微生物学报

项目 Items	含量 Content
全磷Total phosphorus (g/kg)	0.30±0.05
速效磷Available phosphorus (mg/kg)	9.83±0.21
全钾Total potassium (g/kg)	19.73±2.27
速效钾Available potassium (mg/kg)	208.00±1.00
全氮Total nitrogen (g/kg)	0.37±0.02
全碳Total carbon (g/kg)	5.01±0.20
pH	9.80±0.16
EC (μS/cm)	1 105.33±28.86

项目 Items	含量 Content
全磷Total phosphorus (g/kg)	0.30±0.05
速效磷Available phosphorus (mg/kg)	9.83±0.21
全钾Total potassium (g/kg)	19.73±2.27
速效钾Available potassium (mg/kg)	208.00±1.00
全氮Total nitrogen (g/kg)	0.37±0.02
全碳Total carbon (g/kg)	5.01±0.20
pH	9.80±0.16
EC (μS/cm)	1 105.33±28.86

测试项目Test items	结果Results	测试项目Test items	结果Results
葡萄糖发酵试验Glucose fermentation test	+	淀粉水解试验Starch hydrolysis test	+
乳糖发酵试验Lactose fermentation test	-	硝酸盐还原试验Nitrate reduction test	-
蔗糖发酵试验Sucrose fermentation test	-	吲哚试验Indole test	+
麦芽糖发酵试验Maltose fermentation test	-	甲基红试验Methyl red test	-
过氧化氢酶试验Catalase test	+	柠檬酸试验Citric acid test	+

测试项目Test items	结果Results	测试项目Test items	结果Results
葡萄糖发酵试验Glucose fermentation test	+	淀粉水解试验Starch hydrolysis test	+
乳糖发酵试验Lactose fermentation test	-	硝酸盐还原试验Nitrate reduction test	-
蔗糖发酵试验Sucrose fermentation test	-	吲哚试验Indole test	+
麦芽糖发酵试验Maltose fermentation test	-	甲基红试验Methyl red test	-
过氧化氢酶试验Catalase test	+	柠檬酸试验Citric acid test	+

特征 Characteristic	嗜冷假单胞菌 Pseudomonas psychrophila MPP2402	恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida^[28]	维罗尼假单胞菌 Pseudomonas putida^[29]	莫尔氏假单胞菌 Pseudomonas umsongensis^[30]
菌落特征 Colony characteristics	黄色，表面光滑隆起 Yellow, smooth and raised surface			菌落中间凸起，圆形，淡黄色 The middle of the colony is raised, rounded, yellowish
生长温度 Growth temperature (℃)	5-30	30	30	28
革兰氏染色 Gram stain	-	-	-	-
淀粉水解试验 Starch hydrolysis test	+	+		-
甲基红试验 Methyl red test	-	+	-	-
吲哚试验 Indole test	+	-	+	-
葡萄糖发酵试验 Glucose fermentation test	+	+		+
过氧化氢酶试验 Catalase test	+	+	+	+
柠檬酸试验 Lactic acid test	+		+

特征 Characteristic	嗜冷假单胞菌 Pseudomonas psychrophila MPP2402	恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida^[28]	维罗尼假单胞菌 Pseudomonas putida^[29]	莫尔氏假单胞菌 Pseudomonas umsongensis^[30]
菌落特征 Colony characteristics	黄色，表面光滑隆起 Yellow, smooth and raised surface			菌落中间凸起，圆形，淡黄色 The middle of the colony is raised, rounded, yellowish
生长温度 Growth temperature (℃)	5-30	30	30	28
革兰氏染色 Gram stain	-	-	-	-
淀粉水解试验 Starch hydrolysis test	+	+		-
甲基红试验 Methyl red test	-	+	-	-
吲哚试验 Indole test	+	-	+	-
葡萄糖发酵试验 Glucose fermentation test	+	+		+
过氧化氢酶试验 Catalase test	+	+	+	+
柠檬酸试验 Lactic acid test	+		+

初始pH Initial pH	可溶性磷含量 Soluble phosphorus content (mg/L)	活菌数 Viable bacterial count (×10⁶ CFU/mL)	pH
7.0	504.05±20.11	135.00±11.53	4.35±0.11
8.0	461.42±12.64	149.67±11.93	4.46±0.09
9.0	400.84±20.14*	230.33±13.20	4.82±0.04*
10.0	198.49±8.58*	330.33±5.51*	5.47±0.08*

初始pH Initial pH	可溶性磷含量 Soluble phosphorus content (mg/L)	活菌数 Viable bacterial count (×10⁶ CFU/mL)	pH
7.0	504.05±20.11	135.00±11.53	4.35±0.11
8.0	461.42±12.64	149.67±11.93	4.46±0.09
9.0	400.84±20.14*	230.33±13.20	4.82±0.04*
10.0	198.49±8.58*	330.33±5.51*	5.47±0.08*

pH	1 d	2 d	3 d
7.0	406.67±15.28	456.67±25.17	526.67±5.77
8.0	376.67±25.17	453.33±15.28	506.67±20.82
9.0	266.33±7.09*	393.33±20.82*	416.67±15.28
10.0	261.67±6.66*	353.33±20.82*	256.00±8.71*

pH	1 d	2 d	3 d
7.0	406.67±15.28	456.67±25.17	526.67±5.77
8.0	376.67±25.17	453.33±15.28	506.67±20.82
9.0	266.33±7.09*	393.33±20.82*	416.67±15.28
10.0	261.67±6.66*	353.33±20.82*	256.00±8.71*

类型 Types	Content (μg/mL)
苹果酸Malic acid	5.93±0.50
草酸Oxalic acid	22.84±0.97*
酒石酸Tartaric acid	15.11±0.64*
柠檬酸Citric acid	0.00±0.00
琥珀酸Succinic acid	51.53±3.80*

类型 Types	Content (μg/mL)
苹果酸Malic acid	5.93±0.50
草酸Oxalic acid	22.84±0.97*
酒石酸Tartaric acid	15.11±0.64*
柠檬酸Citric acid	0.00±0.00
琥珀酸Succinic acid	51.53±3.80*

低温耐盐碱解磷菌的筛选及其作用分析

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葛紫怡 , 王思宇 , 苏旭 , 甘诗韵 , 蒋欣桐 , 黄玉威 , 孟军 ^*

微生物学报 | 研究报告 2025,65(12): 5573-5589

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(12): 5573-5589

低温耐盐碱解磷菌的筛选及其作用分析

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葛紫怡, 王思宇, 苏旭, 甘诗韵, 蒋欣桐, 黄玉威, 孟军^*

作者信息

沈阳农业大学国家生物炭研究院，农业农村部生物炭与土壤改良重点实验室，辽宁沈阳

Isolation and function analysis of phosphate-solubilizing bacteria with psychrotolerance and saline-alkaline tolerance

Ziyi GE, Siyu WANG, Xu SU, Shiyun GAN, Xintong JIANG, Yuwei HUANG, Jun MENG^*

Affiliations

Key Laboratory of Biochar and Soil Improvement, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, National Institute of Biochar, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning, China

出版时间: 2025-12-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250433

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摘要

收起

目的针对寒区盐碱土壤磷素有效性受限这一生态瓶颈问题，分离兼具低温适应性与盐碱抗逆性的功能型解磷细菌，评估其解磷性能及环境适应性，并初步探究其解磷机制。方法以吉林省白城市的盐碱土壤为研究材料，采用无机磷选择性培养基进行细菌分离。利用钼锑抗比色法定量测定细菌的解磷能力，通过形态学观察及16S rRNA基因系统发育树构建完成细菌的分类鉴定。运用多参数梯度优化实验确定最佳解磷条件。进一步采用HPLC定量分析有机酸代谢谱，结合结晶紫染色法及苯酚-硫酸法表征生物膜形成能力及胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)组分。结果成功筛选得到的一株嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila) MPP2402，该菌表现出广泛的环境适应性，可在温度5-30 ℃、pH 7.0-10.0、NaCl 0.2-0.8 mol/L的条件下稳定增殖。经参数优化，其最佳解磷条件为温度15 ℃、初始pH 7.0、NaCl 0.4 mol/L、接种量1%、Ca₃(PO₄)₂添加量5 g/L，此时可溶性磷含量高达574.66 mg/L，较基础培养条件提高14.8%。MPP2402的解磷作用可能是通过分泌琥珀酸(51.53 μg/mL)、草酸(22.84 μg/mL)、酒石酸(15.11 μg/mL)和苹果酸(5.93 μg/mL)等有机酸协同发挥磷酸盐溶解功能，并利用EPS构建生物膜屏障和调节活菌数量以抵御低温、盐碱等不良环境。结论细菌MPP2402的分离为高效耐盐碱菌种资源挖掘和冷凉地区土壤养分改良奠定了前期基础。

关键词

解磷菌 / 低温 / 盐碱 / 有机酸 / 生物膜

Abstract

收起

Objective To isolate multifunctional phosphate-solubilizing bacteria (PSB) exhibiting psychrophilic adaptation and saline-alkaline tolerance in response to the ecological challenge of phosphorus limitation in saline-alkaline soils in cold regions, evaluate their phosphate-solubilizing efficiency and environmental adaptability, and preliminarily investigate their phosphate-solubilizing mechanisms. Methods We used an inorganic phosphorus-selective medium to isolate bacterial strains from saline-alkaline soils in Baicheng, Jilin Province. The phosphate-solubilizing capacity was quantitatively determined through the molybdenum-antimony colorimetric method. Taxonomic identification was performed through morphological characterization and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. The phosphate solubilization conditions were optimized via multi-parameter gradient optimization. HPLC was employed to quantify organic acid metabolites. Phenol-sulfuric acid assay and crystal violet staining were employed to characterize biofilm formation and extracellular polysaccharide (EPS) synthesis. Results The isolated strain Pseudomonas psychrophila MPP2402 demonstrated broad-spectrum environmental adaptability, maintaining stable growth at 5-30 ℃, pH 7.0-10.0, and 0.2-0.8 mol/L NaCl. The strain achieved 574.66 mg/L soluble phosphorus (14.8% increase) under optimal conditions: 15 ℃, pH 7.0, 0.4 mol/L NaCl, 1% inoculum density, and 5 g/L Ca₃(PO₄)₂. MPP2402 may exert the phosphate-solubilizing effect through the secretion of organic acids such as succinic acid (51.53 μg/mL), oxalic acid (22.84 μg/mL), tartaric acid (15.11 μg/mL), and malic acid (5.93 μg/mL), which worked in concert to solubilize phosphate. Additionally, the strain utilized EPS to construct a biofilm barrier and regulated the viable count in adverse environments such as low-temperature and saline-alkaline conditions. Conclusion The successful isolation of MPP2402 establishes a foundational resource for developing efficient saline-alkaline tolerant microbial agents and improving soil nutrient management in cold-region ecosystems.

Key words

phosphate-solubilizing bacteria / low temperature / saline-alkaline / organic acids / biofilm

引用本文

葛紫怡, 王思宇, 苏旭, 甘诗韵, 蒋欣桐, 黄玉威, 孟军. 低温耐盐碱解磷菌的筛选及其作用分析. 微生物学报, 2025 , 65 (12) : 5573 -5589 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250433

Ziyi GE, Siyu WANG, Xu SU, Shiyun GAN, Xintong JIANG, Yuwei HUANG, Jun MENG. Isolation and function analysis of phosphate-solubilizing bacteria with psychrotolerance and saline-alkaline tolerance[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (12) : 5573 -5589 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250433

正文

收起

磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，在细胞能量交换和生物合成过程中起着关键作用^[1]。与其他大量营养元素相比，磷元素具有较高的固相亲和性，易与土壤中的Ca、Fe、Al等金属元素结合形成难溶性磷酸盐^[2]。因此，提高土壤磷素利用效率对于维持农业生产力和稳定生态系统均具有重要的实际意义。

在土壤-植物-微生物循环中，解磷菌能够将难溶性磷酸盐转化为植物可直接利用的形态，是实现土壤磷素形态转化和利用的有效工具^[3]。这类功能细菌主要通过分泌有机酸(如琥珀酸、苹果酸等)降低土壤或微环境中的pH值，促使PO₄^3-转化为HPO₄^2-和H₂PO₄^-，从而显著提高有效磷含量^[4]。此外，研究表明苹果酸、酒石酸等有机酸能够调节编码细胞运动及代谢相关蛋白的基因表达，促进生物膜的形成^[5]。在胁迫条件下，这种调节作用能够增加胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)等关键代谢产物的生成，这些代谢产物通过与金属离子形成络合物，也可能成为微生物解磷的有效途径^[6]。

在农业领域，自1903年Stalstrom^[7]首次从土壤中分离出解磷菌后，国内外学者陆续开展了大量相关研究。目前，已有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、青霉属(Penicillium)等20多个菌属被陆续发现^[8]，且在试验培养条件及水稻(Oryza sativa L.)、玉米(Zea mays L.)、大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]等作物栽培实际应用中均显示出较高的解磷能力^[9-13]。大量研究表明，土壤中解磷菌分布广泛，其对难溶磷的转化主要受温度、土壤pH、盐度等因素影响^[14-17]。其中，低温可能会提高细菌死亡率或诱导细菌进入休眠状态。当温度条件改善时，休眠的细菌可能恢复活性，但这一过程取决于剩余活跃种群的状态和数量^[15]。土壤中的盐碱胁迫会使磷素被盐基离子吸附，以无效态形式存在于高pH土壤中，从而影响细菌的生存和代谢活动，限制了磷的形态转化和可用性^[18-19]。以往研究主要从不同生态地区筛选解磷细菌，研究其解磷特性^[3,9,20]。对低温、耐盐碱解磷细菌的研究还相对薄弱，这制约着对冷凉盐碱地区土壤改良及细菌胁迫适应研究的认识。

本研究于冬季从世界三大苏打盐碱地集中分布区之一的吉林省白城市地区(122°E, 45°N)采集盐碱土壤样品，分离筛选出一株兼具低温适应性与盐碱抗逆性的功能型解磷细菌。利用无机磷选择培养基在不同温度下对其解磷能力进行定性和定量测定，结合形态学观察及16S rRNA基因序列分析等方法开展菌种鉴定。探究温度、pH、NaCl、接种量及Ca₃(PO₄)₂添加量等因素对所筛选菌种解磷效果的影响，确定其发挥最佳解磷能力的环境参数组合。进一步从有机酸-生物膜-EPS等方面分析该菌种的解磷作用，以期为改善冷凉盐碱土壤养分状况、促进磷素的转化和利用效率提供理论依据。

1 材料与方法

收起

1.1 样品采集

土壤样品于2023年11月采集自吉林省白城市盐碱地(土壤的理化性质见表1)。采用随机五点取样法在0-20 cm表层土壤剖面取样^[21]。样品置于无菌袋中，在冷藏条件下带回实验室，置于4 ℃冰箱保藏，供后续研究。

1.2 培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，酵母提取物5.0，琼脂18.0-20.0 (液体培养基不加)，pH 7.0-7.2，121 ℃灭菌20 min。

无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10.0，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，(NH₄)₂SO₄ 0.5，MnSO₄·4H₂O 0.03，FeSO₄·7H₂O 0.03，Ca₃(PO₄)₂ 5.0，琼脂18.0-20.0 (液体培养基不加)，pH 7.0-7.5，115 ℃灭菌30 min。

1.3 解磷菌的分离及鉴定

取10 g土壤置于90 mL LB培养液中，30 ℃、180 r/min培养3 d；以5%接种量转接至LB培养液中，在相同条件下再次培养3 d。随后，将温度分别降低至15 ℃和5 ℃，重复上述操作。将目标菌液逐步稀释至10^-3-10^-8后，各取0.1 mL均匀涂布于无机磷固体培养基，于30 ℃倒置培养3-7 d。

对长势较好的单菌落进行定性分析，测量菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算溶磷指数(D/d)，初步判断细菌的解磷能力^[11]。

将初步筛选的细菌接种于无机磷培养液中，分别在温度为5、15、30 ℃、转速180 r/min的条件下振荡培养7 d进行复筛，每天取1 mL培养液于离心管中，4 000 r/min离心20 min，取上清液，采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量^[22]。以未接种解磷菌的无机磷培养液作为空白对照(CK)，每个处理设置3次重复。

对解磷细菌进行形态特征和生理生化鉴定，并采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，进行分子生物学鉴定^[23]。将获得的16S rRNA序列输入GenBank数据库，用BLAST程序与数据库中的序列进行比对，通过MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.4 细菌耐受性单因素条件优化

以初始接种量5%、初始pH 7.2为基准条件，依次考察温度(5、10、15、20 ℃)、pH (7.0、8.0、9.0、10.0)、NaCl (0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L)、接种量(1%、3%、5%、7%)以及Ca₃(PO₄)₂添加量(2.5、5、7.5、10 g/L)对培养液中解磷能力、pH、活菌数的影响。所有试验参数的调整均基于前一变量已获得最优培养液的基础上进行，并以未接种解磷菌的无机磷培养液作为空白对照(CK)，每个处理设置3次重复。

1.5 有机酸含量的测定

取1.4节研究得到的最优结果对应的培养液，于4 ℃、4 000 r/min离心20 min后取上清液，并过0.22 μm滤膜。利用高效液相色谱法(HPLC)测定滤液中有机酸 (草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和琥珀酸)的含量^[24]。高效液相色谱柱： C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相A：20 mmol/L磷酸氢二钠用磷酸(调pH至2.6):甲醇=99:1；流动相B：甲醇；紫外检测波长：210 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL/min。

1.6 生物膜形成量和胞外多糖(EPS)成分分析

取20 μL培养液和180 μL无机磷培养基加入96孔板中培养24 h后，用200 μL无菌PBS缓冲液清洗板孔3次，然后在室温下用200 μL的0.1%结晶紫染色20 min。随后再次用200 μL无菌PBS缓冲液清洗板孔3次，并将孔板置于200 μL 95%乙醇溶液中孵育20 min以溶解结晶紫，用酶标仪在595 nm处检测吸光度，从而获得生物膜形成量^[25]。

将MPP2402发酵液4 ℃、8 000 r/min离心10 min收集上清液，加入3倍体积无水乙醇并混合均匀，4 ℃静置24 h使EPS析出后，再次离心后弃去上清，保留沉淀并烘干备用^[26]。采用苯酚-硫酸法和Bradford法分别测定多糖和蛋白质的含量^[27]。

1.7 数据处理

使用SPSS 27对试验数据进行正态性和方差齐性检验，根据检验结果进行单因素ANOVA和非参数检验的显著性分析，并使用Origin Pro 2021作图，数据用平均数±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

收起

2.1 解磷菌的分离、筛选及鉴定

2.1.1 解磷菌形态学和生化鉴定结果

利用无机磷培养基对吉林白城盐碱地区土壤中的解磷菌进行筛选，通过观察菌落周围是否形成清晰透明圈进行初步筛选，透明圈的形成表明细菌具有解磷能力。经过3轮透明圈法筛选，选取溶磷指数(D/d)≥1.5的细菌作为候选菌进行纯化培养。其中，MPP2402的D/d值为1.75±0.07，表现出较强的解磷能力。MPP2402在LB固体培养基上的菌落呈黄色，表面光滑隆起，边缘整齐，不透明。经染色分析，鉴定为革兰氏阴性杆菌，无芽孢(图1)。其生理生化测定结果如表2所示。

2.1.2 解磷能力测定

MPP2402经不同梯度恒温培养(7 d)显示(图2)，其不仅能在5-30 ℃的宽温域范围内保持正常生长代谢，且表现出显著的无机磷溶解动态特性。此外，可溶性磷浓度在培养初期(0-3 d)呈增长趋势，随后进入稳定期(3-7 d)浓度呈下降趋势。值得注意的是，15 ℃时MPP2402在第3天达到峰值(500.62 mg/L)，显著高于5 ℃ (374.82 mg/L)、30 ℃ (362.47 mg/L)。这种非对称温度响应模式表明，MPP2402具有最适解磷温度向低温区偏移的特征。

2.1.3 16S rRNA基因鉴定

基于16S rRNA基因序列分析，菌株MPP2402 (GenBank登录号为PV664474)与嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)的相似性高达99.93% (图3)。进一步通过形态与生理生化特征比较发现：MPP2402与同属模式菌株——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)^[28]、维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)^[29]和莫尔氏假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)^[30]共享革兰氏阴性杆菌形态、葡萄糖利用能力阳性、过氧化氢酶阳性及柠檬酸盐利用能力阳性等属级特征，但其温度适应性有所差异(表3)。综上所述，MPP2402符合假单胞菌属定义。

2.2 细菌耐受性优化

2.2.1 培养温度

如图4所示，嗜冷假单胞菌MPP2402的溶磷效能呈现典型的中低温适应性。其中，温度为15 ℃和20 ℃时解磷能力较好，分别为504.74 mg/L和494.81 mg/L，二者无显著差异。无机磷培养液pH降至4.64-5.73，呈偏酸性。这表明MPP2402在溶解Ca₃(PO₄)₂过程中会产生酸性物质，导致环境中pH值降低，而且产酸能力越强可溶性磷含量越高。值得注意的是，温度为10 ℃时活菌数最高(2.49×10⁸ CFU/mL)，但其解磷能力为408.16 mg/L，显著低于15 ℃组。综合考虑，15 ℃呈现出“适当密度高效”的理想模式，可将其作为后续试验的优化温度。

2.2.2 培养液pH值

由表4可知，MPP2402的解磷能力随着初始pH升高呈现下降趋势，在初始pH为7.0时解磷能力最优(504.05 mg/L)。活菌数却呈现增加趋势，初始pH为10.0时活菌数最高(3.30×10⁸ CFU/mL)，初始pH为7.0时活菌数最低(1.35×10⁸ CFU/mL)，说明活菌数的增加未能有效提高培养液中的可溶性磷含量。与此同时，MPP2402在pH 7.0-10.0的LB培养基均能生长。其中pH为9.0时，MPP2402培养第1天活菌数相对较低，但第2天活菌数显著增加，表明其通过延滞期调控来适应碱性胁迫；而pH为10.0时，活菌数整体偏低，但仍维持一定活性。综上所述，MPP2402展现出广泛的pH适应性(pH 7.0-10.0)，属于耐碱微生物(表5、图5)。

培养3 d后，液体中的pH值有所下降(4.35-5.47)，这与温度条件下的结果相吻合，而从整体来看，pH值仍呈现升高趋势。进一步分析发现，培养后的pH值和活菌数的变化趋势具有一定相似性。基于以上观察分析，综合考虑解磷效果、细菌的稳定性和适应性，以及实际应用需求，选择以pH为7.0的条件继续后续试验。

2.2.3 培养液NaCl浓度

将MPP2402分别接种于不同盐浓度(0.2-0.8 mol/L NaCl)的无机磷培养液中培养3 d，其均能正常生长且均具有一定解磷能力(图6)。随着NaCl浓度的升高，解磷能力呈现先升高后降低的趋势，而pH值则呈相反趋势。与上述结果存在差异的是，该变量培养液中的pH值均小于5.0。特别地，当MPP2402处于0.4 mol/L NaCl环境时解磷能力最高，为558.60 mg/L，同时培养液中的pH值最低，为4.44。据此，可判定其为耐盐微生物。

活菌数在不同浓度NaCl环境下普遍较低。相较于低浓度的NaCl环境，MPP2402在高浓度NaCl条件下的生长状况受到更为显著的抑制，菌落直径减小，生物量也有所下降。这一结果表明，尽管MPP2402具备耐盐能力，但过高的NaCl浓度仍会对其生长产生负面影响。

2.2.4 细菌接种量

在初始pH 7.0、0.4 mol/L NaCl的条件下配制无机磷培养基，测定MPP2402不同接种量对其解磷能力、活菌数及pH值的影响。如图7所示，MPP2402的解磷能力随着接种量的增加呈现降低趋势。其中，接种量为1%和3%时解磷能力较好，分别为572.96 mg/L和563.24 mg/L，且二者无显著性差异。

MPP2402的活菌数总体呈现上升趋势，但在接种量为1%、3%、5%时，活菌数量相对较少。与此同时，培养液中的pH值呈现上升趋势。值得注意的是，接种量为1%、3%、5%的培养液中的pH值均低于5.0，这与上述研究结果相吻合。综上所述，MPP2402的最适接种量为1%。

2.2.5 培养液中Ca₃(PO₄)₂ 含量

当以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源时，5 g/L Ca₃(PO₄)₂添加量的解磷能力显著高于其他添加量，为574.7 mg/L (图8)。活菌数和培养液中的pH值呈现逐步上升的趋势。其中，添加量为2.5 g/L Ca₃(PO₄)₂培养液逐渐变为透明，经过计算发现该浓度大约可以释放499.0 mg/L可溶性磷，说明培养液中的可溶性磷含量几乎被完全释放出来。综上所述，本次优化试验结果可靠，可以有效增强MPP2402的解磷能力。

2.3 低温、耐盐碱解磷菌的作用分析

2.3.1 有机酸种类及含量

通过采用HPLC对MPP2402优化发酵液中的5种有机酸进行定量分析(表6、图9)，结果显示MPP2402分泌4种有机酸，其中琥珀酸含量最多，为51.53 μg/mL，其次为草酸、酒石酸、苹果酸，但未检测出柠檬酸。由此可知，MPP2402在解磷过程中培养液pH下降归因于有机酸的产生。

2.3.2 生物膜及EPS组分分析

如图10所示，MPP2402在低温、盐碱胁迫处理(优化后)条件下促进生物膜的形成，其形成量随时间推移持续增加。此外，MPP2402分泌的EPS中成分以多糖为主，蛋白质为辅。在未胁迫处理(优化前)条件下，培养液中的多糖和蛋白质含量呈现“先下降后稳定”的趋势；而胁迫后MPP2402生长速率降低，培养液中的多糖和蛋白质含量持续下降。进一步分析EPS组分发现，优化后多糖/蛋白比值在胁迫初期(0-48 h)升高，多糖合成占优；胁迫后期(48-72 h)比值降低，蛋白质合成占优。综上所述，胁迫通过分阶段调控EPS组分驱动细菌形成抗逆性生物膜，体现了MPP2402在逆境中“生存优先”的适应性。

3 讨论

收起

3.1 解磷菌的筛选及其低温盐碱环境

本研究从吉林省白城市的苏打盐碱地成功分离筛选出嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila) MPP2402，经定向优化后其溶磷效能提升至574.67 mg/L，表现出显著优于同类细菌的代谢潜力。系统文献计量分析显示：张晗昱等^[20]从青藏高原年多冻土区分离出3株解磷假单胞菌，在15 ℃时可溶性磷含量为312.60-344.58 mg/L；李琦等^[31]在高寒草地筛选解磷菌，发现假单胞菌为优势细菌，进一步证明了假单胞菌在低温环境中的广泛分布和解磷潜力，但其环境适应性研究未涉及盐碱因子。与既往研究多聚焦单一环境因子不同，本研究构建了低温-盐碱胁迫试验体系。结果表明MPP2402在温度5-30 ℃、初始pH 7.0-10.0、NaCl 0.2-0.8 mol/L范围内均能保持代谢活性且具有解磷功能，为功能生物菌剂的开发提供了优良种质资源和理论支持。

在耐受性条件优化过程中，试验结果表明pH在细菌生长和解磷能力方面起关键作用。MPP2402培养液中的pH下降可使难溶性磷转化为可溶性磷，该结果与Etesami等^[32]和Xu等^[33]的研究一致。此外，MPP2402在不同pH条件下，LB培养基与无机磷培养基中的活菌数变化存在显著差异，这种差异可能源于细菌在过酸环境(pH<5.0)下生长受限，这一结论与不动杆菌JL-1^[34]和施氏假单胞菌^[35]的研究结果一致。然而，MPP2402在高初始pH环境下表现出独特的适应性，其活菌数随初始pH的增加而增加，这一特性与高威等^[36]的研究结果(活菌数会随着初始pH的增加呈现先增加后减少的趋势)存在差异。然而，菌株MPP2402在高初始pH环境下的活菌数随pH升高呈线性增长趋势，表明高碱性环境对MPP2402生长更具适应性，这与高威等^[36]的研究结果(活菌数会随着初始pH的增加呈现先增加后减少的趋势)存在差异。此外，观察到MPP2402随着盐度增加，活菌数呈现减少趋势，且细菌个体较小。这与王宏燕等^[37]报道的细菌生长量随盐度增加而减少，以及李青青等^[38]发现的细菌活性表现较差，且生长呈现扁平状等现象相一致。这些研究共同印证了高盐浓度对细菌生长的负面影响。然而，当前摇瓶试验体系(液相均质环境)与农田土壤(多相异质体系)在氧分压、离子梯度等方面存在显著差异，后续考虑开发土壤微宇宙模拟系统评估细菌原位定殖能力；同时，为了进一步提高细菌在盐碱环境中的适应性和生存能力，将利用启动子置换策略强化ectoine合成途径，通过替换关键基因的启动子，提高ectoine的合成效率，从而增强细菌在盐碱环境中的渗透压调节能力。

3.2 低温、耐盐碱解磷菌的作用分析

解磷菌的主要作用机制归因于分泌有机酸酸化周质空间^[1]，并与Ca²⁺、Al³⁺、Fe³⁺螯合释放可溶性磷^[4]。HPLC分析显示，MPP2402上清培养液中存在多种有机酸，即琥珀酸(51.53 μg/mL)、草酸(22.84 μg/mL)、酒石酸(15.11 μg/mL)、苹果酸(5.93 μg/mL)。这表明MPP2402通过分泌有机酸与Ca²⁺螯合，降低培养液中pH值，促进Ca₃(PO₄)₂的释放，提高可溶性磷含量。已有研究发现，施加解磷菌会影响pH和总酸度的产生，并提高有效P组分的可利用性^[39]。De Almeida等^[40]研究对不同解磷菌的有机酸含量与可溶性磷含量以及可溶性磷含量和pH之间进行Pearson相关性分析发现存在显著相关性。在本研究检测的有机酸中，MPP2402所释放的琥珀酸占比最高，达到有机酸总量的54%。这一现象与Vyas等^[41]的研究结论相符，即琥珀酸是解磷细菌发挥功能的关键物质，高效菌株通常大量分泌琥珀酸，而低效菌株的分泌量则显著偏低。转录组分析也表明，近缘菌株PSB W134 (假单胞菌属)通过特异性上调丙酮酸羧化酶相关基因(如BLU65_RS05250/oadA)，并协同激活琥珀酸脱氢酶基因(BLU65_RS26355/BLU65_RS26360)驱动TCA循环碳流重组，促进琥珀酸积累及下游苹果酸等有机酸的分泌，从而增强对难溶性磷酸盐的溶解能力^[42]。值得注意的是，尽管柠檬酸在微生物代谢中是一个关键的中间体，通常在三羧酸循环中起着核心作用^[43]。然而MPP2402并未检测到柠檬酸的分泌，这可能意味着MPP2402在代谢过程中将碳源优先导向了琥珀酸的合成，而非柠檬酸的积累，这种调整可能是MPP2402在特定环境条件下提高适应性的一种策略^[44]。

MPP2402在低温、盐碱胁迫处理(优化后)能够显著促进生物膜的形成及其EPS的分泌。Ferguson等^[45]研究表明，细菌在面对不利环境时能够通过增强生物膜的构建来增强自身的抗逆性，有助于保护细胞免受外界不利因素的直接侵害，与本研究结果一致。生物膜的持续形成也暗示了细菌在胁迫环境下仍具有生长和繁殖能力^[35]。这种增强的生物膜形成能力可能源于MPP2402 [属于假单胞菌属(Pseudomonas)]基因组编码的精密调控网络。该网络包括复杂的信号系统(如Gac/Rsm系统、c-di-GMP信号系统)和关键结构基因(如pel、psl操纵子，lapA等)，使其能够动态调控生物膜形成及EPS组分以响应环境胁迫信号^[46-47]。此外，l-苹果酸作为核心信号分子可以通过yqxM操纵子和KinD-Spo0A通路促进生物膜形成^[48-49]。本研究还观察到MPP2402在未胁迫处理(优化前)下，培养液中的多糖和蛋白质含量呈现“先下降后稳定”的趋势，这一变化规律反映了细菌在生长初期对营养物质的快速利用，葡萄糖作为主要碳源用于细菌的生长和代谢，导致培养液中多糖含量下降^[50]。随着时间的推移，细菌的代谢产物会代替碳源维持能量生产，使得培养液中的多糖和蛋白质含量趋于稳定^[51]。然而，在胁迫处理(优化后)下培养液中的多糖和蛋白质含量持续下降，说明胁迫环境对细菌的生长和代谢产生了显著的抑制作用，与优化过程中的活菌数结果^[52]一致。但是MPP2402仍然能够通过调控EPS组分来适应胁迫环境。优化后多糖/蛋白比值呈现“先升后降”的阶段性变化，胁迫初期(0-48 h)比值升高，这可能是高c-di-GMP水平优先诱导pel、psl等基因表达，促进多糖合成^[53]。多糖具有较高的黏性和稳定性，能够为生物膜提供结构支撑和保护作用^[54]。胁迫后期(48-72 h)比值降低，这可能意味着在生物膜结构相对稳定后细菌开始注重蛋白质的合成，以增强生物膜的功能性，如提高生物膜对营养物质的摄取能力、改善细胞间的信号传导等，从而更好地适应长期的胁迫环境^[55]。这种EPS组分的阶段性动态调控可能与群体感应(QS)机制紧密相关。在胁迫条件下，MPP2402强烈的聚集行为形成了具有空间异质性的生物膜结构。在生物膜内部有限的EPS基质空间内，局部细胞密度远高于培养液的平均水平，从而激活的QS系统调控了EPS合成相关基因^[56]。

4 结论

收起

本研究采用定向筛选策略从我国典型的苏打盐碱地分布区域分离出一株兼具耐低温和盐碱的广适性嗜冷假单胞菌MPP2402。其在15 ℃、初始pH 7.0、NaCl 0.4 mol/L、接种量1%、Ca₃(PO₄)₂添加量5 g/L条件下的解磷量可达574.66 mg/L。该菌的解磷作用可能通过产生有机酸(95.41 μg/mL)降低培养液pH，进一步通过形成生物膜增加EPS分泌量及活菌数量抵御低温和盐碱等不良环境。本研究为开发适用于东北寒区盐碱地的多功能生物磷肥提供了菌种资源。未来研究将重点解析其逆境响应基因簇的调控网络，并通过根际定殖强化技术构建微生物-植物联合修复体系，推动其在苏打盐碱土改良中的工程化应用。

作者贡献声明

收起

葛紫怡：提出概念，数据收集与监管，数据分析，撰写文章；王思宇：软件程序，监督管理，验证；苏旭：收集耐受性单因素条件优化的数据与整理；甘诗韵：收集生物膜形成量和胞外多糖(EPS)成分的数据与整理；蒋欣桐：完成呈现；黄玉威：数据分析；孟军：审阅，获取基金，提供资源，软件程序，监督管理。

作者利益冲突公开声明

收起

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

基金

收起

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-01-51)
辽宁省科技计划(2024JH2/102400001)

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文献

收起

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2025年第65卷第12期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250433

接收时间：2025-06-04
首发时间：2025-12-08
出版时间：2025-12-04

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出版历史

收稿日期：2025-06-04
录用日期：2025-07-11

基金

National Modern Agricultural Industrial Technology System(CARS-01-51)

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-01-51)

Liaoning Provincial Science and Technology Program(2024JH2/102400001)

辽宁省科技计划(2024JH2/102400001)

作者信息

沈阳农业大学国家生物炭研究院，农业农村部生物炭与土壤改良重点实验室，辽宁沈阳

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参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250433

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

项目 Items	含量 Content
全磷Total phosphorus (g/kg)	0.30±0.05
速效磷Available phosphorus (mg/kg)	9.83±0.21
全钾Total potassium (g/kg)	19.73±2.27
速效钾Available potassium (mg/kg)	208.00±1.00
全氮Total nitrogen (g/kg)	0.37±0.02
全碳Total carbon (g/kg)	5.01±0.20
pH	9.80±0.16
EC (μS/cm)	1 105.33±28.86

项目

Items

含量

Content

全磷Total phosphorus (g/kg)

0.30±0.05

速效磷Available phosphorus (mg/kg)

9.83±0.21

全钾Total potassium (g/kg)

19.73±2.27

速效钾Available potassium (mg/kg)

208.00±1.00

全氮Total nitrogen (g/kg)

0.37±0.02

全碳Total carbon (g/kg)

5.01±0.20

9.80±0.16

EC (μS/cm)

1 105.33±28.86

测试项目Test items	结果Results	测试项目Test items	结果Results
葡萄糖发酵试验Glucose fermentation test	+	淀粉水解试验Starch hydrolysis test	+
乳糖发酵试验Lactose fermentation test	-	硝酸盐还原试验Nitrate reduction test	-
蔗糖发酵试验Sucrose fermentation test	-	吲哚试验Indole test	+
麦芽糖发酵试验Maltose fermentation test	-	甲基红试验Methyl red test	-
过氧化氢酶试验Catalase test	+	柠檬酸试验Citric acid test	+

测试项目Test items

结果Results

测试项目Test items

结果Results

葡萄糖发酵试验Glucose fermentation test

淀粉水解试验Starch hydrolysis test

乳糖发酵试验Lactose fermentation test

硝酸盐还原试验Nitrate reduction test

蔗糖发酵试验Sucrose fermentation test

吲哚试验Indole test

麦芽糖发酵试验Maltose fermentation test

甲基红试验Methyl red test

过氧化氢酶试验Catalase test

柠檬酸试验Citric acid test

特征 Characteristic	嗜冷假单胞菌 Pseudomonas psychrophila MPP2402	恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida^[28]	维罗尼假单胞菌 Pseudomonas putida^[29]	莫尔氏假单胞菌 Pseudomonas umsongensis^[30]
菌落特征 Colony characteristics	黄色，表面光滑隆起 Yellow, smooth and raised surface			菌落中间凸起，圆形，淡黄色 The middle of the colony is raised, rounded, yellowish
生长温度 Growth temperature (℃)	5-30	30	30	28
革兰氏染色 Gram stain	-	-	-	-
淀粉水解试验 Starch hydrolysis test	+	+		-
甲基红试验 Methyl red test	-	+	-	-
吲哚试验 Indole test	+	-	+	-
葡萄糖发酵试验 Glucose fermentation test	+	+		+
过氧化氢酶试验 Catalase test	+	+	+	+
柠檬酸试验 Lactic acid test	+		+

特征

Characteristic

嗜冷假单胞菌

Pseudomonas psychrophila

MPP2402

恶臭假单胞菌

Pseudomonas putida^[28]

维罗尼假单胞菌

Pseudomonas putida^[29]

莫尔氏假单胞菌

Pseudomonas umsongensis^[30]

菌落特征

Colony characteristics

黄色，表面光滑隆起

Yellow, smooth and raised surface

菌落中间凸起，圆形，淡黄色

The middle of the colony is raised, rounded, yellowish

生长温度

Growth temperature (℃)

5-30

革兰氏染色

Gram stain

淀粉水解试验

Starch hydrolysis test

甲基红试验

Methyl red test

吲哚试验

Indole test

葡萄糖发酵试验

Glucose fermentation test

过氧化氢酶试验

Catalase test

柠檬酸试验

Lactic acid test

初始pH Initial pH	可溶性磷含量 Soluble phosphorus content (mg/L)	活菌数 Viable bacterial count (×10⁶ CFU/mL)	pH
7.0	504.05±20.11	135.00±11.53	4.35±0.11
8.0	461.42±12.64	149.67±11.93	4.46±0.09
9.0	400.84±20.14*	230.33±13.20	4.82±0.04*
10.0	198.49±8.58*	330.33±5.51*	5.47±0.08*

初始pH

Initial pH

可溶性磷含量

Soluble phosphorus content (mg/L)

活菌数

Viable bacterial count

(×10⁶ CFU/mL)

7.0

504.05±20.11

135.00±11.53

4.35±0.11

8.0

461.42±12.64

149.67±11.93

4.46±0.09

9.0

400.84±20.14*

230.33±13.20

4.82±0.04*

10.0

198.49±8.58*

330.33±5.51*

5.47±0.08*

pH	1 d	2 d	3 d
7.0	406.67±15.28	456.67±25.17	526.67±5.77
8.0	376.67±25.17	453.33±15.28	506.67±20.82
9.0	266.33±7.09*	393.33±20.82*	416.67±15.28
10.0	261.67±6.66*	353.33±20.82*	256.00±8.71*

1 d

2 d

3 d

7.0

406.67±15.28

456.67±25.17

526.67±5.77

8.0

376.67±25.17

453.33±15.28

506.67±20.82

9.0

266.33±7.09*

393.33±20.82*

416.67±15.28

10.0

261.67±6.66*

353.33±20.82*

256.00±8.71*

类型 Types	Content (μg/mL)
苹果酸Malic acid	5.93±0.50
草酸Oxalic acid	22.84±0.97*
酒石酸Tartaric acid	15.11±0.64*
柠檬酸Citric acid	0.00±0.00
琥珀酸Succinic acid	51.53±3.80*

类型 Types

Content (μg/mL)

苹果酸Malic acid

5.93±0.50

草酸Oxalic acid

22.84±0.97*

酒石酸Tartaric acid

15.11±0.64*

柠檬酸Citric acid

0.00±0.00

琥珀酸Succinic acid

51.53±3.80*