微生物学报

Primers name	Primer sequences (5ʹ→3ʹ)
POP-F POP-R	CCATTTCAGGTGTCGTGAAGGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTC ATGGCTGATTATGATCTAGATTACGGAATCCAGTCGATGTTCAGGCACC
POP-qF POP-qR	TTCAAAGGCACAGTCAAGGC ATCTCGCTCCTGGAAGATGG
FMD-SYBR-F FMD-SYBR-R	TGGGACCATACAGGAGAAGT GTAGCTTGGAATCTCGAAGAGG
sus-GAPDH-F sus-GAPDH-R	ACTGAGGACCAGGTTGTGT AGGAAATGAGCTTGACGAAGTG
FMDV-qF FMDV-qR	ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA GCGAGTCCTGCCACGGA
FMDV-Prob	FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA
PB-CF PB CR	TTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACG GATAATCCTGGATGGCGGTCT

Primers name	Primer sequences (5ʹ→3ʹ)
POP-F POP-R	CCATTTCAGGTGTCGTGAAGGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTC ATGGCTGATTATGATCTAGATTACGGAATCCAGTCGATGTTCAGGCACC
POP-qF POP-qR	TTCAAAGGCACAGTCAAGGC ATCTCGCTCCTGGAAGATGG
FMD-SYBR-F FMD-SYBR-R	TGGGACCATACAGGAGAAGT GTAGCTTGGAATCTCGAAGAGG
sus-GAPDH-F sus-GAPDH-R	ACTGAGGACCAGGTTGTGT AGGAAATGAGCTTGACGAAGTG
FMDV-qF FMDV-qR	ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA GCGAGTCCTGCCACGGA
FMDV-Prob	FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA
PB-CF PB CR	TTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACG GATAATCCTGGATGGCGGTCT

稳定表达脯氨酰寡肽酶基因的PK15细胞系的建立及其对口蹄疫病毒增殖的影响

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王姿逸 ¹^,²^,³ , 茹毅 ¹^,² , 卢炳州 ¹^,² , 杨洋 ¹^,² , 赵陇和 ¹^,² , 李亚军 ¹^,² , 李建斌 ¹^,² , 李明桂 ¹^,² , 马坤 ¹^,² , 冷非凡 ³ , 郝荣增 ¹^,² , 郑海学 ¹^,²^,³

微生物学报 | 研究报告 2025,65(10): 4458-4471

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(10): 4458-4471

稳定表达脯氨酰寡肽酶基因的PK15细胞系的建立及其对口蹄疫病毒增殖的影响

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王姿逸¹^,²^,³, 茹毅¹^,², 卢炳州¹^,², 杨洋¹^,², 赵陇和¹^,², 李亚军¹^,², 李建斌¹^,², 李明桂¹^,², 马坤¹^,², 冷非凡³, 郝荣增¹^,², 郑海学¹^,²^,³

作者信息

¹ 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院，动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州

² 甘肃省病原生物学基础学科研究中心，甘肃兰州

³ 兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州

A PK15 cell line stably expressing prolyl oligopeptidase (POP) and its effect on the proliferation of foot-and-mouth disease virus

Ziyi WANG¹^,²^,³, Yi RU¹^,², Bingzhou LU¹^,², Yang YANG¹^,², Longhe ZHAO¹^,², Yajun LI¹^,², Jianbin LI¹^,², Minggui LI¹^,², Kun MA¹^,², Feifan LENG³, Rongzeng HAO¹^,², Haixue ZHENG¹^,²^,³

Affiliations

¹ State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, College of Veterinary Medicine of Lanzhou University, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, Gansu, China

² Gansu Province Research Center for Basic Discipline of Pathogen Biology, Lanzhou, Gansu, China

³ School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou, Gansu, China

出版时间: 2025-09-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250191

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摘要

收起

【目的】 利用PiggyBac转座子系统构建稳定表达脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase, POP)基因的猪肾PK15细胞系，并系统评估POP蛋白表达对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)增殖的影响。 【方法】 构建重组表达质粒，转染PK15细胞后通过Western blotting检测目的蛋白表达；采用有限稀释法筛选获得稳定表达POP的单克隆细胞系，并利用RT-qPCR和Western blotting检测POP基因和蛋白表达的稳定性；通过Cell Counting Kit-8试验评估筛选细胞系的细胞活力；综合运用Western blotting、RT-qPCR以及病毒滴度测定等方法，系统分析FMDV在稳定表达细胞系中的复制。 【结果】 成功构建了稳定表达POP蛋白的PK15单克隆细胞系；与对照细胞系相比，该细胞系的细胞活力无显著差异；单克隆细胞系传至P30代时，POP蛋白表达水平保持稳定；接种病毒实验结果显示，FMDV在稳定表达POP的PK15细胞系中的增殖水平显著高于对照组，并在不同代次细胞系中保持稳定。 【结论】 本研究成功构建了稳定表达POP蛋白的PK15细胞系，并证实该细胞系可显著促进FMDV的复制，为进一步解析POP蛋白促进FMDV复制的分子机制提供了实验材料。

关键词

脯氨酰寡肽酶(POP) / PiggyBac转座子系统 / PK15细胞 / 病毒增殖

Abstract

收起

[Objective] To construct a PK15 cell line stably expressing the prolyl oligopeptidase (POP) by using the PiggyBac transposon system and systematically investigate its regulatory role in the proliferation of foot-and-mouth disease virus (FMDV). [Methods] A recombinant PiggyBac vector carrying the POP gene was constructed and transfected into PK15 cells, and the expression of the target protein was detected by Western blotting. The monoclonal cell line stably expressing POP was isolated via the limiting dilution method. The stability of mRNA and protein levels of POP was verified by RT-qPCR and Western blotting, respectively. The viability of the selected cell line was assessed by the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. FMDV replication kinetics in the stable cell line were comprehensively analyzed by Western blotting, RT-qPCR, and the 50% tissue culture infective dose (TCID₅₀) assay. [Results] A PK15 cell line stably expressing POP was established. No significant differences in cell viability were observed between the stable cell line and the control cell line. The protein level of POP remained stable in the established cell line after 30 passages. The results of the viral infection assay demonstrated that the FMDV proliferation level in the PK15 cell line stably expressing POP was significantly higher than that in the control group, with this stimulatory effect being maintained across multiple passages. [Conclusion] We successfully constructed a PK15 cell line stably expressing POP. The results reveal that POP overexpression enhances FMDV replication in a passage-independent manner. These findings provide a valuable experimental model for elucidating the molecular mechanism underlying the role of POP in FMDV replication.

Key words

prolyl oligopeptidase (POP) / PiggyBac transposition system / PK15 cells / virus proliferation

引用本文

王姿逸, 茹毅, 卢炳州, 杨洋, 赵陇和, 李亚军, 李建斌, 李明桂, 马坤, 冷非凡, 郝荣增, 郑海学. 稳定表达脯氨酰寡肽酶基因的PK15细胞系的建立及其对口蹄疫病毒增殖的影响. 微生物学报, 2025 , 65 (10) : 4458 -4471 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250191

Ziyi WANG, Yi RU, Bingzhou LU, Yang YANG, Longhe ZHAO, Yajun LI, Jianbin LI, Minggui LI, Kun MA, Feifan LENG, Rongzeng HAO, Haixue ZHENG. A PK15 cell line stably expressing prolyl oligopeptidase (POP) and its effect on the proliferation of foot-and-mouth disease virus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (10) : 4458 -4471 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250191

正文

收起

口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，具有快速远距离传播的特点。FMDV主要感染猪、牛、羊、鹿、羚羊、骆驼等多种偶蹄类动物^[1-2]，感染动物的临床症状主要包括发热、跛行，以及在口腔、蹄部和乳房等部位出现水疱性病变^[3]。FMD对全球畜牧业构成严重威胁，不仅影响动物及动物产品的国际贸易，还可能引发重大经济损失和社会影响，世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, WOAH)将其列为法定报告的动物疫病^[4-5]。目前，FMD主要分布在非洲、中东和亚洲，以及南美洲的部分地区^[6]。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形，在电子显微镜下呈现典型的二十面体对称结构^[7]。FMDV基因组编码4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和8种非结构蛋白(L^pro、2A、2B、2C、3A、3B、3C^pro和3D^pol)^[8]。在病毒感染过程中，病毒蛋白或基因组与多种宿主因子发生复杂的相互作用，这些宿主因子在病毒的复制过程中起着促进或抑制的双重调控作用^[9]。

脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase, POP)是一种在进化上高度保守的丝氨酸蛋白酶，最初由Walter等^[10]在人子宫组织中发现。该酶能够特异性裂解Pro-Leu肽键，具有重要的水解酶活性与非酶学功能^[11]。POP蛋白由2个主要功能结构域组成：一是具有典型α/β水解酶折叠的催化结构域，负责底物的识别和催化；二是独特的β-螺旋结构域由七重四链β片层构成，该结构虽无催化功能，但在维持酶的整体构象和稳定性中起重要作用^[12-13]。研究表明POP在神经系统疾病的发生发展和治疗中具有重要功能。王姿逸等^[14]通过猪全基因组筛选和功能验证，首次证明POP蛋白能有效促进FMDV的复制，表明该蛋白与病毒复制密切相关，这一发现为深入研究病毒-宿主相互作用提供了新的线索。

PiggyBac (PB)转座子系统是一种高效的基因转移工具，能够高效转座较大片段的DNA，定点整合目的基因序列，显著降低外源基因的随机整合概率；还具有独特的无痕切除特性，能够将转座子从基因组中精确移除，恢复原始基因组序列^[15]。基于这些优势，PiggyBac转座子系统已被广泛应用于多个研究领域，包括转基因动物制备、基因治疗、细胞系构建以及癌症研究等，特别是在构建表达治疗性重组蛋白的稳定细胞系和制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)等方面展现出重要的应用价值^[16-17]。本研究利用PiggyBac转座子系统，将包含POP基因的转座子质粒和表达转座酶的辅助质粒共转染PK15细胞，通过筛选获得稳定表达POP基因的POP-PK15细胞系，并对其表达稳定性和功能进行了系统验证，研究该细胞系对FMDV增殖的影响，以期为深入探究POP促进FMDV感染和复制的分子机制提供可靠的细胞模型。

1 材料与方法

收起

1.1 细胞、病毒、抗体

猪肾上皮细胞(porcine kidney-15 cells, PK15 cells)、仓鼠肾细胞(baby hamster kidney-21 cells, BHK-21 cells)、pCMV-HA-POP质粒、PiggyBac transposase (pPBT)转座酶质粒和PiggyBac-EF1α-GFP-puro质粒均由本实验室保存；FMDV O/GDBY/CHA/2010毒株由WOAH/国家口蹄疫参考实验室保存；鼠抗HA标签单克隆抗体和兔抗β-actin单克隆抗体均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；兔抗POP多克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG和Alexa-594标记的抗小鼠IgG均购自Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗小鼠IgG均购自Immunoway公司。

1.2 主要试剂

限制性核酸内切酶Nhe I和BamHI、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix，NEB公司；DNA胶回收试剂盒、Plasmid DNA Mini Kit，Omega公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒、ECL显影液，上海雅酶生物医药科技有限公司；蛋白marker，ThermoFisher Scientific公司；抗体稀释液、4%多聚甲醛固定液、CCK-8试剂盒，上海碧云天生物技术股份有限公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit，宝日医生物技术(北京)有限公司；Polyplus jetPRIME转染试剂，Polyplus Transfection公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，苏州依科赛生物科技股份有限公司；0.25% EDTA胰酶和DMEM细胞培养基，Gibco公司；DAPI染色液，北京索莱宝生物科技有限公司。

1.3 重组表达质粒的构建与引物设计

以实验室前期构建的真核表达质粒pCMV-HA-POP为模板，通过PCR扩增获得HA-POP基因。使用Nhe I和BamHI双酶切处理PiggyBac-EF1α-GFP-puro载体，并通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体片段。将扩增的HA-POP基因片段与线性化载体通过同源重组方法连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的菌液涂布于含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养12-16 h。挑取单克隆菌落进行扩大培养，提取质粒后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。经序列比对确认正确的重组质粒命名为PB-EF1α-HA-POP-puro。

设计POP基因扩增引物、FMDV引物和探针、内参基因GAPDH的引物、基因整合鉴定引物，引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。相关序列信息见表1。

1.4 POP蛋白的表达验证

将PK15细胞按5×10⁵个/mL密度接种于6孔板中，使用含有10% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。待细胞汇合度达到70%-80%时，按照jetPRIME转染试剂说明书进行质粒转染。

在1.5 mL EP管中依次加入200 µL转染buffer、1.0 µg质粒(实验组为PB-EF1α-HA-POP-puro，对照组为相应空载体)和2.0 µL jetPRIME^® reagent，轻柔混匀后室温静置10 min，配制转染复合物。将转染复合物逐滴加入细胞中，轻轻混匀后继续培养。转染后24 h收取细胞样品，采用预冷的裂解液(RIPA:蛋白酶抑制剂混合物=100:1)进行细胞裂解，4 ℃、13 000 r/min离心15 min收集上清。将细胞裂解液与5×蛋白上样缓冲液按比例混合，100 ℃煮样10 min制备总蛋白样品。蛋白样品经10% SDS-PAGE分离，通过湿转法将蛋白转移至NC膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h，随后分别加入鼠源抗HA标签一抗(1:2 000稀释)和鼠源β-actin单抗(1:2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(1:5 000稀释)，室温孵育1 h。使用ECL化学发光底物进行显色，通过全自动化学发光成像系统采集和分析图像。

1.5 细胞转染与单克隆细胞的筛选鉴定

1.5.1 细胞转染

将PK15细胞接种于6孔板，待生长密度达到70%时，根据jetPRIME转染试剂操作说明书进行质粒转染。实验组：共转染3 μg POP表达质粒和1 μg pPBT质粒；对照组：共转染3 μg PiggyBac-EF1α-GFP-puro质粒和1 μg pPBT质粒。转染后6 h更换新鲜培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养24 h后，使用荧光显微镜观察对照组细胞的GFP荧光表达情况，以评估转染效率。

1.5.2 单克隆细胞的筛选

转染24 h后，将PK15细胞按1:3的比例传代至6孔板，在培养基中加入浓度为5 µg/mL的嘌呤霉素进行筛选，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养。每3 d更换抗性筛选培养基，持续观察细胞状态，待阴性对照细胞完全死亡时终止筛选，更换为完全培养基。待细胞状态恢复正常后，用0.25%胰酶消化细胞，采用有限稀释法将细胞稀释至10个/mL，将每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养2周后挑选生长状态良好的单克隆细胞进行扩大培养并传代保存。

1.5.3 单克隆细胞的鉴定

取筛选的4株单克隆细胞和对照细胞，分别用Western blotting、RT-qPCR和RT-PCR方法鉴定蛋白表达、基因水平和目标基因整合情况。

1.6 细胞系的生长活力检测

将上述筛选获得的POP-PK15细胞系、对照细胞系GFP-PK15和亲本细胞WT-PK15用0.25%胰酶消化后计数，调整细胞密度至2×10⁵个/mL，每孔100 μL接种至96孔板，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。于不同时间点(0、12、24、36、48 h)在板孔中加入CCK-8试剂10 μL/孔，继续在37 ℃、5% CO₂培养箱中避光孵育2 h后，使用酶标仪测定每孔的OD ₄₅₀，计算细胞相对活性，如公式(1)所示。每个时间点设置3个复孔，实验重复3次。

细胞相对活性=(实验组OD ₄₅₀值-空白组OD ₄₅₀值)/(对照组OD ₄₅₀值-空白组OD ₄₅₀值)×100%(1)

1.7 单克隆细胞系的传代稳定性分析

将POP-PK15细胞系和对照细胞系GFP-PK15进行连续传代培养，分别收取第1、5、10、15、20、25、30代次(P1-P30)的细胞样品，每次待细胞密度达到80%-90%时进行样品采集。采用Western blotting方法检测收集的细胞样品中的POP蛋白表达情况。具体方法参考1.4节，以β-actin作为内参，计算POP蛋白的相对表达量，比较不同代次细胞中POP蛋白的表达水平，评估细胞系的遗传稳定性。

1.8 单克隆细胞系对FMDV增殖的影响

分别将POP-PK15细胞系和对照细胞系GFP-PK15铺于12孔板中，待细胞密度长至70%，将FMDV以病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0的滴度接种细胞，轻轻混匀后继续培养。12 h后收取2份细胞样品及细胞上清液。其中一份细胞样品用于Western blotting检测FMDV VP1蛋白水平，具体方法参考1.4节。另一份细胞样品用于RT-qPCR，检测FMDV mRNA转录水平变化。提取病毒RNA，利用一步法荧光定量PCR对FMDV的病毒拷贝数进行定量。反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探针(10 μmol/L) 0.8 μL，Viral RNA 2 μL，RNase free H₂O补充至总体积20 μL，混匀。PCR反应条件：42 ℃逆转录5 min，95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。所有样品设置3个重复，根据扩增的C _T值计算病毒拷贝数。

1.9 病毒TCID₅₀的测定

收集病毒感染后12 h的细胞上清，将BHK-21细胞铺于96孔板中，用无血清DMEM培养基将病毒上清10倍连续稀释(1×10^-1-1×10^-10)，每个稀释度样品重复8孔，同时设置正常细胞对照组(NC)。感染后48 h观察并记录出现细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀，每个试验重复3次，取其平均值。

1.10 间接免疫荧光试验

将生长状况良好的POP-PK15和WT-PK15细胞铺于共聚焦专用培养皿，待细胞密度长至60%时接种FMDV (MOI=0.1)；置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养12 h，弃病毒液并用预冷的1×PBS洗细胞3次，每次5 min；加入4%多聚甲醛固定细胞，室温固定10 min；用PBS洗细胞3次，每次5 min；使用抗体稀释液稀释一抗(1:300)，4 ℃孵育过夜；用PBS清洗细胞3次，每次5 min；用PBS稀释相应的荧光标记二抗(1:1 000)，在避光条件下室温孵育1 h；用PBS洗细胞3次，每次5 min；加入DAPI染料对细胞核进行染色，室温孵育10 min；用PBS清洗细胞3次，每次5 min；使用激光共聚焦显微镜进行观察并采集图像。

1.11 不同MOI的FMDV感染POP-PK15细胞对病毒增殖的影响

将POP-PK15细胞和对照细胞分别接种到12孔板，待细胞密度达到70%时分别以不同MOI (0、0.1、1.0、2.0)的FMDV感染2种细胞。感染后12 h收取2份细胞样品及细胞上清液，通过Western blotting、RT-qPCR以及TCID₅₀评估不同MOI的FMDV感染POP-PK15细胞系对病毒增殖的影响。具体方法参考1.4、1.8和1.9节。

1.12 不同时间点FMDV感染POP-PK15细胞系对FMDV增殖的影响

将POP-PK15细胞和对照细胞分别铺于35 mm培养皿中。待细胞长满后以MOI=0.1接种FMDV，分别于0-24 h不同时间点收取2份细胞样品及细胞上清液。通过Western blotting、RT-qPCR以及TCID₅₀评估不同时间点对病毒增殖的影响。具体方法参考1.4、1.8和1.9节。

1.13 不同传代次数的POP-PK15细胞系对FMDV增殖的影响

分别将对照细胞和POP-PK15细胞系在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养至所需代次。选取第10、20、30代细胞，将其接种到6孔板中，以MOI=0.1接种FMDV，在感染后12 h收取2份细胞样品及细胞上清液，通过Western blotting、RT-qPCR以及TCID₅₀评估不同代次的POP-PK15细胞系对病毒增殖的影响。具体方法参考1.4、1.8和1.9节。

1.14 数据处理

本研究所有试验均重复3次，应用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，采用Student’s t检验和one-way ANOVA方差分析。统计学显著性差异表示为：ns (P>0.05)表示无统计学差异性，*P<0.05表示数据具有统计学显著性差异，**P<0.01表示数据具有高度统计学显著性差异，***P<0.001表示数据具有极显著统计学差异。

2 结果与分析

收起

2.1 重组表达质粒的鉴定

对POP蛋白重组表达质粒进行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳分析结果显示2条明显的DNA条带，分别为6 600 bp的载体片段和2 500 bp的POP基因片段(图1)，与预期的基因片段大小相符；同时基因测序结果也证明PB-EF1α-HA-POP-puro质粒构建成功。

2.2 重组表达质粒转染细胞的蛋白表达鉴定

Western blotting和蛋白条带灰度分析结果显示，POP蛋白表达质粒转染细胞后能够成功表达POP蛋白，且蛋白质分子量符合预期(图2A、2B)。这表明本研究构建的POP真核表达质粒转染PK15细胞可以成功表达目标蛋白。

2.3 稳定细胞系的筛选和鉴定

Western blotting结果显示，筛选出的4株单克隆细胞均能表达POP蛋白(图3A)；POP mRNA水平显著高于野生型对照细胞(图3B)；RT-PCR特异性扩增条带表明POP基因已稳定整合到细胞基因组中(图3C)；荧光显微镜观察显示，对照细胞系GFP-PK15细胞内有明显的绿色荧光蛋白表达(图3D)。上述结果表明目的基因已稳定整合，且细胞内目标蛋白表达明显。

2.4 细胞活力检测

CCK-8检测结果显示，筛选的POP单克隆细胞系在各时间点的细胞活力与对照细胞相比无显著差异(图4)。这表明PK15细胞稳定表达POP蛋白对细胞增殖无影响。

2.5 POP-PK15细胞系的传代稳定性鉴定

将POP-PK15细胞系和GFP-PK15细胞系连续传代培养至30代(P30)，分别在特定代次收集细胞样品。Western blotting和蛋白表达灰度分析结果显示，稳定细胞系在传代后POP蛋白表达水平未发生明显变化(图5A、5B)，表明该细胞系可以稳定表达POP蛋白。

2.6 POP-PK15细胞系对FMDV增殖的影响

Western blotting及蛋白表达灰度分析结果表明，POP-PK15细胞接种FMDV后FMDV VP1蛋白表达水平显著高于对照组(图6A)。病毒滴度测定结果显示，与对照组细胞相比，POP-PK15细胞中FMDV的滴度显著升高(图6B)。同时，FMDV mRNA水平显著高于对照组(图6C)。此外，间接免疫荧光试验结果也显示，POP-PK15细胞中FMDV的感染细胞数量明显多于WT-PK15对照组细胞(图6D)。结果表明，POP-PK15细胞系能够显著促进FMDV的增殖。

2.7 FMDV接种POP-PK15细胞系后不同时间的增殖情况

Western blotting及蛋白表达灰度分析结果表明，病毒感染后FMDV VP1蛋白表达水平从10 h开始显著升高(图7A、7B)。病毒滴度测定结果显示，POP-PK15细胞中FMDV的滴度在8-24 h均显著高于对照细胞(图7C)。RT-qPCR结果显示，POP-PK15细胞中FMDV mRNA水平从接种后8 h开始显著升高(图7D)。上述结果表明POP-PK15细胞系可以显著促进FMDV的增殖。

2.8 不同MOI的FMDV接种POP-PK15细胞系对病毒增殖的影响

Western blotting和蛋白表达灰度分析结果表明，不同MOI的FMDV接种POP-PK15细胞后FMDV VP1蛋白表达水平均显著高于对照组(图8A)。病毒滴度测定结果显示，POP-PK15细胞中的FMDV的滴度均显著高于对照细胞(图8B)。此外，RT-qPCR结果也表明，与对照细胞相比，POP-PK15细胞系中FMDV mRNA水平显著升高(图8C)。上述结果表明POP-PK15细胞在接种不同MOI的FMDV后可以显著促进FMDV的增殖。

2.9 不同代次的POP-PK15细胞系对FMDV增殖的影响

Western blotting及蛋白表达灰度分析结果表明，分别接种P10、P20、P30代次的POP-PK15细胞系中FMDV VP1蛋白表达水平均显著高于GFP-PK15细胞(图9A、9B)；病毒滴度测定结果也显示，POP-PK15细胞中FMDV滴度均显著高于对照细胞(图9C)；同时，POP-PK15细胞中FMDV mRNA水平也显著高于对照细胞(图9D)。

3 讨论

收起

在病毒感染周期中宿主蛋白通过多种分子机制参与并调控病毒复制的各个环节。大量研究证实，多种宿主蛋白在病毒识别、细胞入侵、基因组转录、蛋白翻译、病毒组装以及子代病毒释放等过程中发挥着重要的调控作用^[9,18]。FMDV结构蛋白VP3与宿主组蛋白去乙酰化酶8 (histone deacetylase 8, HDAC8)发挥特异性相互作用，显著促进病毒复制^[19]；在登革热病毒研究中宿主蛋白酰基辅酶A硫酯酶2 (acyl-CoA thioesterase 2, ACOT2)被证实参与病毒多聚蛋白加工过程，为抗病毒药物研发提供了新的分子靶点^[20]。此外，FMDV结构蛋白VP1与宿主核糖体蛋白SA (ribosomal protein SA, RPSA)的相互作用可通过双重机制促进病毒复制：一方面抑制RPSA的生理功能，另一方面维持丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路的持续激活^[21]。

近年来，通过构建稳定表达特定宿主蛋白的细胞系来增强病毒感染效率的研究策略取得了诸多进展。以丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)为例，研究人员成功构建了稳定表达HCV受体CD81和SR-B1的细胞系，显著提高了HCV的感染效率和复制能力^[22]。PiggyBac转座子系统的应用为快速构建稳定表达特定基因的细胞株提供了高效解决方案。该系统不仅简化了实验操作、降低了研究成本，而且具有独特的优势：既可实现单个基因的转移和表达，又能完成多个基因的共表达，在基因组合调控研究和药物开发等领域展现出广阔的应用前景^[15,23]。赵晓彤等^[24]利用PiggyBac转座子技术成功构建了UL19过表达的小鼠乳腺癌细胞模型，为深入研究VP5蛋白诱导免疫细胞发挥抗肿瘤活性的分子机制提供了理想的实验平台。综上所述，稳定表达特定宿主蛋白的细胞系不仅在病毒-宿主相互作用研究中具有重要价值，而且为抗病毒药物研发和病毒致病机制研究提供了强有力的技术支撑，展现出广阔的应用前景。

POP作为一种多功能蛋白酶具有酶促活性和非酶活性，参与了许多生物学过程，在细胞生长和分化、炎症以及某些神经退行性和神经精神疾病的发展中发挥了作用。Jiang等^[25]的研究发现炎症损伤后小鼠大脑中的POP水平显著升高，而POP基因敲除小鼠对高脂饮食诱导的炎症反应明显减弱，这揭示了POP在神经系统疾病中的潜在作用。此外，在生命早期POP水平的上调可能与其参与多种细胞的增殖和分化过程有关，包括肝细胞、卵巢细胞、睾丸细胞及神经元^[11,26-27]。本课题组前期通过猪全基因组筛选鉴定出多个与FMDV感染相关的候选基因，前期研究证实猪POP蛋白与FMDV复制过程密切相关^[14]。基于此，本研究利用PiggyBac转座子系统成功构建了稳定表达POP基因的PK15细胞系。研究表明POP蛋白的过表达对细胞活力无显著影响(P>0.05)，进一步研究发现与对照细胞相比，POP过表达细胞系可显著促进FMDV的增殖(P<0.05)，且该促进效应在细胞系传代过程中保持稳定。这一发现不仅为阐明FMDV与宿主相互作用的分子机制提供了新的线索，也为开发靶向宿主因子的抗病毒策略奠定了重要的实验基础。

本研究揭示了猪POP蛋白在促进FMDV增殖中的重要作用，这一发现拓展了对宿主因子与FMDV相互作用的认识。然而，POP调控FMDV增殖的具体分子机制仍有待阐明。基于现有研究推测POP可能通过多种分子途径影响FMDV的复制过程：(1) 直接参与调控病毒生命周期的关键阶段；(2) 通过调节细胞内信号转导通路创造有利于病毒复制的微环境；(3) 可能影响宿主细胞的抗病毒免疫应答。值得注意的是，目前的研究仅限于体外细胞水平，尚缺乏体内实验数据的支持。因此，后续研究将着重构建POP基因敲除的动物模型和POP特异性小分子抑制剂的体内试验，从活体水平验证POP对FMDV感染的影响，探索POP作为潜在抗病毒靶点的可行性。这些研究将为进一步阐明FMDV-宿主相互作用的分子机制提供新的视角，同时也为开发基于宿主因子的抗病毒策略奠定理论基础。

4 结论

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本研究成功构建了稳定表达猪POP蛋白的POP-PK15细胞系，该细胞系具有良好的传代稳定性，并可以显著促进FMDV的增殖。本研究结果为进一步深入探究POP蛋白促进FMDV增殖的分子机制提供了可靠的细胞模型，对宿主蛋白调控小RNA病毒复制的研究具有重要的参考价值。

基金

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国家自然科学基金(32372990)
甘肃省自然科学基金(23YFNA0011)
甘肃省自然科学基金(23JRRA549)

参考文献

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文献

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2025年第65卷第10期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250191

接收时间：2025-03-09
首发时间：2025-11-03
出版时间：2025-09-04

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收稿日期：2025-03-09
录用日期：2025-04-25

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甘肃省自然科学基金(23YFNA0011)

甘肃省自然科学基金(23JRRA549)

作者信息

¹ 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院，动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州

² 甘肃省病原生物学基础学科研究中心，甘肃兰州

³ 兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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