微生物学报

Primers name	Primer sequences (5′→3′)
lmo0175-up-F	CCCAAGCTTAGTATCTGACAGATATCTTTGACAAGATACTT
lmo0175-up-R	TTTAATAAGAAAAAACTATTATTTAAAAAGAAATAAAAAAACACCT
lmo0175-down-F	CTTTTTAAATAATAGTTTTTTCTTATTAAACATTATATAAATAACCTCTT
lmo0175-down-R	CCGGAATTCTCCATAAACATCCTGTTATAAAACTAATC
lmo0175-front-F	ATAAGATGTGTACACCGAACCTTGAT
CΔlmo0175-F	GAAGGAGAGTGAAACCCATGGATGTTTAATAAGAAAAAAACTATCGCT
CΔlmo0175-R	ATCGAATTCCTGCAGCCCGGGTTACTGATAGTTTTTCTTTCTTCCTCTCA
lmo0175-in-F	ACACATGAACGGTGACATTTAGTGTATTTG
lmo0175-in-R	AAAGCAAAAGTAAAGTTCGACTGGAAAACT
lmo0175-out-F	ATTTCTGGTAATTCAGGCACCCC
lmo0175-out-R	TATAGCTGAAATAACAAGAAGATGGTAGAGGTTTT

Primers name	Primer sequences (5′→3′)
lmo0175-up-F	CCCAAGCTTAGTATCTGACAGATATCTTTGACAAGATACTT
lmo0175-up-R	TTTAATAAGAAAAAACTATTATTTAAAAAGAAATAAAAAAACACCT
lmo0175-down-F	CTTTTTAAATAATAGTTTTTTCTTATTAAACATTATATAAATAACCTCTT
lmo0175-down-R	CCGGAATTCTCCATAAACATCCTGTTATAAAACTAATC
lmo0175-front-F	ATAAGATGTGTACACCGAACCTTGAT
CΔlmo0175-F	GAAGGAGAGTGAAACCCATGGATGTTTAATAAGAAAAAAACTATCGCT
CΔlmo0175-R	ATCGAATTCCTGCAGCCCGGGTTACTGATAGTTTTTCTTTCTTCCTCTCA
lmo0175-in-F	ACACATGAACGGTGACATTTAGTGTATTTG
lmo0175-in-R	AAAGCAAAAGTAAAGTTCGACTGGAAAACT
lmo0175-out-F	ATTTCTGGTAATTCAGGCACCCC
lmo0175-out-R	TATAGCTGAAATAACAAGAAGATGGTAGAGGTTTT

单核增生李斯特氏菌LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175介导的抗氧化应激和感染生物学研究

PDF下载

葛泓睿 ¹ , 李豪杰 ¹ , 高宇杰 ¹ , 徐加利 ¹ , 张蕊 ² , 宋厚辉 ¹ , 程昌勇 ¹ , 邓思敏 ¹

微生物学报 | 研究报告 2025,65(10): 4504-4516

收起

微生物学报 | 研究报告 2025, 65(10): 4504-4516

单核增生李斯特氏菌LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175介导的抗氧化应激和感染生物学研究

全屏

葛泓睿¹, 李豪杰¹, 高宇杰¹, 徐加利¹, 张蕊², 宋厚辉¹, 程昌勇¹, 邓思敏¹

作者信息

¹浙江农林大学动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心，浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地，同一健康和食品安全“一带一路”国际联合实验室，中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江杭州

²中国农业大学动物医学院，北京

Oxidative resistance and infection ability mediated by LPXTG motif-anchored protein Lmo0175 in Listeria monocytogenes

Hongrui GE¹, Haojie LI¹, Yujie GAO¹, Jiali XU¹, Rui ZHANG², Houhui SONG¹, Changyong CHENG¹, Simin DENG¹

Affiliations

¹Key Laboratory of Applied Biotechnology on Green-eco-healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Zhejiang Engineering Research Center for Veterinary Diagnostics & Advanced Technology, Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management, Belt and Road International Joint Laboratory for One Health and Food Safety, China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics, College of Veterinary Medicine, Zhejiang A&F University, Hangzhou, Zhejiang, China

²College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing, China

出版时间: 2025-09-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250203

文章导航

摘要

收起

【目的】 通过比较单核增生李斯特氏菌参考菌株EGD-e、lmo0175基因缺失株Δlmo0175和回补株CΔlmo0175在细菌生长、抗氧化应激、细胞和宿主感染等方面的差异，明确LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175在单核增生李斯特氏菌抗氧化应激和感染致病中的作用。 【方法】 通过构建lmo0175的基因缺失株和回补株，探究Lmo0175对单核增生李斯特氏菌生长、抗氧化应激、细胞黏附、细胞侵袭、胞内增殖和组织定殖能力及小鼠致病力等方面的影响，从而明确Lmo0175在该菌抗氧化应激和感染宿主中的作用。 【结果】 lmo0175基因缺失后，单核增生李斯特氏菌在抗氧化应激、胞内增殖和小鼠脏器定殖等方面的能力显著降低，但在生长能力、细胞黏附和侵袭能力方面无显著差异。 【结论】 本研究阐明了LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175参与单核增生李斯特氏菌抗氧化应激、胞内增殖和组织定殖等过程，且有助于该菌对小鼠的致病力。

关键词

单核增生李斯特氏菌 / 氧化应激 / 宿主感染 / LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175

Abstract

收起

[Objective] To compare the bacterial growth, oxidative resistance, and bacterial infection in cells and host among Listeria monocytogenes EGD-e, lmo0175 (LPXTG motif-anchored protein)-deleted and complementary strains, so as to investigate the roles of Lmo0175 in anti-oxidative resistance and bacterial infection. [Methods] The lmo0175-deleted and complementary strains were constructed to compare the difference in bacterial growth, oxidative resistance, adhesion, invasion, intracellular proliferation, survival of infected mice, and bacterial loads in organs of Listeria monocytogenes. [Results] The deletion of lmo0175 remarkably decreased oxidative resistance, cell proliferation, colonization in the liver and spleen, and pathogenicity in mice. However, it had no significant impact on bacterial growth, adhesion or invasion. [Conclusion] The LPXTG motif-anchored protein Lmo0175 contributes to the anti-oxidative resistance, proliferation, and colonization in specific organs of Listeria monocytogenes.

Key words

Listeria monocytogenes / oxidative stress / host infection / LPXTG motif-anchored protein Lmo0175

引用本文

葛泓睿, 李豪杰, 高宇杰, 徐加利, 张蕊, 宋厚辉, 程昌勇, 邓思敏. 单核增生李斯特氏菌LPXTG基序锚定蛋白Lmo0175介导的抗氧化应激和感染生物学研究. 微生物学报, 2025 , 65 (10) : 4504 -4516 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250203

Hongrui GE, Haojie LI, Yujie GAO, Jiali XU, Rui ZHANG, Houhui SONG, Changyong CHENG, Simin DENG. Oxidative resistance and infection ability mediated by LPXTG motif-anchored protein Lmo0175 in Listeria monocytogenes[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (10) : 4504 -4516 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250203

正文

收起

单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一种重要的人畜共患胞内病原菌，广泛存在于农场、食品加工厂和食物等环境中^[1]。该菌对人类和动物的健康构成严重威胁，并对食品安全造成挑战^[2]。单核增生李斯特氏菌感染人引起的李斯特菌病被认为是最严重的食源性疾病之一^[2]，可引起老年人、孕妇、幼儿等免疫功能低下者的脑膜炎、流产或新生儿败血症等临床症状，其感染后死亡率高达30%^[3-4]。

单核增生李斯特氏菌具有较强的环境适应能力，能够耐受活性氧、酸、高渗透压、低温和高温等环境应激^[5]。其中，氧化应激是细菌最常见的环境应激压力之一^[6]。单核增生李斯特氏菌编码多种代谢酶来感知和适应富氧环境从而抵抗氧化应激，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽S-转移酶^[7-8]。细菌对环境变化的感知和适应能力对其生存和致病至关重要^[9]。单核增生李斯特氏菌表达多种毒力或致病因子，介导细菌从应激环境向宿主细胞质的迁移，促进细菌在宿主肠道内的生存、细胞黏附与入侵、吞噬体逃逸，随后在细胞质内复制和细胞间迁移^[9]。在该致病过程中，表面蛋白和分泌蛋白发挥着至关重要的作用^[10]。LPXTG基序锚定蛋白是一类羧基端带有LPXTG保守基序并共价锚定到细胞壁肽聚糖上的表面蛋白，在感染宿主过程中发挥重要的毒力作用^[11-15]。然而，许多LPXTG基序锚定蛋白的生物学功能尚未明确。

本实验室前期研究发现，单核增生李斯特氏菌中的Lmo0175是一个功能未知的LPXTG基序锚定细胞壁蛋白，在基因组中被注释为肽聚糖结合蛋白(peptidoglycan-binding protein)，含有黏蛋白结合蛋白MucBP (mucin-binding protein，270-330 aa)和内化素InlK_D3 (179-258 aa)结构域，提示其可能与宿主感染有关^[16-17]。此外，本实验室前期筛选还发现，Lmo0175可能与抗氧化应激有关。因此，本研究拟通过比较单核增生李斯特氏菌EGD-e、缺失株Δlmo0175和回补株CΔlmo0175在生长、抗氧化应激、细胞感染和小鼠感染等方面的差异，明确Lmo0175在该菌抗氧化应激和宿主感染中发挥的作用，为下一步解析其抗氧化应激和宿主感染的机制奠定重要基础。

1 材料与方法

收起

1.1 菌株、质粒和引物

本研究所用的单核增生李斯特氏菌参考菌株EGD-e，用牛脑心浸出液肉汤培养基(brain heart infusion, BHI)在37 ℃、180 r/min摇床中振荡培养，或用BHI固体培养基在37 ℃恒温生化培养箱中静置培养。大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α菌株，用LB肉汤或固体培养基在37 ℃振荡(180 r/min)或静置培养。上述菌株均由本实验室保存。本研究所用温敏型穿梭质粒pSKV7^[18] (7.1 kb，lac启动子，Amp^r，Cm^r)及在此基础上构建的用于缺失株构建的重组质粒pSL2652 (8.0 kb，lac启动子，Amp^r，Cm^r)；整合型穿梭质粒pIMK2^[19] (6.2 kb，P _help 启动子，Kana^r)及用于回补株构建的重组质粒pSL2658 (7.2 kb，lmo0175启动子，Kana^r)均由本实验室保存。人肠上皮细胞Caco-2和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别在添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640和DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO₂的细胞恒温培养箱中静置培养。

本研究所涉及引物见表1。

1.2 Δlmo0175缺失菌株和CΔlmo0175回补菌株的构建和筛选

基于单核增生李斯特氏菌无痕基因敲除原理构建基因缺失株^[20]。以过夜培养的单核增生李斯特氏菌EGD-e (GenBank登录号：NC_003210.1)菌液为基因组DNA模板，以lmo0175-up-F/R和lmo0175-down-F/R (表1)为引物，分别扩增lmo0175基因(GenBank登录号：NP_463706.1)的上、下游同源臂。随后以lmo0175基因的上、下游同源臂1:1 (摩尔比)混合物为模板，以lmo0175-up-F和lmo0175-down-R为引物，通过重叠PCR获得上、下游同源臂融合片段。上述PCR反应体系(50 μL)：2×KOD One^TM PCR Master Mix 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，DNA模板2 µL，ddH₂O 19 µL。PCR反应条件：98 °C预变性5 min；98 °C变性10 s，58 °C退火5 s，72 °C延伸1 s，共35个循环；72 °C终延伸7 min。PCR扩增得到的lmo0175上、下游同源臂融合片段与pKSV7质粒经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后连接，获得重组质粒pSL2652，随后将pSL2652质粒电转至单核增生李斯特氏菌EGD-e感受态中。菌液在42 ℃含10 μg/mL Cm^r抗性的BHI肉汤中培养2-3代后涂布在含Cm^r抗性的BHI平板上。待长出单菌落后，利用lmo0175-front-F/lmo0175-down-R (表1)引物筛选出发生同源重组的阳性克隆，扩增产物大小为1 000 bp。然后将阳性克隆在30 ℃的BHI肉汤中传代培养约10代后，在无抗生素的BHI平板上划线。待长出单菌落后，用无菌牙签挑取数个单菌落，同步接种于无抗生素和含Cm^r抗性的BHI平板中培养。观察在无抗生素的培养基中长势良好，且在对应含Cm^r抗性的培养基中无法生长的菌落即为疑似基因缺失株。用引物lmo0175-front-F/lmo0175-down-R (表1)对筛选出的疑似基因缺失菌株进行PCR和测序双重验证，最终获得基因缺失菌株Δlmo0175。

参考文献[20]构建单核增生李斯特氏菌的回补菌株。以单核增生李斯特氏菌EGD-e菌株基因组为模板，以CΔlmo0175-F/R (表1)为引物扩增单转录本lmo0175的启动子和基因编码区。扩增产物经Sac Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切后构建至pIMK2质粒中，获得重组质粒pSL2658。将pSL2658质粒电转至Δlmo0175感受态中，通过Kana^r (50 μg/mL)抗性筛选，并对筛选出的单克隆经菌落PCR和测序验证后最终获得回补菌株CΔlmo0175。

在lmo0175基因上、下游同源臂上设计一对外部引物lmo0175-out-F/R (表1)；在lmo0175基因内部设计一对内部引物lmo0175-in-F/R (表1)，通过lmo0175基因内外部引物对单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175进行PCR鉴定。

1.3 生长曲线的绘制和菌落计数

参考文献[21]，通过绘制生长曲线和菌落计数比较单核增生李斯特氏菌各菌株的生长能力差异。过夜培养的单核增生李斯特氏菌按1:100转接后，37 ℃静置培养12 h，且每隔1 h用多功能酶标仪Synergy^TM H1测定OD₆₀₀吸光值。将上述转接后的菌液培养至4、6和8 h时，各取100 μL菌液进行倍比稀释并计数。每个菌株设置3个重复。

1.4 氧化应激试验

向BHI肉汤培养基中加入不同浓度的H₂O₂、金属离子氧化剂Cu²⁺和Cd²⁺、巯基特异性氧化剂肼(diamide)，探究Lmo0175对单核增生李斯特氏菌在肉汤培养基中抗氧化应激能力的影响^[20]。过夜培养的单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175菌液6 000 r/min离心5 min后，用新鲜BHI培养基将菌体重悬并调整至相同OD₆₀₀吸光值，然后按1:100转接至添加氧化剂的新鲜BHI培养基的96孔板中，200 μL/孔，37 ℃静置培养，且每隔1 h测定OD₆₀₀吸光值。每个菌株设置3个重复。

向BHI固体培养基中加入不同浓度的H₂O₂、金属离子氧化剂Cu²⁺和Cd²⁺、巯基特异性氧化剂肼，探究Lmo0175对单核增生李斯特氏菌在固体培养基中抗氧化应激能力的影响^[20]。将上述重悬后的菌液调整OD₆₀₀为0.6左右(约2×10⁹ CFU/mL)，倍比稀释后取10 μL菌液点在带有不同氧化剂的BHI平板上，置于37 ℃恒温生化培养箱中静置培养过夜后观察菌落生长情况。

1.5 细菌黏附和侵袭试验

参考文献[22]，利用Caco-2细胞比较单核增生李斯特氏菌各菌株在上皮细胞上的黏附和侵袭能力的差异。培养到OD₆₀₀为0.6左右的单核增生李斯特氏菌菌液，用1×PBS (10 mmol/L)洗涤菌液2次后，用RPMI 1640培养基稀释至2×10⁶ CFU/mL备用。稀释后的菌液以感染复数(multiplicity of infection, MOI)=10感染Caco-2细胞。黏附试验：感染30 min后，用PBS洗涤细胞3次，裂解细胞，并将细胞悬液进行倍比稀释后涂布于BHI固体培养基上，待过夜培养后对平板上的菌落进行计数。侵袭试验：感染1.5 h后，加入含50 µg/mL庆大霉素的RPMI 1640细胞培养基处理30 min，洗涤细胞3次，裂解细胞并涂布计数。

1.6 RAW264.7细胞中的胞内增殖试验

利用RAW264.7细胞比较单核增生李斯特氏菌各菌株在巨噬细胞中的胞内增殖能力的差异^[23]。培养到OD₆₀₀为0.6左右的单核增生李斯特氏菌菌液，先用PBS洗涤2次，再用DMEM培养基倍比稀释至5×10⁶ CFU/mL备用。稀释后的菌液以MOI=10感染RAW264.7细胞30 min。洗涤细胞2次，再用含50 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基处理30 min。洗涤细胞3次，再用含5 μg/mL庆大霉素和10% FBS的DMEM培养基继续培养1、4和7 h。培养结束后用PBS洗涤细胞3次，再裂解细胞并涂布计数。

1.7 小鼠存活和组织载菌量试验

通过小鼠模型比较单核增生李斯特氏菌各菌株在小鼠脏器中的定殖能力和对小鼠的致病力差异^[24]。培养后的单核增生李斯特氏菌菌液用PBS洗涤2次并稀释至2×10⁷ CFU/mL备用。向6周龄ICR雌性小鼠分别腹腔注射单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175菌液各200 µL，每株菌注射8只小鼠。感染24 h后分离脾脏(spleen)和肝脏(liver)进行组织匀浆，并对组织悬液进行倍比稀释和涂布计数。每组去除最高值和最低值后进行数据处理。

用处理后的单核增生李斯特氏菌菌液按上述方法感染ICR雌性小鼠，每株菌注射10只小鼠，感染后每隔12 h观察和记录各组小鼠的存活情况，累计观察7 d。

本研究动物实验已通过浙江农林大学实验动物伦理委员会审查，编号为ZAFUAC202483。

1.8 数据统计与处理

使用GraphPad Prism 8.0进行数据处理和显著性分析。本研究均采用t检验进行显著性分析，其中ns表示P>0.05，*表示0.01<P<0.05，**表示0.001<P<0.01，***表示P<0.001。使用Adobe Illustrator 2025进行图片排版。

2 结果与分析

收起

2.1 构建单核增生李斯特氏菌lmo0175缺失株Δlmo0175和回补株CΔlmo0175

经PCR的lmo0175上、下游同源臂条带大小分别为500 bp (图1A，泳道Up和Down)，融合后的同源臂片段大小为1 000 bp (图1A，泳道Overlap)。含重组质粒pSL2652的菌体经菌落PCR (图1B，泳道pSL2652)和测序验证，表明用于筛选lmo0175缺失的pSL2652质粒构建成功。同样，将lmo0175及其上游启动子区克隆至pIMK2穿梭质粒中，得到重组质粒pSL2658。

将pSL2652和pSL2658质粒分别电转至单核增生李斯特氏菌EGD-e和Δlmo0175中，筛选lmo0175缺失株和回补株。利用lmo0175的内、外部引物对单核增生李斯特氏菌各菌株进行PCR验证。当用lmo0175-inner-F/R扩增时，仅有EGD-e和CΔlmo0175出现400 bp大小的条带；当用lmo0175-outer-F/R扩增时，Δlmo0175和CΔlmo0175出现771 bp大小的条带，而EGD-e出现1 900 bp大小的条带(图1C)，表明缺失株Δlmo0175和回补株CΔlmo0175构建成功。

2.2 Lmo0175不影响单核增生李斯特氏菌的生长

通过绘制单核增生李斯特氏菌的生长曲线，发现EGD-e、∆lmo0175和C∆lmo0175在0-12 h的生长水平无显著差异(图2A)。细菌培养4、6和8 h后的菌落计数结果表明，EGD-e、∆lmo0175和C∆lmo0175在4-8 h无显著差异(图2B、2C)。结果表明，lmo0175基因缺失后不影响该菌在37 ℃ BHI肉汤中的生长能力。

2.3 Lmo0175参与单核增生李斯特氏菌在固体培养条件下的抗氧化应激

比较单核增生李斯特氏菌EGD-e、∆lmo0175和C∆lmo0175在添加不同浓度常见氧化剂H₂O₂、Cu²⁺、Cd²⁺和肼的BHI固体培养基中的生长差异，探究Lmo0175在抗氧化应激中的作用。如图3所示，发现在10 mmol/L和15 mmol/L H₂O₂的BHI平板上，3株菌在10^-1-10^-6稀释度的生长无显著差异。在CuCl₂氧化剂的应激平板上，EGD-e和C∆lmo0175均在最高稀释度10^-6 (0.25 mmol/L CuCl₂)、10^-6 (0.5 mmol/L CuCl₂)和10^-3 (1 mmol/L CuCl₂)存在大量菌落生长，而∆lmo0175能在上述应激平板上大量生长的最高稀释度分别为10^-5 (0.25 mmol/L CuCl₂)、10^-3 (0.5 mmol/L CuCl₂)和10^-1 (1 mmol/L CuCl₂)，因此∆lmo0175与EGD-e和C∆lmo0175相比在0.25、0.5和1 mmol/L CuCl₂氧化剂的应激平板上分别表现出1、3和2个数量级的显著差异。在0.25、0.5和1 mmol/L CdCl₂氧化剂的应激平板上，∆lmo0175与EGD-e和C∆lmo0175相比均表现出1个数量级的显著差异。在1、1.5和2 mmol/L肼氧化剂的应激平板上，∆lmo0175与EGD-e和C∆lmo0175相比均表现出1个数量级的显著差异。因此，在添加Cu²⁺、Cd²⁺和肼的固体培养基中，Lmo0175参与单核增生李斯特氏菌的抗氧化应激。

2.4 Lmo0175参与单核增生李斯特氏菌在肉汤培养条件下的抗氧化应激

比较单核增生李斯特氏菌EGD-e、∆lmo0175和C∆lmo0175在添加不同浓度常见氧化剂H₂O₂、Cu²⁺、Cd²⁺和肼的BHI肉汤培养基中的生长差异，探究Lmo0175在抗氧化应激中的作用。如图4所示，EGD-e、∆lmo0175和C∆lmo0175在不同浓度H₂O₂ BHI培养基中生长无显著差异。与EGD-e和C∆lmo0175相比，∆lmo0175在1 mmol/L和1.5 mmol/L CuCl₂BHI培养基中生长显著变慢，尤其是在1.5 mmol/L CuCl₂BHI培养基中，∆lmo0175的对数期和稳定期生长均显著变慢。∆lmo0175在1.5 mmol/L CdCl₂BHI培养基中的生长较EGD-e和C∆lmo0175显著变慢。∆lmo0175在1、1.5和2 mmol/L肼BHI培养基中生长均显著变慢。各生长条件下EGD-e和C∆lmo0175的生长均无显著差异。结果表明，在添加Cu²⁺、Cd²⁺和肼氧化剂的肉汤培养基中，Lmo0175参与单核增生李斯特氏菌的抗氧化应激。

2.5 Lmo0175有助于单核增生李斯特氏菌在吞噬细胞中的增殖

通过体外黏附和侵袭试验，探究Lmo0175对单核增生李斯特氏菌黏附和侵袭人肠上皮细胞Caco-2的影响。结果表明，与EGD-e和CΔlmo0175相比，Δlmo0175的黏附率(图5A)和侵袭率(图5B)均无显著差异。

通过体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，比较单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175在巨噬细胞中增殖能力的差异。结果表明，与EGD-e和CΔlmo0175相比，Δlmo0175在感染0.5 h时的黏附率和1.5 h时的侵袭率均无显著差异。在感染3 h (增殖时间2 h)时，各菌株的增殖率无显著差异；在感染6 h (增殖时间5 h)时，EGD-e和CΔlmo0175的增殖率分别是Δlmo0175的2.55倍和3.05倍；在感染9 h (增殖时间8 h)时，与Δlmo0175相比，EGD-e和CΔlmo0175增殖率分别提高了149.88%和182.02% (图5C)。因此，缺失lmo0175导致单核增生李斯特氏菌在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的增殖能力显著降低。结果表明，Lmo0175有助于单核增生李斯特氏菌在细胞内的增殖，但不影响细菌的黏附和侵袭。

2.6 Lmo0175有助于单核增生李斯特氏菌对小鼠的致病力

通过小鼠存活曲线比较感染单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175的小鼠存活情况。结果发现在感染60 h时，感染EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175的小鼠存活率分别为20%、80%和40%；在感染84 h时，感染EGD-e和CΔlmo0175的小鼠存活率均降至0，而感染Δlmo0175的小鼠在感染84 h及之后的整个观察期内的存活率均为40% (图6A)。因此，缺失lmo0175的单核增生李斯特氏菌感染小鼠的存活能力显著提高。

通过感染小鼠组织载菌量试验比较单核增生李斯特氏菌EGD-e、Δlmo0175和CΔlmo0175在小鼠组织中的定殖能力。结果表明，在感染24 h时，与EGD-e相比，感染Δlmo0175的小鼠肝脏和脾脏载菌量分别下降了8.03%和10.35%；与CΔlmo0175相比，感染Δlmo0175的小鼠肝脏和脾脏载菌量分别下降了0.80%和8.63%；而EGD-e和CΔlmo0175的肝脏和脾脏载菌量无显著差异(图6B)。因此，缺失lmo0175基因导致单核增生李斯特氏菌在小鼠组织中的定殖能力显著减弱。

综上所述，Lmo0175有助于单核增生李斯特氏菌在组织脏器中的定殖和对小鼠的致病力。

3 讨论与结论

收起

单核增生李斯特氏菌广泛存在于土壤和水源中，人食用受该菌污染的食物可引起菌血症，免疫功能低下者和老人常并发脑膜脑炎，孕妇则会发生胎儿-胎盘感染而流产或产死胎^[25]。在过去的几十年里，它作为一种主要的食源性病原体，在西方国家和最近的非洲造成了多次疫情^[26]。单核增生李斯特氏菌不仅环境适应能力强，还能通过表达多种因子介导细菌从应激环境向宿主细胞质的迁移，并促进细菌在宿主肠道内的生存、黏附和吞噬体逃逸^[9]。单核增生李斯特氏菌被巨噬细胞吞噬后暂时驻留在液泡的氧化环境中^[27]。细菌内化后分泌的李斯特氏菌溶血素O (LLO)和2种磷脂酶(PlcA和PlcB)迅速介导其从氧化吞噬体逃逸到高度还原的细胞质中^[28-30]，从而促进存活、细胞内复制，并最终扩散到邻近细胞中^[31]。因此，单核增生李斯特氏菌是研究宿主感染过程中细菌对氧化还原变化的适应性反应的良好模型系统^[32-33]。本研究通过比较单核增生李斯特氏菌在生长、抗氧化应激和感染致病中的作用，明确了Lmo0175在单核增生李斯特氏菌抗氧化应激和感染宿主中的作用。

本研究通过比较单核增生李斯特氏菌在添加不同氧化剂的肉汤和固体培养基中的生长能力差异，发现Lmo0175有助于该菌在金属离子氧化剂Cu²⁺ (P<0.05)、Cd²⁺ (P<0.05)和巯基特异性氧化剂diamide (P<0.05)中的抗氧化应激。通过细胞和动物模型发现Lmo0175有助于单核增生李斯特氏菌的胞内增殖、肝脾组织中的定殖及在小鼠中的致病力。之前的研究发现过氧化物酶Lmo0367、谷胱甘肽过氧化物酶Lmo0983、硫醇过氧化物酶Tpx (Lmo1583)、硫氧还蛋白Lmo1609和氢过氧化物酶OhrA (Lmo2199)在有氧生长、急性过氧化物解毒和细胞感染中均是必不可少的^[34]。因此，单核增生李斯特氏菌中存在多种参与氧化应激耐受和宿主感染的蛋白质。然而也有研究发现，假定血红素过氧化物酶ChdC (Lmo2113)和血红素依赖过氧化氢酶Kat (Lmo2785)是体外有氧生长所必需的；铁蛋白Fri (Lmo0943)和过氧化物氧还酶AhpA (Lmo1604)是单核增生李斯特氏菌在急性过氧化应激中生存所必需的；尽管在巨噬细胞感染期间Fri、AhpA和Kat的表达量均增加，但只有Fri被证明是胞浆生长所必需的^[34]。由此可见，并非所有参与体外抗氧化应激的蛋白质都参与宿主感染期间的氧化应激调控过程。本研究发现Lmo0175参与抵抗体外氧化应激，又与宿主感染期间单核增生李斯特氏菌在巨噬细胞中的增殖有关，并最终影响小鼠致病力。提示Lmo0175可能利用其抗氧化应激能力帮助单核增生李斯特氏菌在宿主免疫细胞的氧化环境中存活和增殖，从而介导在小鼠感染中的致病力。

革兰氏阳性菌通过分选酶SrtA识别LPXTG保守基序并在其苏氨酸和甘氨酸之间切割蛋白质，然后催化苏氨酸的羧基与肽聚糖五甘氨酸跨桥上的氨基形成酰胺键，从而将表面蛋白锚定到细胞壁上^[35]。前期分析发现Lmo0175为LPXTG基序锚定肽聚糖结合蛋白，含有MucBP和InlK_D3结构域，提示其与宿主感染有关。最近在金黄色葡萄球菌^[36]、罗伊氏乳杆菌^[37]、单核增生李斯特氏菌^[38]等食源菌中也有LPXTG基序锚定蛋白参与环境应激的报道。此外，结核分枝杆菌ArfA (Rv0899)能够与肽聚糖结合并有助于该菌在酸性应激条件下的生长^[39]。结核分枝杆菌细胞锚定酯酶Rv1288能够结合肽聚糖，在营养缺陷条件下表达上调，且有助于该菌在营养缺陷下的生长；耻垢分枝杆菌中的该同源蛋白还与细胞壁脂质含量、耐药性及细胞内存活有关^[40]。因此，LPXTG基序锚定蛋白除了公认的参与多种革兰氏阳性菌的宿主感染过程之外，越来越多的研究明确其与环境适应之间的关系。

综上所述，本研究通过构建lmo0175的缺失株和回补株明确了Lmo0175在单核增生李斯特氏菌抗氧化应激和宿主感染中的生物学功能。这一发现为进一步解析Lmo0175介导抗氧化应激和宿主感染的机制及明确LPXTG基序锚定蛋白的功能奠定了重要基础。

基金

收起

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

NICAOGÁIN

, O’BYRNE

. The role of stress and stress adaptations in determining the fate of the bacterial pathogen Listeria monocytogenes in the food chain[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1865.

[2]

European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control (EFSA and ECDC). The European union one health 2018 zoonoses report[J]. EFSA Journal, 2019, 17(12): e05926.

[3]

BALLOM

, TSAI

, TAYLOR

, TANG

, ZHU

. Stability of Listeria monocytogenes in non-fat dry milk powder during isothermal treatment and storage[J]. Food Microbiology, 2020, 87: 103376.

[4]

DROLIA

, TENGURIA

, DURKES

, TURNER

, BHUNIA

. Listeria adhesion protein induces intestinal epithelial barrier dysfunction for bacterial translocation[J]. Cell Host & Microbe, 2018, 23(4): 470-484.e7.

[5]

WALES

, DAVIES

. Co-selection of resistance to antibiotics, biocides and heavy metals, and its relevance to foodborne pathogens[J]. Antibiotics, 2015, 4(4): 567-604.

[6]

EZRATY

, GENNARIS

, BARRAS

, COLLET

. Oxidative stress, protein damage and repair in bacteria[J]. Nature Reviews Microbiology, 2017, 15(7): 385-396.

[7]

IMLAY

. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(7): 443-454.

[8]

WHITELEY

, RUHLAND

, EDROZO

, RENIERE

. A redox-responsive transcription factor is critical for pathogenesis and aerobic growth of Listeria monocytogenes [J]. Infection and Immunity, 2017, 85(5): e00978-16.

[9]

SIBANDA

, BUYS

. Listeria monocytogenes pathogenesis: the role of stress adaptation[J]. Microorganisms, 2022, 10(8): 1522.

[10]

CHEN

, NGUYEN

, MITCHELL

, MARGOLIS

, MA

, PORTNOY

. The listeriolysin O PEST-like sequence co-opts AP-2-mediated endocytosis to prevent plasma membrane damage during Listeria infection[J]. Cell Host & Microbe, 2018, 23(6): 786-795.e5.

[11]

LINGNAU

, DOMANN

, HUDEL

, BOCK

, NICHTERLEIN

, WEHLAND

, CHAKRABORTY

. Expression of the Listeria monocytogenes EGD inlA and inlB genes, whose products mediate bacterial entry into tissue culture cell lines, by PrfA-dependent and-independent mechanisms[J]. Infection and Immunity, 1995, 63(10): 3896-3903.

[12]

BIERNE

, MAZMANIAN

, TROST

, GRACIELA PUCCIARELLI

, LIU

, DEHOUX

, JÄNSCH

, PORTILLO

, SCHNEEWIND

, COSSART

, CONSORTIUM

ELG

. Inactivation of the srtA gene in Listeria monocytogenes inhibits anchoring of surface proteins and affects virulence[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(4): 869-881.

[13]

GHOSH

, HALVORSEN

, AMMENDOLIA

, MOR-VAKNIN

, O’RIORDAN

MXD

, BRUMELL

, MARKOVITZ

, HIGGINS

. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin[J]. mBio, 2018, 9(1): e00160-18.

[14]

DORTET

, MOSTOWY

, COSSART

. Listeria and autophagy escape: involvement of InlK, an internalin-like protein[J]. Autophagy, 2012, 8(1): 132-134.

[15]

SABET

, TOLEDO-ARANA

, PERSONNIC

, LECUIT

, DUBRAC

, POUPEL

, GOUIN

, NAHORI

, COSSART

, BIERNE

. The Listeria monocytogenes virulence factor InlJ is specifically expressed in vivo and behaves as an adhesin[J]. Infection and Immunity, 2008, 76(4): 1368-1378.

[16]

McGUCKIN

, LINDÉN

, SUTTON

, FLORIN

. Mucin dynamics and enteric pathogens[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011, 9(4): 265-278.

[17]

NEVES

, JOB V, DORTET

, COSSART

, DESSEN

. Structure of internalin InlK from the human pathogen Listeria monocytogenes [J]. Journal of Molecular Biology, 2013, 425(22): 4520-4529.

[18]

SMITH

, YOUNGMAN

. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specific expression of the Bacillus subtilis spollM gene[J]. Biochimie, 1992, 74(7/8): 705-711.

[19]

MONK

, GAHAN

CGM

, HILL

. Tools for functional postgenomic analysis of Listeria monocytogenes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(13): 3921-3934.

[20]

CHENG

, HAN

, XU

, SUN

, LI

, HAN

, CHEN

, SONG

. YjbH mediates the oxidative stress response and infection by regulating SpxA1 and the phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system (PTS) in Listeria monocytogenes [J]. Gut Microbes, 2021, 13(1): 1-19.

[21]

林柯辰, 李豪杰, 赵秀玲, 周思, 廖俊慧, 王子念, 金戈旋, 朱富鑫, 徐加利, 孙静, 宋厚辉, 邓思敏, 程昌勇. 单增李斯特菌LPXTG蛋白Lmo0880在感染致病中的作用[J]. 微生物学报, 2024, 64(3): 893-906.

LIN

, LI

, ZHAO

, ZHOU

, LIAO

, WANG

, JIN

, ZHU

, XU

, SUN

, SONG

, DENG

, CHENG

. Role of LPXTG-anchored protein Lmo0880 in Listeria monocytogenes infection[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(3): 893-906 (in Chinese).

[22]

MATHIPA

, THANTSHA

, BHUNIA

. Lactobacillus casei expressing internalins A and B reduces Listeria monocytogenes interaction with Caco-2 cells in vitro [J]. Microbial Biotechnology, 2019, 12(4): 715-729.

[23]

XIA

, LUO

, CHEN

, LIU

, WANG

, DENG

, XU

, HAN

, SUN

, JIANG

, SONG

, CHENG

. Characterization of a DsbA family protein reveals its crucial role in oxidative stress tolerance of Listeria monocytogenes [J]. Microbiology Spectrum, 2023, 11(6): e0306023.

[24]

CHENG

, CHEN

, SUN

, XU

, DENG

, XIA

, HAN

, ZHANG

, WANG

, LEI

, ZHAI

, WU

, FANG

, SONG

. The MICOS complex subunit Mic60 is hijacked by intracellular bacteria to manipulate mitochondrial dynamics and promote bacterial pathogenicity[J]. Advanced Science, 2024, 11(46): e2406760.

[25]

LECUIT

. Listeria monocytogenes, a model in infection biology[J]. Cellular Microbiology, 2020, 22(4): e13186.

[26]

THOMAS

, GOVENDER

, McCARTHY

, ERASMUS

, DOYLE

, ALLAM

, ISMAIL

, RAMALWA

, SEKWADI

, NTSHOE

, SHONHIWA

, ESSEL

, TAU N, SMOUSE

, NGOMANE

, DISENYENG

, PAGE

, GOVENDER

, DUSE

, STEWART

, et al. Outbreak of listeriosis in South Africa associated with processed meat[J]. New England Journal of Medicine, 2020, 382(7): 632-643.

[27]

MYERS

, TSANG

, SWANSON

. Localized reactive oxygen and nitrogen intermediates inhibit escape of Listeria monocytogenes from vacuoles in activated macrophages[J]. Journal of Immunology, 2003, 171(10): 5447-5453.

[28]

VADIA

, ARNETT

, HAGHIGHAT

, WILSON-KUBALEK

, TWETEN

, SEVEAU

. The pore-forming toxin listeriolysin O mediates a novel entry pathway of L. monocytogenes into human hepatocytes[J]. PLoS Pathogens, 2011, 7(11): e1002356.

[29]

JONES

, PORTNOY

. Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O in place of listeriolysin O[J]. Infection and Immunity, 1994, 62(12): 5608-5613.

[30]

GEDDE

, HIGGINS

, TILNEY

, PORTNOY

. Role of listeriolysin O in cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes [J]. Infection and Immunity, 2000, 68(2): 999-1003.

[31]

TILNEY

, PORTNOY

. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes [J]. Journal of Cell Biology, 1989, 109(4 Pt 1): 1597-1608.

[32]

RENIERE

, WHITELEY

, PORTNOY

. An in vivo selection identifies Listeria monocytogenes genes required to sense the intracellular environment and activate virulence factor expression[J]. PLoS Pathogens, 2016, 12(7): e1005741.

[33]

RUHLAND

, RENIERE

. Sense and sensor ability: redox-responsive regulators in Listeria monocytogenes [J]. Current Opinion in Microbiology, 2019, 47: 20-25.

[34]

CESINGER

, SCHWARDT

, HALSEY

, THOMASON

, RENIERE

. Investigating the roles of Listeria monocytogenes peroxidases in growth and virulence[J]. Microbiology Spectrum, 2021, 9(1): e0044021.

[35]

SIEGEL

, REARDON

, TON-THAT

. Anchoring of LPXTG-like proteins to the Gram-positive cell wall envelope[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2017, 404: 159-175.

[36]

WANG

, MA

, SHEN

, FANG

, PEI

, LI

, ZHU

, SHU

, LI

, XUE

. Genes associated with desiccation stress in foodborne Staphylococcus aureus as revealed by transposon insertion mutagenesis[J]. Food Research International, 2023, 163: 112271.

[37]

ZHANG

, OU MJ, WU

, ZHENG

, ZHANG

, YU

, GUO

, ZHANG

, PAN

, WU

. Coupled effect of nutritional food molecules and Lactobacillus reuteri surface protein interaction on the bacterial gastrointestinal tolerance[J]. Foods, 2024, 13(22): 3685.

[38]

BALANDYTÉ

, BRODARD

, FREY

, OEVERMANN

, ABRIL

. Ruminant rhombencephalitis-associated Listeria monocytogenes alleles linked to a multilocus variable-number tandem-repeat analysis complex[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(23): 8325-8335.

[39]

YAO

, BARGHAVA

, KIM

, NIEDERWEIS

, MARASSI

. Molecular structure and peptidoglycan recognition of Mycobacterium tuberculosis ArfA (Rv0899)[J]. Journal of Molecular Biology, 2012, 416(2): 208-220.

[40]

MAAN

, KUMAR

, KAUR

. Rv1288, a two domain, cell wall anchored, nutrient stress inducible carboxyl-esterase of Mycobacterium tuberculosis, modulates cell wall lipid[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2018, 8: 421.

2025年第65卷第10期

PDF下载

167

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250203

接收时间：2025-03-16
首发时间：2025-11-03
出版时间：2025-09-04

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2025-03-16
录用日期：2025-03-25

基金

the College Students’ Innovative Entrepreneurial Training Program in Zhejiang Province in 2025

作者信息

²中国农业大学动物医学院，北京

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxb/CN/10.13343/j.cnki.wsxb.20250203

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT