微生物学报

在flashBAC杆状病毒表达系统中制备人GⅡ.4型诺如病毒样颗粒

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刘志鹏 ¹ , 肖锦宁 ² , 段良伟 ¹ , 王琼梓 ¹ , 王向鹏 ¹^,^*

微生物学报 | 研究报告 2024,64(10): 3798-3808

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微生物学报 | 研究报告 2024, 64(10): 3798-3808

在flashBAC杆状病毒表达系统中制备人GⅡ.4型诺如病毒样颗粒

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刘志鹏¹, 肖锦宁², 段良伟¹, 王琼梓¹, 王向鹏¹^,^*

作者信息

1 新乡医学院医学技术学院, 河南省免疫与靶向药物重点实验室, 河南新乡 453003

2 新乡医学院第三附属医院检验科, 河南新乡 453003

Preparation of virus-like particles of human GⅡ.4 norovirus in the flashBAC baculovirus expression system

Zhipeng LIU¹, Jinning XIAO², Liangwei DUAN¹, Qiongzi WANG¹, Xiangpeng WANG¹^,^*

Affiliations

1 Henan Key Laboratory of Immunology and Targeted Drugs, School of Medical Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan, China

2 Department of Clinical Laboratory, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan, China

出版时间: 2024-06-21 doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240206

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摘要

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【目的】人诺如病毒(human norovirus, HuNoV)是全球范围内引起人急性胃肠炎的主要病原之一，目前尚无有效的疫苗对该病毒进行预防。本研究旨在利用flashBAC杆状病毒表达系统，制备HuNoV病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)，为研发HuNoV疫苗奠定基础。【方法】将GⅡ.4型HuNoV的VP1蛋白全长基因序列进行密码子优化后合成，克隆至杆状病毒pBacPAK9转移载体，获得pBacPAK9-8his-VP1重组质粒。酶切、测序鉴定正确后将重组质粒与线性baculovirus plasmid (Bacmid)共转染SF9细胞，获得含有VP1基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Hi-Five (HF)细胞进行表达，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Western blotting分析VP1蛋白的表达。用镍柱亲和层析方法纯化VP1蛋白；对纯化后的VP1蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting检测。使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)对纯化的VP1蛋白进行纯度鉴定。利用透射电镜观察VLP。【结果】构建了pBacPAK9-8his-VP1重组质粒，VP1蛋白在HF细胞中主要在细胞质内表达，分子量约为58 kDa。HPLC结果显示VP1蛋白纯度大于99%，透射电镜可以观察到形状规则、大小均一、直径约为30−40 nm的VLP。【结论】利用杆状病毒表达系统制备了GⅡ.4型HuNoV的VLP，为HuNoV疫苗的研发奠定了基础。

关键词

人诺如病毒 / VP1蛋白 / 杆状病毒表达系统 / 病毒样颗粒

Abstract

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[Objective] Human norovirus (HuNoV) is one of the most common pathogens causing acute gastroenteritis in humans worldwide. Currently, there are no approved vaccines to prevent this disease. This study aimed to prepare virus-like particles (VLPs) of HuNoV in the flashBAC baculovirus expression system, laying a foundation for the development of vaccines against HuNoV. [Methods] After codon optimization, the full-length gene sequence of the VP1 protein of HuNoV GⅡ.4 was synthesized and cloned into the baculovirus pBacPAK9 transfer vector to obtain the recombinant plasmid pBacPAK9-8his-VP1. After enzyme digestion and sequencing, the recombinant plasmid was co-transfected with the linear baculovirus plasmid (Bacmid) into SF9 cells to obtain a recombinant baculovirus carrying the VP1 gene. Hi-Five (HF) cells were infected by the recombinant baculovirus for protein expression, and the expression of VP1 was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. VP1 was purified by Ni-NTA affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blotting. The purity of VP1 was examined by high performance liquid chromatography (HPLC). The VLPs were observed by transmission electron microscopy. [Results] A transfer plasmid pBacPAK9-8his-VP1 was constructed, and the VP1 protein, with a molecular weight of approximately 58 kDa, was mainly expressed in the cytoplasm of HF cells. The HPLC results showed that the purity of VP1 was over 99%. The VLPs with a regular shape, uniform sizes, and diameters of 30–40 nm were observed by transmission electron microscopy. [Conclusion] The VLPs of HuNoV GⅡ.4 were prepared with a baculovirus expression system, laying a foundation for the development of HuNoV vaccines.

Key words

human norovirus / VP1 protein / baculovirus expression system / virus-like particles

引用本文

刘志鹏, 肖锦宁, 段良伟, 王琼梓, 王向鹏. 在flashBAC杆状病毒表达系统中制备人GⅡ.4型诺如病毒样颗粒. 微生物学报, 2024 , 64 (10) : 3798 -3808 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240206

Zhipeng LIU, Jinning XIAO, Liangwei DUAN, Qiongzi WANG, Xiangpeng WANG. Preparation of virus-like particles of human GⅡ.4 norovirus in the flashBAC baculovirus expression system[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024 , 64 (10) : 3798 -3808 . DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240206

正文

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人诺如病毒(human norovirus, HuNoV)是全球范围内引起人急性胃肠炎暴发流行的主要病原之一，该病毒主要通过污染的水源或食物经粪-口途径传播，也可以通过呕吐物的气溶胶进行传播^[1]。该病毒传染性强，人群普遍易感，患者临床症状主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头痛、发热和肌肉痛等症状，多数感染者呈自限性，预后较好^[2]。该病毒对儿童威胁大，5岁以下儿童感染后有时会出现电解质紊乱、脱水、酸中毒和惊厥等症状，甚至死亡^[3-4]。目前无获批疫苗和特效的疗法用于预防和治疗HuNoV感染引起的疾病，该病毒引发疾病负担重，在人口聚集的幼儿园和学校等场所容易引起暴发流行，从而成为突发公共卫生问题^[5]。HuNoV分类属于杯状病毒科诺如病毒属，基因组为单股正链RNA，病毒体呈二十面体立体对称的球形颗粒，无包膜。病毒基因全长约为7.5 kb，由3个开放阅读框(open reading frames, ORF)组成，分别是ORF1、ORF2和ORF3^[6]。ORF1编码病毒的6个非结构蛋白，主要功能是参与病毒的复制。ORF2编码病毒的主要衣壳蛋白VP1，ORF3编码病毒的次要衣壳蛋白VP2。病毒的二十面体衣壳由90个VP1蛋白二聚体和少量的VP2蛋白组成，病毒感染机体后，VP1蛋白可以引起体液免疫，是疫苗研发的主要抗原^[7-8]。VP1蛋白由外壳结构域(S区)和突出结构域(P区)组成，S区在不同毒株之间高度保守，P区不同毒株之间变异较大，病毒的保护性抗原表位主要在P区^[9-11]。根据病毒RNA聚合酶和衣壳蛋白基因序列的不同，HuNoV被分为5个基因群，分别是GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GⅤ群，同一基因群可进一步再分为不同基因型，其中GⅡ.4型毒株是全球范围内主要流行的毒株^[12-13]。

病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)是由病毒的一个或多个结构蛋白组成的与天然病毒在形态和结构相似的空心蛋白颗粒。VLP不含病毒的遗传物质，不能自主复制，因此不具有致病性和传染性，VLP能诱导机体产生免疫应答反应，所以基于VLP的亚单位疫苗受到广泛的关注。研究表明HuNoV的VP1蛋白可以自组装成VLP^[14-15]，由于HuNoV尚不能通过细胞进行培养，所以HuNoV疫苗的研发主要集中在重组蛋白疫苗。FlashBAC杆状病毒表达系统属于真核蛋白表达系统，该系统缺失了杆状病毒基因组DNA必需基因的一部分，用人工合成的基因(bacterial artificial chromosome, BAC)替代多角体编码区，改造后的杆状病毒能在大肠杆菌中复制，不能在昆虫细胞中复制。当与携带目的基因的转移载体共转染昆虫细胞后，通过同源重组重新获得必需基因片段，并将目的基因转移到杆状病毒基因组中，只有发生同源重组的病毒才能在昆虫细胞中复制，从而实现在昆虫细胞中一步法生产重组病毒，该系统表达外源蛋白具有省时省力和蛋白表达量高等特点。本研究拟通过应用flashBAC杆状病毒表达系统表达GⅡ.4型HuNoV的VP1蛋白制备VLP，为HuNoV亚单位疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

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1.1 材料

杆状病毒转移载体pBacPAK9、SF9昆虫细胞、Hi-Five (HF)昆虫细胞、杆状病毒质粒baculovirus plasmid (Bacmid)和大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验室保存或制备；GⅡ.4型HuNoV VP1蛋白(PDB登录号为7K6V_AA)基因序列根据SF9细胞密码子偏好性进行优化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接至pUC57载体；限制性内切酶、PrimeSTAR Max Premix (2×)，TaKaRa公司；闪电克隆酶、GⅡ.4型HuNoV兔源多克隆性抗体、HRP标记山羊抗兔抗体，北京博奥龙免疫技术有限公司；昆虫细胞IB907、IB908无血清培养基，浙江壹生科生物技术有限公司；梭华-Sofast转染试剂，厦门太阳马生物工程有限公司；镍柱填料，博格隆(上海)生物技术有限公司。

1.2 主要仪器

PCR仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；全自动化蛋白纯化仪，苏州赛普生物科技股份有限公司；高效液相色谱仪，岛津公司；透射电子显微镜，HITACHI公司。

1.3 重组质粒pBacPAK9-8his-VP1的构建和鉴定

以合成的pUC57-VP1质粒为模板，PCR扩增N端带有8个组氨酸标签的VP1基因片段，PCR正向引物F序列：5′-GAATTCGAGCTCGGTACC (载体同源臂序列) ATGCATCACCACCATCACCATCATCAC (His标签序列) GAGAATTTGTATTTCCAAGGC-3′，反向引物R序列：5′-GGCCGCCCTGCAGGCCTCGAG (载体同源臂序列) TCATAGTGCCCTCCTCCGTC-3′。PCR反应体系(50 μL)：模板(200 ng) 1 μL，引物F和R (10 μmol/L)各1 μL，PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL，无菌水22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，用凝胶回收试剂盒回收VP1片段。以pBacPAK9质粒为模板，用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ切割质粒得到线性化pBacPAK9。酶切体系：pBacPAK9质粒2 μg，Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ各1 μL，10×Cutsmart 5 μL，无菌水补至总体积为50 μL。37 ℃酶切1 h。VP1基因连接体系：线性化pBacPAK9 2 μL，VP1基因片段3 μL，2×闪电克隆酶5 μL。50 ℃条件下连接30 min，获得重组质粒pBacPAK9-8his-VP1。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布接种至氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养16 h后挑取单菌落进行扩大培养，提取质粒用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 表达VP1蛋白重组杆状病毒的制备

将pBacPAK9-8his-VP1质粒与线性化Bacmid用梭华-Sofast转染试剂共转染至SF9细胞构建重组杆状病毒，具体操作如下：将SF9细胞接种至6孔细胞培养板，细胞密度为1.5×10⁶个/mL，细胞贴壁后进行转染。转染体系分为A液和B液两部分进行制备，A液：线性Bacmid 4 μL，pBacPAK9-8his-VP1质粒4 μg，IB908培养基100 μL；B液：转染试剂5 μL，IB908 100 μL。将B液吸取后轻轻加至A液中并轻轻吹打混匀，室温静置20 min，将混合液缓慢滴加至细胞培养孔，用封口膜封住6孔细胞培养板侧面，27 ℃静置培养。转染6 d后，收获细胞悬液2 mL即为P1代重组杆状病毒。为提高重组杆状病毒效价，取P1代病毒继续在SF9细胞中传代，6 d后收集细胞悬液即为P2代重组杆状病毒。取P2代病毒在SF9细胞中传代，6 d后收获细胞悬液即为P3代重组杆状病毒。

1.5 VP1蛋白在HF昆虫细胞中的表达和鉴定

取对数生长期的HF细胞(密度为2.5×10⁶个/mL) 800 mL接入2 L摇瓶中，取P3代重组杆状病毒按体积分数1%接种至2 L摇瓶中。感染病毒的HF细胞27 ℃、120 r/min培养3 d，培养结束后收获HF细胞进行VP1蛋白的鉴定。取1 mL接毒的HF细胞悬液，12 000 r/min离心1 min，收集细胞，加入600 μL PBS缓冲液，用超声波对HF细胞进行破碎。超声破碎程序：工作2 s，停止3 s，总时间2 min，功率占比30%。超声结束后，12 000 r/min离心1 min，收集上清。同时收集未接毒的HF细胞进行相同处理作为对照。取80 μL细胞上清加入20 μL 5×Loading buffer，煮沸10 min，用SDS-PAGE和Western blotting鉴定蛋白的表达。

SDS-PAGE检测流程：制备12%的蛋白胶，按照Marker、表达样品和HF细胞的加样顺序加入，80 V电压20 min，140 V电压40 min。电泳结束后，将蛋白胶用考马斯亮蓝染色液进行成像观察。

Western blotting鉴定蛋白流程：细胞上清经SDS-PAGE后，将蛋白胶上的蛋白转至硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜，用等渗缓冲盐溶液(tris-HCl buffer solution tween, TBST)洗膜3次，每次5 min，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭NC膜，150 r/min摇床室温封闭1 h。用TBST洗膜3次，每次5 min，将GⅡ.4型HuNoV兔源多克隆性抗体用含5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释10 000倍作为一抗使用，150 r/min摇床室温孵育1 h。用TBST洗膜3次，每次5 min，二抗为1:5 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG抗体，150 r/min摇床室温孵育30 min。用TBST洗膜3次，每次5 min，最后加入ECL化学发光液进行显色处理，观察结果。

1.6 VP1蛋白的纯化

取1.4杆状病毒感染的HF细胞，在4 ℃条件下12 000 r/min离心20 min，收集细胞，称量细胞质量。按照1 g细胞10 mL缓冲液比例，用缓冲液A液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和5 mmol/L咪唑，pH 7.4)对细胞进行重悬。用超声波破碎仪对细胞悬液进行破碎，超声破碎程序：开2 s关3 s，总时间15 min，功率占比60%。超声结束后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清，上清经0.45 μm滤器进行过滤。过滤后的溶液使用镍柱利用全自动化蛋白纯化仪对VP1蛋白进行纯化：首先使用超纯水对机器管路进行冲洗，流速设置8 mL/min，待基线(蛋白吸收峰，电导，pH)平衡后，连接5 mL的镍柱预装柱，将A泵放置缓冲液A液中，B泵放置缓冲液B液(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和500 mmol/L咪唑，pH 7.4)中。然后使用缓冲液B液对镍柱进行清洗，设置100%缓冲液B液，流速调整至2 mL/min，待基线平衡后，切换至100%缓冲液A液，待基线平衡后，将A泵放于待上样的样品中上样，上样结束后A泵再次放入缓冲液A液中；待基线平衡后，A泵放入0.5 mol/L NaCl溶液中，目的是去除镍柱非特异性结合蛋白。基线再次平衡后放入A液，调整20% B液，目的是去除镍柱结合力较弱的杂蛋白。待基线平衡后，使用100%缓冲液B液洗脱目的蛋白，根据洗脱峰收集目的蛋白。最后洗脱结束后，使用2 mol/L NaCl溶液进行柱子清洗，用20%乙醇进行封柱，待基线平衡后，取下镍柱放置4 ℃冰箱保存。收集的蛋白处于高浓度咪唑中，使用透析袋将咪唑透析出去，透析液为不含咪唑的缓冲液A液，透析比例：1 mL样品使用100 mL缓冲液。透析条件：4 ℃、300 r/min透析过夜。透析后的蛋白用0.22 μm滤器过滤，对蛋白分装保存。

1.7 VP1蛋白的纯度的鉴定

使用高效液相色谱仪对VP1蛋白的纯度进行鉴定：使用经过0.45 μm滤膜过滤并超声脱气的超纯水置换高效液相色谱仪中的保存液，将色谱柱中的保存液50%甲醇置换掉。之后将超纯水换为流动相(50 mmol/L PB，300 mmol/L NaCl，pH 7.0)，平衡色谱柱，至基线平稳。4 ℃取出待上样的样品200 μL，加入到色谱柱专用瓶中。色谱柱型号：BioCore SEC-500高效液相SEC色谱柱(柱参数：7.8 mm× 300 mm；粒径：5 μm；填料孔径：500 Å)；采集流速：0.8 mL/min；检测器：UV检测器；采集波长：280 nm；柱温：25 ℃；样品室温度：25 ℃；上样量：50 μL；采集时间：25 min。25 min后，将流动相切换至纯水，待基线平稳后，切换至保存液50%甲醇，待基线平稳后，取出柱子，关闭高效液相色谱仪进行检测，对结果进行分析。

1.8 HuNoV VLP的观察

取纯化的蛋白样品200 μL，滴于载玻片表面，形成水滴状，镊子取出铜网放置于液体表面。样品固定1 min，用吸水纸吸取铜网侧面水分，晾干至水膜消失，用2%的磷钨酸进行染色1 min，用吸水纸吸取铜网侧面水分，晾干，用透射电子显微镜观察VP1蛋白。

2 结果与分析

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2.1 pBacPAK9-8his-VP1质粒的构建和鉴定

PCR扩增的VP1基因5′端和3′端各带有与线性化pBacPAK9载体同源的序列，闪电克隆酶利用同源重组的原理，将VP1基因序列连接至pBacPAK9载体。构建的重组质粒pBacPAK9- 8his-VP1经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，用1%的琼脂糖电泳检测，结果显示可以分离出大小约1 700 bp的VP1基因片段(图1)。VP1基因测序结果完全匹配密码子优化后的序列，说明重组质粒pBacPAK9-8his-VP1构建成功。

2.2 表达VP1重组杆状病毒在SF9细胞中的制备

显微镜下观察未转染质粒的SF9细胞，结果显示细胞形态清晰，生长良好，大小较均一(图2A)。转染pBacPAK9-8his-VP1质粒与线性化Bacmid的SF9细胞可以观察到细胞形态直径变大，出现肿胀破裂现象(图2B)，说明重组杆状病毒初步制备成功。收集P1代的杆状病毒继续传至P3代，仍然可以观察到SF9细胞发生细胞病变效应，说明重组杆状病毒制备成功。

2.3 VP1蛋白在HF昆虫细胞中的表达和鉴定

VP1蛋白大小约为58 kDa，与未感染杆状病毒的HF细胞相比，感染杆状病毒的HF细胞SDS-PAGE检测结果显示：在55−70 kDa之间有较粗蛋白条带，初步说明VP1蛋白在HF细胞中可以表达(图3A)。Western blotting使用HuNoV的多克隆抗体作为一抗，结果显示在55−70 kDa之间存在特异性蛋白条带(图3B)，说明表达VP1蛋白在HF细胞中成功表达。

2.4 纯化后VP1蛋白的鉴定

VP1蛋白经过镍柱纯化后，SDS-PAGE结果显示在55−70 kDa之间有单一条带(图4A)，Western blotting结果显示在55−70 kDa之间有单一条带(图4B)，符合VP1蛋白的大小。说明VP1蛋白已经成功纯化。纯化后的VP1蛋白使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行检测：800 mL HF细胞培养3 d后可获得约20 g细胞，从20 g细胞中可以纯化出约300 mg的VP1蛋白。

2.5 HPLC鉴定VP1蛋白纯度

HPLC鉴定结果显示，不含咪唑的缓冲液A液在13.8−15.8 min时会出现波动，利用不含咪唑的缓冲液A液(图5A)作为对照，判断出HPLC可信区间为1.0−13.8 min, HPLC结果显示纯化的VP1蛋白纯度 > 99% (图5B)。

2.6 透射电镜下观察VLP

HuNoV VP1蛋白在透射电子显微镜下的观察结果如图6所示，VP1蛋白自组装形成大小均一、形态规则、直径约为30−40 nm的VLP，说明昆虫细胞表达的VP1蛋白可以在细胞内自组装成VLP。

3 讨论

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HuNoV是世界范围内引起人急性胃肠炎的主要病原之一，该病毒引起的疾病是全球性的公共卫生问题。目前尚无获批的疫苗用于该病毒的预防，也无特效的药物治疗HuNoV感染引起的疾病。HuNoV疫苗研发的困难主要有3个原因：(1) HuNoV分型较多，抗原变异大，不同HuNoV基因组之间几乎无交叉保护性，同组内不同型别毒株之间交叉保护性弱，导致疫苗研发难度大^[16]；(2) HuNoV目前尚不能进行体外细胞分离培养，也无合适的动物模型培养病毒，所以制备弱毒疫苗或灭活疫苗难度较大；(3) 对HuNoV的免疫学认识尚不足，病毒感染机体后免疫保护特征、病毒变异以及免疫保护相关性研究不够深入^[17]。虽然HuNoV的疫苗研发较为困难，但是目前国内外已经有多款疫苗正在研究，这些疫苗主要有两大类。第一类是HuNoV的VLP亚单位疫苗^[18-19]，第二类是基于腺病毒载体或水泡性口炎病毒载体表达VP1蛋白的重组活病毒载体疫苗^[20-21]。本研究的主要目的是利用flashBAC杆状病毒表达系统，通过在昆虫细胞中表达目前流行最广泛的GⅡ.4型HuNoV的VP1蛋白，观察表达的VP1蛋白能否形成VLP，为HuNoV亚单位疫苗的研发提供参考。

VLP是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而形成的高度结构化的蛋白质颗粒，保留了病毒蛋白的天然构象，具备激发宿主先天和适应性免疫反应的能力。此外VLP不含有病毒的遗传物质，所以其安全性要高于灭活和弱毒疫苗，这使VLP在疫苗研发中更具有优势。关于病毒VLP的制备，目前已经有几十种感染人和动物的病毒制备了VLP，如人乳头瘤病毒^[22]、流感病毒^[23]、口蹄疫病毒^[24]、鸭细小病毒^[25]等。关于VLP的制备，主要包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及杆状病毒表达系统。本研究使用的杆状病毒表达系统制备的VLP具有如下优势：(1) 杆状病毒主要感染昆虫细胞，不感染哺乳动物和人类细胞，安全性高；(2) 杆状病毒表达系统属于真核生物表达系统，能实现蛋白的正确折叠和翻译后的修饰；(3) 杆状病毒感染的昆虫细胞可以实现转瓶培养，蛋白产量高，便于纯化，适合规模化生产。本研究中制备的VLP是通过HF细胞的转瓶培养获得的，方便了后期VLP的大量生产；(4) 目前报道的使用杆状病毒表达系统制备VLP主要是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统^[15]，flashBAC系统是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的一种改进版本，与Bac-to-Bac杆状病毒表达系统相比，flashBAC系统构建重组杆状病毒无需蓝白斑筛选工作，极大缩短了重组杆状病毒的构建时间，加快了实验进程。此外，本研究通过镍柱亲和层析法纯化即可得到高纯度的蛋白，经过HPLC的检测，VP1纯度在99%以上。传统的氯化铯梯度离心法纯化HuNoV的VLP^[15]，其产量往往比较低，本研究使用的亲和层析法纯化VLP操作简单、产量较高，不需要超高速离心机等贵重的仪器设备，更适用于VLP的大量生产。总之，flashBAC系统在继承了传统Bac-to-Bac系统优势的基础上，通过技术上的优化和改进，提供了一种更为高效和方便的重组蛋白表达解决方案，这些优势使得flashBAC系统在蛋白质的真核表达方面具有较好的应用前景。

当前HuNoV主要流行毒株的基因型是GⅡ.4型，为制备该基因型病毒的VLP，我们首先将VP1基因序列根据昆虫细胞的密码子偏好性进行了优化，构建了表达VP1蛋白的杆状病毒转移载体，在SF9昆虫细胞中成功包装了表达VP1蛋白的杆状病毒；其次，制备的杆状病毒感染HF昆虫细胞，该细胞可以使用转瓶进行悬浮培养，蛋白产量较高。为了方便蛋白的纯化，在VP1蛋白的氨基酸端添加了8个组氨酸标签，可以利在全自动蛋白纯化仪上用镍柱对VP1蛋白进行纯化。VP1蛋白经HPLC的鉴定，蛋白纯度在99%以上，说明本研究建立的VP1蛋白制备和纯化方法具有较好的工艺流程。最后通过透射电子显微镜的观察，发现VP1蛋白可以自组装形成大小均一、形态规则、直径约为30−40 nm的VLP。

4 结论

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本研究利用flashBAC杆状病毒表达系统成功表达了GⅡ.4型HuNoV的VP1蛋白，VP1蛋白的纯度在99%以上，VP1蛋白可以组装成VLP。本研究为研发GⅡ.4型HuNoV亚单位疫苗奠定了物质基础，同时也为其他基因型HuNoV VLP的制备提供了技术参考。

基金

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河南省科技攻关项目(232102311062)
河南省科技攻关项目(222102310688)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

FLYNN TG, OLORTEGUI MP, KOSEK MN. Viral gastroenteritis[J]. Lancet, 2024, 403 (10429):862-876.

https://doi.org/10.1016/S0140-6736(23)02037-8

[2]

ATMAR RL, OPEKUN AR, GILGER MA, ESTES MK, CRAWFORD SE, NEILL FH, GRAHAM DY. Norwalk virus shedding after experimental human infection[J]. Emerging Infectious Diseases, 2008, 14 (10):1553-1557.

https://doi.org/10.3201/eid1410.080117

[3]

DEANTONIO R, HESS-HOLTZ M, ABREGO L, CAPITAN-BARRIOS Z, DONOSO LH, DE LEÓN T, SÁEZ LLORENS X, MORENO B, WEIL JG. Norovirus in children under 2 years of age: an epidemiological study in Panama during the COVID-19 pandemic[J]. Frontiers in Pediatrics, 2024, 12:1292967.

https://doi.org/10.3389/fped.2024.1292967

[4]

SATTER SM, ABDULLAH Z, FARIHA F, KARIM Y, RAHMAN MM, BALACHANDRAN N, GHOSH PK, HOSSAIN ME, MIRZA SA, HALL AJ, GASTAÑADUY PA, RAHMAN M, VINJÉ J, PARASHAR UD. Epidemiology and risk factors of norovirus infections among diarrhea patients admitted to tertiary care hospitals in Bangladesh[J]. The Journal of Infectious Diseases, 2023, 228 (7):818-828.

https://doi.org/10.1093/infdis/jiad274

[5]

LOPMAN BA, STEELE D, KIRKWOOD CD, PARASHAR UD. The vast and varied global burden of norovirus: prospects for prevention and control[J]. PLoS Medicine, 2016, 13 (4):e1001999.

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1001999

[6]

THORNE LG, GOODFELLOW IG. Norovirus gene expression and replication[J]. Journal of General Virology, 2014, 95 (Pt 2):278-291.

[7]

KIM NE, KIM MJ, PARK BJ, KWON JW, LEE JM, PARK JH, SONG YJ. A DNA vaccine against GⅡ. 4 human norovirus VP1 induces blocking antibody production and T cell responses[J]. Vaccine, 2024, 42 (6):1392-1400.

https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2024.01.090

[8]

SALMEN W, HU L, BOK M, CHAIMONGKOL N, ETTAYEBI K, SOSNOVTSEV SV, SONI K, AYYAR BV, SHANKER S, NEILL FH, SANKARAN B, ATMAR RL, ESTES MK, GREEN KY, PARREÑO V, VENKATARAM PRASAD BV. A single nanobody neutralizes multiple epochally evolving human noroviruses by modulating capsid plasticity[J]. Nature Communications, 2023, 14:6516.

https://doi.org/10.1038/s41467-023-42146-0

[9]

FORD-SILTZ LA, WALES S, TOHMA K, GAO Y, PARRA GI. Genotype-specific neutralization of norovirus is mediated by antibodies against the protruding domain of the major capsid protein[J]. The Journal of Infectious Diseases, 2022, 225 (7):1205-1214.

https://doi.org/10.1093/infdis/jiaa116

[10]

LINDESMITH LC, MCDANIEL JR, CHANGELA A, VERARDI R, KERR SA, COSTANTINI V, BREWER-JENSEN PD, MALLORY ML, VOSS WN, BOUTZ DR, BLAZECK JJ, IPPOLITO GC, VINJE J, KWONG PD, GEORGIOU G, BARIC RS. Sera antibody repertoire analyses reveal mechanisms of broad and pandemic strain neutralizing responses after human norovirus vaccination[J]. Immunity, 2019, 50 (6):1530-1541. e8.

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.05.007

[11]

HE X, JIANG N, LI Y. Saccharomyces cerevisiae cells that display norovirus P induce both systemic and mucosal neutralizing antibodies[J]. Virology, 2024, 594:110034.

https://doi.org/10.1016/j.virol.2024.110034

[12]

BONURA F, FILIZZOLO C, PIZZO M, SANFILIPPO GL, CACIOPPO F, PALAZZOTTO E, Di BERNARDO F, COLLURA A, MARTELLA V, DE GRAZIA S, GIAMMANCO GM. Biological specimen banking as a time capsule to explore the temporal dynamics of norovirus epidemiology[J]. Viruses, 2023, 15 (12):2303.

https://doi.org/10.3390/v15122303

[13]

CHHABRA P, TULLY DC, MANS J, NIENDORF S, BARCLAY L, CANNON JL, MONTMAYEUR AM, PAN CY, PAGE N, WILLIAMS R, TUTILL H, ROY S, CELMA C, BEARD S, MALLORY ML, MANOUANA GP, VELAVAN TP, ADEGNIKA AA, KREMSNER PG, LINDESMITH LC, et al. Emergence of novel norovirus GⅡ. 4 variant[J]. Emerging Infectious Diseases, 2024, 30 (1):163-167.

https://doi.org/10.3201/eid3001.231003

[14]

SION E, AB-RAHIM S, MUHAMAD M. Trends on human norovirus virus-like particles (HuNoV-VLPs) and strategies for the construction of infectious viral clones toward in vitro replication[J]. Life, 2023, 13 (7):1447.

https://doi.org/10.3390/life13071447

[15]

DEVANT JM, HOFHAUS G, BHELLA D, HANSMAN GS. Heterologous expression of human norovirus GⅡ. 4 VP1 leads to assembly of T=4 virus-like particles[J]. Antiviral Research, 2019, 168:175-182.

https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.05.010

[16]

谢迪, 何莲花, 刘晖, 李金松. 人诺如病毒感染引起的急性胃肠炎流行特征及其影响因素的研究进展[J]. 病毒学报, 2024, 40 (1):140-150.

XIE D, HE LH, LIU H, LI JS. Research advances in the epidemic characteristics and influencing factors of human norovirus infection-induced acute gastroenteritis[J]. Chinese Journal of Virology, 2024, 40 (1):140-150.

[17]

FORD-SILTZ LA, TOHMA K, PARRA GI. Understanding the relationship between norovirus diversity and immunity[J]. Gut Microbes, 2021, 13 (1):1-13.

[18]

PARRA GI, BOK K, TAYLOR R, HAYNES JR, SOSNOVTSEV SV, RICHARDSON C, GREEN KY. Immunogenicity and specificity of norovirus consensus GⅡ. 4 virus-like particles in monovalent and bivalent vaccine formulations[J]. Vaccine, 2012, 30 (24):3580-3586.

https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.03.050

[19]

HOU W, LV L, WANG Y, XING M, GUO Y, XIE D, WEI X, ZHANG X, LIU H, REN J, ZHOU D. 6-valent virus-like particle-based vaccine induced potent and sustained immunity against noroviruses in mice[J]. Frontiers in Immunology, 2022, 13:906275.

https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.906275

[20]

GUO L, WANG J, ZHOU H, SI H, WANG M, SONG J, HAN B, SHU Y, REN L, QU J, HUNG T. Intranasal administration of a recombinant adenovirus expressing the norovirus capsid protein stimulates specific humoral, mucosal, and cellular immune responses in mice[J]. Vaccine, 2008, 26 (4):460-468.

https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2007.11.039

[21]

MA Y, LI J. Vesicular stomatitis virus as a vector to deliver virus-like particles of human norovirus: a new vaccine candidate against an important noncultivable virus[J]. Journal of Virology, 2011, 85 (6):2942-2952.

https://doi.org/10.1128/JVI.02332-10

[22]

STANLEY M. Hpv vaccines: alternative dosage schedules[J]. Expert Review of Vaccines, 2019, 18 (12):1309-1316.

https://doi.org/10.1080/14760584.2019.1704261

[23]

PUSHKO P, TRETYAKOVA I. Influenza virus like particles (VLPs): opportunities for H7N9 vaccine development[J]. Viruses, 2020, 12 (5):518.

https://doi.org/10.3390/v12050518

[24]

谭书桢, 董虎, 孙世琪, 郭慧琛. 口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获[J]. 生物工程学报, 2023, 39 (12):4849-4860.

TAN SZ, DONG H, SUN SQ, GUO HC. Construction of foot-and-mouth disease virus like particles-induced expression vectors and screening of BHK-21 cell pools[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39 (12):4849-4860.

[25]

邹昕熠, 杜彦妮, 陈姝汐, 周文笛, 王文秀, 张馨月, 刘文涛, 蔡春雨, 罗启慧. 新型鸭细小病毒样颗粒的制备及鉴定[J]. 微生物学通报, 2023, 50 (12):5404-5412.

ZOU XY, DU YN, CHEN SX, ZHOU WD, WANG WX, ZHANG XY, LIU WT, CAI CY, LUO QH. Preparation and identification of novel duck parvovirus virus-like particles[J]. Microbiology China, 2023, 50 (12):5404-5412.

2024年第64卷第10期

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doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240206

接收时间：2024-03-29
首发时间：2026-03-21
出版时间：2024-06-21

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收稿日期：2024-03-29
录用日期：2024-06-17

基金

Key Scientific and Technological Project of Henan Province(232102311062)

河南省科技攻关项目(232102311062)

Key Scientific and Technological Project of Henan Province(222102310688)

河南省科技攻关项目(222102310688)

作者信息

1 新乡医学院医学技术学院, 河南省免疫与靶向药物重点实验室, 河南新乡 453003

2 新乡医学院第三附属医院检验科, 河南新乡 453003

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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