微生物学报

引物名称 Primers name	引物序列 Primer sequences (5′→3′)
Lmo0736-BamH I	CGCGGTACCATGAAAATTGCTATTGGAAATGATCATGTTGGA
Lmo0736-Sal I	ACGCCGTCGATTAATCATTTTCATCTTCAATTCTAGCAATCATTTTCGAC
M13-F	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R	AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
pSL2622-Pst I-a-fwd	AAAACTGCAGACTCAAAAGTTAGTTGACGTCCATTTGATG
pSL2622-b-rev	CCCCCTCCTTAATCATTTTCAAATTTTCATCGTAATTCCTCCATCTTTTCTTGT
pSL2622-c-fwd	GGAATTACGATGAAAATTGAAAATGATTAAGGAGGGGTTGTTATGGAG
pSL2622-Kpn I-d-rev	CGGGGTACCTTTGTTGTTTCAATGATATCTTGAATAGAAGTTCCTGAAC
in1	GAGCTTAAGCCAGTTATTGTTGC
in2	CAATTCTAGCAATCATTTCGACG
CLmo0736-Sac I-fwd	CCGCGAGCTCCTATGTAGATGTGAAAATCGCAGA
CLmo0736-Pst I-rev	AAAACTGCAGAACAACCCCTCCTTAATCATTT
pIMK2-F	ATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCG
pIMK2-R	ATATGGCGCTTCATAGAGTAATTCTG

引物名称 Primers name	引物序列 Primer sequences (5′→3′)
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单增李斯特菌核糖-5-磷酸异构酶B的酶活鉴定及感染中的作用

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翁艳岚 ¹ , 朱斌杰 ¹ , 余鑫 ¹ , 郝云 ¹ , 杨译哲 ¹ , 杨文凯 ¹ , 林淦 ¹ , 邓思敏 ¹ , 聂政 ¹ , 宋厚辉 ¹ , 程昌勇 ¹ , 江玲丽 ²^,^* , 徐加利 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2025,65(11): 4905-4920

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(11): 4905-4920

单增李斯特菌核糖-5-磷酸异构酶B的酶活鉴定及感染中的作用

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翁艳岚¹, 朱斌杰¹, 余鑫¹, 郝云¹, 杨译哲¹, 杨文凯¹, 林淦¹, 邓思敏¹, 聂政¹, 宋厚辉¹, 程昌勇¹, 江玲丽²^,^*, 徐加利¹^,^*

作者信息

1 浙江农林大学动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心，浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地，同一健康和食品安全“一带一路”国际联合实验室，中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江杭州

2 宁波卫生职业技术学院，浙江宁波

Ribose-5-phosphate isomerase B of Listeria monocytogenes: activity and role in infection

Yanlan WENG¹, Binjie ZHU¹, Xin YU¹, Yun HAO¹, Yizhe YANG¹, Wenkai YANG¹, Gan LIN¹, Simin DENG¹, Zheng NIE¹, Houhui SONG¹, Changyong CHENG¹, Lingli JIANG²^,^*, Jiali XU¹^,^*

Affiliations

1 Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Zhejiang Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics & Advanced Technology, Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management, Belt and Road International Joint Laboratory for One Health and Food Safety, China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, College of Veterinary Medicine of Zhejiang A&F University, Hangzhou, Zhejiang, China

2 Ningbo College of Health Sciences, Ningbo, Zhejiang, China

出版时间: 2025-11-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250256

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摘要

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目的解析基因lmo0736编码的核糖-5-磷酸异构酶B (ribose-5-phosphate isomerase B, RpiB)的酶活功能，并探究其对单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, LM)感染能力的影响。方法采用原核表达与纯化技术获取Lmo0736重组蛋白(LM Lmo0736)，利用酶活性测定试验验证其底物催化功能；运用细菌同源重组技术构建lmo0736基因敲除株(LM Δlmo0736)及回补株(LM CΔlmo0736)；通过生长曲线测定试验探究细菌体外生长能力的变化；借助体外细胞模型(Caco-2肠道上皮细胞和L929成纤维细胞)评估细菌的黏附、侵袭及胞间迁移能力；通过ICR小鼠感染模型测定感染后7 d的存活率及48 h的脏器载菌量，以此评估其对小鼠的感染能力。结果 LM Lmo0736具有典型的RpiB酶活性，可催化d-核糖-5-磷酸转化为d-核酮糖-5-磷酸，其动力学参数为：V_max=0.366 mmol/(L·min)，K_m=4.489 mmol/L，k_cat=12.300 s^-1，k_cat/K_m=2.740 L/(mmol·s)。与野生株EGD-e及回补株相比，LM Δlmo0736在BHI液体培养基中的生长速度无显著差异，表明lmo0736缺失不影响细菌基础生长能力的LM Δlmo0736菌株在Caco-2细胞内的黏附、侵袭能力以及在L929细胞内的胞间迁移能力均显著减弱，且在小鼠体内的脏器定殖能力降低，提示lmo0736通过RpiB依赖的代谢途径调控LM的感染能力。结论本研究证实LM Lmo0736蛋白具有典型的RpiB酶活性，其功能缺失虽未显著改变细菌的基础生长能力，但会削弱细菌对宿主细胞的黏附、侵袭、胞内迁移能力以及在小鼠体内的脏器定殖能力，进而显著降低菌株的感染能力。该研究成果为深入探究RpiB在LM中的生物学功能积累了实验数据，从代谢与毒力关联的角度为完善食源性病原菌的感染机制提供了实验基础。

关键词

单增李斯特菌 / 核糖-5-磷酸异构酶B / 酶活 / 毒力

Abstract

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Objective To analyze the activity of ribose-5-phosphate isomerase B (RpiB) encoded by lmo0736 and explore its effect on the infection of Listeria monocytogenes (LM). Methods The recombinant protein Lmo0736 was obtained by prokaryotic expression and purification, and its catalytic activity for substrates was verified by the enzyme activity assay. The LM strain with lmo0736 knockout (LM Δlmo0736) and the complementary strain (LM CΔlmo0736) were constructed by bacterial homologous recombination. The growth curves of bacteria in vitro were plotted. The adhesion, invasion, and intercellular migration of bacteria were evaluated by in vitro cell infection models (Caco-2 intestinal epithelial cells and L929 fibroblasts). The ICR mouse infection model was used to measure the 7 d survival rate and 48 h organ load of each strain, and thus the pathogenicity of strains in mice was evaluated. Results Lmo0736 had typical RpiB activity and catalyzed the conversion of d-ribose-5-phosphate to d-ribulose-5-phosphate, with V_max=0.366 mmol/(L·min), K_m=4.489 mmol/L, k_cat=12.300 s^-1, and k_cat/K_m=2.740 L/(mmol·s). The growth rate of LM Δlmo0736 was not significantly different from that of the wild type EGD-e and LM CΔlmo0736in vitro, indicating that the deletion of lmo0736 did not affect the basic growth of bacteria. LM Δlmo0736 demonstrated significantly decreased adhesion and invasion in Caco-2 cells and intercellular migration in L929 cells and weakened colonization in mice, which indicated that lmo0736 regulated the pathogenicity of LM through a RpiB-dependent metabolic pathway. Conclusion This study reveals for the first time that the Lmo0736 of LM has typical RpiB activity. Although the functional loss of Lmo0736 does not directly affect the basic growth of the bacteria, it significantly attenuates the pathogenicity by weakening the adhesion, invasion, and intracellular migration in host cells and the colonization in vivo. The results accumulate experimental data for in-depth exploration of the biological functions of RpiB in LM. From the perspective of the association between metabolism and virulence, this study provides an experimental basis for delving into the infection mechanism of foodborne pathogens.

Key words

Listeria monocytogenes / ribose-5-phosphate isomerase B / enzyme activity / virulence

引用本文

翁艳岚, 朱斌杰, 余鑫, 郝云, 杨译哲, 杨文凯, 林淦, 邓思敏, 聂政, 宋厚辉, 程昌勇, 江玲丽, 徐加利. 单增李斯特菌核糖-5-磷酸异构酶B的酶活鉴定及感染中的作用. 微生物学报, 2025 , 65 (11) : 4905 -4920 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250256

Yanlan WENG, Binjie ZHU, Xin YU, Yun HAO, Yizhe YANG, Wenkai YANG, Gan LIN, Simin DENG, Zheng NIE, Houhui SONG, Changyong CHENG, Lingli JIANG, Jiali XU. Ribose-5-phosphate isomerase B of Listeria monocytogenes: activity and role in infection[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (11) : 4905 -4920 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250256

正文

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单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种革兰氏阳性胞内致病菌，可在高盐、低温及氧化应激等极端环境中存活，并通过污染肉制品、乳制品等食品引发人兽共患病^[1-2]。其感染可导致孕妇流产、新生儿脑膜炎及免疫缺陷患者败血症，致死率高达30%，被世界卫生组织列为“零容忍”食源性病原体^[3]。作为重要的食源性胞内寄生菌，LM的致病性高度依赖其代谢可塑性^[4]，以应对宿主微环境中的营养限制与氧化压力^[5]。

磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)是细菌碳代谢的核心枢纽。该途径通过氧化分支生成NADPH (维持氧化还原稳态)，并通过非氧化分支提供核苷酸前体(如核糖-5-磷酸)，同时与糖酵解、三羧酸循环及细胞壁合成等多条通路相互作用^[6-8]。研究表明PPP代谢能够灵活调控细菌的环境适应性。据文献报道，七磷酸景天庚酮糖(sedoheptulose-7-phosphate, S7P)作为细胞壁组分前体可影响抗生素敏感性^[9]；在大肠杆菌中编码核糖-5-磷酸异构酶的rpiAB基因缺失会增加细菌对抗生素的敏感性^[10]；而在氧化应激条件下，自由基对PPP关键酶的靶向修饰会破坏NADPH合成与碳通量分配，形成代谢-氧化损伤的恶性循环^[11-12]。此外，PPP通过整合代谢与毒力调控网络在病原菌宿主适应中发挥关键作用^[13]。新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)中PPP基因(tktA、rpiA、rpe)缺失会显著抑制其在巨噬细胞内的增殖能力^[8]；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) PPP突变株(Δpgl、Δtkt)则表现为生物被膜形成能力减弱、氧化应激耐受下降及毒力因子表达水平降低，并伴随着广泛的代谢重编程，如流向糖酵解、三羧酸循环和几种细胞包膜前体的通量增加^[14-16]。这些发现均表明PPP相关酶作为抗菌靶点具有潜力，这一点在依赖NADPH/核苷酸合成的胞内病原体中尤为突出^[17]。

核糖-5-磷酸异构酶(ribose-5-phosphate isomerase, Rpi)是PPP非氧化分支的关键酶，可催化d-核糖-5-磷酸(d-ribose 5-phosphate, DR5P)与d-核酮糖-5-磷酸(d-ribulose 5-phosphate, DRU5P)的可逆异构化反应，其特异性主要依据底物结合位点的结构特异性识别DR5P的醛糖形式，通过质子转移机制将其异构化为酮糖形式，或者通过可逆反应调控、辅因子以及代谢环境的调节作用为核苷酸合成与NADPH再生提供代谢基础^[18]。尽管Rpi存在RpiA和RpiB2种同工酶，但后者主要分布于各种微生物中^[19]，其功能特性与致病关联尚未明确。现有研究多聚焦于RpiB的晶体结构及稀有糖制备的工业应用潜力^[20-21]，但对其在病原菌代谢-致病网络中的调控机制尚未明确。因此，探明LM RpiB的生物学特性及其对感染能力的影响显得尤为重要。

本研究以LM Lmo0736 (在生物信息学网站被注释为RpiB假定蛋白)为研究对象，通过蛋白表达、酶活鉴定、基因敲除、细胞和小鼠模型感染等试验验证其作为PPP关键酶的催化功能，并探究其对LM感染能力的影响，旨在为完善食源性病原菌的感染机制提供实验基础。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

LM野生型EGD-e (37 ℃、200 r/min BHI的培养基中培养)、pKSV7质粒、pIMK2质粒、pET-30a(+)质粒、大肠杆菌DH5α和Rosetta感受态均为本实验室保存。

1.1.2 培养基

LB液体培养基(g/L)：氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0。在液体培养基中加入15.0 g/L琼脂粉得到LB固体培养基。BHI液体培养基：BHI粉剂37.0 g/L。在液体培养基中加入15.0 g/L琼脂粉得到BHI固体培养基。培养基于121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 实验动物

SPF级ICR雌性小鼠(5周龄)购自杭州医学院实验动物中心。

动物实验方案经浙江农林大学实验动物管理办公室(该单位已在省科技厅实验动物管理办公室完成资质备案，备案号为SYXK-2023-0015)审核批准，编号为ZAFUAC202423，小鼠生产许可证号为SCXK-2024-0002。所有操作严格遵循《实验动物福利伦理审查指南》要求。

1.1.4 主要试剂和仪器

10%胎牛血清(FBS)，北京缔一生物科技有限公司；R/MINI 1640培养基，武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基，苏州海星生物科技有限公司；2×KOD PCR Master Mix，东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶，New England Biolabs公司；高纯度质粒小提试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公司；DNA纯化试剂盒，广州艾基生物技术有限公司；培养基BHI所用粉剂，Oxoid公司；0.25%胰酶-EDTA，北京诺为生物技术有限公司。常规抗生素工作浓度为氨苄青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)、氯霉素(10 μg/mL)，其他化学试剂均为国产分析纯。

蛋白纯化用Ni-NTA亲和层析介质，上海信裕生物科技有限公司；凝胶过滤层析用Superdex系列填料、ÄKTA纯化系统，思拓凡生物科技(杭州)有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；多功能酶标仪，伯腾仪器(上海)有限公司；蛋白电泳仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；核酸电泳系统，北京六一仪器厂；梯度PCR扩增仪、台式小型离心机、单通道移液器、旋涡振荡仪，Eppendorf公司。

1.2 LM Lmo0736蛋白序列比对及结构特征分析

从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载获取Lmo0736 (GenBank登录号为CAC98814.1)及其他已报道的RpiB家族同源蛋白的氨基酸序列。使用CLC Sequence Viewer 8.0软件进行多重序列比对，以可视化保守基序。利用SWISS-MODEL在线工具(https://swissmodel. expasy.org/)预测Lmo0736的三维结构。从蛋白质数据库(PDB数据库：https://www.rcsb.org)下载已解析的RpiB家族成员晶体结构，采用ChimeraX 1.6.1软件的Matchmaker工具将Lmo0736预测结构与参考蛋白进行空间叠合。

1.3 LM Lmo0736蛋白原核表达纯化

将从NCBI获取的lmo0736基因序列经SnapGene设计引物，序列详见表1。PCR反应体系(50 μL)：2×KOD PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板3 μL，ddH₂O 20 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，60 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，共35个循环；68 ℃终延伸3 min。

PCR产物经纯化后克隆至pET-30a(+)质粒，通过卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，经T7通用引物及测序验证重组质粒构建正确性。将重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态中，以1 mmol/L IPTG于16 ℃、200 r/min条件下诱导表达16 h。菌体经8 000 r/min离心10 min，用10 mmol/L PBS缓冲液重悬，通过压力破碎仪(200 bar，破碎3 min；800 bar，破碎3 min)对菌体进行破碎，经12 000 r/min离心10 min后分离上清与沉淀，经SDS-PAGE验证目的蛋白表达，后续蛋白纯化流程参考文献[22]完成。所用引物序列见表1。

1.4 LM Lmo0736蛋白的酶活显色方法优化及酶活测定

重组蛋白酶活测定以DR5P为底物，采用半胱氨酸-咔唑法对反应产物DRU5P进行显色测定^[23-24]。在酶活测定之前，对显色条件按照最佳显色波长、最适显色温度、最适显色时间及最适冰浴时间依次进行检测优化^[24]。最适显色波长测定方法如下：取60 μL 2.0 mmol/L的DR5P标准溶液于离心管中，用蒸馏水补足至100 μL，加入20 μL半胱氨酸氨酸盐溶液和600 μL 70%硫酸溶液，混匀后立即加入20 μL咔唑乙醇溶液，60 ℃水浴保温10 min，取出冰上冷却，在450-600 nm波长之间每隔5 nm测定吸光值。其余条件优化及酶活力鉴定方法均如下：配制pH为8.5的100.0 mmol/L Tris-HCl，加入25.0 μL 10 ng/μL的酶，在37 ℃孵育3 min，加入25.0 μL 2.0 mmol/L DR5P，37 ℃反应5 min，加入50.0 μL 12.5 mol/L硫酸终止反应。取100 μL反应液加入20 μL 15 g/L半胱氨酸盐溶液和600 μL 70%硫酸溶液，混匀后立即加入20 μL 0.12%咔唑乙醇溶液，以蒸馏水作为对照，取200 μL测定其吸光值。在此基础上，根据优化后的最佳显色条件做DRU5P的标准品曲线，测定Lmo0736的酶活动力学参数。酶活力单位(U)定义为：以DR5P为底物，每分钟催化产生1.0 μmol的DRU5P所需的酶量。所有测定结果均为3次重复平行试验数据的平均值。

1.5 lmo0736 缺失株构建和验证

从NCBI下载获取lmo0736基因序列，参考江文玲等^[25]的同源重组策略设计上下游同源臂扩增引物。分别用pSL2622-Pst I-a-fwd/pSL2622-b-rev扩增上游同源臂，pSL2622-c-fwd/ pSL2622-Kpn I-d-rev扩增下游同源臂。引物序列详见表1，PCR反应体系和反应条件同1.3节。重叠延伸拼接后，与线性化的pKSV7经双酶切连接，转化至大肠杆菌感受态并筛选阳性克隆，经测序确认重组质粒pSL2622构建正确。将pSL2622电转入EGD‑e感受态，经氯霉素筛选后，先于42 ℃下含氯霉素的BHI液体培养基中连续传代5次，经M13-F/R通用引物PCR验证完成同源重组后，再于30 ℃下无抗BHI液体培养基中传代至质粒丢失，最后通过抗性筛选获得无氯霉素抗性菌。用内部引物in1/in2检测目的基因缺失、外部引物out1/out2 (即pSL2622-c-fwd/pSL2622-Kpn I-d-rev)验证上下游拼接，经测序确认后获得LM Δlmo0736基因缺失株并保藏于-80 ℃。所用引物序列见表1。

1.6 lmo0736 回补株的构建

基于BioCyc和Softberry平台定位并预测lmo0736基因启动子区域，以EGD-e基因组为模板，用SnapGene设计引物CLmo0736-Sac I-fwd/CLmo0736-Pst I-rev，引物序列详见表1，PCR反应体系和反应条件同1.3节，扩增lmo0736基因及其启动子区。将扩增得到的片段与pIMK2质粒重组连接，转化后筛选阳性克隆，经电泳验证和测序分析获得重组质粒pSL2631。将该质粒电转入LM Δlmo0736缺失株感受态细胞，通过卡那霉素抗性筛选，用pIMK2通用引物pIMK2-F/R进行PCR扩增及测序双重验证，最终获得回补株LM CΔlmo0736。

1.7 LM Δlmo0736 生长曲线的测定

选取EGD-e、LM Δlmo0736及LM CΔlmo0736的单克隆菌落，分别接种于5 mL BHI液体培养基，37 ℃、200 r/min进行12 h预培养。菌体经10 mmol/L PBS洗涤2次后调整悬液至OD₆₀₀为0.6。按1:100比例接种至新鲜BHI培养基，取200 μL悬液加入96孔板作为基线样本(0 h)，剩余培养体系置于37 ℃恒温摇床持续培养12 h。使用全波长酶标仪每小时动态监测各组OD₆₀₀吸光值，每孔检测前实施5 s振荡混匀。实验全程设置空白培养基对照。

1.8 LM Δlmo0736 对Caco-2肠上皮细胞黏附、侵袭试验

将Caco-2细胞在含10%胎牛血清的R/MINI 1640培养基中传代培养，并以2.5×10⁵个/mL的密度接种于24孔板(每孔500 μL)，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中贴壁培养。取对数生长期即OD₆₀₀值为0.6的菌液，按1:1 000比例稀释至预热的R/MINI 1640培养基。弃去细胞培养液，10 mmol/L PBS轻柔洗涤2次，加入含菌的培养基(MOI=10)，水平摇匀后继续培养。黏附：感染30 min后，移除培养基并用预热的10 mmol/L PBS洗涤2次以去除未黏附菌体。每孔加入500 μL预冷细胞裂解液，4 ℃静置15 min后剧烈涡旋至产生均匀泡沫，取100 μL裂解产物进行3次连续10倍梯度稀释，点板于BHI琼脂平板后，倒置培养于37 ℃恒温培养箱中12-14 h，统计菌落形成单位(CFU)以计算胞内菌量。侵袭：感染60 min后，采用含庆大霉素(100 μg/mL)的R/MINI 1640培养基孵育1 h以清除胞外菌。使用10 mmol/L PBS洗涤细胞3次后，按黏附部分方法裂解、稀释及培养计数。

1.9 LM Δlmo0736 对L929鼠源成纤维细胞胞内迁移试验

将L929成纤维细胞在含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中传代培养，并以1.2×10⁶个/mL的密度接种于6孔板(每孔2 mL)，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养至完全贴壁。取OD₆₀₀值为0.6的菌液，用预热的无血清DMEM培养基稀释至终浓度为1×10⁷CFU/mL。弃去细胞培养液后，用10 mmol/L PBS轻柔洗涤2次，按MOI=0.2接种含菌培养基，水平十字振荡混匀。每隔15 min执行8字形轨迹振荡(持续5 s/次，共4次)，确保细菌均匀接触细胞表面。感染1 h后移除培养基，10 mmol/L PBS洗涤3次并更换含庆大霉素(100 μg/mL)的DMEM终止胞外菌增殖。感染后1 h，移除培养基并经PBS洗涤2次。配制含1.5%低熔点琼脂糖、50 μg/mL庆大霉素的DMEM混合液(预热至42 ℃)，每孔加入3 mL覆盖层。超净台通风干燥15 min使琼脂固化，将培养板倒置于湿润环境中，37 ℃继续培养48-72 h观察空斑形成。移除琼脂层后，每孔加入4%多聚甲醛600 μL固定30 min。轻柔冲洗去除残留琼脂，采用0.1%结晶紫溶液染色15 min，双蒸水洗涤至背景清晰。将培养板晾干并拍照记录空斑形态，ImageJ软件量化空斑面积(阈值设定：直径≥0.5 mm)。

1.10 LM Δlmo0736 对小鼠存活和脏器定殖能力试验

将菌株EGD-e、LM Δlmo0736及LM CΔlmo0736于BHI液体培养基中培养至对数生长期，用PBS缓冲液调整OD₆₀₀值为0.6，经10倍稀释后制备成2×10⁸ CFU/mL的菌悬液；取SPF级ICR小鼠(5周龄，雌性)随机分为3组(n=6/组)，为精准控制注射体积并减少腹腔穿刺损伤，使用胰岛素注射器腹腔注射100 μL菌悬液(含2×10⁶ CFU)。于接种48 h后无菌采集肝脏、脾脏组织，经预冷PBS漂洗后制备脏器匀浆液，梯度稀释接种于BHI平板，37 ℃倒置培养12-14 h后进行菌落计数；生存分析组(n=9/组)自接种后持续观察7 d，每8 h记录临床症状及生存状态。

1.11 数据统计与分析

所有试验均进行3组平行，3次生物学重复，试验结果使用GraphPad 9.0软件进行t-test统计学分析，数据用mean±SD表示，ns表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，使用Adobe Illustrator 2021进行科学图表整合与可视化呈现。

2 结果与分析

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2.1 LM Lmo0736的氨基酸同源序列和三维结构特征比对

序列比对结果如图1A所示，LM Lmo0736与来自大肠杆菌(Escherichia coli)^[26]、热解纤维醋酸弧菌(Acetivibrio thermocellus)^[18]、海热袍菌(Thermotoga maritima)^[27]、克氏锥虫^[28]及粗球孢子菌^[29]的RpiB在关键氨基酸催化位点(包括红色三角形标志的开环残基和红色星形标志的催化残基)高度一致。其与前三者的序列一致性分别为66.67%、60.42%与50.00%，显示出RpiB在不同物种间氨基酸序列的保守性。SWISS-MODEL模拟的Lmo0736的立体结构如图1B所示，该蛋白呈α-β-α三明治构象，包含五股平行的β片层核心及两侧各3个α-螺旋，与已报道RpiB家族结构特征一致。进一步以蛋白质数据库(PDB)中不同来源RpiB的晶体结构为模板，对LM Lmo0736 (红色标注)与其他RpiB进行立体结构重叠比对，结果如图1C所示。RpiB家族蛋白具有高度保守的三维构象，核心α-β-α折叠结构域的拓扑相似度达95%以上。上述结果表明，LM Lmo0736蛋白符合RpiB家族的结构特征。

2.2 Lmo0736蛋白的原核表达及纯化

将构建的Lmo0736原核表达质粒热转到E. coli Rosetta感受态细胞，经IPTG诱导表达后对菌体裂解液进行镍柱亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE分析纯化产物。结果如图2A所示，重组蛋白大小符合预期，为20.2 kDa。随后利用凝胶过滤层析对咪唑洗脱的重组蛋白进行进一步纯化，SDS-PAGE结果如图2B所示，目标蛋白条带单一性显著提高，表明获得了高纯度蛋白。

2.3 半胱氨酸显色法优化及Lmo0736蛋白酶活鉴定

半胱氨酸显色法可以测定酮糖的吸光值，因此被用于核糖-5-磷酸异构酶的酶活测定^[30]。如图3所示，检测波长为OD₅₃₅，显色温度80 ℃，显色时间25 min，冰浴35 min为最佳显色条件。如图3D所示，通过比较LM Lmo0736蛋白酶实验组与蒸馏水对照组(即仅含有底物DR5P和与LM Lmo0736同体积的蒸馏水)可确定Lmo0736具有典型的RpiB酶活性，能催化DR5P转化为DRU5P。

2.4 Lmo0736蛋白酶活动力学参数的测定

首先分别取浓度为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的DRU5P标准溶液，并根据优化后的显色条件绘制产物DRU5P的标准曲线，如图4A所示。在此基础上，测定LM Lmo0736重组蛋白的酶活，结果如图4B所示。经计算后得到V_max为0.366 mmol/(L·min)，K_m为4.489 mmol/L，k_cat为12.300 s^-1，k_cat/K_m为2.740 L/(mmol·s)。通过查阅文献可知，LM Lmo0736的K_m值显著低于热纤梭菌[(17.0±0.4) mmol/L]与嗜热海栖菌[(37.0±1.8) mmol/L]^[19]的RpiB，但高于大肠杆菌RpiB (1.230 mmol/L)，这表明Lmo0736对底物具有相对较高的结合亲和力。

2.5 LM Δlmo0736 和LM CΔlmo0736 菌株PCR验证与体外生长能力比较

通过同源重组技术成功构建LM Δlmo0736基因缺失株，并利用重组质粒pSL2631电转化至LM Δlmo0736感受态细胞中获得回补株LM CΔlmo0736。通过PCR扩增验证发现目的片段大小符合预期结果(图5A)。经北京擎科生物科技股份有限公司测序验证分析，最终确定缺失株与回补株构建成功。各菌株体外生长情况如图5B所示，缺失株LM Δlmo0736在BHI液体培养基中连续12 h的增殖速率与野生株及回补株无差异，证实lmo0736基因缺失不影响LM在BHI培养基中的生长能力。

2.6 lmo0736 基因缺失减弱了LM的黏附侵袭能力

LM作为重要的食源性致病菌，可通过耐受低pH等极端环境特性突破宿主胃肠道屏障。为解析lmo0736基因在细菌侵袭过程中的生物学功能，选用可模拟肠道上皮屏障功能的Caco-2细胞模型进行验证。如图6所示，感染Caco-2细胞0.5 h和3 h后，统计学分析表明LM Δlmo0736的黏附率和侵袭率较EGD-e均显著降低(P<0.05)。与此同时，LM CΔlmo0736的黏附率与侵袭率均恢复至野生型水平(P>0.05)。上述结果表明，lmo0736基因缺失显著削弱了细菌对宿主细胞的黏附和侵袭能力。

2.7 lmo0736 基因缺失减弱了LM的胞间迁移能力

胞间迁移能力是LM逃逸宿主免疫清除的关键致病机制，其效率与细菌的胞内增殖能力共同决定感染进程。为系统解析lmo0736基因对胞间迁移的调控作用，本研究采用小鼠成纤维细胞系L929模型，通过空斑形成试验评估野生株EGD-e、LM Δlmo0736及LM CΔlmo0736的胞内增殖与迁移表型(空斑数量与直径分别反映上述功能，二者呈显著正相关)。空斑形态如图7A所示，缺失lmo0736后空斑直径较野生株有所减小。使用ImageJ软件量化空斑直径并定量分析后结果如图7B所示，LM Δlmo0736菌株的空斑直径较野生株极显著减少(P<0.001)，而LM CΔlmo0736的空斑直径与野生株相比无明显差异(P>0.05)。通过统计空斑数量发现，缺失lmo0736后空斑数量也显著减少(P<0.05)。上述结果表明，lmo0736基因缺失后降低了李斯特菌的胞间迁移能力和胞内增殖能力。

2.8 lmo0736 基因缺失减弱了LM对小鼠的脏器定殖能力

为验证lmo0736基因对LM在小鼠体内感染能力的影响，本研究采用5周龄ICR雌性小鼠建立腹腔感染模型。实验组分别接种2×10⁶ CFU的野生株EGD-e、LM Δlmo0736及LM CΔlmo0736，观察感染进程并检测脏器细菌载量。存活曲线如图8A所示，3组感染小鼠均在接种后56 h陆续死亡，LM Δlmo0736组与EGD-e组的累计死亡率无显著差异(P>0.05)。感染小鼠48 h后脏器定殖情况如图8B所示，LM Δlmo0736在肝脏和脾脏的细菌载量均显著低于EGD-e组(P<0.05)，而LM CΔlmo0736组载菌量与野生株相比无显著差异(P>0.05)。实验结果表明，lmo0736基因缺失降低了LM在小鼠体内的脏器定殖能力。

3 讨论与结论

收起

LM是重要的人畜共患病原菌，兼具环境耐受能力与高宿主致病力，其致病机制与代谢网络的关联是当前研究热点。磷酸戊糖途径作为中心碳代谢的关键支路，不仅为核苷酸合成提供糖前体，还通过生成NADPH参与维持胞内氧化还原平衡。这一代谢过程在病原菌适应宿主微环境中起核心作用。包括Rpi酶在内的PPP关键酶，已在金黄色葡萄球菌、新生弗朗西斯菌等病原菌中被证实通过代谢-毒力偶联机制调控致病过程^[8-14]。然而，在LM中RpiB的代谢功能及其与感染能力之间的关联尚未明确。因此，本研究通过酶活分析、基因敲除技术及感染能力评价，系统解析LM Lmo0736在LM代谢网络与感染过程中的作用。

Rpi酶家族分为RpiA与RpiB，具有不同的结构起源与相似的功能。前者几乎存在于自然界所有生物中，而RpiB主要存在于微生物中。Rpi酶都通过2个主要的连续步骤进行催化反应。以RpiB催化R5P转化为RU5P的过程为例，前者的呋喃糖环的打开依赖于组氨酸(H) (图1A中红色三角形标记)为O₄提供质子^[31]，一旦环打开，立即发生异构化，首先由催化碱[半胱氨酸(C)，图1A中红色星形标记]从C₂中提取质子开始，随后在苏氨酸(T)或丝氨酸(S) (图1A中红色星形标记)的参与下依次进行O₁质子化和O₂去质子化，同时形成烯二醇(酸)中间体^[32]，最后，C₁接受从初始催化碱释放的质子形成RU5P^[32]。在本研究中，多序列比对结果显示LM Lmo0736的99位开环残基与66位催化残基分别为组氨酸和半胱氨酸(与文献报道一致)，68位催化残基为丝氨酸(与克氏锥虫一致)，其他的糖结合残基(黑色星形)和磷酸盐结合残基(黑色三角形)与文献报道的高度一致。这表明RpiB在不同物种间的核心催化位点具有高度保守性。

从现有研究可知，RpiB的底物特异性表现出显著的多样性与复杂性。不同微生物来源的RpiB不仅在底物特异性与活性方面存在较大差异，而且其最佳醛糖底物也各不相同。值得注意的是，所有研究报道的RpiB均能识别DR5P作为底物^[19]。因此开展酶活试验，验证其将DR5P催化为DRU5P的能力有助于明确LM Lmo0736作为RpiB家族成员的身份。本研究通过酶动力学分析证实，LM Lmo0736能够催化DR5P转化为DRU5P，与典型RpiB功能特征一致，证实了该酶具有典型的RpiB活性，提示其具备保守的催化机制。后续研究中可在现有基础上进一步借助代谢物分析或质谱手段精准验证催化方向与效率；同时，鉴于LM Lmo0736关键氨基酸催化位点的高度保守性可聚焦于关键催化位点功能验证、非保守区域功能挖掘及翻译后修饰调控机制研究，以系统揭示其独特生物学特性。

表型分析表明，LM Δlmo0736在基础培养基中的生长能力较野生株和回补株无显著差异，但其在宿主细胞内的黏附、侵袭及胞间迁移能力均显著降低，且感染小鼠后脏器定殖能力明显下降，提示lmo0736编码的RpiB在感染过程中可能具有不可替代的调控功能。未来研究需结合代谢通量分析技术，进一步解析RpiB同工酶的功能分化及其在宿主微环境中的动态调控机制。相关文献报道，LM毒力因子(如内化素InlA或肌动蛋白ActA)的表达通常依赖NADPH/GSH氧化还原平衡的调控机制^[33-34]。RpiB可能通过代谢物供应失衡影响致病力：一方面，RpiB催化的RU5P生成是PPP非氧化支路的关键节点，其缺失可能导致NADPH合成减少，削弱细菌应对宿主氧化应激的能力^[35-36]；另一方面，PPP代谢物可通过直接或间接结合转录调控蛋白(如全局转录调控因子CodY或RNA聚合酶结合转录因子DksA)影响毒力基因表达^[37-38]。相比之下，RpiB影响LM毒力的具体机制和代谢途径仍需进一步深入研究。

综上所述，本项工作对LM中lmo0736编码的RpiB开展了相关研究，初步鉴定了其酶活性以及对细菌感染能力可能产生的影响，结果表明RpiB在LM的感染过程中发挥一定的作用。本研究为食源性病原菌感染的机制研究提供了实验基础，为食源性病原菌的防控提供了理论依据。

作者贡献声明

收起

翁艳岚：实验实施、数据分析、论文撰写和修改；朱斌杰：数据收集与监管、协助细胞感染试验操作；余鑫：数据收集与监管、方法论；郝云：协助基因缺失株和回补株构建试验操作；杨译哲：数据收集与监管、协助蛋白表达试验操作；杨文凯：协助酶活试验操作；林淦：协助试验操作、验证；邓思敏：提供技术支持、数据分析；聂政：提供技术支持、软件使用；宋厚辉：提出概念、获取基金、提供资源；程昌勇：获取基金、提供资源、审阅文章；江玲丽：获取基金、研究构思和设计、论文讨论；徐加利：获取基金、研究构思和设计、数据分析、论文修改。

作者利益冲突公开声明

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作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

基金

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国家重点研发计划(2023YFD1801000)
国家自然科学基金(32302961)
国家自然科学基金(32473026)
浙江省“尖兵领雁+X”国际科技合作载体联合研发项目(2025C04009)
宁波市公益类科技项目(2022S006)
浙江农林大学学生科研训练项目(2024kx0082)

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2025年第65卷第11期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250256

接收时间：2025-03-31
首发时间：2025-11-10
出版时间：2025-11-04

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收稿日期：2025-03-31
录用日期：2025-06-09

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2 宁波卫生职业技术学院，浙江宁波

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250256

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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