微生物学报

代谢物 Metabolite	VIP	P value
甘油酸Glyceric acid (GA)	1.275 57	1.044 03	1.249 10	0.05
乳糖Lactose	1.233 39	1.251 95	1.239 97	0.05
半乳糖Galactose	1.035 96	-	-	0.05
异柠檬酸Isocitric acid	1.230 16	-	1.204 99	0.05
顺乌头酸cis-aconitic acid	-	1.297 92	1.208 94	0.05
葡萄糖酸Gluconic acid	-	-	1.098 68	0.05
腺苷5′-单磷酸Adenosine 5′-monophosphate (AMP)	1.181 32	1.133 22	1.217 46	0.05
3-磷酸甘油酸3-phosphoglyceric acid (3-PGA)	1.122 55	1.044 00	-	0.05
α-酮戊二酸2-ketoglutaric acid (α-KG)	1.274 38	1.298 10	1.217 49	0.05
葡萄糖-1-磷酸Glucose-1-phosphate (G-1-P)	1.080 08	1.210 83	1.088 54	0.05
果糖Fructose	1.165 38	1.220 86	-	0.05
延胡索酸Fumaric acid (FA)	1.210 31	1.280 28	1.171 28	0.05
丙酮酸Pyruvic acid (Pyru)	-	1.278 47	1.198 18	0.05
果糖-6-磷酸Fructose-6-phosphate	-	-	1.060 63	0.05
柠檬酸Citric acid (CA)	1.151 17	1.281 12	1.141 58	0.05
泛酸Pantothenic acid	-	-	1.058 21	0.05
硫辛酸Lipoic acid	1.262 62	-	1.248 14	0.05
γ-氨基丁酸Gamma-aminobutyric acid	1.100 94	-	1.075 22	0.05
核糖-5-磷酸Ribose-5-phosphate	-	1.206 29	1.180 75	0.05
丙氨酸Alanine (Ala)	1.084 34	1.074 28	1.138 98	0.05
l-天冬酰胺l-asparagine (Asn)	1.117 86	1.184 39	1.154 51	0.05
l-天冬氨酸l-aspartic acid (Asp)	1.091 34	-	1.118 61	0.05
l-瓜氨酸l-citrulline (Cit)	1.072 24	1.034 54	1.053 21	0.05
l-胱氨酸l-cystine (Cys)	-	1.088 59	-	0.05
l-谷氨酸l-clutamic acid (Glu)	1.041 11	1.059 08	-	0.05
l-甘氨酸l-glycine (Gly)	1.104 49	1.181 08	-	0.05
l-异亮氨酸l-isoleucine (Ile)	1.092 01	1.171 17	-	0.05
l-亮氨酸l-leucine (Leu)	1.104 83	1.169 53	-	0.05
l-谷氨酰胺l-glutamine (Gln)	1.013 02	-	-	0.05
鸟氨酸Ornithine (Orn)	1.089 45	-	1.093 04	0.05
l-赖氨酸l-lysine (Lys)	-	-	1.014 83	0.05
l-甲硫氨酸l-methionine (Met)	-	1.088 55	-	0.05
l-苯丙氨酸l-phenylalanine (Phe)	1.100 52	1.185 35	1.000 82	0.05
l-脯氨酸l-proline (Pro)	1.116 14	-	1.104 15	0.05
l-丝氨酸l-serine (Ser)	-	1.130 53	-	0.05
l-苏氨酸l-threonine (Thr)	1.029 69	1.175 88	1.037 14	0.05
l-色氨酸l-tryptophan (Trp)	-	1.081 23	-	0.05
l-酪氨酸l-tyrosine (Tyr)	1.006 72	1.106 14	-	0.05
l-缬氨酸l-valine (Val)	1.072 58	1.171 24	1.006 47	0.05

代谢物 Metabolite	VIP	P value
甘油酸Glyceric acid (GA)	1.275 57	1.044 03	1.249 10	0.05
乳糖Lactose	1.233 39	1.251 95	1.239 97	0.05
半乳糖Galactose	1.035 96	-	-	0.05
异柠檬酸Isocitric acid	1.230 16	-	1.204 99	0.05
顺乌头酸cis-aconitic acid	-	1.297 92	1.208 94	0.05
葡萄糖酸Gluconic acid	-	-	1.098 68	0.05
腺苷5′-单磷酸Adenosine 5′-monophosphate (AMP)	1.181 32	1.133 22	1.217 46	0.05
3-磷酸甘油酸3-phosphoglyceric acid (3-PGA)	1.122 55	1.044 00	-	0.05
α-酮戊二酸2-ketoglutaric acid (α-KG)	1.274 38	1.298 10	1.217 49	0.05
葡萄糖-1-磷酸Glucose-1-phosphate (G-1-P)	1.080 08	1.210 83	1.088 54	0.05
果糖Fructose	1.165 38	1.220 86	-	0.05
延胡索酸Fumaric acid (FA)	1.210 31	1.280 28	1.171 28	0.05
丙酮酸Pyruvic acid (Pyru)	-	1.278 47	1.198 18	0.05
果糖-6-磷酸Fructose-6-phosphate	-	-	1.060 63	0.05
柠檬酸Citric acid (CA)	1.151 17	1.281 12	1.141 58	0.05
泛酸Pantothenic acid	-	-	1.058 21	0.05
硫辛酸Lipoic acid	1.262 62	-	1.248 14	0.05
γ-氨基丁酸Gamma-aminobutyric acid	1.100 94	-	1.075 22	0.05
核糖-5-磷酸Ribose-5-phosphate	-	1.206 29	1.180 75	0.05
丙氨酸Alanine (Ala)	1.084 34	1.074 28	1.138 98	0.05
l-天冬酰胺l-asparagine (Asn)	1.117 86	1.184 39	1.154 51	0.05
l-天冬氨酸l-aspartic acid (Asp)	1.091 34	-	1.118 61	0.05
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l-谷氨酰胺l-glutamine (Gln)	1.013 02	-	-	0.05
鸟氨酸Ornithine (Orn)	1.089 45	-	1.093 04	0.05
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l-酪氨酸l-tyrosine (Tyr)	1.006 72	1.106 14	-	0.05
l-缬氨酸l-valine (Val)	1.072 58	1.171 24	1.006 47	0.05

靶向代谢组学分析添加天冬氨酸培养盐单胞菌时四氢嘧啶的代谢通路变化

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逯心玥 ¹ , 李昊鑫 ¹ , 张培霞 ¹ , 师博涵 ¹ , 李永臻 ¹ , 王嵘 ¹ , 朱德锐 ¹ , 韩睿 ²

微生物学报 | 研究报告 2025,65(10): 4621-4636

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微生物学报 | 研究报告 2025, 65(10): 4621-4636

靶向代谢组学分析添加天冬氨酸培养盐单胞菌时四氢嘧啶的代谢通路变化

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逯心玥¹, 李昊鑫¹, 张培霞¹, 师博涵¹, 李永臻¹, 王嵘¹, 朱德锐¹, 韩睿²

作者信息

¹青海大学医学院，基础医学研究中心，青海西宁

²青海大学农林科学院，蔬菜遗传与生理重点实验室，青海西宁

Targeted metabolomics reveals changes in metabolic pathways related to ectoine in Halomonas cultured with aspartate

Xinyue LU¹, Haoxin LI¹, Peixia ZHANG¹, Bohan SHI¹, Yongzhen LI¹, Rong WANG¹, Derui ZHU¹, Rui HAN²

Affiliations

¹Department of Basic Medical Sciences, Medical College, Qinghai University, Xining, Qinghai, China

²Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology, Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Qinghai University, Xining, Qinghai, China

出版时间: 2025-09-04 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250237

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摘要

收起

【目的】 添加9种不同氨基酸培养坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonas campaniensis) XH26，分析菌株的生长情况与胞内四氢嘧啶(ectoine)的积聚量差异，明确最适氨基酸前体对菌株XH26四氢嘧啶的合成代谢通路的影响。 【方法】 在最适盐浓度(1.5 mol/L)条件下，以9种氨基酸(l-谷氨酸钠、l-谷氨酰胺、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-组氨酸、l-色氨酸、l-甘氨酸、l-丝氨酸和l-赖氨酸)作为培养基的单一碳/氮源，设置氨基酸浓度梯度范围为20-50 mmol/L (间隔5 mmol/L)，筛选四氢嘧啶积聚量最高的最适氨基酸及其作用浓度。设置l-天冬氨酸低浓度组[low group (L), 20 mmol/L]、中浓度组[medium group (M), 35 mmol/L]和高浓度组[high group (H), 50 mmol/L]进行靶向代谢组学测序与分析。 【结果】 四氢嘧啶合成量随氨基酸浓度梯度先增加后降低，并在最适(30 mmol/L或35 mmol/L)浓度时达到最高。代谢组学分析显示，分别筛选出28个(L vs. M)、27个(L vs.H)和26个(H vs.M)显著差异代谢物，如甘油酸、乳糖、腺苷5′-单磷酸、α-酮戊二酸、葡萄糖-1-磷酸、延胡索酸、柠檬酸等。KEGG代谢通路富集分析发现l-丙氨酸、l-天冬氨酸和l-谷氨酸代谢通路是最显著的富集通路。 【结论】 靶向代谢组学技术分析细菌胞内差异代谢物发现，菌株XH26通过天冬氨酸-丙氨酸轴和精氨酸-脯氨酸代谢轴实现氮稳态与能量供应的再平衡。

关键词

坎帕尼亚盐单胞菌 / 靶向代谢组学 / 四氢嘧啶 / 能量代谢

Abstract

收起

[Objective] We systematically analyzed the growth and compared the ectoine accumulation of Halomonas campaniensis XH26 cultured with nine different amino acids, aiming to clarify the optimal amino acid for ectoine accumulation of strain XH26. [Methods] Under the optimal salt concentration of 1.5 mol/L, nine amino acids (l-monosodium glutamate, l-glutamine, l-aspartic acid, l-asparagine, l-histidine, l-tryptophan, l-glycine, l-serine, and l-lysine) were selected as the single carbon/nitrogen source of the culture medium and added within the concentration range of 20-50 mmol/L (interval of 5 mmol/L), on the basis of which the optimal concentration and optimal amino acid for ectoine accumulation were screened. l-aspartic acid was selected to culture the cells at low (L, 20 mmol/L), medium (M, 35 mmol/L), and high (H, 50 mmol/L) concentrations for targeted metabolomics sequencing and analysis. [Results] The amount of ectoine synthesis first increased and then decreased as the amino acid concentration increased and reached the highest at optimum concentration (30/35 mmol/L). Metabolomics analysis screened out 28 (L vs. M), 27 (L vs. H), and 26 (H vs. M) significantly differential metabolites, such as glyceric acid, lactose, adenosine 5′-monophosphate, α-ketoglutaric acid, glucose-1-phosphate, fumaric acid, and citric acid. KEGG metabolic pathway enrichment analysis showed that l-alanine, l-aspartic acid, and l-glutamate metabolic pathways were the most significantly enriched pathways. [Conclusion] Targeted metabolomics of differential metabolites of bacteria discovers that the strain achieves a rebalance between nitrogen homeostasis and energy supply through the aspartate-alanine axis and the arginine-proline metabolic axis.

Key words

Halomonas campaniensis / targeted metabolomics / ectoine / energy metabolism

引用本文

逯心玥, 李昊鑫, 张培霞, 师博涵, 李永臻, 王嵘, 朱德锐, 韩睿. 靶向代谢组学分析添加天冬氨酸培养盐单胞菌时四氢嘧啶的代谢通路变化. 微生物学报, 2025 , 65 (10) : 4621 -4636 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250237

Xinyue LU, Haoxin LI, Peixia ZHANG, Bohan SHI, Yongzhen LI, Rong WANG, Derui ZHU, Rui HAN. Targeted metabolomics reveals changes in metabolic pathways related to ectoine in Halomonas cultured with aspartate[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2025 , 65 (10) : 4621 -4636 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250237

正文

收起

目前，代谢组学(metabonomics/metabolomics)技术已广泛用于胞内各类化合物的关键代谢途径、代谢节点和代谢流调控分析，是合成生物学和系统代谢工程的研究热点^[1]。根据研究目的不同，代谢组学分为非靶向代谢组学(untargeted metabolomics, uTM)和靶向代谢组学(targeted metabolomics, TM) 2种。uTM化合物覆盖率高(几乎所有)，但准确度低、针对性较弱；而TM具有较高的数据准确性和可靠性，尤其适用于针对特定的代谢通路和代谢物^[2]。Ouyang等^[3]利用uTM技术分析眼虫藻(Euglena gracilis)和需钠弧菌(Vibrio natriegens)的共生分子机制，发现藻-菌共培养后细菌胞内代谢物显著增加，如甲基氨基甲酸、四氢嘧啶(ectoine)、胆碱、龙胆碱(gentianine)、4R-氨基戊酸、l-谷氨酸和l-缬氨酸等，表明藻-菌共培养系统具有互惠共生作用。Joghee等^[4]利用TM技术分析嗜盐细菌在盐胁迫条件下的显著差异代谢物(significantly differential metabolites, SDM)，结果显示在中等盐度条件(5% NaCl)下核苷酸及其衍生物[如腺嘌呤、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)]有所增加；而在高盐浓度(10% NaCl)时核苷酸、维生素、芳香族氨基酸(如l-苯丙氨酸、l-酪氨酸和l-色氨酸)和支链氨基酸(l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-缬氨酸)的含量水平有所下降。

四氢嘧啶是一类积聚于好氧耐盐/嗜盐微生物胞内的具有亲水性和两性离子特征的相容溶质有机化合物^[5]。其主要合成途径为：草酰乙酸→l-天冬氨酸→天冬氨酸-β-半缩醛→醛氨酸→草酰乙二氨基丁酸→N-γ-乙酰二氨基丁酸→四氢嘧啶^[6]。研究表明四氢嘧啶的生物合成与天冬氨酸(aspartate, Asp)和天冬氨酸半醛(l-aspartate-4-semialdehyde, ASA)代谢直接相关，同时与氨基酸及其衍生物[如l-谷氨酸(l-glutamate, Glu)、l-谷氨酰胺(l-glutamine, Gln)和l-天冬酰胺(l-asparagine, Asn)]以及TCA循环中的柠檬酸(citric acid)、苹果酸(malic acid)和草酰乙酸(oxaloacetic acid, OAA)等代谢物间接相关^[7-9]。然而，菌株XH26胞内差异代谢物是否与四氢嘧啶的代谢通路存在关联，四氢嘧啶特定代谢通路(如l-天冬氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸等)的动态变化以及氨基酸浓度梯度如何动态调控代谢通量分配及合成效率的机制仍不明确，有待深入探究。由于目标代谢物种类明确，且需要对差异代谢物进行高灵敏度和高准确度的定量比较，靶向代谢组学技术相较于非靶向代谢组学更能满足本研究对数据可靠性与生物学解释力的要求。因此，本研究以坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonas campaniensis) XH26菌株为研究对象，通过靶向代谢组学技术并结合多元统计分析与KEGG通路富集分析研究不同l-天冬氨酸浓度梯度条件下的代谢物差异，探究影响四氢嘧啶合成的关键差异代谢物及代谢应答机制，以期为构建高产四氢嘧啶的工程菌株奠定基础。

1 材料与方法

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1.1 菌株来源与培养条件

野生盐单胞菌株H. campaniensis sp. XH26 (CCTCC M2019776M)分离自小柴旦盐湖。菌株XH26培养基(g/L)^[10]：l-谷氨酸钠5.61，酶水解酪素7.50，NaCl 87.50 (最适盐浓度1.5 mol/L)，MgSO₄·7H₂O 24.65，柠檬酸钠3.00，无水CaCl₂ 0.20，KCl 55.88，酵母2.00。菌株接种量为1%，培养时间为48 h，pH 8.0，温度35 ℃。

1.2 主要试剂和仪器

分析纯l-谷氨酸钠和酶水解酪素，天津市永大化学试剂有限公司；分析纯NaCl和KCl，北京索莱宝科技有限公司；乙腈，赛默飞世尔科技公司；HPLC级四氢嘧啶标准品，Fluka公司；HPLC级甲醇，ThermoFisher Scientific公司。

微孔过滤器，天津亳津科技有限公司；冷冻研磨仪，上海万柏生物科技有限公司；色谱分析柱，Merck公司；紫外分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；高效液相色谱仪，Agilent公司；液相质谱联用仪，SCIEX公司；液相色谱柱，Waters公司。

1.3 菌株生长和四氢嘧啶检测

基于最适盐浓度(1.5 mol/L)条件下，分别以l-谷氨酸钠、l-谷氨酰胺、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-组氨酸、l-色氨酸、l-甘氨酸、l-丝氨酸和l-赖氨酸为培养基单一碳/氮源氨基酸，设置氨基酸浓度梯度范围为20-50 mmol/L (间隔5 mmol/L)。活化菌液(OD₆₀₀约为1.20)按1%的接种量分别转接至摇瓶内(n=3)，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，紫外分光光度计测定菌液光度密度值(OD₆₀₀)，并提取菌株胞内四氢嘧啶进行HPLC定量分析。HPLC检测条件：流动相乙腈/水=80/20 (体积比)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm，进样量5 µL。最后以培养时间(t)为横坐标，以OD₆₀₀值与四氢嘧啶产量为纵坐标，绘制菌株生长和四氢嘧啶产量的关系曲线。

1.4 制备代谢组学样本

l-天冬氨酸对菌株XH26胞内四氢嘧啶积聚量的促进效率最高，由此选择最低(20 mmol/L)、最适(35 mmol/L)以及最高(50 mmol/L)浓度梯度分别作为低浓度组[low group (L)]、中浓度组[medium group (M)]和高浓度组[high group (H)]进行靶向代谢组学分析。精确称取10 mg样本，加入一颗钢珠，加入500 μL 90%甲醇，冷冻研磨仪研磨6 min (-10 ℃、50 Hz)，4 ℃、14 000×g离心20 min，取上清液20 μL至1.5 mL离心管氮气吹干，加入50 μL 50%乙腈水溶液，涡旋1 min，然后瞬离5 s，加入30 μL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液(丹磺酰氯用15 mL离心管配制)和40 μL 0.5 mol/L Na₂CO₃-NH₄HCO₃缓冲液(用15 mL离心管配制)，封口并迅速涡旋1 min，然后瞬时离心5 s，恒温振荡器60 ℃、110 r/min反应30 min。反应完成后常温静置5 min，然后瞬离5 s，加入10 μL 0.25 mol/L NaOH溶液，涡旋1 min，然后瞬时离心5 s，再次恒温振荡器60 ℃、110 r/min反应10 min。反应完成后恢复至室温(静置5 min)，加入70 μL 10%甲酸溶液，涡旋1 min，4 ℃、14 000×g离心15 min，取上清液至进样小瓶，上机检测。

1.5 质谱检测与数据质控

采用LC-ESI-MS/MS对样品中的目标物进行定性定量检测。色谱条件：ExionLC AD system，柱温40 ℃，进样量2 μL。流动相A (0.1%甲酸水)，流动相B (0.1%甲酸甲醇)。质谱条件：SCIEX QTRAP 6500+，采用正模式检测，Curtain Gas (CUR)为35，Collision Gas (CAD)为Medium，IonSpray Voltage (IS)为+5 000，Temperature (TEM)为350，Ion Source Gas1 (GS1)为60，Ion Source Gas2 (GS2)为60。上机完成之后，LC-MS原始数据导入Progenesis QI (Waters 公司)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。采用R软件(v.1.6.2) ropls包进行主成分分析(principal components analysis, PCA)和正交最小偏二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)预处理后数据矩阵，并使用循环交互(n=7)评估模型的稳定性。利用OPLS-DA模型得到的变量权重值(variable importance in the projection, VIP)和Student’s t检验P值，VIP>1，P<0.05的代谢物为显著差异代谢物。利用KEGG (http://www.kegg.jp)进行差异代谢物通路注释。Python软件(v.3.11.3) scipy.stats包进行通路富集分析，并通过Fisher精确检验获得与实验处理最相关的生物学途径。

1.6 数据处理

利用Origin软件(v.8.6)和Adobe Illustrator (v.29.3.1)软件绘制实验图形，SPSS (v.27.0)软件中方差分析(analysis of variance, ANOVA)计算组间差异(显著性水平α设为0.05)。原始代谢数据经过偏差过滤、填补缺失值和归一化等处理，再利用MetaboAnalyst (v.6.0)对不同菌株样品之间的代谢物进行比较分析。

2 结果与分析

收起

2.1 添加9种不同氨基酸培养菌株XH26与胞内四氢嘧啶的积聚量分析

在最适盐度(1.5 mol/L)培养基中添加不同浓度的氨基酸(l-谷氨酸钠、l-谷氨酰胺、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-赖氨酸、l-色氨酸、l-甘氨酸、l-丝氨酸和l-组氨酸)，培养盐单胞菌菌株XH26 (48 h)，并检测菌株胞内四氢嘧啶的积聚量和生长曲线(图1)。结果显示，随着氨基酸浓度的增加，菌株XH26胞内四氢嘧啶的积聚量均呈先增加后减少的变化趋势。当Gln、Asp、Gly和Ser的浓度为20-35 mmol/L时菌株胞内的四氢嘧啶积聚量呈上升趋势，且在35 mmol/L时达到最大值，分别为0.58、0.64、0.54和0.58 g/L；随着氨基酸浓度的进一步增加菌株胞内的四氢嘧啶积聚量呈现下降趋势。当MSG、Asn、Lys、Trp和His的浓度为20-30 mmol/L时菌株胞内的四氢嘧啶积聚量呈上升趋势，且在30 mmol/L时达到最大值，分别为0.59、0.58、0.57、0.41和0.53 g/L；随着氨基酸浓度的进一步增加，菌株胞内的四氢嘧啶积聚量呈现下降趋势。菌株的生长趋势与四氢嘧啶含量的变化趋势相似，当氨基酸浓度过高时菌株的OD₆₀₀值和四氢嘧啶积聚量均同步下降。

2.2 HPLC检测四氢嘧啶的积聚量与代谢组样本靶向定量检测

抽提菌株XH26胞内四氢嘧啶，并利用HPLC分析四氢嘧啶积聚量的变化(图2A)。结果显示，四氢嘧啶的浓度在中浓度组(M)中达到最高，为0.61 g/L；低浓度组(L)和高浓度组(H)的浓度分别为0.50 g/L和0.48 g/L。统计分析表明，L组与H组之间存在一定差异(P<0.05)，而M组与H组及L组与M组之间差异显著(P<0.01)。采用LC-ESI-MS/MS法对46种已知氨基酸及其衍生物(图2B)以及中心碳循环代谢物(图2C)进行了准确定量，结果以浓度(ng/mg)表示，为后续代谢模式识别和机制探究提供了基础数据支持。在不同天冬氨酸浓度处理下，菌株胞内氨基酸及其衍生物和中心碳循环代谢物的含量发生了显著变化。M组中，l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-赖氨酸、丙氨酸、3-磷酸甘油酸等含量升高，l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、柠檬酸和α-酮戊二酸等含量降低；H组中，l-谷氨酰胺、乳糖、葡萄糖酸和α-酮戊二酸等含量升高，其余大部分代谢物均呈降低趋势。

2.3 不同天冬氨酸浓度培养下代谢组样本多元统计分析

为系统揭示不同天冬氨酸浓度培养下代谢物的整体变化趋势与样本间差异性，基于多元统计分析对氨基酸及其衍生物和中心碳代谢两组代谢物进行模式识别(图3)，进一步验证组间代谢差异的显著性与系统性特征。氨基酸及衍生物的PCA模型分析显示(图3A)，第一主成分揭示了37.4%的代谢物信息，第二主成分揭示了51.0%的代谢物信息，对照组与实验组成分在空间分布上相对独立。PLS-DA模型分析显示(图3C)，主要得分28.0%，正交得分71.7%。中心碳代谢的PCA模型分析显示(图3B)，第一主成分揭示了40.6%的代谢物信息，第二主成分揭示了32.3%的代谢物信息，对照组与实验组成分在空间分布上相对独立。PLS-DA模型分析显示(图3D)，主要得分99.7%，正交得分0.19%。对照组与实验组样本组内分布较为聚集，组间总体分布趋势相对独立，代谢物差异明显。R²和Q²的值超过0.4通常被视为可接受的阈值，氨基酸及衍生物模型(图3E)的Q²值为0.946，R²Y为0.481，Q²的回归线截距为-0.495 9<0；中心碳循环模型(图3F)的Q²值为0.479，R²Y为0.488，Q²的回归线截距为-0.241 9<0，表明此模型无过度拟合现象，具有较好的可预测性和拟合度，可准确地描述数据。

2.4 筛选差异代谢物与聚类分析

为筛选出与四氢嘧啶积聚密切相关的关键代谢物，基于OPLS-DA模型筛选显著差异代谢物，并通过聚类分析比较不同组间代谢物上表达模式。结果显示，在3个比较组中分别筛选出28个(L vs. M)、27个(L vs. H)和26个(H vs. M)显著差异代谢物(VIP>1, P<0.05，表1)。甘油酸、乳糖、腺苷5′-单磷酸、α-酮戊二酸、葡萄糖-1-磷酸、延胡索酸、柠檬酸、丙氨酸(alanine, Ala)、l-天冬酰胺(l-asparagine)、l-瓜氨酸(l-citrulline)、l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)、l-苏氨酸(l-threonine)和l-缬氨酸(l-valine)是共同差异代谢物。在中浓度组中甘油酸、腺苷5′-单磷酸、l-天冬氨酸(l-aspartic acid)、l-天冬酰胺、丙氨酸和硫辛酸(lipoic acid)等上调。

利用Origin软件对不同天冬氨酸浓度组(L、M、H)的代谢物进行层次聚类分析(hierarchical cluster analysis，图4)。结果显示，在L组中葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸、l-酪氨酸、l-谷氨酸以及甲硫氨酸等显著上调；在M组中l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-赖氨酸、丙氨酸以及l-脯氨酸等显著上调；在H组中，仅甘油酸和丙酮酸显著上调。整体来看代谢物表达在不同组间呈现明显差异，部分代谢物在中浓度组显著上调(红色区域)，而在高浓度组和低浓度组中表现为下调(蓝色区域)。此外，一些代谢物在低浓度组和高浓度组中具有相似的表达模式，而中浓度组的代谢特征较为独特，表现出与其他2组不同的聚类趋势。

2.5 KEGG富集分析差异代谢物

为进一步解析差异代谢物在代谢网络中的生物学功能，利用MetaboAnalyst平台进行KEGG差异代谢物的富集分析，确定主要受影响的代谢途径，并绘制各比较组的气泡图(前25个，图5)。结果显示，在L vs. M比较组中与菌株XH26胞内代谢相关的代谢物主要富集于精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)、乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、TCA循环(TCA cycle)及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis)等通路。在L vs. H比较组中主要富集于乙醛酸和二羧酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、TCA循环和精氨酸生物合成等通路。在H vs. M比较组中主要富集于TCA循环、精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)、精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)和泛酸和辅酶A的生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)。在3个比较组中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)通路均为最显著的富集通路。

3 讨论与结论

收起

3.1 氨基酸浓度梯度对四氢嘧啶合成的双相调控机制

氨基酸按其侧链R基团的结构和理化性质不同分为4类：非极性疏水性氨基酸、极性中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸^[11]。Zhao等^[12]在构建大肠杆菌基因工程菌时以天冬氨酸为碳源或氮源底物进行补料发酵，结果显示相比对照菌株四氢嘧啶的总积累量提高了3.1%。本研究中添加的9种氨基酸包括酸性氨基酸(MSG和Asp)、极性中性氨基酸(Gln、Asn、Try和Ser)、碱性氨基酸(His和Lys)和非极性疏水性氨基酸(Gly)。菌株XH26经9种氨基酸培养后，以Asp培养后的四氢嘧啶积聚量最高(因其作为直接前体，路径最短且无代谢分流)，其次是MSG (经TCA循环转化为α-KG后生成l-天冬氨酸^[13])、Asn [经天冬酰胺酶(asparaginase, ASNase)水解为l-天冬氨酸和氨，但水解步骤引入轻微延迟^[14]]、Ser和Gln (需多步碳/氮流重定向或竞争氮源)、Lys和Gly (因降解路径冗长或一碳代谢竞争导致前体供应不足)、His和Try [His和Try则因碳骨架不适配或产生毒性中间体(如犬尿氨酸)严重抑制合成效率^[15-16]]。当氨基酸浓度达到最适(30 mmol/L或35 mmol/L)浓度时四氢嘧啶积聚量达到峰值，当超过最适浓度时又呈现下降趋势，表明四氢嘧啶随氨基酸浓度变化呈现“先增后减”的双相趋势，这一现象与代谢流的动态重分配密切相关^[17]。过量氨基酸可能通过以下机制抑制合成：其一是反馈抑制，高浓度Gln通过mTOR通路抑制GS活性，减少Glu生成，限制四氢嘧啶前体供应^[18]；其二是代谢分流，Asp通过天冬氨酸激酶(aspartokinase, AspK)促进Lys合成，竞争性消耗OAA，削弱TCA循环对四氢嘧啶的碳骨架支持^[19-20]；其三是氮毒性，氨积累抑制谷氨酸脱氢酶(glutamic dehydrogenase, GDH)，阻断α-KG的还原胺化^[21-22]。尽管Gln、Ser、MSG、Asn、Lys等氨基酸在最适浓度下的四氢嘧啶积聚量与Asp数值接近，但其对合成代谢网络的影响程度并不相当。Asp作为四氢嘧啶合成的直接前体，不仅在路径结构上具有最短合成距离，更在代谢流调控中处于核心节点，其引发的丙氨酸-天冬氨酸轴重构与能量代谢联动强于其他氨基酸。相比之下，Gln、Ser等需经多步转化进入通路，调控作用分散，系统响应范围有限。因此即使部分氨基酸在产量上略趋接近，但在代谢路径主导性与系统调控强度上Asp的影响更具主导性与持续性。

3.2 添加天冬氨酸培养对XH26菌株糖代谢和TCA循环的影响

细菌常通过动态调控能量代谢和TCA循环响应外界渗透压、碳/氮源失衡等环境胁迫^[23]。如Pastor等^[24]研究伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的渗透应激机制时发现，其通过天冬氨酸代谢重编程增强四氢嘧啶合成，同时抑制TCA循环以优先分配碳流至相容性溶质。Rensing等^[25]研究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在铜胁迫下的代谢适应时发现，其通过抑制TCA循环(α-KG和CA下调)并激活谷胱甘肽合成通路，以螯合金属离子并缓解氧化损伤。在本研究中，中浓度天冬氨酸(35 mmol/L)胁迫下TCA循环通路受到抑制(CA、α-KG和FA下调)，菌株处于能量代谢失衡和氮代谢紊乱的状态^[26]。α-KG的短缺抑制Glu合成(α-KG+氨基酸→Glu)，导致Glu与Gln下调。为缓解氮源匮乏，OAA经天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)转化为Asp，进一步生成l-天冬酰胺储存氨基(图6)^[27]。这一过程不仅补偿氮代谢需求，还为四氢嘧啶合成提供了前体。此外，糖酵解增强(3-PGA、Pyru上调)产生的Pyru通过天冬氨酸-丙氨酸循环，在丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)作用下转化为Ala，同时消耗Glu生成α-KG (Pyru+Glu→Ala+α-KG)^[28-29]。此循环虽然导致了Glu的消耗增多，但为菌株提供了可溶性氮载体以支持氮转运。由于TCA循环通路受到抑制，ATP合成减少，而腺苷5′-单磷酸(AMP上调)积累激活AMPK通路，促进糖酵解(葡萄糖下调，Pyru上调)与脂肪酸氧化，从而恢复能量稳态^[30]。硫辛酸作为丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex, PDH)的辅因子缓解了TCA循环通路阻滞，同时其抗氧化功能协同四氢嘧啶抵抗代谢压力诱导的活性氧(reactive oxygen species, ROS)损伤^[31]。代谢网络通过以上策略实现动态平衡。M组通过分流碳/氮流至天冬氨酸-丙氨酸轴，实现氮稳态与能量供应的再平衡，同时启动相容性溶质合成以增强胁迫耐受性，这一阶段代表菌株的代偿期(compensatory stage)^[32]。

当l-天冬氨酸浓度达到50 mmol/L时代谢代偿机制突破阈值进入失代偿期(decompensation)^[32]。为缓解严重受阻的TCA循环(α-KG、CA、FA持续下调)，Gln经谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)水解为Glu，再经谷氨酸脱氢酶(glutamic dehydrogenase, GLUD)生成α-KG^[27]。这一过程虽然短暂回补了TCA循环，但由于Gln的过度消耗导致氮代谢全面紊乱(Gly、Ser和支链氨基酸等下调)。Gln分解产生的氨需要通过尿素循环并消耗Asp与l-精氨酸转化为尿素解毒，导致天冬氨酸相关代谢通路(Asp下调、Asn下调)彻底崩溃^[33]。葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸的持续减少提示碳流无法有效进入糖酵解或磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)，NADPH/ATP合成严重受限。支链氨基酸(l-异亮氨酸和l-缬氨酸)与芳香族氨基酸(l-苯丙氨酸)含量降低，表明蛋白质合成与分解代谢失衡^[34]，进入“代谢僵局”。H组中氮代谢网络的不可逆损伤标志菌株从代偿适应转向代谢崩溃^[32]。除Asp外，Gln、Ser、Asn、MSG与Lys等氨基酸虽然并非直接前体，但通过多种途径支持了天冬氨酸-丙氨酸代谢轴的动态平衡。其中，Gln通过谷氨酸合成途径供给Glu，Ser通过一碳代谢调节氮流分配，Asn水解产生Asp，MSG经TCA循环生成α-酮戊二酸进一步促进Glu合成，Lys则通过反馈调控AspK影响Asp碳流(图6)。上述代谢物和通路协同作用强化了丙氨酸转氨循环(Pyru+Glu→Ala+α-KG)的活性，提升了天冬氨酸-丙氨酸轴的碳氮流动性，从而为四氢嘧啶合成提供了持续而稳定的碳源和氮源支持。

3.3 精氨酸-脯氨酸代谢轴对氮源分配的全局调控

氮代谢网络作为细胞应对环境胁迫的核心枢纽，其动态调控不仅依赖关键代谢通路的局部适应，还需通过全局协同机制实现资源分配与稳态维持^[35]。例如，Jensen等^[36]研究谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的氨胁迫响应机制发现，通过激活精氨酸生物合成通路(argB/argC基因上调)增强尿素循环通量，将过量氨转化为精氨酸并进一步生成l-脯氨酸，同时抑制谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)以减少氮同化负担。联合KEGG通路分析显示，l-精氨酸通过精氨酸脱亚氨酶(arginine deiminase, ADI)分解为l-瓜氨酸和氨，瓜氨酸通过鸟氨酸转氨酶(ornithine transaminase, OTA)生成谷氨酸半醛，为四氢嘧啶提供直接前体；氨通过谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合酶(GS-GOGAT)循环整合到谷氨酸代谢中，直接参与四氢嘧啶合成^[37]。在本研究中M组由于TCA循环通路受到抑制导致Glu合成受限，氨积累激活尿素循环，继而l-精氨酸(尿素循环的核心)通过精氨酸酶(arginase, Arg)催化生成鸟氨酸和尿素，直接参与氨解毒^[37]。此外，Glu在谷氨酸激酶(glutamate kinase, GK)和吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)催化下生成脯氨酸，作为相容性溶质抵抗渗透压应激(与四氢嘧啶协同)；脯氨酸-吡咯啉-5-羧酸循环过度消耗NADPH/NADH平衡氧化还原状态，缓解TCA循环抑制导致的NADH/NAD⁺失衡^[38]。在高浓度胁迫下尿素循环关键中间体(如l-精氨酸、l-鸟氨酸)可能因合成酶活性抑制或前体耗竭(Asp下调)而减少，导致氨无法有效排出，支链氨基酸(l-异亮氨酸和l-缬氨酸)的下调表明氨毒性加剧。Glu的严重缺乏切断了脯氨酸合成路径，导致l-脯氨酸水平下降，削弱其渗透保护与抗氧化功能^[39]；同时，氧化应激可能激活脯氨酸氧化酶(proline oxidase, POX)，将l-脯氨酸降解为吡咯啉-5-羧酸并生成ROS，进一步放大氧化损伤^[40]。这种氮代谢网络的动态平衡确保了在盐胁迫下细胞既能维持基础氮代谢稳态，又能优先将资源分配给渗透保护剂的生物合成。Gln、Asn、Lys和Ser等氨基酸同样在代谢网络中发挥了重要作用。如Gln可通过GLS水解生成Glu，继而经GK和P5CS催化合成l-脯氨酸，支持细胞在高渗胁迫下的渗透保护；Asn则通过Asp供给进一步参与尿素循环，与Arg及Orn代谢关联促进氨的排泄与氮稳态维持；Lys作为Asp代谢的分支产物可能通过竞争性抑制AspK，影响Arg的生物合成通量，从而间接调节尿素循环及氨解毒速率；Ser和Gly则通过调节一碳单位代谢为氮循环提供还原力支持。这些协同效应不仅有助于缓解氮毒性和氧化压力，还为四氢嘧啶合成提供了稳定的代谢环境。

基金

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国家自然科学基金(32260019)
青海中央引导地方科技发展资金(2024ZY015)

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文献

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. Proline modulates the intracellular redox environment and protects mammalian cells against oxidative stress[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2008, 44(4): 671-681.

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, LIU

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. The proline regulatory axis and cancer[J]. Frontiers in Oncology, 2012, 2: 60.

2025年第65卷第10期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20250237

接收时间：2025-03-24
首发时间：2025-11-03
出版时间：2025-09-04

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收稿日期：2025-03-24
录用日期：2025-04-29

基金

the National Natural Science Foundation of China(32260019)

国家自然科学基金(32260019)

the Qinghai Central Government Guide Local Science and Technology Development Fund(2024ZY015)

青海中央引导地方科技发展资金(2024ZY015)

作者信息

¹青海大学医学院，基础医学研究中心，青海西宁

²青海大学农林科学院，蔬菜遗传与生理重点实验室，青海西宁

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

代谢物 Metabolite	VIP	P value
甘油酸Glyceric acid (GA)	1.275 57	1.044 03	1.249 10	0.05
乳糖Lactose	1.233 39	1.251 95	1.239 97	0.05
半乳糖Galactose	1.035 96	-	-	0.05
异柠檬酸Isocitric acid	1.230 16	-	1.204 99	0.05
顺乌头酸cis-aconitic acid	-	1.297 92	1.208 94	0.05
葡萄糖酸Gluconic acid	-	-	1.098 68	0.05
腺苷5′-单磷酸Adenosine 5′-monophosphate (AMP)	1.181 32	1.133 22	1.217 46	0.05
3-磷酸甘油酸3-phosphoglyceric acid (3-PGA)	1.122 55	1.044 00	-	0.05
α-酮戊二酸2-ketoglutaric acid (α-KG)	1.274 38	1.298 10	1.217 49	0.05
葡萄糖-1-磷酸Glucose-1-phosphate (G-1-P)	1.080 08	1.210 83	1.088 54	0.05
果糖Fructose	1.165 38	1.220 86	-	0.05
延胡索酸Fumaric acid (FA)	1.210 31	1.280 28	1.171 28	0.05
丙酮酸Pyruvic acid (Pyru)	-	1.278 47	1.198 18	0.05
果糖-6-磷酸Fructose-6-phosphate	-	-	1.060 63	0.05
柠檬酸Citric acid (CA)	1.151 17	1.281 12	1.141 58	0.05
泛酸Pantothenic acid	-	-	1.058 21	0.05
硫辛酸Lipoic acid	1.262 62	-	1.248 14	0.05
γ-氨基丁酸Gamma-aminobutyric acid	1.100 94	-	1.075 22	0.05
核糖-5-磷酸Ribose-5-phosphate	-	1.206 29	1.180 75	0.05
丙氨酸Alanine (Ala)	1.084 34	1.074 28	1.138 98	0.05
l-天冬酰胺l-asparagine (Asn)	1.117 86	1.184 39	1.154 51	0.05
l-天冬氨酸l-aspartic acid (Asp)	1.091 34	-	1.118 61	0.05
l-瓜氨酸l-citrulline (Cit)	1.072 24	1.034 54	1.053 21	0.05
l-胱氨酸l-cystine (Cys)	-	1.088 59	-	0.05
l-谷氨酸l-clutamic acid (Glu)	1.041 11	1.059 08	-	0.05
l-甘氨酸l-glycine (Gly)	1.104 49	1.181 08	-	0.05
l-异亮氨酸l-isoleucine (Ile)	1.092 01	1.171 17	-	0.05
l-亮氨酸l-leucine (Leu)	1.104 83	1.169 53	-	0.05
l-谷氨酰胺l-glutamine (Gln)	1.013 02	-	-	0.05
鸟氨酸Ornithine (Orn)	1.089 45	-	1.093 04	0.05
l-赖氨酸l-lysine (Lys)	-	-	1.014 83	0.05
l-甲硫氨酸l-methionine (Met)	-	1.088 55	-	0.05
l-苯丙氨酸l-phenylalanine (Phe)	1.100 52	1.185 35	1.000 82	0.05
l-脯氨酸l-proline (Pro)	1.116 14	-	1.104 15	0.05
l-丝氨酸l-serine (Ser)	-	1.130 53	-	0.05
l-苏氨酸l-threonine (Thr)	1.029 69	1.175 88	1.037 14	0.05
l-色氨酸l-tryptophan (Trp)	-	1.081 23	-	0.05
l-酪氨酸l-tyrosine (Tyr)	1.006 72	1.106 14	-	0.05
l-缬氨酸l-valine (Val)	1.072 58	1.171 24	1.006 47	0.05

代谢物

Metabolite

VIP

P value

L vs. M (A)

L vs. H (B)

H vs. M (C)

甘油酸Glyceric acid (GA)

1.275 57

1.044 03

1.249 10

0.05

乳糖Lactose

1.233 39

1.251 95

1.239 97

0.05

半乳糖Galactose

1.035 96

0.05

异柠檬酸Isocitric acid

1.230 16

1.204 99

0.05

顺乌头酸cis-aconitic acid

1.297 92

1.208 94

0.05

葡萄糖酸Gluconic acid

1.098 68

0.05

腺苷5′-单磷酸Adenosine 5′-monophosphate (AMP)

1.181 32

1.133 22

1.217 46

0.05

3-磷酸甘油酸3-phosphoglyceric acid (3-PGA)

1.122 55

1.044 00

0.05

α-酮戊二酸2-ketoglutaric acid (α-KG)

1.274 38

1.298 10

1.217 49

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葡萄糖-1-磷酸Glucose-1-phosphate (G-1-P)

1.080 08

1.210 83

1.088 54

0.05

果糖Fructose

1.165 38

1.220 86

0.05

延胡索酸Fumaric acid (FA)

1.210 31

1.280 28

1.171 28

0.05

丙酮酸Pyruvic acid (Pyru)

1.278 47

1.198 18

0.05

果糖-6-磷酸Fructose-6-phosphate

1.060 63

0.05

柠檬酸Citric acid (CA)

1.151 17

1.281 12

1.141 58

0.05

泛酸Pantothenic acid

1.058 21

0.05

硫辛酸Lipoic acid

1.262 62

1.248 14

0.05

γ-氨基丁酸Gamma-aminobutyric acid

1.100 94

1.075 22

0.05

核糖-5-磷酸Ribose-5-phosphate

1.206 29

1.180 75

0.05

丙氨酸Alanine (Ala)

1.084 34

1.074 28

1.138 98

0.05

l-天冬酰胺l-asparagine (Asn)

1.117 86

1.184 39

1.154 51

0.05

l-天冬氨酸l-aspartic acid (Asp)

1.091 34

1.118 61

0.05

l-瓜氨酸l-citrulline (Cit)

1.072 24

1.034 54

1.053 21

0.05

l-胱氨酸l-cystine (Cys)

1.088 59

0.05

l-谷氨酸l-clutamic acid (Glu)

1.041 11

1.059 08

0.05

l-甘氨酸l-glycine (Gly)

1.104 49

1.181 08

0.05

l-异亮氨酸l-isoleucine (Ile)

1.092 01

1.171 17

0.05

l-亮氨酸l-leucine (Leu)

1.104 83

1.169 53

0.05

l-谷氨酰胺l-glutamine (Gln)

1.013 02

0.05

鸟氨酸Ornithine (Orn)

1.089 45

1.093 04

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l-赖氨酸l-lysine (Lys)

1.014 83

0.05

l-甲硫氨酸l-methionine (Met)

1.088 55

0.05

l-苯丙氨酸l-phenylalanine (Phe)

1.100 52

1.185 35

1.000 82

0.05

l-脯氨酸l-proline (Pro)

1.116 14

1.104 15

0.05

l-丝氨酸l-serine (Ser)

1.130 53

0.05

l-苏氨酸l-threonine (Thr)

1.029 69

1.175 88

1.037 14

0.05

l-色氨酸l-tryptophan (Trp)

1.081 23

0.05

l-酪氨酸l-tyrosine (Tyr)

1.006 72

1.106 14

0.05

l-缬氨酸l-valine (Val)

1.072 58

1.171 24

1.006 47

0.05