微生物学报

Primer names	Sequences (5′→3′)
Nsp8	Forward: CGCGGATCCGCCACCATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGGTGGCTTCTACCTACGTGGGC
	Reverse: CGGCTCGAGTCACTGCAGCTTCACGATCCTCTC
HSPA8	Forward: CGCGGATCCGCCACCATGGCAGCACTAACTGCAGCATTT
	Reverse: CGGCTCGAGTCAGGCATAGTCAGGCACATCGTAGGGGTAGTCCACTTCTTCGATGGTAGG
PEDV N	Forward: ACTACCTCGGAACAGGACCTCA
	Reverse: AGACGCCTTTCTGACACCCA
GAPDH	Forward: ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA
	Reverse: GATCGAGTTGGGGCTGTGACT

Primer names	Sequences (5′→3′)
Nsp8	Forward: CGCGGATCCGCCACCATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGGTGGCTTCTACCTACGTGGGC
	Reverse: CGGCTCGAGTCACTGCAGCTTCACGATCCTCTC
HSPA8	Forward: CGCGGATCCGCCACCATGGCAGCACTAACTGCAGCATTT
	Reverse: CGGCTCGAGTCAGGCATAGTCAGGCACATCGTAGGGGTAGTCCACTTCTTCGATGGTAGG
PEDV N	Forward: ACTACCTCGGAACAGGACCTCA
	Reverse: AGACGCCTTTCTGACACCCA
GAPDH	Forward: ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA
	Reverse: GATCGAGTTGGGGCTGTGACT

Name	Sense (5′→3′)	Antisense (5′→3′)
siRNA-1	CGAUGAGGCUGUUGCUUAUTT	AUAAGCAACAGCCUCAUCGTT
siRNA-2	GGAAAGGAGAACAAGAUUATT	UAAUCUUGUUCUCCUUUCCTT
siRNA-3	GGUAUGUUUCUGUACUGUATT	UACAGUACAGAAACAUACCTT

Name	Sense (5′→3′)	Antisense (5′→3′)
siRNA-1	CGAUGAGGCUGUUGCUUAUTT	AUAAGCAACAGCCUCAUCGTT
siRNA-2	GGAAAGGAGAACAAGAUUATT	UAAUCUUGUUCUCCUUUCCTT
siRNA-3	GGUAUGUUUCUGUACUGUATT	UACAGUACAGAAACAUACCTT

Protein ID	Gene name	Unique peptide	Coverage (%)	Mass (Da)	Score
A0A286ZPN4	HSPA8	2	12	68 190	79
A0A4X1V0Q4	TFAP2D	2	1	50 147	34
A0A286ZJK2	HNRNPM	5	6	72 326	28

Protein ID	Gene name	Unique peptide	Coverage (%)	Mass (Da)	Score
A0A286ZPN4	HSPA8	2	12	68 190	79
A0A4X1V0Q4	TFAP2D	2	1	50 147	34
A0A286ZJK2	HNRNPM	5	6	72 326	28

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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涂赟 ¹ , 于瑞明 ¹ , 张莉萍 ² , 王永录 ² , 潘丽 ² , 刘霞 ¹ , 杜晓华 ¹^,^* , 刘新生 ²^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(10): 3932-3944

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(10): 3932-3944

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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涂赟¹, 于瑞明¹, 张莉萍², 王永录², 潘丽², 刘霞¹, 杜晓华¹^,^*, 刘新生²^,^*

作者信息

1 甘肃农业大学动物医学院, 甘肃兰州 730070

2 中国农业科学院兰州兽医研究所, 动物疫病防控全国重点实验室, 甘肃兰州 730046

Screening and identification of host proteins interacting with Nsp8 of porcine epidemic diarrhea virus

Yun TU¹, Ruiming YU¹, Liping ZHANG², Yonglu WANG², Li PAN², Xia LIU¹, Xiaohua DU¹^,^*, Xinsheng LIU²^,^*

Affiliations

1 College of Animal Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

2 State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China

出版时间: 2024-06-18 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240237

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摘要

收起

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒，PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失，目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白，其存在相互作用的宿主蛋白尚不清楚。【目的】筛选与PEDV Nsp8互作宿主蛋白，初步探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响，为寻找PEDV新的关键性治疗靶点提供理论基础。【方法】利用真核表达载体pcDNA3.1(+)成功构建PEDV Nsp8真核表达质粒，通过免疫共沉淀、质谱分析及激光共聚焦等技术筛选能够与其相互作用的宿主蛋白，进一步在LLC-PK细胞中通过过表达、敲低等方法探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响。【结果】质谱检测筛选到Nsp8潜在互作宿主蛋白36个，验证了宿主蛋白热休克蛋白成员8 (heat shock protein member 8, HSPA8)与Nsp8相互作用，在LLC-PK细胞中过表达HSPA8能够剂量依赖性抑制Nsp8蛋白过表达，而且在蛋白质和转录水平显著剂量依赖性抑制PEDV复制；干扰内源性HSPA8表达能够显著促进PEDV复制，TCID₅₀和间接免疫荧光试验检测(indirect immunofluorescent assay, IFA)结果进一步证明了HSPA8抑制PEDV复制。【结论】本研究筛选出PEDV Nsp8的互作宿主蛋白HSPA8，并且证明HSPA8能显著抑制PEDV复制，为设计以HSPA8为靶点的预防或治疗药物提供新思路。

关键词

猪流行性腹泻病毒 / Nsp8 / 免疫共沉淀技术 / HSPA8

Abstract

收起

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is an enterovirus that can cause severe diarrhea and dehydration. The widespread epidemic of PEDV has caused huge economic losses to the pig breeding industry, which, however, lacks effective means for prevention and treatment. Nsp8 is an important non-structural protein involved in the replication of PEDV, while the host proteins interacting with Nsp8 remains unclear. [Objective] To screen the host proteins interacting with PEDV Nsp8 and explore the effects of the host proteins on the replication of PEDV, so as to provide a theoretical basis for discovering new key functional receptors or therapeutic targets of PEDV. [Methods] The eukaryotic expression plasmid of PEDV Nsp8 was successfully constructed with the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The host proteins interacting with PEDV Nsp8 were screened by co-immunoprecipitation, mass spectrometry, and laser confocal microscopy. The effects of the host proteins on PEDV replication were explored by overexpression and knockdown in LLC-PK cells. [Results] Thirty-six potential host proteins interacting with Nsp8 were screened by mass spectrometry, and the interaction between heat shock protein member 8 (HSPA8) and Nsp8 was verified. The overexpression of HSPA8 in LLC-PK cells inhibited the overexpression of Nsp8 in a dose-dependent manner. Meanwhile, it significantly inhibited the replication of PEDV in a dose-dependent manner at the protein and transcriptional levels. Interfering with endogenous HSPA8 expression significantly promoted the replication of PEDV. The 50% tissue culture infectious dose (TCID₅₀) and indirect immunofluorescence further proved that HSPA8 inhibited PEDV replication. [Conclusion] This study screened out the host protein HSPA8 interacting with PEDV Nsp8 and proved that HSPA8 could significantly inhibit PEDV replication, which provided a new idea for the design of HSPA8-targeted drugs for the prevention or treatment of PEDV.

Key words

porcine epidemic diarrhea virus / Nsp8 / co-immunoprecipitation / HSPA8

引用本文

涂赟, 于瑞明, 张莉萍, 王永录, 潘丽, 刘霞, 杜晓华, 刘新生. 猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定. 微生物学报, 2024 , 64 (10) : 3932 -3944 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240237

Yun TU, Ruiming YU, Liping ZHANG, Yonglu WANG, Li PAN, Xia LIU, Xiaohua DU, Xinsheng LIU. Screening and identification of host proteins interacting with Nsp8 of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (10) : 3932 -3944 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240237

正文

收起

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，可导致仔猪急性水样腹泻、脱水、呕吐、消瘦和精神萎靡等症状，对全球的生猪产业造成了严重的经济损失。PEDV可感染各个年龄段的猪群，成年猪和母猪呈一过性感染，而仔猪感染率和死亡率可达80%−100%^[1]。自1971年首次在英国发现和报道PED以来，比利时、匈牙利、法国、德国、日本和韩国等多个国家相继出现PED的流行^[2]。1986年我国首次报道了PED，呈现零星散发状态^[3]。然而2010年末，以各年龄猪高发病率和新生仔猪高死亡率为特征的PED疫情在我国大范围暴发，造成了巨大的经济损失^[4]。2013年4月，一种强毒力PEDV变异株席卷美国，随后加拿大、墨西哥、哥伦比亚、日本、韩国和菲律宾等许多国家也相继暴发了PED疫情^[5]。至此，PED已在全球大部分国家暴发和流行，并且呈现常年高发和逐步扩大蔓延的趋势。

PEDV是一种有囊膜的单股、正链RNA病毒，基因组全长约为28 kb，属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae) α冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员^[6]。PEDV除编码4种结构蛋白(刺突蛋白S、膜蛋白M、包膜蛋白E和核衣壳蛋白N)外，开放阅读框3 (open reading frame, ORF3)、ORF1a及ORF1b还编码辅助性蛋白ORF3和16种非结构蛋白(Nsp1–Nsp16)^[7]。PEDV非结构蛋白在病毒复制的过程中发挥重要作用。冠状病毒中Nsp8是非常保守的蛋白，研究表明，NSP8能够与RNA模板上5′-(G/U)CC-3′结合来启动互补寡聚核苷酸的合成，被认为具有次级的RdRp活性，在病毒基因组的转录和复制过程中为NSP12提供RNA引物^[8]。Nsp8会与Nsp7形成十六聚体超级复合物的晶体结构，这种独特的空圆柱体结构由Nsp8组成，Nsp7将其固定在一起，该复合物可能具有调控病毒复制的功能^[9-10]。进一步研究发现SARS-CoV的RNA聚合酶(Nsp12)需要与Nsp8和Nsp9结合，才能激活其复制RNA的能力^[11]。除了参与病毒复制以外，在SARS-CoV-2的研究中发现Nsp8是一种不完全线粒体自噬诱导剂，它可以通过阻止自噬体和溶酶体的融合，导致自噬体增加，通过损伤线粒体和诱导自身或线粒体自噬^[12]。上述研究表明，Nsp8在冠状病毒的复制周期中具有重要作用，而目前关于PEDV Nsp8的相关研究报道非常少，因此，筛选与PEDV Nsp8互作的宿主蛋白对了解PEDV与宿主细胞的相互作用具有重要的意义。

本研究利用免疫共沉淀和质谱分析技术筛选到与PEDV非结构蛋白Nsp8潜在的互作宿主蛋白HSPA8，HSPA8是热休克蛋白70家族中一种组成型表达的蛋白质(也称HSC70)，参与多种细胞活动，如蛋白质的折叠与运输、抗原的处理与呈递、内吞和自噬等，此外HSPA8还参与调解各种病毒的生命周期，如介导某些病毒的附着、内吞、穿透、转录、复制、组装和出芽等^[13]。宿主细胞在受到病原感染时，HSPA8可易位到细胞膜上并作为受体或共受体参与病毒侵袭^[14]。通过免疫共沉淀和激光共聚焦明确了Nsp8与HSPA8的互作关系，进一步在LLC-PK细胞上验证HSPA8在PEDV复制过程中的调控作用，为研究宿主蛋白与PEDV相互作用及机理提供参考依据。

1 材料与方法

收起

1.1 病毒、细胞和主要试剂

LLC-PK、Vero细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection, ATCC)，并由本实验室保存；抗PEDV N蛋白单克隆抗体由本实验室制备并保存；PEDV毒株CH/HBXT/2018 (GenBank登录号为MH816969)由本实验室分离鉴定并保存；pcDNA3.1(+)载体由本实验室保存；Promega-AMV反转录试剂盒购自Promega公司；Endo-Free Plasmid Midi Kit购自Omega Bio-tek公司；限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ、T4连接酶均购自NEB公司；One Step TB Green^® PrimeScript^TM RT-PCR Kit Ⅱ、PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase和RNAios Plus均购自TaKaRa公司；Protein A+G Agarose、NP-40细胞裂解液、PMSF和Lipofectamine 8000^TM转染试剂均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清和胰酶均购自ThermoFisher Scientific公司；Flag、HA-Tag (26D11) mAb和Hsc70 Antibody均购自Abmart公司；Mouse Anti-β-actin mAb、HRP标记山羊抗小鼠抗体、HRP标记山羊抗兔抗体和488标记山羊抗小鼠IgG (H+L)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗兔IgG H&L购自Abcam公司。

1.2 PEDV Nsp8真核表达质粒的构建及表达

根据PEDV毒株CH/HBXT/2018 (GenBank登录号为MH816969)序列，使用SnapGene软件设计扩增Nsp8基因(582 bp)的特异性引物(表1)，用RNAios Plus提取病毒RNA，Promega-AMV反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。反转录反应体系：AMV RT 5×Buffer 5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 3 μL，Oligo dT (0.5 μg/μL) 2 μL，ddH₂O 7 μL，RNA 7 μL，AMV反转录酶(10 U/μL) 0.5 μL，RNA酶抑制剂(40 U/μL) 0.5 μL。反转录反应条件：42 ℃ 1 h，以cDNA为模板，使用PrimeSTAR^® GXL DNA Polymerase对Nsp8上、下游特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 4 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各2 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.2 U/μL) 1 μL，cDNA 2 μL，ddH₂O 29 μL。PCR反应程序：98 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，30个循环；68 ℃ 10 min。将扩增出的PEDV Nsp8目的基因用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，回收酶切产物，通过T4连接酶连接至pcDNA3.1(+)载体(5 428 bp)，克隆后提取质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将构建成功的真核表达质粒标记为pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8 (6 020 bp)。将pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8与pcDNA3.1(+)分别转染至LLC-PK细胞，24 h后收取细胞样品进行Western blotting验证其过表达情况。

1.3 免疫共沉淀

将LLC-PK细胞均匀铺至两个100 mm细胞培养皿中，待细胞贴壁良好且密度达到80%以上时，用Lipofectamine 8000^TM转染试剂(1.5 μg质粒/2 μL)分别转染pcDNA3.1(+)空载体质粒和pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8质粒各10 μg。转染24 h后用1×PBS将细胞清洗3次，各加入1 mL的NP-40细胞裂解液和10 μL PMSF (蛋白酶抑制剂)，4 ℃、30 r/min裂解2 h后，收集细胞样品，12 000 r/min离心5 min，弃黏稠状细胞沉淀物。取45 μL上清至一新离心管，加入15 μL 4×蛋白上样缓冲液作为Input样品，在剩余上清中各加入3 μL Flag抗体，过夜孵育。孵育结束后，加入50 μL混匀的Protein A+G Agarose，再次孵育4 h。1 500 r/min离心3 min弃掉上清，加入1 mL预冷1×PBS，4 ℃摇床35 r/min洗涤5 min，1 500 r/min离心3 min，重复3次，洗涤完吸尽上清，重新加入60 μL 1×PBS稀释，加入20 μL 4×蛋白上样缓冲液，将该样品作为IP样品。最后将Input样品和IP样品于沸水中变性10 min。

1.4 Western blotting检测

取IP和Input样品进行SDS-PAGE，将胶体中的蛋白转移至NC膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗下多余的脱脂乳，加入Flag抗体(1:5 000)过夜孵育。孵育结束后，用TBST漂洗3次，每次10 min，弃掉漂洗液，加入HRP标记山羊抗小鼠抗体(1:8 000)孵育1 h，再次漂洗3次，每次10 min，弃掉漂洗液，通过ECL化学发光液指示，使用曝光仪观察结果。

1.5 PEDV Nsp8质谱鉴定

将鉴定正确的、大小约为23 kDa (Nsp8)的样品送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行质谱分析。

1.6 HSPA8表达载体的构建及表达

根据猪源HSPA8 (UniProt序列号为：A0A286ZPN4_PIG)的基因序列设计特异性引物(表1)，并添加HA作为标签抗体。提取LLC-PK细胞RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，HSPA8-F和HSPA8-R为引物扩增出HSPA8目的基因(2 121 bp)，用T4 DNA连接酶将BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的HSPA8目的基因连接至pcDNA3.1(+)载体，克隆后提取质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，构建成功的真核表达载体记为pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8 (7 493 bp)。将pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8与pcDNA3.1(+)分别转染至LLC-PK细胞中，24 h后收取细胞样品进行Western blotting验证其过表达情况。

1.7 间接免疫荧光试验检测(indirect immunofluorescent assay, IFA)验证Nsp8和HSPA8表达

将LLC-PK细胞铺至35 mm细胞培养皿中，待其生长至75%后，分别转染pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8、pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8与pcDNA3.1(+)，转染后24 h后弃掉培养基，用1 mL 1×PBS洗涤3次，随后加入1 mL 4%多聚甲醛放置于4 ℃冰箱固定60 min，弃掉固定液，加入1 mL 0.25% TritonX-100室温条件下作用10 min，2 mL 1×PBS在微量振荡器上清洗3次，每次3 min，加入1 mL 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)室温封闭60 min，2 mL 1×PBS洗涤3次，加入3% BSA稀释的Flag抗体(1:1 000)和HA抗体(1:1 000)室温孵育1 h，2 mL 1×PBS洗涤3次后用488标记山羊抗小鼠IgG (H+L)指示目的蛋白，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole)指示细胞核后在荧光显微镜下观察。

1.8 免疫共沉淀验证Nsp8与HSPA8相互作用

将Vero细胞铺至100 mm细胞培养皿中，待其生长至80%后，共同转染pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8与pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8，设置共转pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8和pcDNA3.1(+)为对照组，通过免疫共沉淀和Western blotting检测进行验证。

1.9 激光共聚焦验证Nsp8与HSPA8共定位

将Vero细胞铺至共聚焦细胞培养皿中，用pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒共同转染至Vero细胞，同时以单独转染pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒作为对照，样品制备方法参考1.7，用488标记山羊抗小鼠IgG (H+L)和山羊抗兔IgG H&L指示目的蛋白，DAPI指示细胞核后在激光共聚焦显微镜下观察。

1.10 HSPA8对PEDV Nsp8过表达的影响

将0、1、2和3 μg的pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒分别与2 μg pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8质粒共转染至LLC-PK细胞中，24 h后收取细胞样品进行Western blotting检测分析。

1.11 HSPA8过表达对PEDV复制的影响

采用2 μg pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒和2 μg pcDNA3.1(+)质粒分别转染LLC-PK细胞，24 h后将PEDV以MOI=0.1感染细胞。Western blotting检测：分别在PEDV感染后的0、24和36 h收取细胞样品进行Western blotting检测PEDV N蛋白水平变化；RT-qPCR检测：取PEDV感染后的24 h和36 h细胞样品，加入1 mL RNAios Plus提取RNA，通过One Step TB Green^® PrimeScript^TM RT-PCR Kit Ⅱ试剂盒检测PEDV N基因转录水平变化，PEDV N和内参基因GAPDH引物见表1，每个待测样本设置3个重复。RT-qPCR反应体系：12.5 μL 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4，1 μL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2，上、下游引物(0.4 μmol/L)各1 μL，模板RNA 2 μL，RNase Free dH₂O 7.5 μL。RT-qPCR反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。TCID₅₀检测：将24 h和36 h细胞样品及上清收集反复冻融3次后进行TCID₅₀测定，将Vero细胞铺至96孔板，待生长至80%左右，用无菌1×PBS洗涤3遍后，用1:1 000胰蛋白酶稀释的无血清MEM培养基将冻融后的样品稀释至10^–1–10^–9，将稀释好的样品加入96孔板中，每孔100 μL，每个稀释浓度8个重复，阴性对照只加含胰蛋白酶的无血清MEM培养基，观察病变状况并记录，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀。IFA检测：通过间接免疫荧光检测24 h和36 h细胞样品中PEDV复制情况，具体实验步骤参考1.7。

1.12 不同剂量HSPA8过表达对PEDV复制的影响

将0、1、2和3 μg的pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒分别转染至LLC-PK细胞中，24 h后将PEDV以MOI=0.1感染细胞，PEDV感染后24 h收取细胞样品进行Western blotting检测PEDV N水平蛋白变化。按照上述实验操作，将0、1、2和3 μg的pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒分别转染至LLC-PK细胞中，24 h后将PEDV以MOI=0.1感染细胞，PEDV感染后24 h收取细胞样品进行RT-qPCR检测PEDV N转录水平变化。RT-qPCR反应体系及反应条件参考1.11。

1.13 干扰内源性HSPA8对PEDV复制的影响

将3条浓度为20 pmol/μL的HSPA8的siRNA引物(表2)以120 pmol剂量转染至LLC-PK细胞，48 h后收取细胞样品，Western blotting检测是否有干扰作用。随后将具有干扰效果的siRNA转染PK细胞，48 h后将PEDV以MOI=0.1感染细胞，分别在PEDV感染后24 h和36 h通过Western blotting、RT-qPCR、TCID₅₀和间接免疫荧光检测PEDV复制情况，具体实验步骤参考1.11。

1.14 数据处理

涉及统计学分析的数据进行至少3次重复试验，通过GraphPad Prism 8软件对数据进行t检验和方差分析。

2 结果与分析

收起

2.1 目的基因的扩增和重组质粒的鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR后获得大小约为648 bp和2 121 bp的条带，与目的基因PEDV-Nsp8和猪源HSPA8相符(图1A、1B)，克隆至pcDNA3.1(+)载体后经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后分别得到5 372 bp和648 bp及5 372 bp和2 121 bp的条带，经测序验证后与目的条带符合，说明重组质粒pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8构建成功(图2A、2B)。

2.2 重组质粒的表达和鉴定

鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8转染LLC-PK细胞，Western blotting分析可见大小约为23 kDa (图3A)和77 kDa (图3B)的条带，因重组质粒所表达的蛋白携带有标签蛋白，其真实大小应减去所携带标签蛋白的大小(Flag标签约1 kDa，HA标签约1.1 kDa)，所以Nsp8蛋白大小约为22 kDa，HSPA8蛋白大小约为76 kDa，与预期大小相符；IFA结果显示，与对照组相比，转染pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8实验组有明显绿色荧光(图3C、3D)，表明Nsp8与HSPA8蛋白在LLC-PK细胞内表达，Western blotting和IFA结果共同验证了重组质粒pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8可在LLC-PK细胞中表达。

2.3 质谱筛选与PEDV Nsp8潜在互作的宿主蛋白

PEDV Nsp8的免疫沉淀根据质谱结果的肽段覆盖率，共筛选出36个潜在的互作宿主蛋白，选取热休克蛋白成员8蛋白(HSPA8)、转录因子AP-2δ (transcription factor AP-2 delta, TFAP2D)和蛋白名称异质核糖核蛋白M (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M, HNRNPM)这3个宿主蛋白进行免疫共沉淀(表3)。

2.4 HSPA8与PEDV Nsp8的免疫共沉淀验证

免疫共沉淀实验验证PEDV Nsp8蛋白与上述3个潜在宿主蛋白互作结果表明，HSPA8与PEDV Nsp8互作，其余2个蛋白无互作现象。在HSPA8与PEDV Nsp8互作实验中HSPA8与Nsp8均表达良好，相较于对照组，HSPA8成功与Nsp8共沉淀，说明相互之间存在互作关系(图4)。

2.5 HSPA8与PEDV Nsp8细胞内共定位

pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8和pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒共同转染至Vero细胞后对样品进行处理，在激光共聚焦显微镜下可观察到PEDV Nsp8和HSPA8在细胞质内共定位，说明PEDV Nsp8和HSPA8存在互作关系(图5)。

2.6 过表达HSPA8剂量依赖性抑制PEDV Nsp8表达

将0、0.5、1.0、2.0和3.0 μg的pcDNA3.1(+)-HA-HSPA8质粒分别与2 μg pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp8质粒共转染至LLC-PK细胞后，Western blotting结果显示：随着HSPA8表达量的增加，PEDV Nsp8表达量逐渐降低(图6A)，使用Image J (NIH)对Western blotting结果灰度分析，结果表明过表达HSPA8剂量依赖性抑制PEDV Nsp8表达(图6B)。

2.7 过表达HSPA8抑制PEDV复制

在LLC-PK细胞中过表达HSPA8蛋白，接种PEDV后0、24和36 h的细胞样品Western blotting结果显示，与只接种PEDV组相比，在24 h和36 h，过表达HSPA8降低PEDV N蛋白表达量(图7A)；RT-qPCR结果显示过表达HSPA8，PEDV N基因转录水平明显降低，与细胞对照组相比，差异显著(图7B)；对感染PEDV 24 h和36 h的细胞样品及上清进行TCID₅₀测定(图7C)，结果表明HSPA8过表达显著抑制PEDV复制；IFA检测结果显示，在感染PEDV 24 h和36 h后，过表达HSPA8实验组PEDV复制效率均低于对照组(图7D)。

2.8 HSPA8剂量依赖性抑制PEDV复制

0、1、2和3 μg的HSPA8转染LLC-PK 24 h后接种MOI=0.1的PEDV病毒，24 h收取细胞样品进行Western blotting分析PEDV N蛋白水平变化，表明随着HSPA8转染剂量的增加PEDV N蛋白的表达量呈明显的降低趋势(图8A)；RT-qPCR结果表明，PEDV N mRNA水平随着HSPA8剂量的增加呈剂量依赖性降低(图8B)，上述结果表明，HSPA8过表达剂量依赖性抑制PEDV复制。

2.9 干扰内源性HSPA8促进PEDV复制

合成的3条干扰RNA (siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3)转染LLC-PK细胞，48 h后Western blotting检测干扰效果，结果显示siRNA-3具有明显的特异性干扰效果(图9A)。将siRNA-3转染LLC-PK细胞，48 h后接种PEDV病毒(MOI=0.1)，0、24和36 h的Western blotting结果显示干扰内源性HSPA8后，PEDV N的蛋白表达水平显著升高(图9B)，RT-qPCR结果显示PEDV N的mRNA水平显著升高(图9C)；对感染PEDV 24 h和36 h的细胞样品及上清进行TCID₅₀测定(图9D)，结果表明干扰HSPA8显著促进PEDV复制；IFA检测结果显示，在感染PEDV 24 h和36 h后干扰HSPA8实验组PEDV复制效率均高于对照组(图9E)。

3 讨论与结论

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病毒与宿主细胞之间的相互作用一般是通过病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用^[15]。PEDV在侵入宿主细胞后也一定会与宿主细胞发生相互作用，已有的研究显示PEDV M蛋白能够与S100A11和PPID相互作用，并且这两种互作蛋白参与下调感染细胞中的病毒复制^[16]；PEDV N蛋白与TARDBP相互作用，TARDBP通过蛋白酶体和自噬降解途径降解N蛋白，有效抑制PEDV病毒的复制，并通过上调MyD8的Ⅰ型干扰素的信号转导^[17]；PEDV N蛋白与Sp1相互作用并干扰其与启动子区的结合，从而抑制HDAC1的表达实现免疫逃避^[18]。虽然关于PEDV与宿主细胞的相互作用已有较多研究报道，但关于Nsp8蛋白与其他宿主蛋白之间的相互作用尚不清楚。因此，本研究筛选了能够与PEDV非结构蛋白Nsp8相互作用的宿主蛋白，为后续进一步阐明非结构蛋白Nsp8在PEDV复制中的重要作用提供新的思路和依据。

前期研究发现，猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV) M蛋白能够协同HSPA8/HSC70，通过网格蛋白(clathrin)介导的内吞途径完成病毒的细胞内化过程^[19]。此外，HSPA8蛋白参与调节病毒的基因组复制，小鼠潜伏相关核抗原(murine mouse latent associated nuclear antigen, mLANA)是小鼠γ疱疹病毒68 (murine gammaherpesvirus 68, gammaHV68)的一种与病毒复制相关的蛋白，MHV68感染的3T12成纤维细胞中，mLANA直接与HSPA8相互作用，并将其募集至细胞核中积累，这有助于形成病毒复制复合物，进而促进病毒DNA复制^[20]。因此，HSPA8能够参与对病毒的调控且在不同的病毒中具有不同的机制。本研究结果同样也表明，宿主蛋白HSPA8与PEDV非结构蛋白NSP8存在相互作用，能够调控PEDV复制并呈现剂量依赖性。

分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)是一种选择性降解具有某种共有氨基酸基序(KFERQ)的蛋白，HSPA8选择性结合具有这种序列的底物，并运输底物与受体溶酶体相关膜蛋白A2相结合(LAMP2A)以启动降解^[21]。研究发现，Htt-552蛋白与CMA的组成蛋白HSPA8和LAMP2A相互作用，通过过表达以及干扰的方法改变LAMP-2A和HSPA8在细胞中的表达含量改变CMA的水平，在CMA激活时，Htt-552的蓄积减少，抑制CMA活性则Htt-552蓄积增多^[22]。在本研究中发现HSPA8过表达剂量依赖性抑制Nsp8的过表达，二者之间存在互作关系，因此有理由怀疑Nsp8存在KFERQ序列，被CMA途径所自噬降解，这有待后续试验验证。

本研究结果表明，在LLC-PK细胞中过表达HSPA8，可显著抑制PEDV的复制。进一步地，利用siRNA敲低HSPA8的表达水平，PEDV的复制显著增加，表明宿主蛋白HSPA8通过与PEDV Nsp8相互作用抑制PEDV的复制，但详细作用机制仍需进一步地深入研究。

基金

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国家生猪技术创新中心项目(NCTIP-XD/C 03)

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

WANG D, FANG LR, XIAO SB. Porcine epidemic diarrhea in China[J]. Virus Research, 2016, 226:7-13.

https://doi.org/10.1016/j.virusres.2016.05.026

[2]

JUNG K, ANNAMALAI T, LU ZY, SAIF LJ. Comparative pathogenesis of US porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strain PC21A in conventional 9-day-old nursing piglets vs. 26-day-old weaned pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2015, 178 (1/2):31-40.

[3]

CHEN JF, WANG CB, SHI HY, QIU HJ, LIU SW, CHEN XJ, ZHANG ZB, FENG L. Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Archives of Virology, 2010, 155 (9):1471-1476.

https://doi.org/10.1007/s00705-010-0720-2

[4]

SUN RQ, CAI RJ, CHEN YQ, LIANG PS, CHEN DK, SONG CX. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China[J]. Emerging Infectious Diseases, 2012, 18 (1):161-163.

https://doi.org/10.3201/eid1801.111259

[5]

HOU YX, LIN CM, YOKOYAMA M, YOUNT BL, MARTHALER D, DOUGLAS AL, GHIMIRE S, QIN YB, BARIC RS, SAIF LJ, WANG QH. Deletion of a 197-amino-acid region in the N-terminal domain of spike protein attenuates porcine epidemic diarrhea virus in piglets[J]. Journal of Virology, 2017, 91 (14):e00227-e00217.

[6]

LIN F, ZHANG HY, LI LQ, YANG Y, ZOU XD, CHEN JH, TANG XC. PEDV: insights and advances into types, function, structure, and receptor recognition[J]. Viruses, 2022, 14 (8):1744.

https://doi.org/10.3390/v14081744

[7]

LEE C. Porcine epidemic diarrhea virus: an emerging and re-emerging epizootic swine virus[J]. Virology Journal, 2015, 12:193.

https://doi.org/10.1186/s12985-015-0421-2

[8]

汪梦俊, 申硕. 冠状病毒非结构蛋白的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志, 2022, 35 (1):100-111.

WANG MJ, SHEN S. Progress in research on non-structural protein of coronaviruses[J]. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35 (1):100-111.

[9]

TE VELTHUIS AJ, van den WORM SHE, SNIJDER EJ. The SARS-coronavirus nsp7+nsp8 complex is a unique multimeric RNA polymerase capable of both de novo initiation and primer extension[J]. Nucleic Acids Research, 2012, 40 (4):1737-1747.

https://doi.org/10.1093/nar/gkr893

[10]

ZHAI YJ, SUN F, LI XM, PANG H, XU XL, BARTLAM M, RAO ZH. Insights into SARS-CoV transcription and replication from the structure of the nsp7–nsp8 hexadecamer[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2005, 12:980-986.

[11]

SUBISSI L, POSTHUMA CC, COLLET A, ZEVENHOVEN-DOBBE JC, GORBALENYA AE, DECROLY E, SNIJDER EJ, CANARD B, IMBERT I. One severe acute respiratory syndrome coronavirus protein complex integrates processive RNA polymerase and exonuclease activities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111 (37):E3900-E3909.

[12]

ZONG S, WU Y, LI WL, YOU Q, PENG Q, WANG CH, WAN P, BAI T, MA YL, SUN BL, QIAO JL. SARS-CoV-2 Nsp8 induces mitophagy by damaging mitochondria[J]. Virologica Sinica, 2023, 38 (4):520-530.

https://doi.org/10.1016/j.virs.2023.05.003

[13]

WANG Z, LI YT, YANG X, ZHAO J, CHENG YN, WANG JK. Mechanism and complex roles of HSC70 in viral infections[J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11:1577.

https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01577

[14]

VEGA-ALMEIDA TO, SALAS-BENITO M, de NOVA-OCAMPO MA, del ANGEL RM, SALAS-BENITO JS. Surface proteins of C6/36 cells involved in dengue virus 4 binding and entry[J]. Archives of Virology, 2013, 158 (6):1189-1207.

https://doi.org/10.1007/s00705-012-1596-0

[15]

LASSO G, MAYER SV, WINKELMANN ER, CHU T, ELLIOT O, PATINO-GALINDO JA, PARK K, RABADAN R, HONIG B, SHAPIRA SD. A structure-informed atlas of human-virus interactions[J]. Cell, 2019, 178 (6):1526-1541.e16.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.005

[16]

DONG SJ, WANG RY, YU RS, CHEN BQ, SI FS, XIE CF, LI Z. Identification of cellular proteins interacting with PEDV M protein through APEX2 labeling[J]. Journal of Proteomics, 2021, 240:104191.

https://doi.org/10.1016/j.jprot.2021.104191

[17]

DONG SJ, KONG N, ZHANG Y, LI YW, SUN DG, QIN WZ, ZHAI HJ, ZHAI XY, YANG XY, YE CQ, YE MQ, LIU CL, YU LX, ZHENG H, TONG W, YU H, ZHANG W, TONG GZ, SHAN TL. TARDBP inhibits porcine epidemic diarrhea virus replication through degrading viral nucleocapsid protein and activating type Ⅰ interferon signaling[J]. Journal of Virology, 2022, 96 (10):e0007022.

https://doi.org/10.1128/jvi.00070-22

[18]

XU JD, MAO JY, HAN X, SHI FS, GAO Q, WANG TJ, ZHANG ZN, SHAN Y, FANG WH, LI XL. Porcine epidemic diarrhea virus inhibits HDAC1 expression to facilitate its replication via binding of its nucleocapsid protein to host transcription factor Sp1[J]. Journal of Virology, 2021, 95 (18):e0085321.

https://doi.org/10.1128/JVI.00853-21

[19]

JI ZY, DONG H, JIAO RX, ZHU XY, SHI HY, CHEN JF, SHI D, LIU JB, JING ZY, ZHANG JL, WANG XB, YE DD, ZHANG JY, ZHANG X, FENG L. The TGEV membrane protein interacts with HSC70 to direct virus internalization through clathrin-mediated endocytosis[J]. Journal of Virology, 2023, 97 (4):e0012823.

https://doi.org/10.1128/jvi.00128-23

[20]

VIRGIN HW 4th, LATREILLE P, WAMSLEY P, HALLSWORTH K, WECK KE, dal CANTO AJ, SPECK SH. Complete sequence and genomic analysis of murine gammaherpesvirus 68[J]. Journal of Virology, 1997, 71 (8):5894-5904.

https://doi.org/10.1128/jvi.71.8.5894-5904.1997

[21]

KAUSHIK S, CUERVO AM. The coming of age of chaperone-mediated autophagy[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19:365-381.

https://doi.org/10.1038/s41580-018-0001-6

[22]

QI L, ZHANG XD, WU JC, LIN F, WANG J, DiFIGLIA M, QIN ZH. The role of chaperone-mediated autophagy in huntingtin degradation[J]. PLoS One, 2012, 7 (10):e46834.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0046834

2024年第64卷第10期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240237

接收时间：2024-04-15
首发时间：2026-03-21
出版时间：2024-06-18

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收稿日期：2024-04-15
录用日期：2024-06-11

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National Center of Technology Innovation for Pigs Project(NCTIP-XD/C 03)

国家生猪技术创新中心项目(NCTIP-XD/C 03)

作者信息

1 甘肃农业大学动物医学院, 甘肃兰州 730070

2 中国农业科学院兰州兽医研究所, 动物疫病防控全国重点实验室, 甘肃兰州 730046

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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