为了消除氧自由基对自身的危害，细菌会从以下3个方面对胞内代谢进行调节^[21]：激活氧应激信号通路使细胞进入氧化应激状态、改变胞内关键酶的酶活水平以及重新调整胞内NADPH/NADH水平。通过上述调节，细胞在消除氧毒害的同时实现了胞内代谢通量在整体水平上的重新分配，从而引起α-酮戊二酸产量的积累。在上述调节方式中，关键酶的酶活水平调节是α-酮戊二酸积累最为关键的因素。例如，通过分析P. fluorescens在氧化应激条件下的生理变化时发现，参与NADPH合成的酶的酶活水平均有所上升，其中NADP-依赖型的异柠檬酸裂解酶的酶活水平比正常情况下提高了194.3%。然而，胞内参与NADH合成的酶的酶活水平会表现出明显下调，其中变化最大的就是α-酮戊二酸脱氢酶，其酶活力降低了82.5%^[22]。因此，处于氧化应激条件下的细菌会积累α-酮戊二酸，可能是由于异柠檬酸酶酶活水平升高增加了α-酮戊二酸的合成，而α-酮戊二酸脱氢酶酶活水平下降弱化了α-酮戊二酸的代谢所引起。随后，通过进一步分析P. fluorescens处于氧化应激条件下的代谢通量变化发现，α-酮戊二酸产量比正常情况下有显著提高，这也进一步证实了细胞处于氧化应激下会引起α-酮戊二酸积累^[23]。另一方面，胞内NADPH/NADH水平的重新分配是细胞积累α-酮戊二酸的另一个关键因素。E. coli在氧应激条件下胞内活性氧增加，糖酵解途径的代谢通量被重新导向到磷酸戊糖途径以及TCA循环，从而引起胞内NADPH/NADH增加，最终导致α-酮戊二酸量的积累，其中α-酮戊二酸的积累速率比正常情况下提高了106.0%^[24-25]。在本研究中工程菌E. coli KA29在高溶氧水平条件下也可能会引起胞内活性氧水平升高并激发氧化应激系统，从而提高α-酮戊二酸产量。

基金

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江苏省自然科学基金(BK20241629)
中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP124023)

参考文献

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文献

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2026年第66卷第1期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250545

接收时间：2025-07-17
首发时间：2026-01-12
出版时间：2026-01-04

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收稿日期：2025-07-17
录用日期：2025-09-05

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Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20241629)

江苏省自然科学基金(BK20241629)

Fundamental Research Funds for the Central Universities(JUSRP124023)

中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP124023)

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江南大学生命科学与健康工程学院，江苏无锡

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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